Tài liệu đề tài độc tố aflatoxin an toàn và vệ sinh thực phẩm

Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM Môn học: AN TOÀN VÀ VỆ SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI TIỂU LUẬN: 0 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh GVHD : Lớp học phần : 210501601 Nhóm : Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2010 1 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh DANH SÁCH SINH VIÊN Họ và tên MSSV 1. 2. 3. 4. 5. NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN ................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................... 2 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh MỤC LỤC MỤC LỤC .....................................................................................................................................2 MỞ ĐẦU .....................................................................................................................................4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN..............................................................................5 1. Lịch sử phát hiện Aflatoxin........................................................................................................5 2. Các loài có khả năng sản sinh Aflatoxin....................................................................................5 3. Điều kiện sản sinh Aflatoxin......................................................................................................6 3.1. Chủng sinh độc tố...................................................................................................................6 3.2. Cơ chất và môi trường............................................................................................................7 4. Cấu trúc và các tính chất của Aflatoxin.....................................................................................9 4.1. Cấu trúc hóa học.....................................................................................................................9 4.2. Tính chất vật lí......................................................................................................................10 4.3. Tính chất hóa học.................................................................................................................12 4.4. Sự chuyển hóa và bài tiết aflatoxin......................................................................................13 5. Độc tính của Aflatoxin.............................................................................................................14 6. Các phương pháp phát hiện Aflatoxin......................................................................................14 6.1. Phương pháp sinh học..........................................................................................................14 6.1.1. Thử nghiệm trên vịt con 1 ngày tuổi.................................................................................14 6.1.2. Thử nghiệm trên phôi gà...................................................................................................15 6.2. Phát hiện bằng đường lý - hoá học.......................................................................................16 6.2.1. Chiết xuất và tinh chế nước chiết......................................................................................16 6.2.2. Tách bằng sắc ký...............................................................................................................16 6.3. Các phương pháp định lượng...............................................................................................18 6.3.1. Sắc kí lớp mỏng hiệu suất cao (high ferformane thin layer chromatography-HPTLC). . .18 6.3.2. Phương pháp sắc kí lỏng cao áp(high ferformane liquid chromatorgaphy-HPLC)..........19 6.4. Xét nghiệm ở người..............................................................................................................19 7. Hiện trạng nhiễm Aflatoxin của các sản phẩm thực phẩm ở Việt Nam và thế giới.................19 7.1. Tại Việt Nam........................................................................................................................19 7.2. Trên thế giới..........................................................................................................................21 CHƯƠNG 2: NHỮNG TÁC ĐỘNG CỦA AFLATOXIN...........................................................24 1. Cơ chế tác động của Aflatoxin.................................................................................................24 2. Ảnh hưởng của Aflatoxin lên thực vật.....................................................................................26 3. Ảnh hưởng của Aflatoxin lên động vật....................................................................................27 3.1. Tác dụng cấp tính.................................................................................................................27 3.2. Tác dụng mãn tính................................................................................................................28 3.2.1. Gây tổn thương gan...........................................................................................................28 3.2.2. Gây ung thư.......................................................................................................................29 3.2.3. Tính gây quái thai.............................................................................................................30 3.2.4. Tính gây đột biến..............................................................................................................30 3.3. Một số ví dụ điển hình..........................................................................................................30 3.3.1. Cá......................................................................................................................................30 3.3.2. Heo....................................................................................................................................31 3.3.3. Trâu bò..............................................................................................................................31 3 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh 3.3.4. Gà, vịt................................................................................................................................32 3.3.5. Chuột.................................................................................................................................33 3.4. Kết luận................................................................................................................................33 4. Ảnh hưởng lên việc nuôi cấy tế bào.........................................................................................34 5. Ảnh hưởng của Aflatoxin lên con người..................................................................................34 CHƯƠNG 3: MỘT SỐ BIỆN PHÁP PHÒNG NGỪA AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM. 37 1. Những sản phẩm có nguy cơ nhiễm Aflatoxin.........................................................................37 2. Các biện pháp phòng ngừa.......................................................................................................39 2.1. Thực hiện giáo dục truyền thông cho nông dân...................................................................39 2.2. Phòng chống nấm mốc cho lương thực trong quá trình bảo quản........................................41 2.3. Điều trị khi bị nhiễm độc......................................................................................................43 2.4. Các phương pháp thường dùng để khử độc tố Aflatoxin......................................................44 2.4.1. Phương pháp vật lý...........................................................................................................44 2.4.1.1. Nhiệt độ.........................................................................................................................44 2.4.1.2. Chiếu xạ........................................................................................................................45 2.4.2. Phương pháp hoá học........................................................................................................45 2.4.2.1. Chiết xuất bằng một dung môi......................................................................................46 2.4.2.2. Làm biến đổi phân tử....................................................................................................46 2.4.3. Phương pháp sinh học.......................................................................................................48 2.4.3.1. Cạnh tranh giữa các loài nấm........................................................................................48 2.4.3.2. Các chuyển hóa sinh học...............................................................................................48 CHƯƠNG 4: MỘT SỐ SẢN PHẨM CÓ KHẢ NĂNG KHỬ ĐỘC TỐ AFLATOXIN.............51 1. rADTZ......................................................................................................................................51 1.1. Quá trình nghiên cứu rADTZ...............................................................................................52 1.2. Bản chất hoá học và cơ chế khử độc của rADTZ.................................................................52 1.3. Qui trình sản xuất rADTZ...................................................................................................52 1.4. Tiềm năng ứng dụng của rADTZ.........................................................................................53 2. Afla-Guard®............................................................................................................................54 PHỤ LỤC ...................................................................................................................................55 KẾT LUẬN ...................................................................................................................................59 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................................60 4 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh MỞ ĐẦU Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm trên lương thực, thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ con người và vật nuôi. Độc tố aflatoxin chủ yếu do loài vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus tạo ra, là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc cho người và gia súc, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến,… thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong. Trong rất nhiều loại aflatoxin trong tự nhiên thì aflatoxin B1 được coi là chất độc nguy hiểm nhất. Mặc dù sự hiện diện của Aspergillus flavus không phải lúc nào cũng gắn liền với việc tồn tại aflatoxin với hàm lượng gây độc, nhưng nó cũng thể hiện nguy cơ lớn về việc có thể nhiễm aflatoxin. Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí thường cao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa trong khi các phương tiện thu hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khô ráo thoáng mát là điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Do đó việc kiểm soát dư lượng aflatoxin là cần thiết và quan trọng. Giới hạn về mức nhiễm aflatoxin đã là một trong những tiêu chuẩn của an toàn vệ sinh thực phẩm. Để có cái nhìn tổng quan về aflatoxin, các ảnh hưởng của độc tố này lên cơ thể con người cũng như các loài động vật và các biện pháp phòng tránh việc nhiễm aflatoxin, nhóm chúng em đã chọn đề tài: “Độc tố Aflatoxin”. Do kiến thức và thời gian tìm hiểu của chúng em còn hạn chế, hơn nữa có rất ít tài liệu tiếng Việt đề cập chuyên sâu về vấn đề này, các thông tin trong bài tiểu luận chủ yếu lấy từ các nguồn trang web nước ngoài nên bài tiểu luận này không tránh khỏi những thiếu sót, nhóm chúng em mong cô và các bạn thông cảm và đóng góp ý kiến để các bài tiểu luận sau của chúng em được hoàn thiện hơn. 5 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN 1. Lịch sử phát hiện Aflatoxin Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là “bệnh gà tây X” (Turkey X disease). Sau đó, các loại gia cầm khác như vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và tử vong rất nhiều. Qua điều tra, người ta xác định được bệnh có liên quan đến một loại độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra. Đến năm 1961 người ta đã tìm ra bản chất hoá học của độc chất này là Aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2. Giữa 4 loại trên thì thì Aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất. Năm 1961, các công trình nghiên cứu công nhận rằng Aflatoxin được tạo ra bởi nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây ra khối u ở gan của động vật. Trên động vật thủy sản, những nghiên cứu đầu tiên về độc tố Aflatoxin trên cá hồi được thực hiện bởi Ashley và các cộng sự. Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố Aflatoxin. Các nhà khoa học cũng đã xác định được công thức phân tử và công thức cấu tạo của Aflatoxin. 2. Các loài có khả năng sản sinh Aflatoxin Aflatoxin thường được tạo bởi hai loài nấm quen thuộc là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus với các lượng khác nhau tùy thuộc vào chủng nấm, cơ chất, điều kiện khí hậu và môi trường. Một số loài nấm mốc khác cũng có khả năng sinh Aflatoxin với lượng rất ít như loài: Penicillium puberulum Bai, các chủng thuộc Aspergillus như Aspergillus tamariikita, Aspergillus niger tiegh, Aspergillus ostiamis wehmen, Aspergillus ruper Tuy nhiên cũng còn nhiều tranh cãi vì trong quá trình phát triển, Aspergillus flavus thường lẫn với nhiều loài nấm khác, đặc biệt là với Penicillium rubrum stoll và khi đó có thể nhầm Aflatoxin là do Penicillium sản sinh ra. Trong một số trường hợp, cũng có thể nhầm lẫn với độc tố Sterigmatoxistin và Avecsin vì có cấu tạo hóa học gần giống với Aflatoxin. 6 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh Aspergillus flavus 3. Aspergillus parasiticus Điều kiện sản sinh Aflatoxin Khả năng sinh độc tố của các chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus rất khác nhau. Điều đó phụ thuộc vào các yếu tố như chủng nấm mốc, các cơ chất, các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm của cơ chất và môi trường. 3.1. Chủng sinh độc tố − Aflatoxin được sản sinh từ hai chủng nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. − Không phải tất cả các chủng Aspergillus flavus được khảo sát đều sản sinh ra Aflatoxin, chỉ 73% có khả năng sản sinh Aflatoxin, trong đó có 23% sản sinh Aflatoxin ở mức cao nhất. Người ta đã ghi nhận được nhiều biến đổi quan trọng tùy theo cơ chất từ đó đã phân lập các chủng A.flavus và tùy theo theo nguồn gốc địa lý. Chẳng hạn, người ta đã thấy trong số 284 mẫu phân lập từ gạo ở Hoa Kỳ có 94% số chủng có sinh độc tố, 86% đối với các mẫu phân lập từ lạc cũng tại nước này và chỉ 71% đối với các mẫu được phân lập cũng từ lạc nhưng ở Ixraen. − Ngoài ra, lượng Aflatoxin cũng thay đổi rất nhiều tùy theo các chủng. − Ngoài việc định lượng tổng số các Aflatoxin, người ta còn quan tâm xác định tỷ lệ riêng phần của các Aflatoxin khác nhau đã biết. Nói chung, Aflatoxin B1 được tạo ra nhiều nhất cả trong thiên nhiên lẫn nuôi cấy, rồi đến Aflatoxin G1, sau đó rất xa là Aflatoxin B2, còn Aflatoxin G2 và các Aflatoxin khác thì tỷ lệ khá thấp. 7 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh − Phân biệt các chủng sinh độc tố và không sinh độc tố qua những đặc điểm hình thái: chủng sinh độc tố có đầu bào tử đính màu xanh lục, ngay cả ở các giống nuôi cấy lâu ngày (thể bình hai lớp, cuống bào tử đính với vách có gai). − Một chủng sinh độc tố có thể mất khả năng đó qua nhiều lần cấy truyền liên tiếp trên các môi trường tổng hợp. Thế nhưng tính độc của một chủng tăng lên khi cấy truyền liên tiếp trên những môi trường tự nhiên thích hợp. 3.2. Cơ chất và môi trường − Cơ chất là các hạt có dầu, đặc biệt là hạt lạc và các sản phẩm từ lạc. Lượng độc tố chứa trong lạc cao nhất. Các chủng phân lập từ thịt ôi, bánh mì, các thực phẩm bột sống hay phomat ô nhiễm tự nhiên thường không có hoặc có rất ít khả năng sinh độc tố. Ngược lại, gần 1/3 số chủng phân lập từ các gia vị có khả năng sản sinh Aflatoxin. − Ngay cả trên cùng một cơ chất, khả năng sản sinh Aflatoxin của các chủng Aspergillius flavus cũng khác nhau. Nguyên nhân của hiện tượng này cũng có thể do một số giống lạc có tính kháng với Aspergillius flavus sinh độc tố Aflatoxin. Các nhà tạo giống đã dựa vào cơ sở phát hiện trên nhằm tạo ra những giống lạc không bị nhiễm aflatoxin. Đây là hướng nghiên cứu nhiều nhà khoa học sử dụng nhằm loại bỏ Aflatoxin theo cách có lợi nhất. − Sự hình thành Aflatoxin phụ thuộc vào sinh khối sợi nấm và thời gian phát triển, khối lượng sợi nấm càng nhiều thì sản sinh độc tố càng nhiều và ngược lại. Thời gian để sản sinh cực đại Aflatoxin thường từ ngày thứ sáu đến ngày thứ bảy sau đó giảm đi. Lí do của sự giảm lượng Aflatoxin trong những ngày tiếp theo là do quá trình tự phân giải của chính bản thân nấm mốc. − Nhiệt độ thích hợp nhất để sản sinh Aflatoxin của các chủng nấm mốc là từ 25-28 oC. Nếu nuôi cấy Aspergillius flavus ở 45oC thì khả năng sản sinh Aflatoxin sẽ bị ức chế. − Hàm lượng nước trong cơ chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành Aflatoxin. Ở lạc nhân, lượng nước từ 15-30% thì sự hình thành Aflatoxin xuất hiện sau 2 ngày; trên gạo cần lượng nước là 24-26% và ở ngô là 19-24%. Như vậy có thể nói sự sản sinh Aflatoxin diễn ra rất nhanh. Đặc biệt là sau thu hoạch, cơ chất có hàm lượng nước khá cao, thời gian làm khô kéo dài là nguyên nhân dẫn đến nhiễm Aflatoxin. 8 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh − Độ pH ban đầu của môi trường ảnh hưởng rất ít đến sự hình thành Aflatoxin; dù nó là bao nhiêu thì lúc nào cũng có xu hướng quy về trị số giữa 4 và 5. − Nguồn carbon: người ta đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc thêm các đường hexoza vào môi trường nuôi cấy lên sản lượng Aflatoxin của A.flavus và kết luận rằng các đường glucose, fructose, manose thuận lợi cho sự tổng hợp Aflatoxin. Gluxit D glucose D manose D fructose D galactose D gulose D arabinose D xilose D ribose D eritrose D glyxerandehyt Nồng độ 1% +++ +++ +++ + +++ 3% +++ +++ +++ ++ 0 ++ + 0 +++ − Nguồn đạm: trên môi trường có đạm nitrite, A.flavus tiết ra ít Aflatoxin; trên môi trường có đạm amoniac, axit uric và axit glutamic, A.flavus sản xuất ra nhiều hơn; vì vậy trong công thức cổ điển của Czapeck, NaNO 3 được thay thế bằng NH4Cl hay một muối amoni khác. Lượng Aflatoxin cao nhất trên môi trường có nấm men hay có pepton hoặc tốt hơn nữa là có các axit amin. Tiamin và các vitamin nhóm B kích thích sự tổng hợp các Aflatoxin, riboflavin và piridoxin thì không có tác dụng. − Các ion kim loại: sự có mặt của Zn, Mg hay Fe kích thích khả năng sản sinh Aflatoxin; Co, Cr, Mn, Ca chỉ có ít hiệu lực. − Các chất khác: khi A.flavus phát triển trên hạt lúa mì, lượng Aflatoxin tạo ra ở giai đoạn phôi mầm nhiều hơn hẳn ở giai đoạn phôi nhũ. Ngoài ra, người ta thấy việc thêm lipid (chiết từ mầm lúa mì bằng pentan) vào một cơ chất gồm mầm lúa mì đã loại bỏ lipid có hiệu quả tốt đến việc sản sinh Aflatoxin. Ảnh hưởng có lợi của các axit béo đến việc hình thành độc tố được nhiều người công nhận, làm cho người ta nghĩ rằng chúng có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp các Aflatoxin; việc phân hủy sinh học của chúng đưa đến sự hình thành các tiền sản phẩm tham gia vào vòng chuyển hóa sinh tổng hợp Aflatoxin. Thêm 9 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh dimetylsunfoxit (DMSO) vào môi trường nuôi cấy sẽ làm nồng độ Aflatoxin hoặc tăng lên chút ít hoặc giảm sút nhiều. Ở đây có lẽ là một tác động chuyển hóa qua lại hơn là một phản ứng hóa học giữa DMSO và các Aflatoxin. 4. 4.1. Cấu trúc và các tính chất của Aflatoxin Cấu trúc hóa học Các Aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật. Hiện nay người ta đã tìm thấy khoảng 18 loại aflatoxin khác nhau, tuy nhiên có 4 loại chính thường gặp nhất gồm 4 hợp chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản phẩm trao đổi chất tạo bởi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, được đặt tên là B1, B2, G1, G2. Bốn chất được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng. B là chữ viết tắt của Blue (màu xanh nước biển) và chữ G là chữ viết tắt của Green (màu xanh lá cây). Các sắc kí đồ lớp mỏng alumin, thu được từ nước chiết bằng clorofrom : metanol (98.5 : 1.5) được tách bằng hệ thống clorofrom : cacbon tetraclorua : nước : metanol (2 : 2.5 : 1 : 3) đã phát hiện hai vết huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại: một vết huỳnh quang xanh tím, đó là aflatoxin B1, một vết khác có Rf thấp hơn và huỳnh quang màu lục, đó là aflatoxin G 1. Aflatoxin G1 có cấu trúc rất gần với cấu trúc aflatoxin B1: nó có hai chức lacton, còn aflatoxin B1 chỉ có một. Bằng cách khử nối đôi cách trong nhân hidrofuran tận cùng của dihidroaflatoxin B 1 và G1 ta thu được hai sản phẩm độc khác là aflatoxin B 2 và G2. So với aflatoxin B1, độc tính của chúng đối với vịt con kém hơn từ 60 đến 100 lần; như vậy chúng sẽ không độc, nếu không có các khả năng mất hidrat chuyển thành aflatoxin B1 rất độc. Aflatoxin B1, B2 trong sữa bò được chuyển hoá và gọi là Aflatoxin M 1 và Aflatoxin M2 (M là một chữ viết tắt của Milk). Aflatoxin M 1 có huỳnh quang xanh tím, aflatoxin M 2 có Rf thấp hơn và huỳnh quang tím. Aflatoxin M1 là hidroxi – 4 aflatoxin B1, và aflatoxin M2 là hidroxi – 4 aflatoxin B2. Trong bốn loại Aflatoxin thì Aflatoxin B1 thường được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, tiếp theo là G1, trong khi đó B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn. 10 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh Ngoài 6 loại aflatoxin chủ yếu trên, người ta còn phát hiện một số loại aflatoxin khác, người ta đã đề nghị gọi các hợp chất đó là flavatoxin hoặc flavacuramin: − Aflatoxin P1: là một sản phẩm trao đổi chất, là dẫn xuất fenolic của aflatoxin B 1. Người ta đã phân lập được chúng trên cột ambeclit XAD – 2 (Rohm và Haas). Trọng lượng phân tử của nó, xác định bằng khối phổ là 2.8. Sản phẩm này là kết quả sự khử metyl của aflatoxin B1. − Aflatoxin 3B hay toxin B3: một chất có Rf thấp, phân lập từ bình nuôi cấy A. flavus, dạng tinh thể, màu vàng kim, độ độc kém aflatoxin B1 từ 40 đến 50 lần. − Aflatoxin B3 ( được Siubblefield và đồng sự phân lập) còn gọi là porositicol: nhân xiclopenten tận cùng của aflatoxin B1 được thay thế bằng một chuỗi bên etanol, do đó chất này là 6 – metoxi -7 - (2’ – hidroxictyl) difurocumarin. 4.2. Tính chất vật lí Các Aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím sóng dài. Điều này cho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực kì thấp (0,5 ng hay thấp hơn trên một vết ở sắc kí bản mỏng). Nó cung cấp điểm cơ bản về mặt thực hành cho tất cả các phương pháp hoá lý 11 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh về việc phát hiện và định lượng. Nồng độ Aflatoxin M1 0,02mg/l có thể được phát hiện trong sữa lỏng. Aflatoxin tinh khiết rất bền vững ở nhiệt độ cao lên đến điểm nóng chảy, khi được làm nóng trong không khí. Tuy nhiên nó tương đối không bền khi để dưới không khí và dưới tia cực tím ở phiến sắc kí bản mỏng, và đặc biệt khi hoà tan ở các dung môi có độ phân cực cao. Các Aflatoxin trong các dung môi clorofom và benzen bền vững trong nhiều năm nếu được giữ trong chỗ tối và lạnh. Các Aflatoxin ít hoặc không bị phá huỷ dưới điều kiện nấu bình thường và làm nóng khi thanh trùng. Tuy nhiên, khi có độ ẩm và ở nhiệt độ cao vẫn có thể tiêu hủy aflatoxin trong một khoảng thời gian nhất định. Các Aflatoxin được hoà tan trong các dung môi phân cực nhẹ như clorofom, metanol và đặc biệt ở dimethylsulfoit (dung môi thường được sử dụng như phương tiện trong việc áp dụng các Aflatoxin vào các động vật thực nghiệm). Tính tan của Aflatoxin trong nước dao động từ 10-20mg/l. 4.3. Tính chất hóa học Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử Aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thuỷ phân trong môi trường kiềm, đặc tính này là quan trọng trong bất kì quá trình chế biến thực 12 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh phẩm vì quá trình xử lý kiềm làm giảm hàm lượng Aflatoxin của các sản phẩm, mặc dù sự có mặt của protein, pH và thời gian xử lý có thể thay đổi các kết quả. Tuy nhiên nếu xử lý kiềm là nhẹ thì việc axit hoá sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo Aflatoxin ban đầu. Bảng: Tính chất lý – hóa chủ yếu của các aflatoxin (* Kết quả của Townsend, ** Kết quả của Stubblefield và đồng tác giả, *** kết quả của Beljiaars) Ở nhiệt độ cao (khoảng 100oC) sự mở vòng decarboxylation xảy ra và phản ứng có thể tiến xa hơn, dẫn đến sự mất mát các nhóm methoxy từ vòng thơm. Khi có các acid vô cơ và bổ sung nước, Aflatoxin B1 và G1 chuyển hóa thành Aflatoxin B2A và G2A. Các sản phẩm cộng hợp tương tự của Aflatoxin B1 và G1 cũng được hình thành với clorua axit formic thionyl, clorua axit axetic và axit thionyl trifluoroacetic. 13 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh Nhiều tác nhân oxy hóa, chẳng hạn như hypochlorite natri, thuốc tím, chlorine, hydrogen peroxide, ozone và peborat natri phản ứng với Aflatoxin và thay đổi các phân tử Aflatoxin, một số phản ứng làm mất huỳnh quang. Sự hydro hóa Aflatoxin B1 và B2 sinh ra Aflatoxin G1, G2 tương ứng. Sự khử Aflatoxin B1 bằng 3 mol hydro sinh ra tetrahydroxyaflatoxin. khử Aflatoxin B1 và B2 bằng natriborohydride tạo ra RB1 và RB2 tương ứng. Hiện tượng đó là kết quả của việc mở vòng lacton bởi sự khử nhóm acid và nhóm xeton ở vòng cyclopentene. 4.4. Sự chuyển hóa và bài tiết aflatoxin Allcrofl và Carnaghan là những người đầu tiên nhận thấy nếu cho bò sữa ăn khô lạc có nhều aflatoxin, thì sữa của chúng độc với vịt con một ngày tuổi. Qua phân tích người ta phát hiện ra các các chất độc chỉ gồm những vết aflatoxin B 1, chủ yếu là các dẫn xuất aflatoxin M1 và M2. Một lượng rất ít các aflatoxin đó đã được phát hiện trong các giống nuôi cấy A.flavus trên lạc và trên nhiều cơ chất khác. Để chắc chắn rằng các aflatoxin M trong sữa là những sản phẩm chuyển hóa của aflatoxin ăn vào, người ta đã cho chuột cái đang cho con bú uống aflatoxin B1 và đã tìm thấy aflatoxin M1 trong sữa. Aflatoxin M1 còn được tìm thấy trong sữa dê, mật chuột, gan chuột, phân và nước tiểu bò cái và cừu; máu, nước tiểu, mật, thận thỏ con, trong nước tiểu người ăn bơ dầu lạc có nhiễm khuẩn. Việc chuyển hóa các aflatoxin xảy ra rất nhanh. Nếu cho bò cái ăn một lượng duy nhất (0.5 mg/kg) hỗn hợp các aflatoxin B1: 44%, G1: 44%, B2: 2% và phân tích đều đặn sữa, người ta thấy 85% lượng aflatoxin phát hiện thấy trong sữa và nước tiểu được bài tiết ra trong vòng 48 giờ; 4 ngày sau trong sữa và 6 ngày sau trong nước tiểu, phân không phát hiện được một vết nào nữa. Trong sữa chỉ aflatoxin M1 và lượng chất này chiếm 0.35% lượng aflatoxin B1 ăn phải. Mặt khác, nếu cho 67 đến 200 mg aflatoxin B 1 vào khẩu phần hàng tuần của một bò cái, người ta thấy có 0.07 đến 0.15 mg/kg aflatoxin M 1 trong sữa đã đông khô. Ở các động vật không có vú, sự chuyển hóa aflatoxin B 1 chủ yếu là sự hidroxyl hóa, đồng thời mất nhóm metyl; cuối cùng đưa đến những sản phẩm như aflatoxin P 1 tìm thấy trong nước tiểu. 14 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh Nếu cho chuột ăn các aflatoxin B 1 và G1, phân tích nước tiểu của chúng thấy nhân cumarin vẫn còn nguyên vẹn; phân tử bị thoái biến do mở nhân furan, hình thành một mạch bên thẳng tận cùng bởi một nhóm andehyt. Nhóm này sẽ tự oxi hóa khi bài tiết ra. 5. Độc tính của Aflatoxin Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết người khoảng 10 mg), độc tố Aflatoxin còn được xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư. Aflatoxin là một trong những chất gây ung thư gan mạnh nhất, nếu hấp thu một lượng là 2,5 mg Aflatoxin trong thời gian ngắn (khoảng 3 tháng) có thể dẫn đến ung thư gan sau một năm. Aflatoxin gây ra các tác hại chính sau đây: − Phá hủy tế bào gan, thận và các bộ phận khác. − Ức chế lên hệ miễn dịch. − Ăn mòn thành ruột và dạ dày. − Suy dinh dưỡng, chậm lớn, chết. − Gây ra ung thư gan ở người và gia súc. Như vậy, Aflatoxin có khả năng gây độc cấp tính và mãn tính ở người và động vật. Nghiêm trọng nhất và nguy hiểm nhất là khả năng gây xơ gan và ung thư gan. 6. Các phương pháp phát hiện Aflatoxin Phát hiện được sự có mặt của Aflatoxin trong thức ăn là điều rất quan trọng. Nhiều phương pháp phát hiện Aflatoxin đã được đưa ra, tất cả đều rất đáng chú ý và có thể bổ sung cho nhau. 6.1. 6.1.1. Phương pháp sinh học Thử nghiệm trên vịt con 1 ngày tuổi Những thí nghiệm đầu tiên nhằm chứng minh tính độc của các Aflatoxin được tiến hành trên vịt con 1 ngày tuổi (nặng khoảng 50 g). Người ta chỉ xử lý lạc hoặc các sản phẩm có nguồn gốc từ lạc bằng cloroform rồi chiết các chất cặn hòa tan bằng metanol; sau khi tinh chế bằng phân chia giữa các dung môi không hòa lẫn (metanol 10 thể tích, nước 1 thể tích, ete dầu hỏa 10 thể tích), cặn được hòa thành nhũ tương trong nước (sao cho nồng độ cuối cùng của 1 ml tương đương với 40 g mẫu ban đầu) và cho vào cổ họng vịt con bằng 1 ống chất dẻo. Ngày đầu tiên, cho vịt nuốt một lượng lớn nước chiết tương ứng với 10 g mẫu ban 15 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh đầu, rồi tăng dần liều lên để trong 4 ngày, con vật đã tiếp nhân 1 lượng tương đương 80 g. Mẫu thử được coi là rất độc nếu vịt con chết trong 7 ngày kể từ lúc bắt đầu thí nghiệm, độc vừa hay ít độc tùy theo tổn thương ở gan của những con vịt còn sống được đem giải phẫu vào ngày thứ 7. Vịt là một loài vật đặc biệt mẫn cảm nên người ta có thể phát hiện bằng phương pháp sinh học những lượng Aflatoxin rất nhỏ. Thử nghiệm này được sử dụng rất nhiều. Một mặt nó cho biết DL50 của các Aflatoxin; mặt khác, chúng ta còn biết được khi vịt con tiếp nhận một lượng Aflatoxin ít nhất bằng 0.04mg/kg thì thấy các ống dẫn mật phát triển dị thường. Tuy nhiên, cách thử này cũng có nhiều điều bất tiện như: cần phải tổ chức nuôi vịt, có khó khăn ở chỗ con vật có thể trớ ra liều thuốc độc ta vừa cho nuốt… Loại Aflatoxin B1 B2 G1 G2 6.1.2. DL50 (mg/kg) 0.36 1.69 0.78 2.45 Thử nghiệm trên phôi gà Đây là thử nghiệm được dùng nhiều nhất sau thử nghiệm trên vịt con 1 ngày tuổi. Tiến hành thử nghiệm bằng cách tiêm nước chiết vào buồng khí hoặc vào lòng đỏ của trứng gà Leghorn trắng đã thụ tinh và ấp trong 5 ngày (cũng có thể tiêm trước khi ấp hay tiêm sau 9 ngày). Phôi gà rất mẫn cảm với Aflatoxin, chết trong 2 ngày sau nếu mẫu thử tiêm vào có trên 0.3 μg Aflatoxin. Thử nghiệm này có độ mẫn cảm gấp 200 lần so với thử nghiệm trên vịt con. Người ta có thể kiểm tra các tổn thương do Aflatoxin bằng phương pháp tế bào học, đặc biệt việc xét nghiệm gan rất bổ ích. Ngoài ra, người ta cũng biết được DL50 tiêm vào buồng khí là như sau: Loại Aflatoxin B1 B2 G1 G2 M1 DL50 (μg/trứng) 0.025 0.125 1.2 0.27 0.2 16 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” 6.2. GVHD: Trần Thị Mai Anh Phát hiện bằng đường lý - hoá học Ta có thể nhận biết sự có mặt Afltoxin một cách dễ dàng nhờ một số tính chất của chúng: − Khử nitrat bạc ammoniac, molipdat và natri tungstat − Trong môi trường pecloric, tạo với cacbonzon thành hợp chất cộng có màu tím đặc trưng, cũng chức năng này phản ứng yếu với vanilin trong môi trường xút 38% − Ngưng tụ với phenol trong môi trường sunfuric và acid sunfuric cũng có vết hình dẻ quạt − Dễ bị phân hủy trong môi trường kiềm − Phản ứng với di-O-anizidin-tetrazolium clorua để tạo thành các hợp chất xanh – tím với các aflatoxin B1, B2 và nâu với aflatoxin G2. 6.2.1. Chiết xuất và tinh chế nước chiết Phần lớn các phương pháp chiết xuất và tinh chế đều dựa trên tính chất các Aflatoxin tan trong một số dung môi hữu cơ như cloroform, metanol, etanol, axeton, benzen…và không tan trong một số dung môi béo như hexan, ete dầu hỏa, ete etylic… 6.2.2. Tách bằng sắc ký Sắc ký giấy  Việc tách bằng phương pháp sắc ký đầu tiên được thực hiện trên sắc ký giấy và triển khai bằng hệ thống benzen: toluen: xiclohexan: etanol: nước. Các phương pháp được khuyên dùng là những phương pháp cổ điển, dùng 2 hệ thống dung môi: − Hệ thống 1 gồm butanol: axit acetic: nước (20: 19: 1) − Hệ thống 2 gồm cloroform: metanol (95: 5) Với hệ thống 1, việc làm bão hòa thùng sắc ký với pha ướt và triển khai thực hiện với pha trên ở nhiệt độ 24oC. Sắc ký chạy kéo dài 20 giờ trên băng giấy Whatmann số 1, kích thước 550 x 30 mm. Vết sắc ký ở cách gốc băng giấy 60 mm, cách tầm dung môi bắt đầu lan 30 mm. Với dung môi 2, việc làm bão hòa và chạy sắc ký thực hiện với cùng 1 pha và lần lượt kéo dài 1 giờ và 3 giờ 30 phút. Hệ thống dung môi này được sử dụng nhiều. Dù là dung môi nào, người ta cũng sấy ở 100oC trong vòng 20 phút. 17 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” GVHD: Trần Thị Mai Anh Sắc ký cột: loại sắc ký này thường được sử dụng. Tùy theo trường hợp mà người ta  dùng: − Cột alumin − Cột gel silic với chất tách là cloroform và 5% hỗn hợp metanol-cloroform. − Cột axit silixic với chất tách là hỗn hợp cloroform: etanol (99: 1). − Cột xenluloza với chất tách là hỗn hợp hexan: cloroform (1: 1). Sắc ký lớp mỏng: đây là phương pháp được dùng thường xuyên nhất. Có thể triển  khai trong nhiều hỗn hợp khác nhau, thông thường nhất là: − Cloroform: metanol (99: 1), (98: 2), (97: 3), (95: 5), (93:7) − Cloroform: axeton (90: 10), (85: 15) − Cloroform: axeton: etanol (89: 10: 1) − Cloroform: axeton: 2-propanol (850: 125: 25), (825: 150: 25) − Metanol: nước: ete (3: 1: 96) − Benzen: etanol: nước (46: 35: 19) Thời gian triển khai thay đổi từ 45 phút hay 2 đến 3 giờ. Người ta thường khuyên nên hoạt hóa bằng nhiệt vì việc chuyển dịch dung môi ở nhiệt độ thấp chậm hơn. Rõ ràng là Rf của các Aflatoxin khác nhau biến đổi tùy theo điều kiện làm sắc ký. Đối với sắc ký lớp mỏng, người ta thường dùng alumin, bột xenluloza hoặc gel poliamit làm giá. Một điểm rất quan trọng nữa là các lớp mỏng phải thật sự bão hòa trước trong bình, nơi sắc ký sẽ triển khai. Sự bão hòa này phải đủ lâu để được hoàn toàn, nhưng không được kéo dài quá vì có thể gây ra những nhiễu loạn quan trọng trong việc chuyển dịch các thành phần cấu tạo của các mẫu. Giá đỡ sắc ký thường là những tấm kính 200 x 200 mm, nhưng những phương pháp đơn giản hóa khuyên dùng những phiến kính thường để làm tiêu bản hiển vi (26 x 76 mm) hay những giá đỡ mềm như tấm phim. Khi làm sắc ký, một số hợp chất có thể tương tự Aflatoxin; để tránh xác định nhầm, nên sử dụng một hệ thống 2 chiều. Hệ thống này giúp dễ thấy sự khác biệt giữa các Aflatoxin B1 và G1 (do có trị số Rf thường rất gần nhau). 18 Tiểu luận môn ATVSTP: “Độc tố aflatoxin” 6.3. GVHD: Trần Thị Mai Anh Các phương pháp định lượng Mặc dù các quy trình luôn luôn thay đổi, nhưng các bước cơ bản vẫn giữ nguyên, bao gồm: chiết xuất, loại trừ mỡ, làm sạch, phân tích và định lượng. Sự phối hợp các kỹ thuật chiết xuất lỏng và sắc ký dẫn đến phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất ngày nay là phương pháp CB (Contamination Branch) của Eppley. Phương pháp BF (Best Foods) nhanh và kinh tế hơn, nhưng làm sạch kém hơn cũng đã được triển khai. Việc định tính và định lượng các Aflatoxin có thể thực hiện bằng kỹ thuật sắc kí bản mỏng, sắc kí lỏng hiệu cao năng (HPLC) và ELISA. 6.3.1. Sắc kí lớp mỏng hiệu suất cao (high ferformane thin layer chromatographyHPTLC) Do những khiếm khuyết trong phương pháp sắc kí lớp mỏng đơn thuần ở các khâu như chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi, phương pháp HPTLC có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: đưa mẫu lên bản mỏng một cách tự động, cải thiện được sự đồng nhất cả lớp hấp phụ, chạy bản mỏng trong dung môi có kiểm soát. Quá trình đưa mẫu vào bản mỏng được tự động hóa, do đó các vết được định đúng vị trí và đo lường độ huỳnh quang của vết cũng bằng máy densitometess. Thể tích mẫu được dùng trong HPTLC có thể băng 1microlits so với 5-10l mẫu trong phương pháp TLC, như vậy sẽ làm giảm đi rất nhiều diện tích của vết (=1mm). Nồng độ chất chuẩn có thể cần 5pg trong phân tích bằng HPTLC, do đó có thể xác định tới 30pg (0.03microgam) aflatoxin B1 ở lạc. Sử dụng kĩ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phương pháp TLC như một phương pháp định lượng aflatoxin có hiệu quả nhất. 6.3.2. Phương pháp sắc kí lỏng cao áp(high ferformane liquid chromatorgaphyHPLC) Hệ thống phân tích high ferformane tự động HPLC là hệ thông phân tích đắt tiền, chọn lọc, dùng định lượng Aflatoxin. Phương pháp HPLC sử dụng cả hai pha: Pha bình thường và pha phản. Hệ thống này dựa trên sự hấp thụ tia tím (uv) và xác định cường độ huỳnh quang. 19