ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NGUYỄN TUẤN ANH
Tên đề tài:
BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH TỤ CẦU
VÀNG (Staphylococcus aureus) KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo
: Chính Quy
Chuyên ngành
: Công nghệ Sinh học
Khoa
: CNSH - CNTP
Khóa học
: 2011 – 2015
Thái Nguyên, năm 2015
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NGUYỄN TUẤN ANH
Tên đề tài:
BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH TỤ CẦU
VÀNG (Staphylococcus aureus) KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo
: Chính Quy
Chuyên ngành
: Công nghệ Sinh học
Lớp
: K43 CNSH
Khoa
: CNSH - CNTP
Khóa học
: 2011 – 2015
Giảng viên hƣớng dẫn: 1.BS Nguyễn Thị Huyền
2. TS Nguyễn Văn Duy
Thái Nguyên, năm 2015
i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều
kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm cùng các
thầy cô đã trực tiếp giảng dạy và đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong
suốt những năm học vừa qua.
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
TS. Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và
hướng dẫn tận tình tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
BS. Nguyễn Thị Huyền, CN. Trần Trung Anh, cùng các KTV. Nguyễn Thị
Thủy, Trương Thùy Vi, Dương Minh Phương, Khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện Đa
Khoa Trung Ương Thái Nguyên đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi và đã cung cấp các chủng
sinh vật để thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn bố mẹ và những người bạn đã luôn ở bên cạnh động
viên và giúp đỡ tôi học tập làm việc và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Nguyễn Tuấn Anh
ii
DANH MỤC CÁC TỪ, CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
CIAA
Hỗn hợp gồm 24 chloroform : 1 isoamylalcohol (v/v)
CFU
Colony Forming Unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc
DNA
Deoxyribonucleic Acid
dNTPs
Deoxyribonucleotide triphosphates (Hỗn hợp gồm dATP,
dGTP, dCTP, dTTP)
OD
Optical Density - Mật độ quang
PCR
Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp chuỗi trùng
hợp - chỉ quá trình tổng khuếch đại vùng DNA đặc hiệu in vitro
RNA
Ribonucleic Acid
VSV
Vi sinh vật
BP
Môi trường Baird Parker
ELSA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Kỹ thuật hấp thụ miễn
dịch liên kết với enzyme
VK
Vi khuẩn
KS
Kháng sinh
MRSA
Methicillin resistant Staphylococcus aureus
WHO
Tổ chức Y tế Thế giới
VRSA
Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus
S. aureus
Staphylococcus aureus
ANSORP
mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á
PBP
Biến đổi các protein liên kết với Penicillin
iii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 21
Bảng 3.2: Các hóa chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu ..................................... 21
Bảng 3.3: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.................................................. 22
Bảng 4.1: Kiểu hình của 17 chủng S. aureus phân lập được tại Bệnh viên Đa khoa
Trung Ương Thái Nguyên ..................................................................................... 33
Bảng 4.2. Bảng khảo sát tỷ lệ vi khuẩn S. aureus kháng thuốc trên bệnh nhân điều
trị tại bệnh viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên ........................................... 36
Bảng 4.3: Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ 17 chủng S. aureus phân lập được .. 39
Bảng 4.4: So sánh sự có mặt của gen mecA với kiểu hình kháng Methicillin của
các chủng Staphylococcus aureus thu thập được.................................................. 43
iv
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Hình thái Staphylococcus aureus ............................................................ 6
Hình 4.1: Phân lập S. aureus trên môi trường thạch máu ..................................... 31
Hình 4.2: Hình ảnh kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ với chủng S. aureus (S4) ......... 32
Hình 4.3: Điện di kiểm tra dung dịch DNA tổng số tách chiết từ một số mẫu S.
aureus .................................................................................................................... 39
Hình 4.4: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi NucF-NucR .. 41
Hình 4.5: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm Multiplex PCR sử dụng cặp mồi
MecAF-MecAR và NucF-NucR ........................................................................... 42
v
MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề......................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ......................................................................... 3
1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 3
1.2.2. Yêu cầu của đề tài ......................................................................................... 3
1.3. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................. 3
1.3.1. Ý nghĩa trong khoa học ................................................................................. 3
1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn ................................................................................. 3
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 4
2.1. Giới thiệu về Staphylococcus: .......................................................................... 4
2.1.1. Lịch sử phát hiện .......................................................................................... 4
2.1.2. Đặc điểm hình thái ....................................................................................... 5
2.1.3. Danh pháp và phân loại của S. aureus .......................................................... 5
2.2. Cấu trúc di truyền của S. aureus .................................................................... 6
2.3. Các chỉ thị phân tử của S. aureus ..................................................................... 7
2.4. Đặc tính sinh học của S. aureus ....................................................................... 8
2.5.Cơ chế gây bệnh ................................................................................................ 9
2.6. Tình Hình Nghiên Cứu Tính Kháng Thuốc Ở S. aureus ................................. 9
2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................................ 9
2.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước................................................................ 10
2.7. Cơ chế đề kháng kháng sinh .......................................................................... 13
2.7.1. Ức chế bằng enzyme ................................................................................... 13
2.7.2. Giảm tính thấm của tế bào vi khuẩn ........................................................... 14
2.7.3. Biến đổi vị trí gắn kết .................................................................................. 15
2.7.4. Bơm đẩy ...................................................................................................... 16
vi
2.7.5. Cơ chế kháng thuốc kháng sinh thuộc nhóm β-lactam ............................... 17
2.8. Các phương pháp phát hiện S. aureus kháng thuốc ....................................... 18
2.8.1. Phương pháp vi sinh .................................................................................... 18
2.8.2. Kỹ thuật xác định nồng độ tối thiểu của kháng sinh (MIC) ....................... 18
2.8.3. Kỹ thuật PCR .............................................................................................. 19
PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 20
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.................................................................. 20
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................. 20
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ..................................................................................... 20
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu .................................................. 20
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................... 20
3.2.2. Thời gian nghiên cứu .................................................................................. 20
3.3. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 20
3.3.1. Các cặp mồi sử dụng trong đề tài ................................................................ 20
3.3.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài ..................................................................... 21
3.3.3. Dụng cụ, thiết bị .......................................................................................... 22
3.4. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 22
3.4.1. Khảo sát tỷ lệ vi khuẩn S. aureus kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại
Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên ..................................................... 22
3.4.2. Phân lập vi khuẩn S. aureus kháng thuốc ................................................... 22
3.4.3. Phát hiện nhanh S. aureus kháng methicillin bằng kỹ thuật PCR .............. 22
3.5. Phương Pháp Nghiên Cứu.............................................................................. 23
3.5.1. Phương pháp phân lập S. aureus, và làm kháng sinh đồ từ các bệnh nhân
làm tại bệnh viên). ................................................................................................ 23
3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng hóa chất CTAB ................ 27
3.5.3. Phản ứng PCR ............................................................................................ 29
3.5.4. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR ........................................... 30
vii
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 31
4.1. Kết quả phân lập 17 chủng S. aureus kháng thuốc kháng sinh tại Bệnh viện
Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên ...................................................................... 31
4.2. Khảo sát tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của các chủng S. aureus trên các bệnh
nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên .......................... 36
4.3. Thử nghiệm khả năng phát hiện nhanh S. aureus kháng thuốc bằng kỹ thuật
sinh học phân tử .................................................................................................... 38
4.3.1. Tách chiết DNA tổng số.............................................................................. 38
4.3.2. Kiểm định các chủng S. aureus ................................................................... 40
4.3.3. Nghiên cứu khả năng phát hiện nhanh vi khuẩn S. aureus kháng thuốc .... 41
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 46
5.1. Kết luận .......................................................................................................... 46
5.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Loài Staphylococcus aureus là một trong số các vi khuẩn ký sinh ở
trên da và niêm mạc, nhiều nhất là ở mũi. Có khoảng 10-40% người khỏe
mạnh mang S. aureus (Trần Thị Như Hoa, 2012) [6]. Khi có những tổn
thương ở da và niêm mạc kèm theo những rối loạn về chức năng thì các
nhiễm trùng do S. aureus dễ dàng xuất hiện. Hiện nay, hiện tượng S. aureus
kháng kháng sinh trở nên khá phổ biến do tình trạng sử dụng kháng sinh ngày
càng nhiều ở cộng đồng với những kháng sinh có hoạt phổ rộng, nhiều loại
kháng sinh khác nhau với liều lượng không đúng. Hiện tượng kháng thuốc
không chỉ xuất hiện ở các vi khuẩn trong bệnh viện mà còn trên các vi khuẩn
ở cộng đồng ngoài bệnh viện. Việc nghiên cứu mức độ kháng thuốc ở vi
khuẩn là vấn đề rất cần thiết nhằm theo dõi diễn biến kháng thuốc, dự báo xu
thế kháng thuốc và đề ra những biện pháp thích hợp nhằm hạn chế mức gia
tăng tính kháng thuốc từ đó giúp cho việc sử dụng kháng sinh ở cộng đồng
hợp lý và tiết kiệm (Trần Thị Như Hoa, 2012) [6].
Theo một kết quả khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành
phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy các chủng S. aureus phân lập từ bệnh
phẩm có đến 94,1% chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52%
kháng Amoxillin và 12,5% kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs, 2006)
[8]. Cũng theo một báo cáo khác từ tháng 8/2012 - tháng 8/2013, một nghiên
cứu với 143 chủng S. aureus về tỉ lệ đề kháng KS của S. aureus trong 4.299
bệnh phẩm, được phân lập tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, Viện Pasteur Thành
phố Hồ Chí Minh. Kết quả cho thấy: S. aureus chiếm 23,6%, đa số được phân
lập từ bệnh phẩm mủ (36,3%), dịch âm đạo (18,9%), nước tiểu (11,9%) và
phân (10,5%). Qua kết quả từ kháng sinh đồ (KSĐ), tỉ lệ đề kháng của S.
2
aureus với các KS là 93,7% với Penicilline G, 65,0% với Erythromycine,
60,8% với Kanamycine, 58% với Clindamycine. Tỉ lệ MRSA là 39,2%
(Nguyễn Hữu An, 2013) [1].
Với việc phát hiện tính kháng thuốc ở vi khuẩn hiện nay chủ yếu dựa
trên cơ sở nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường chứa kháng sinh. Đây là
phương pháp đã được khẳng định có độ chính xác cao nhưng tốn thời gian và
phải thực hiện nhiều thao tác nuôi cấy phức tạp. Việc phát hiện chậm tính
kháng thuốc ở vi khuẩn cũng là nguyên nhân góp phần làm cho các chủng vi
khuẩn kháng thuốc có cơ hội lây lan. Do đó, việc phát hiện nhanh vi khuẩn
kháng thuốc là một yêu cầu cần thiết góp phần giảm nguy cơ lây lan của các
vi khuẩn kháng thuốc này, đặc biệt trong môi trường bệnh viện.
Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu công bố về các chỉ thị phân tử liên
quan đến tính kháng thuốc kháng sinh ở vi khuẩn nói chung và S. aureus nói
riêng. Đây là những tiền đề cho việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử
trong phát hiện nhanh vi khuẩn kháng thuốc.
Có nhiều phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn kháng thuốc đã được
nghiên cứu công bố như giải trình tự gen, các kỹ thuật PCR, DNA arrays,
ELISA… Trong đó PCR là kỹ thuật đơn giản, không yêu cầu thiết bị phức tạp
nên rất thuận lợi trong việc áp dụng thực tiễn chẩn đoán.
Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên
cứu của Khoa CNSH và CNTP - Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại Học
Thái Nguyên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Bƣớc đầu nghiên cứu
phƣơng pháp phát hiện nhanh tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus)
kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR”
Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát mức
độ kháng thuốc kháng sinh của S. aureus tại các bệnh nhân điều trị tại Bệnh
viện Đa khoa Thái Nguyên trong thời gian từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 5
3
năm 2015 và bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện
nhanh vi khuẩn này kháng Methicillin - 1 trong những thuốc kháng sinh được
điều trị phổ biến và có tỷ lệ kháng thuốc cao.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát được thực trạng kháng thuốc của vi khuẩn S. aureus tại Bệnh
viện Đa khoa Thái Nguyên và bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR
phát hiện nhanh S. aureus kháng Methicillin.
1.2.2. Yêu cầu của đề tài
- Khảo sát được tỷ lệ vi khuẩn S. aureus kháng thuốc trên bệnh nhân
điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên.
- Phân lập được vi khuẩn S. aureus kháng thuốc.
- Ứng dụng được kỹ thuật PCR phát hiện nhanh S. aureus kháng thuốc.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa trong khoa học
Đánh giá được thực trạng S. aureus kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị
tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên và nghiên cứu ứng dụng kỹ
thuật phát hiện nhanh S. aureus kháng thuốc.
1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
Nghiên cứu được kỹ thuật phát hiện nhanh S. aureus kháng thuốc bằng
kỹ thuật PCR. Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho việc xây dựng phương pháp
phát hiện nhanh vi khuẩn kháng kháng sinh góp phần điều trị có hiệu quả
bệnh nhân nhiễm trùng, hạn chế sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong
cộng đồng.
4
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về Staphylococcus:
Staphylococcus có nguồn gốc từ tiếng Latinh, Staphylo (chùm nho) và
coccus (hạt).
Phân loại của vi khuẩn Staphylococcus như sau:
o Giới: Prokaryote
o Phân loại: Firmicute
o Lớp: Firmibacteria
o Họ: Micrococceae
o Giống: Staphylococcus
2.1.1. Lịch sử phát hiện
Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ người scotland Alexander Ogston đã
trình bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học
trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), trình bày
tương đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong
lâm sàng. S. aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878,
phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ
cầu khuẩn từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật (VSV) học. Năm
1926, Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan
giữa sự hiện diện của hoạt động men coagulase huyết tương của vi khuẩn với
khả năng gây bệnh của nó. Tuy nhiên mãi đến năm 1948, phát hiện này mới
được chấp nhận rộng rãi Báo cáo của (Nguyễn Thị An. 2011) [2].
5
2.1.2. Đặc điểm hình thái
Staphylococcus là vi khuẩn gram dương, hình cầu đường kính 0,5 - 1,5
µm, có thể đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm không
đều giống như chùm nho. Đây là loại vi khuẩn không di động và không sinh
bào tử, thường cư trú trên da và màng nhày của người và động vật máu nóng.
Năm 1871, Recklinghausen thu được cầu khuẩn trong thận của bệnh nhân
chết do bệnh nhiễm khuẩn huyết. Năm 1880, Alexander Ogston chứng minh
được áp-xe sinh mủ là do cầu khuẩn dạng chùm và Ogston được công nhận là
người khám phá và đặt tên cho tụ cầu - Staphylococcus vào năm 1882. Năm
1884, Rosenbach nghiên cứu và đặt tên cho cầu khuẩn tạo khuẩn lạc màu vàng là
Staphylococcus pyrogen aureus (Scott E Martin, 2000) [41].
2.1.3. Danh pháp và phân loại của S. aureus
Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp
Cocci, bộ Bacillales, họ Staphylococcaceae, giống Staphylococcus, loài
Staphylococcus aureus, tên khoa học là Staphylococcus aureus (Baba T,
2002) [17].
Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm
chính: tụ cầu có coagulase và tụ cầu không có coagulase. S. aureus gây bệnh
ngộ độc thực phẩm là tụ cầu có coagulase. Nhờ enzyme này mà trên môi
trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng nên còn
được gọi là tụ cầu vàng (Phạm Văn Phúc, 2013) [10].
6
Đặc điểm cấu trúc của Staphylococcus aureus (Hình 2.1)
Hình 2.1: Hình thái Staphylococcus aureus
2.2. Cấu trúc di truyền của S. aureus
Hiện nay người ta đã thành công trong giải trình tự gen của các chủng
tụ cầu vàng được kí hiệu: Newman, COL, UMRSA 252, MW2, MSSA476,
N315, Mn50, N315, Mu50, RF122… (Baird R.M, Lee W.H, 1995) [18] ,
Steven và cộng sự đã thành công trong việc giải trình tự bộ gen dài 2809422
bp của chủng S. aureus COL. Kết quả giải trình tự đã được đăng kí trên
Genbank với mã số: CP000046.1 cho hệ gen và CP000045 cho hệ gen
plasmid. Theo đó, trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ít nhất các cặp G-C,
điều này gây ra mối quan ngại về sự chuyển gen từ các chủng tụ cầu vàng tới
các tác nhân gây bệnh Gram dương khác (Gill S. R,2005) [23].
Trong số các chủng S. aureus phân lập từ các mẫu thực phẩm, tỷ lệ giống
enterotoxigenic được ước tính khoảng 25%. Tại pháp, trong số 61 chủng phân lập
từ phomat và sữ tươi có 15,9% chủng là giống enterotoxigenic. Ở pháp, trong số
332 chủng S. aureus được phân lập từ nhiều loại thức ăn có 57% chủng chứa các
7
gen SEG, SEB, SEI, và SEJ suất hiện với tần số cao hơn hẳn chủng chứa gen SEA
và SEE, trước đây vốn được xem là chiếm ưu thế (Lâm Quốc Hùng, 2009) [7].
2.3. Các chỉ thị phân tử của Staphylococcus aureus
Chủng S. aureus sản xuất ra một enzyme ngoại bào chịu nhiệt nuclease
(thermonuclease [Tnase] ) với tần số tương ứng với thời điểm mà nó sản xuất ra
coagulase (Brakstad O.G, 1992) [20]. Các Tnase là một loại protein có khối lượng
phân tử 17.000 Da. Nó là một endonuclease, làm giảm cả DNA, RNA và hoạt
động của enzyme có thể chống lại nhiệt độ 1000C trong vòng 1 giờ (Brakstad
O.G, 1992) [20]. Trong các phản ứng PCR phát hiện S. aureus, người ta thường
dùng các mồi chuyên biệt để phát hiện gen nuc mã hóa nuclease chịu nhiệt (Sasaki
T, 2010) [40]. Sasaki T. và cộng sự (2010) đã sử dụng gen nuc trong việc nhận
dạng loài Staphylococci dương tính với cogulase bằng phương pháp mulyiplexPCR (Sasaki T, 2010) [40]. Brakstad O.G. và cộng sự (1992) đã sử dụng gen nuc
làm gen chỉ thị trong phát hiện S. aureus bằng phản ứng khuếch đại gen nuc
(Brakstad O.G, 1992) [20]. Wilson I.G. và cộng sự (1991) đã sử dụng gen nuc làm
gen chỉ thị để phát hiện S. aureus trong sữa nghi ngờ bị nhiễm tụ cầu vàng
(Wilson I. G, 1991) [44]. Ngoài ra theo nghiên cứu của Pinto B. và cộng sự (2004)
cho biết có thể dùng các mồi chuyên biệt khác để phát hiện các gen mã hóa độc tố
ruột (enterotoxin), gen tst (gây hội chứng sốc), gen eta và etb (mã hóa độc tố A và
B gây mảng tróc), vùng đệm rDNA 16-23S và (Pinto B, 2005) [37]. Còn có nhiều
phương pháp dựa trên PCR được dùng để phát hiện nhanh tụ cầu như inter-IS256
PCR, spa typing (Wei H. L, 2002) [43], hay phương pháp DNA fingerprinting
cũng như phương pháp RLPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) để phân
loại các dòng S. aureus và kỹ thuật PCR-RELP (Randomly Fragment Length
Polymorphiism) để phân tích gen aroA (Pinto B, 2005) [37].
8
2.4. Đặc tính sinh học của S. aureus
S. aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme
catalase phân giải oxy già, giải phóng oxy và nước:
Catalase
H2O2
H2O + O2
S. aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra
enzyme coagulase. Đây được xem là tính chất đặc trưng của S. aureus, là tiêu
chuẩn để phân biệt S. aureus với các tụ cầu khác. Có hai dạng coagulase:
coagulase “cố định” (“bound” coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase
“tự do” (“free” coagulase) được phóng thích khỏi thành tế bào. Có hai
phương pháp để thực hiện thử nghiệm coagulase là thử nghiệm trên lam kính
và trong ống nghiệm. Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase
“cố định” bằng cách phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống
nghiệm phát hiện những coagulase “tự do” bằng phản ứng dán tiếp với
fibrinogen qua cộng hợp với những yếu tố khác trong huyết tương (Sandel
M.K, 2002) [39].
Ngoài ra, chúng còn phản ứng với DNAse, phosphatase dương tính, có
khả năng lên men và sinh axit từ manitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng
S. aureus đều nhạy với Novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi
trường chứa đến 15% muối NaCl (Sandel M.K, 2002) [39].
Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus
có mầu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5mm, quanh khuẩn lạc có vòng
sáng giộng 25mm ( do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng
thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase), (Sasaki T, 2002) [39]. Trên môi
trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn
lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường
xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol), (Sandel M.K, 2002) [39].
9
Đa số các dòng S. aureus có thể tổng hợp một hay nhiều enterotoxin
trong môi trường có nhiệt độ trên 150C, nhiều nhất khi chúng tăng trưởng ở
nhiệt độ 35-370C (Trần Linh Thước, 2002) [11].
2.5. Cơ chế gây bệnh:
Bước quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây
bệnh và vật chủ là sự bám dính của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật
chủ các bề mặt này bao gồm:
- Da, niêm mạc: Khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu.
- Các tổ chức sâu hơn: Tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt
phế nang, tổ chức nội mô.
S. aureus bám dính vào bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản chất
polypeptide.
Tác nhân gây bệnh như S. aureus mới có khả năng khởi động các quá
trình sinh hóa đặc hiệu như: tăng sinh, bài tiết đôc tố, xâm nhập và hoạt hóa
các chuỗi tín hiệu tế bào vật chủ.
S. aureus xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một số enzyme như:
hyaluronidase, hemolysin, leukocidin… phá hủy các thành phần tế bào vật chủ.
Ước tính khoảng 0,1µg S. aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm ở
người (Nguyễn Hữu An, 2013) [1].
2.6. Tình hình nghiên cứu tính kháng thuốc ở Staphylococcus aureus
2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Tụ cầu kháng Methicilline (MRSA). Được phân lập tại Châu Âu đầu
tiên năm 1960, phát tán nhanh ở Mỹ và trở thành dịch ở nhiều bệnh viện tại
Mỹ ở thập niên 1980 (MRSA gặp với tỷ lệ 10-40%). Ở Canada gặp đầu tiên:
1979, trở thành dịch năm 1981. Từ năm 1995 đến năm 2004 tỷ lệ tăng từ
0,46/1000 ca lên 5,9/1000 ca. Nghiên cứu năm 2006 ở 48 BV tại Canada cho
10
thấy : 11.700 /29.000 bệnh nhân nhập viện có mang MRSA gây bệnh nhiễm
trùng (Baba T, 2002) [16].
Một báo cáo mới nhất của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công bố ngày
30/4/2014 cho thấy hầu như tất cả các khu vực đều cho kết quả kháng cao với
methicillin trong điều trị S. aureus (MRSA); trong đó, Đông Nam Á hơn
25%, Đông Địa Trung Hải hơn 50%, châu Âu 60%, châu Phi 80%, Tây Thái
Bình Dương 80%, châu Mỹ 90% (Tổ chức Y tế thế giới, 2014) [12].
Những phân tích gần đây cho thấy tại Hoa Kỳ hàng năm có khoảng
48000 người tử vong vì MRSA (Methicillin resistant S. aureus). Ước tính có
khoảng 19000 người Mỹ tử vong vì MRSA trong năm 2005.
2.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, hầu hết các cơ sở khám, chữa bệnh đang phải đối mặt với
tốc độ lan rộng của các vi khuẩn kháng với nhiều loại kháng sinh. Mức độ và
tốc độ kháng thuốc ngày càng gia tăng, đang ở mức báo động. Gánh nặng do
kháng thuốc ngày càng tăng do chi phí điều trị tăng lên, thời gian điều trị kéo
dài, ảnh hưởng đến sức khỏe người bệnh, cộng đồng và sự phát triển chung
của xã hội. Trong tương lai, các quốc gia có thể sẽ phải đối mặt với khả năng
không có thuốc để điều trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm nếu không có các
biện pháp can thiệp phù hợp.
Hiện nay, kháng thuốc không phải là vấn đề mới, nhưng đã trở nên
nguy hiểm, cấp bách, đòi hỏi phải có sự nỗ lực tổng hợp nhằm giúp nhân loại
tránh khỏi nguy cơ quay trở lại thời kỳ chưa có kháng sinh. Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO) nhận định, chúng ta đang sống trong kỷ nguyên phụ thuộc kháng
sinh và yêu cầu toàn cầu có trách nhiệm bảo vệ nguồn thuốc kháng sinh quý
giá cho thế hệ sau (Trường Đại Học Y Khoa-nhà xuất bản Y học, 1974) [13].
Một khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí
Minh năm 2005 cho thấy các chủng S. aureus phân lập từ bệnh phẩm cho
11
thấy có đến 94,1% chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin,
52% kháng Amoxillin và 12,5% kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs,
2006) [8].
Từ tháng 8/2012 - đến tháng 8/2013, một nghiên cứu với 143 chủng
S. aureus về tỉ lệ đề kháng KS của S. aureus trong 4.299 bệnh phẩm, được
phân lập tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh.
Kết quả cho thấy: S. aureus chiếm 23,6% , đa số được phân lập từ bệnh phẩm
mủ (36,3%), dịch âm đạo (18,9%), nước tiểu (11,9%) và phân (10,5%). Qua
kết quả từ kháng sinh đồ (KSĐ), tỉ lệ đề kháng của S. aureus với các KS là
93,7% với Penicilline G, 65,0% với Erythromycine, 60,8% với Kanamycine,
58% với Clindamycine. Cho tỉ lệ MRSA là 39,2% (Nguyễn Hữu An, 2013) [1].
Trong một nghiêm cứu khác cũng cho thấy tỉ lệ kháng kháng sinh của
S. aureus khác nhau giữa các bệnh viện và giữa các kháng sinh xét nghiệm.
Có tới 68,8% các chủng phân lập tại bệnh viện Chợ Rẫy kháng với
Gentamicin. Tỉ lệ kháng Oxacillin cao nhất tại Bệnh viện Đa khoa Trung
ương Huế với 63,8% . Theo báo cáo của Bệnh viện Chợ Rẫy năm 2008, có
8% số chủng S. aureus phân lập được đề kháng với Vancomycin. Tuy nhiên,
đến năm 2009, phần lớn các bệnh viện kể cả Chợ Rẫy không có chủng S.
aureus nào đề kháng với Vancomycin trừ một số bệnh viện tỉnh và bệnh viện
trực thuộc Sở y tế cho kết quả đáng nghi ngờ về tỉ lệ kháng Vancomycin của
tụ cầu vàng ví dụ như 60,9% S. aureus kháng Vancomycin tại bệnh viện
Uông Bí, 24,1% tại bệnh viện Bình Định và 15,6% tại bệnh viện Xanh Pôn.
(Nguyễn Văn Duy, 2011) [3].
Theo một nghiên cứu khác cho thấy tình trạng kháng kháng sinh ở Việt
Nam đã ở mức độ cao. Trong số các nước thuộc mạng lưới giám sát các căn
nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP), Việt Nam có mức độ kháng
Penicillin cao nhất (71,4%) và kháng Erythromycin (92,1%) (Wei H. L,
- Xem thêm -