Tài liệu Chế tạo, nghiên cứu tính chất của vật liệu nano yvo4 eu3+ và eupo4.h2o thử nghiệm ứng dụng đánh dấu huỳnh quang y sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------- LÊ THỊ VINH CHẾ TẠO, NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA VẬT LIỆU NANO YVO4:Eu3+ VÀ EuPO4.H2O THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG ĐÁNH DẤU HUỲNH QUANG Y SINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU Hà Nội – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------- LÊ THỊ VINH CHẾ TẠO, NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA VẬT LIỆU NANO YVO4:Eu3+ VÀ EuPO4.H2O THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG ĐÁNH DẤU HUỲNH QUANG Y SINH Chuyên ngành: Vật liệu quang học, quang điện tử và quang tử Mã số: 62 44 01 27 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Lê Quốc Minh 2. TS. Trần Thu Hương Hà Nội – 2017 i LỜI CAM ĐOAN Công trình được thực hiện tại phòng Quang Hóa Điện tử - Viện Khoa học vật liệu – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Lê Quốc Minh và TS. Trần Thu Hương. Các số liệu và kết quả trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Lê Thị Vinh ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Lê Quốc Minh và TS. Trần Thu Hương những người Thầy đã dành cho tôi sự động viên giúp đỡ tận tình và những định hướng khoa học hiệu quả trong suốt quá trình thực hiện luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Quang Hóa Điện tử, Viện Khoa học vật liệu, Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trường Đại học Mỏ - Địa chất đã tạo điều kiện thuận lợi về mọi mặt để tôi được tập trung nghiên cứu trong suốt thời gian làm luận án. Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn của mình tới tập thể các anh, chị, bạn và em đang công tác tại Viện Khoa học vật liệu (TS. Trần Quốc Tiến; TS. Hoàng Thị Khuyên; TS. Nguyễn Thanh Hường; TS. Đỗ Thị Anh Thư; TS. Nguyễn Vũ; TS. Lâm Thị Kiều Giang; NCS. Đỗ Khánh Tùng; NCS. Phạm Thị Liên); TS. Nguyễn Mạnh Hùng Trường Đại học Mỏ Địa Chất đã chia sẻ kinh nghiệm, động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Trần Kim Anh Viện Khoa học vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; NCS. Hà Thị Phượng Trường Đại học Y Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong các phép đo đạc. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô, các anh chị, các bạn đồng nghiệp trong Bộ môn Hóa học, trong Khoa Khoa học cơ bản, Trường Đại học Mỏ - Địa chất đã chia sẻ trong công việc, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án này. Lời cuối cùng, tôi xin gửi tới những người thân trong gia đình, anh em và các bạn bè đã động viên, chia sẻ, giúp đỡ trong suốt quá trình hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày 08 tháng 12 năm 2016 Tác giả Lê Thị Vinh iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... i  LỜI CẢM ƠN............................................................................................................... ii  MỤC LỤC ..................................................................................................................... i  CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU .......................................................................... vi  DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. viii  DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ ......................................................................... ix  MỞ ĐẦU .......................................................................................................................1  Chương 1 .......................................................................................................................5  VẬT LIỆU NANO PHÁT QUANG CHỨA ION ĐẤT HIẾM ....................................5  1.1. Vật liệu nano...........................................................................................................5  1.1.1. Phân loại ............................................................................................................. 5  1.1.2. Chiến lược chế tạo vật liệu nano ........................................................................ 7  1.2. Vật liệu nano phát quang chứa ion đất hiếm ..........................................................7  1.2.1. Đặc điểm chung của các nguyên tố đất hiếm ..................................................... 7  1.2.2. Vật liệu huỳnh quang chứa ion đất hiếm ............................................................ 8  1.2.2.1. Cơ chế phát quang chứa ion đất hiếm ......................................................... 8  1.2.2.2. Sự tách mức năng lượng ở phân lớp 4f của nguyên tố đất hiếm .................. 9  1.2.2.3. Ion Europi (Eu3+, Eu2+) ............................................................................. 11  1.3. Vật liệu nano phát quang YVO4:Eu3+...................................................................13  1.4. Vật liệu nano phát quang EuPO4.H2O ..................................................................18  1.5. Công cụ đánh dấu huỳnh quang miễn dịch y sinh ................................................21  Kết luận chương 1 .......................................................................................................24  Chương 2 .....................................................................................................................25  iv CÁC KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM ..........................................................................25  2.1. Các phương pháp hóa học chế tạo vật liệu ...........................................................25  2.1.1. Phương pháp thủy nhiệt .................................................................................... 25  2.1.2. Phương pháp vi sóng (Microwave) .................................................................. 26  2.1.2.1. Quy trình tổng hợp YVO4:Eu3+ theo phương pháp vi sóng ...................... 28  2.1.2.2. Quy trình tổng hợp EuPO4.H2O theo phương pháp vi sóng ..................... 29  2.1.3. Phương pháp tổng hợp sử dụng chất tạo khuôn mềm....................................... 30  2.1.4. Các hệ mẫu được chế tạo và nghiên cứu trong luận án .................................... 31  2.2. Phân tích cấu trúc và hình thái bề mặt của vật liệu ..............................................32  2.2.1. Phép đo giản đồ nhiễu xạ tia X......................................................................... 32  2.2.2. Phép chụp ảnh hiển vi điện tử quét .................................................................. 33  2.2.3. Phép chụp ảnh hiển vi điện tử truyền qua ........................................................ 34  2.2.4. Hệ đo phổ hồng ngoại ....................................................................................... 35  2.3. Khảo sát tính chất quang của vật liệu ...................................................................37  2.3.1. Phép đo phổ huỳnh quang ................................................................................ 37  2.3.2 Phương pháp phân tích huỳnh quang miễn dịch sinh hóa (FIA) ....................... 38  Kết luận chương 2 .......................................................................................................39  Chương 3 .....................................................................................................................40  NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT VẬT LIỆU YVO4:Eu3+ .40  3.1. Ảnh hưởng của phương pháp chế tạo mẫu ...........................................................40  3.2. Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt .................................................................44  3.3. Ảnh hưởng của độ pH...........................................................................................50  3.4. Ảnh hưởng của thời gian vi sóng .........................................................................53  3.5. Ảnh hưởng của công suất với chất tạo khuôn mềm PEG .....................................56  Kết luận chương 3 .......................................................................................................60  v Chương 4 .....................................................................................................................61  NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT VẬT LIỆU EuPO4.H2O 61  4.1. Ảnh hưởng của nồng độ .......................................................................................61  4.2. Ảnh hưởng của độ pH đến cấu tạo và tính chất của EuPO4.H2O .........................66  4.2.1. Ảnh hưởng của độ pH của các mẫu [Eu3+]/ [PO43-] = 1/15 (EP 1-15) ..............66  4.2.2. Ảnh hưởng của độ pH của các mẫu EuPO4 (1-1) ............................................. 69  Kết luận chương 4 .......................................................................................................72  Chương 5 .....................................................................................................................73  ỨNG DỤNG CỦA VẬT LIỆU NANO CHỨA TÁC NHÂN PHÁT QUANG EUROPI TRONG Y SINH HỌC VACXIN................................................................73  5.1. Xây dựng quy trình chế tạo công cụ đánh dấu nhận dạng huỳnh quang miễn dịch74  5.1.1. Bọc vỏ vật liệu nano phát quang (Ln- VLNPQ) bằng Silica............................ 76  5.1.2. Chức năng hóa vật liệu đã được bọc vỏ ........................................................... 77  5.2.3. Liên kết thực thể nano và các phần tử sinh học ............................................... 81  5.2. Thử nghiệm phương pháp phân tích huỳnh quang miễn dịch, ứng dụng nhận dạng virut sởi ...............................................................................................................83  5.2.1. Quy trình thử nghiệm cho phương pháp phân tích huỳnh quang miễn dịch .... 83  5.2.1.1. Chuẩn bị tế bào.......................................................................................... 83  5.2.1.2 Chuẩn bị mẫu và gây nhiễm ....................................................................... 84  5.2.1.3. Nhận dạng virut sởi bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang ............. 85  5.2.2. Kết quả thử nghiệm .......................................................................................... 86  Kết luận chương 5 .......................................................................................................88  KẾT LUẬN CỦA LUẬN ÁN .....................................................................................89  DANH MỤC CÁC CÔNG BỐ KHOA HỌC .............................................................91  TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................93  vi CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU Các chữ viết tắt FTIR: Phổ hồng ngoại khai triển Fourier ET: Truyền năng lượng FESEM: Kính hiển vi điện tử quét phát trường (Field emission scanning electron microscopy) TEM: Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope) RE3+: Ion đất hiếm hóa trị 3 XRD: Nhiễu xạ tia X (X-ray Diffraction) T: Tứ giác (Tetragonal) Hex.: Lục giác (Hexagonal) M: Đơn tà (Monoclinic) Sys./SG: Hệ tinh thể/Nhóm đối xứng không gian PL: Phổ huỳnh quang (Photolumisnescence) IR: Phổ hồng ngoại RE-NPs: Vật liệu nano phát quang chứa đất hiếm (Rere Earth NanoPhosphor) Ln-VLPQ: Vật liệu nano phát quang YVO4:Eu3+ và EuPO4 NTA: Naphtoyltrifluoroacetone TOPO: Trioctylphosphineoxide DIC : Differential Interference Contrast) HRTEM: High resolution TEM FFT: Fast Fourier transform vii Các ký hiệu λ: Bước sóng (wavelength) λexc: Bước sóng kích thích (Excitation wavelength) θ: Góc nhiễu xạ tia X Mw: Khối lượng phân tử E: Năng lượng ΔE: Năng lượng chuyển tiếp CH2(CH2CHO): Glutaraldehyde RN = C = NR: Carbodiimide viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Cấu hình điện tử của các ion nguyên tố đất hiếm [53] ................................ 10  Bảng 1.2. Một vài dạng cấu trúc và trạng thái ổn định của octho phốt phát LnPO4 [74] .................................................................................................................................... 19  Bảng 2.1. Ký hiệu các mẫu vật liệu YVO4:Eu3+ sử dụng trong luận án .................... 31  Bảng 2.2. Ký hiệu các mẫu vật liệu EuPO4 sử dụng trong luận án ............................ 32  Bảng 3.1. Các đặc trưng cấu trúc mạng tinh thể của mẫu YVO4:Eu3+ chế tạo bằng phương pháp thủy nhiệt (YVE-HT) và phương pháp vi sóng (YVE-MW) ............... 43  Bảng 3.2. Các đặc trưng cấu trúc mạng tinh thể của hệ YVO4:Eu3+ chế tạo bằng phương pháp thủy nhiệt khi có các chất hoạt động bề mặt ........................................ 46  Bảng 3.3. Các đặc trưng cấu trúc mạng tinh thể của hệ mẫu YVO4:Eu3+ được chế tạo bằng phương pháp vi sóng khi thay đổi thời gian ...................................................... 54  Bảng 4.1. Các đặc trưng cấu trúc mạng tinh thể của các mẫu EuPO4.H2O với sự thay đổi [PO43-] ở pH =6 .................................................................................. 62  Bảng 4.2. Tỉ lệ cường độ giữa đỉnh 7F1 và 7F2 của EuPO4.H2O khi thay đổi [PO43-] . 65  Bảng 4.3. Tỉ lệ cường độ giữa đỉnh 7F1 (5D0 →7F1) và 7F2 (5D0 →7F2) của mẫu EuPO4.H2O với tỷ lệ [Eu3+]/[PO43-] =1/15 ở với pH khác nhau ................................. 69  Bảng 4.4. Cường độ, tỉ lệ cường độ giữa các đỉnh phát xạ cực đại tương ứng của các vật liệu nano EuPO4.H2O với tỷ lệ [Eu3+]/ [PO43-] = 1/1 khi thay đổi độ pH ở bước sóng 393 nm................................................................................................................ 71  ix DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ Hình 1.1. Vật liệu nhân tạo và vật liệu tự nhiên trong thang nano............................... 6  Hình 1.2. Mô hình tách mức năng lượng phân lớp 4f................................................. 11  Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc năng lượng của ion Eu3+, Eu2+ trong mạng nền ................. 12  Hình 1.4. Cấu trúc tinh thể của vật liệu YVO4 ........................................................... 13  Hình1.5. Phổ huỳnh quang của Eu3+ trong các vật liệu YVO4: Eu3+ (a) và Na(Lu,Eu)O2 (b) [55] ................................................................... 14  Hình 1.6. Sơ đồ hạt nano YVO4:Eu3+ hợp sinh BSA (a) và ảnh hiển vi huỳnh quang của hạt nano liên hợp (b) và cùng với tế bào cần đánh dấu (c) [36] .......................... 15  Hình 1.7. Ảnh TEM của vật liệu YVO4:Eu3+có PEG (a) và (b). vật liệu YVO4:Eu3+ không có PEG (c) [61] ................................................................ 15  Hình 1.8. Ảnh SEM của mẫu YVO4:Eu3+ với độ pH khác nhau (A) 3.47, (B) 4.20, (C) 12, (D) 12.8 [67]................................................................................................... 17  Hình 1. 9. Ảnh HRTEM (D) và ảnh FFT hình chèn của YVO4:Eu3+(D) [67] ........... 17  Hình 1.10. Phổ kích thích (a) và phổ huỳnh quang (b) của EuPO4.H2O [17] ............ 19  Hình 1.11. Ảnh TEM của mẫu thanh nano EuPO4.H2O(A-B) và TbPO4·H2O (C-D) với độ phóng đại khác nhau [44] ................................................................................ 20  Hình 1.12. Hình ảnh hiển vi DIC của tế bào HUVEC [44] ........................................ 20  Hình 1.13. Sơ đồ minh họa quy trình chế tạo sensor miễn dịch ECL của màng EuPO4 / CS [78]...................................................................................................................... 21  Hình 1.14. Sơ đồ nguyên lý phương pháp phân tích đánh dấu huỳnh quang miễn dịch .................................................................................................................................... 23  Hình 2.1. Thiết bị dùng trong công nghệ thủy nhiệt .................................................. 25  Hình 2.2. Sóng điện từ ................................................................................................ 27  Hình 2.3. Hệ thống thiết bị tổng hợp vi sóng ............................................................. 27  x Hình 2.4. Quy trình chế tạo vật liệu YVO4:Eu3+ bằng phương pháp vi sóng và thủy nhiệt ............................................................................................................................ 28  Hình 2.5. Quy trình chế tạo vật liệu EuPO4.H2O bằng phương pháp vi sóng ............ 29  Hình 2.6. Mô hình chế tạo các thanh và ống nano theo phương pháp khuôn mềm dựa vào quá trình tự lắp ráp các phân tử hoạt động bề mặt ............................................... 30  Hình 2.7. Hiện tượng nhiễu xạ tia X từ hai mặt phẳng mạng tinh thể ....................... 33  Hình 2.8. Thiết bị nhiễu xạ tia X D5000 do hãng SIEMEN ...................................... 33  Hình 2.9. Sơ đồ nguyên lý kính hiển vi điện tử quét.................................................. 34  Hình 2.10. Kính hiển vi điện tử quét FESEM ............................................................ 34  Hình 2.11. Sơ đồ nguyên lý kính hiển vi điện tử truyền qua ..................................... 35  Hình 2.12. Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (JEOL-1010) ................................ 35  Hình 2.13. Thiết bị đo phổ hồng ngoại IMPACT-410, NICOLET ............................ 37  Hình 2.14. Sơ đồ khối của hệ đo phổ huỳnh quang ................................................... 38  Hình 2.15. Hệ đo huỳnh quang tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Viện Khoa học Vật liệu .............................................................................................................................. 38  Hình 2.16. Kính hiển vi huỳnh quang (Olympus BX40) ........................................... 38  Hình 3.1.Giản đồ XRD của mẫu YVO4:Eu3+ chế tạo bằng phương pháp thủy nhiệt (YVE-HT) và chế tạo bằng phương pháp vi sóng (YVE-MW) ................................. 41  Hình 3.2. Ảnh SEM của mẫu YVO4:Eu3+ chế tạo bằng phương pháp thủy nhiệt (YVE-HT) (a) và chế tạo bằng phương pháp vi sóng (YVE-MW) (b) ở pH = 6 ....... 42  Hình 3.3. Phổ huỳnh quang của mẫu YVO4:Eu3+ chế tạo bằng phương pháp thủy nhiệt (YVE-HT) và phương pháp vi sóng (YVE-MW) được kích thích tại bước sóng 325 nm ........................................................................................................................ 43  Hình 3.4. Công thức cấu tạo của các chất hoạt động bề mặt HTAB (a); SDS (b); AOT(c)........................................................................................................................ 45  xi Hình 3.5. Giản đồ XRD của mẫu vật liệu YVO4:Eu3+ chế tạo bằng phương pháp thủy nhiệt ủ 200 oC, trong 6 giờ với các chất hoạt động bề mặt, khi không có chất hoạt động bề mặt (đường 1), có thêm các chất hoạt động bề mặt HTAB (đường 2); SDS (đường 3); AOT (đường 4) ......................................................................................... 46  Hình 3.6. Ảnh FESEM của các mẫu hệ YVO4:Eu3+ không có và có các chất hoạt động bề mặt là (a) YVE-HT, (b) YVE-HT/AOT, (c) YVE-HT/HTAB, (d) YVEHT/SDS chế tạo bằng phương pháp thủy nhiệt tại 200 oC oC ủ trong 6 giờ .............. 47  Hình 3.7. Ảnh TEM của mẫu YVO4:Eu3+ chế tạo bằng phương pháp thủy nhiệt có các chất hoạt động bề mặt AOT (YVE-HT/ AOT) chế tạo ở 200 oC ủ trong 6 giờ bằng phương pháp thủy nhiệt ở các thang đo khác nhau 20 nm (a) và 100 nm (b) ... 48  Hình 3.8. Phổ huỳnh quang của các mẫu YVO4:Eu3+ chế tạo bằng phương pháp thủy nhiệt với các chất hoạt động bề mặt khác nhau: 1-YVE-HT, 2- YVE-HT/HTAB, 3YVE-HT/SDS, 4- YVE-HT/AOT được kích thích tại 325 nm ................................. 49  Hình 3.9. Giản đồ nhiễu xạ tia X của các mẫu mẫu YVO4:Eu3+ được chế tạo bằng phương pháp vi sóng ở độ pH khác nhau: pH = 4 (đường a), pH = 6 (đường b), pH = 12 (đường c) ............................................................................................................... 50  Hình 3.10. Ảnh SEM của các mẫu YVO4:Eu3+ được chế tạo bằng phương pháp vi sóng với pH thay đổi: (a) YVEH4 (pH = 4), (b) YVEH6 (pH = 6), (c) YVEH8 (pH = 8), (d) YVEH10 (pH = 10) và (e) YVEH12 (pH = 12) .............................................. 51  Hình 3.11. Phổ huỳnh quang của các mẫu YVO4:Eu3+ được chế tạo bằng phương pháp vi sóng với pH thay đổi: pH = 4 (đường 1), pH = 6 (đường 2), pH = 8 (đường 3), pH = 10 (đường 4) kích thích tại bước sóng 325 nm ............................................ 52  Hình 3.12. Giản đồ nhiễu xạ tia X của mẫu vật liệu YVO4:Eu3+ với công suất 700 W ở nhiệt độ 80 oC và thay đổi thời gian gia nhiệt là: 10 phút (YVE10), 20 phút (YVE20), 30 phút (YVE30) ....................................................................................... 53  Hình 3.13. Ảnh FESEM của các mẫu YVO4:Eu3+ được chế tạo bằng phương pháp vi sóng khi thay đổi thời gian: (a) YVET5 (5 phút), (b) YVET10 (10 phút), (c) YVET15 (15 phút (d) YVET20 (20 phút), (e) YVET25 (25 phút), (h) YVET30 (30 phút) ..... 55  Hình 3.14. Cấu trúc của PEG ..................................................................................... 56  xii Hình 3.15. Ảnh FESEM của mẫu YVO4:Eu3+ và YVO4:Eu3+/PEG ở công suất khác nhau: (a)YVEP3 (300W), (b)YVEP5 (500W), (c)YVEP7 (700W), (d)YVEP9 (900W) ........................................................................................................................ 56  Hình 3.16. Phổ huỳnh quang của các mẫu YVO4:Eu3+ (a) và YVO4:Eu3+ /PEG (b) được kích thích tại bước sóng 325 nm ....................................................................... 57  Hình 3.17. Phổ hồng ngoại của mẫu YVO4:Eu3+ và YVO4:Eu3+ /PEG ở công suất 700W, thời gian vi sóng 15 phút, gia nhiệt 80 oC với pH = 6 .................................... 58  Hình 4.1. Giản đồ XRD của hệ mẫu EuPO4 khi thay đổi [Eu3+]/[PO43-] (EP): EP 1-1, EP 1-3, EP 1-5, EP 1-10, EP 1-15, EP 1-30 tại pH = 6 ở công suất 800W, thời gian 15 phút và nhiệt độ 80 oC ............................................Error! Bookmark not defined.  Hình 4.2. Ảnh FESEM của các mẫu EuPO4.H2O với tỷ lệ [Eu3+] / [PO43- khác nhau: (a) EP1-1, (b) EP 1-3, (c) EP 1-5, (d) EP 1-10, (e) EP 1-15, (f) EP 1-30 tại pH = 6 ở công suất 800W, thời gian 15 phút và nhiệt độ 80 oC ................................................ 63  Hình 4.3. Phổ huỳnh quang của hệ mẫu EuPO4.H2O thay đổi nồng độ [PO43-] ở công suất 800W, thời gian 15 phút và nhiệt độ 80 oC được kích thích tại bước sóng 393 nm ........................................................................................................................ 64  Hình 4.4. Ảnh FESEM của các mẫu EuPO4.H2O với tỷ lệ [Eu3+]/ [PO43-] = 1/15 chế tạo khi thay đổi độ pH khác nhau: (a) EP(1-15) H2 (pH= 2), (b) EP(1-15) H4 (pH= 4), (c) EP(1-15) H6 (pH= 6), (d) EP(1-15) H8 (pH= 8), (e) EP(1-15) H10 (pH= 10), (f) EP(1-15) H12 (pH= 12) ......................................................................................... 67  Hình 4.5. Phổ huỳnh quang của các mẫu EuPO4.H2O với tỷ lệ [Eu3+]/ [PO43-] là 1/15 khi thay đổi độ pH khác nhau tại bước sóng 393 nm ................................................. 68  Hình 4.6. Ảnh SEM các mẫu EuPO4.H2O với tỷ lệ [Eu3+]/[PO43-] = 1/1 ở pH khác nhau: 4, 6, 8, 12 tương ứng (a) EP(1-1) H4, (b) EP(1-1) H6, (c) EP(1-1) H8, (d) EP(1-1) H12................................................................................................................ 70  Hình 4.7. Phổ huỳnh quang của hệ mẫu EuPO4.H2O được chế tạo bằng phương pháp vi sóng với tỷ lệ [Eu3+]/ [PO43-] = 1/1 với pH thay đổi từ 4 ÷ 12 tại bước sóng 393 nm .................................................................................................................................... 70  xiii Hình 5.1. Sơ đồ liên hợp sinh học nhằm gắn kết các phân tử hoạt động sinh học với bề mặt các hạt nano .................................................................................................... 74  Hình 5.2. Sơ đồ bọc vỏ vật liệu nano phát quang (Ln- VLNPQ) bằng Silica ............ 76  Hình 5.3. Sơ đồ gắn nhóm NH2 trên bề mặt vật liệu đã được bọc vỏ ........................ 77  Hình 5.4. Ảnh FESEM của vật liệu YVO4:Eu3+(a) và YVO4:Eu3+@ silica -NH2 (b) 78  Hình 5.5. Ảnh TEM của vật liệu YVO4:Eu3+(a) và YVO4:Eu3+@ silica-NH2 (b) ..... 78  Hình 5.6. Phổ hồng ngoại của mẫu YVO4:Eu3+ và YVO4:Eu3+@Silica-NH2 ............ 79  Hình 5.7. Phổ huỳnh quang của YVO4:Eu3+ và YVO4:Eu3+@Silica-NH2 ................. 80  Hình 5.8. Phổ huỳnh quang của EuPO4.H2O và [email protected] .............. 81  Hình 5.9. Sơ đồ Quy trình chế tạo công cụ đánh dấu nhận dạng theo phương pháp . 82  huỳnh quang miễn dịch Ln-VLPQ@Silica-GAT-IgG ............................................... 82  Hình 5.10. Cơ chế của phản ứng cộng nucleophin (AN) ............................................ 83  Hình 5.11. Ảnh hiển vi quang học huỳnh quang của các mẫu: Mẫu 1a và 1b là mẫu tế bào lành không nhiễm virut sởi sử dụng kháng - kháng thể gắn HQ nhập khẩu. Mẫu 2a và 2b là mẫu tế bào đã lây nhiễm virut sởi sử dụng kháng - kháng thể gắn HQ nhập khẩu; Mẫu 3a và 3b là mẫu tế bào đã lây nhiễm virut sởi sử dụng kháng - kháng thể gắn HQ EuPO4.H2O@silica-GAT-IgG ................................................................ 87  1 MỞ ĐẦU Các vật liệu nano đã có nhiều ứng dụng nổi bật trong các ngành: điện tử, quang học, công nghệ thông tin, năng lượng. Đặc biệt, trong y sinh học vật liệu nano trở thành nền tảng phát triển các công nghệ và công cụ kiểu mới trong cả ba lĩnh vực chẩn đoán, điều trị và nghiên cứu khoa học sự sống [1-3]. Các phương pháp phát hiện sớm các phân tử sinh học, chế tạo thuốc trúng đích và điều trị bệnh đã phát triển mạnh góp phần hình thành ngành sinh y học nano hiện đại. Nhiều loại vật liệu nano như nano bán dẫn, nano từ, nano kim loại và nano phát quang đã được chế tạo và phát triển các ứng dụng trong sinh y học. Trong đó, vật liệu nano phát quang đã có những ứng dụng nổi trội trong chẩn đoán và điều trị bệnh nan y như bệnh ung thư, bệnh truyền nhiễm v.v... Có bốn loại vật liệu nano phát quang đã được nghiên cứu: các chất mầu hữu cơ nano hoá, chấm lượng tử bán dẫn, vật liệu nano kim loại và vật liệu nano phát quang chứa đất hiếm [1]. Thứ nhất, các chất mầu hữu cơ nano hoá có cường độ huỳnh quang mạnh, dễ phân tán trong nhiều môi trường, nhất là môi trường sinh lý. Các chất mầu hữu cơ có nhược điểm phát quang không bền và tính chất phát quang phụ thuộc mạnh vào môi trường. Tiếp đến, sự xuất hiện các chấm lượng tử bán dẫn (Quantum dot) có thể ứng dụng trong nhiều ngành kinh tế kĩ thuật khác nhau, do chúng có hiệu suất phát quang cao, rất bền, phổ phát quang phụ thuộc mạnh vào kích thước và bề mặt. Một trong các vật liệu phát quang sử dụng phương pháp này là các Quantum dot chế tạo từ CdS hay CdSe. Các chấm lượng tử nếu được xử lý thích hợp có thể phân tán tốt trong nước, tiền đề quan trọng để liên hợp sinh học [4]. Tuy nhiên, do thành phần vật liệu chứa các nguyên tố có tính độc với con người và môi trường nên cũng bị hạn chế. Tiếp theo, các vật liệu nano kim loại chủ yếu vật liệu nano bạc (Ag) [5] và vật liệu nano vàng (Au) [6]. Hiện nay, nano bạc đã được ứng dụng diệt khuẩn [7] và nano vàng đã được ứng dụng rất có hiệu quả làm tác nhân điều trị quang nhiệt [8]. Loại vật liệu thứ tư được ứng dụng trong y sinh là vật liệu nano phát quang chứa ion đất hiếm (RE-NPs). Ưu điểm của RE-NPs có thời gian sống huỳnh quang dài, độ dịch chuyển Stock lớn, độ rộng phổ hẹp, thân thiện với cơ thể người và môi trường rất thích hợp cho các ứng dụng trong sinh y học [9]. Nổi bật là phương pháp đánh dấu huỳnh quang nhận dạng 2 [10-12] và các phương pháp điều trị quang nhiệt, quang động [13] dựa vào vật liệu RE-NPs. Với những tiến bộ vượt bậc về tổng hợp hóa học đã phát hiện một số vật liệu nano RE-NPs có hiệu suất phát quang cao [14]. Để tạo ra những vật liệu nano trên có thể dùng các phương pháp như: phương pháp sol-gel [15], phương pháp dung nhiệt [16], phương pháp vi sóng [17] phương pháp khuôn mềm [18, 19]. Trong nước, các nghiên cứu chế tạo vật liệu nano và ứng dụng làm các phương tiện đánh dấu và nhận dạng. Các nghiên cứu tạo ra các công cụ đánh giá chất lượng các sinh phẩm, thực phẩm và các vacxin đã đạt được các thành quả rất khích lệ. Một số nhóm nghiên cứu đã chế tạo thành công vật liệu nano bán dẫn ứng dụng phân tích dư lượng thuốc trừ sâu [20], phát triển các chấm lượng tử phức hợp [21] nano vàng và nano hóa các chất mầu hữu cơ [22] v.v... được cộng đồng khoa học khu vực và thế giới quan tâm. Ngoài ra, các nghiên cứu về vật liệu RE-NPs của Viện Khoa học vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã đạt được những kết quả khá nổi bật về nghiên cứu cơ bản và định hướng ứng dụng [23, 24], điển hình ứng dụng trong phân tích nhận dạng sinh y học vacxin [9]. Theo hướng nghiên cứu này, nhiều kết quả nghiên cứu đã được thực hiện thành công [25-28]. Hiện nay, hướng nghiên cứu chế tạo có điều khiển vật liệu lantanit trên nền phốt phát và vanađat [29] kích thước nano pha tạp với ion Eu (III) đang là mối quan tâm hàng đầu về chế tạo vật liệu nano phát quang chất lượng cao và định hướng ứng dụng trong y sinh học. Hơn nữa, nguyên tố đất hiếm Eu phát quang mạnh, vạch hẹp trong vùng màu đỏ rất thuận tiện trong các ứng dụng trong quang điện tử và sinh y học [30]. Chính vì vậy, Tôi đã lựa chọn đề tài nghiên cứu cho luận án tiến sỹ: “Chế tạo, nghiên cứu tính chất của vật liệu nano YVO4:Eu3+ và EuPO4.H2O thử nghiệm ứng dụng đánh dấu huỳnh quang y sinh” Mục tiêu: 1. Làm chủ được phương pháp tổng hợp có điều khiển vật liệu nano YVO4:Eu3+ và EuPO4.H2O ở dạng hạt và dạng dây. 2. Thiết lập được sự phụ thuộc cấu trúc, hình dạng và hình thái học của hai vật liệu nano phát quang nêu trên vào điều kiện tổng hợp hóa học trong dung dịch. 3 3. Thử nghiệm thành công ứng dụng của vật liệu YVO4:Eu3+ và EuPO4.H2O trong phương pháp phân tích huỳnh quang miễn dịch, đặc biệt phát hiện nhận dạng virut trong sản phẩm vacxin công nghiệp. Đối tượng nghiên cứu: 1. Vật liệu nano phát quang YVO4:Eu3+ và EuPO4.H2O. 2. Công cụ đánh dấu từ YVO4:Eu3+, EuPO4.H2O và các phân tử sinh học đặc hiệu. 3. Quá trình đánh dấu nhận dạng vacxin sởi nhằm xác định chất lượng sản phẩm vacxin công nghiệp. Phương pháp nghiên cứu: Luận án được nghiên cứu bằng phương pháp thực nghiệm. Vật liệu được chế tạo tại phòng thí nghiệm Quang Hóa Điện tử, Viện Khoa học vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Cấu trúc, hình thái học của mẫu được phân tích bằng các phép đo hiện đại có độ tin cậy như: giản đồ nhiễu xạ tia X, phổ hồng ngoại, ảnh hiển vi điện tử phát trường, ảnh hiển vi điện tử truyền qua. Tính chất quang được nghiên cứu thông qua phổ huỳnh quang. Khảo sát khả năng ứng dụng của vật liệu tại cơ sở sản xuất Vĩnh Hưng, được xây dựng từ vốn đầu tư ODA Nhật Bản. Nhà máy thuộc Trung tâm nghiên cứu sản xuất vacxin và sinh phẩm y tế, Polyvac thuộc Bộ Y tế. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn: (i) Góp phần vào sự phát triển Khoa học cơ bản và phát triển công nghệ nano trong lĩnh vực chế tạo vật liệu nano phát quang chứa đất hiếm. (ii) Đóng góp vào sự tìm kiếm phương pháp mới để phân tích tìm giải pháp giúp và xác định tình trạng bệnh nâng cao chất lượng sản xuất vacxin và sinh phẩm y tế. 4 Tính mới: (i). Đã chế tạo thành công vật liệu nano đa dạng phát quang mạnh chứa đất hiếm YVO4:Eu3+ và EuPO4.H2O trên cơ sở phương pháp tổng hợp nano có điều khiển. Vật liệu nano YVO4:Eu3+ và EuPO4.H2O dạng thanh có chiều dài nằm trong khoảng 200  500 nm, độ rộng 10  30 nm và dạng hạt có kích thước dưới 15 nm nhằm tăng cường khả năng ứng dụng trong y sinh. (ii). Vật liệu EuPO4.H2O@silica-GAT-IgG lần đầu tiên được chế tạo thành công bằng cách bọc vật liệu nano phát quang EuPO4.H2O với lớp mỏng silica chứa nhóm NH2 và sau đó liên kết với IgG bằng phản ứng ghép. Kết quả thử nghiệm ở quy trình sản xuất công nghiệp ban đầu cho thấy vật liệu EuPO4.H2O@silica-GAT-IgG có thể nhận dạng được virut sởi. Do đó, vật liệu này rất có triển vọng sử dụng vật liệu nano phát quang chứa đất hiếm làm công cụ đánh dấu nhận dạng nhằm phục vụ trong quy trình sản xuất vacxin chất lượng cao và trong ngành y sinh học. Bố cục của luận án: Ngoài phần mở đầu, kết luận, danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt, danh mục các bảng, danh mục các hình ảnh và hình vẽ, danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án, phụ lục và tài liệu tham khảo, nội dung luận án được trình bày trong 5 chương: Chương 1: Vật liệu nano phát quang chứa ion đất hiếm. Chương 2: Các kỹ thuật thực nghiệm. Chương 3: Nghiên cứu chế tạo và khảo sát tính chất vật liệu YVO4:Eu3+. Chương 4: Nghiên cứu chế tạo và khảo sát tính chất vật liệu EuPO4.H2O. Chương 5: Ứng dụng của vật liệu nano chứa tác nhân phát quang Europi trong y sinh học vacxin. Phần kết luận: Trình bày các kết quả chính của luận án. Các kết quả chính của luận án đã được công bố trong 08 công trình khoa học. 5 Chương 1 VẬT LIỆU NANO PHÁT QUANG CHỨA ION ĐẤT HIẾM 1.1. Vật liệu nano Vật liệu nano là loại vật liệu có kích thước cỡ nanomet, thường nằm trong khoảng từ 1 đến 100 nm. Các tính chất mới của vật liệu được phát hiện ở thang nano với các hiệu ứng đặc biệt liên quan đến kích thước và bề mặt [31, 32]. Các kết quả nghiên cứu cho thấy, vật liệu nano có nhiều đặc tính vật lý, hóa học và cả sinh học khác biệt so với vật liệu kích thước micromet và vật liệu khối. Các tính chất quang học, quang điện tử, xúc tác, tính chất từ hay điện cũng khác so với vật liệu cùng thành phần thông thường có kích thước cỡ micromet trở lên [33, 34]. Do vậy, vật liệu nano có nhiều ứng dụng nổi trội trong các lĩnh vực khoa học công nghệ và kinh tế xã hội như công nghệ thông tin, điện tử, quang học, hiển thị, đặc biệt trong ngành quang điện tử, quang tử và sinh y học [35, 36]. Ngoài ra, còn có nhiều tính chất đặc trưng khác của vật liệu như hoạt tính bề mặt, diện tích bề mặt, các tính chất nhiệt, từ, điện, quang học, cơ học, hóa học thậm chí cả sinh học… của vật liệu cũng bị thay đổi khi giảm kích thước [37]. 1.1.1. Phân loại Vật liệu nano được phân loại dựa vào mục đích nghiên cứu và ứng dụng [38] +) Phân loại theo bản chất của vật liệu (Hình 1.1) Vật liệu nano tự nhiên: các vật liệu nano tự nhiên gồm các phần tử sinh học (Protein, ADN, các virut, tế bào v.v.). Vật liệu nano nhân tạo: các vật liệu nano nhân tạo gồm Fulleren C60, chấm lượng tử, nano huỳnh quang đất hiếm, ống nano các bon, nano vàng, v.v. +) Phân loại theo hình dáng của vật liệu Vật liệu nano không chiều là vật liệu cả ba chiều đều có kích thước nano, các hạt nano, chấm lượng tử nano [39]. Vật liệu nano một chiều là vật liệu trong đó hai chiều có kích thước nano, thanh nano, ống nano và dây nano [40].