Tài liệu đề tài sản xuất chế phẩm enzym amylase từ môi trường lỏng

Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng LỜI NÓI ĐẦU Enzyme giữ vai trò cực kì quan trọng trong ngành công nghệ sinh học hiện đại, hiện nay việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzym đang phát triển rất mạnh mẽ. Nước ta là một nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Vì thế ngành công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzym và ứng dụng chúng ở nước ta hiện nay rất phát triển, trong đó hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực khác nhau. Với đề tài: “Sản xuất chế phẩm enzym amylase từ môi trường lỏng”, thuộc môn Công nghệ Lên Men Thực Phẩm, đây là đề tài rất thú vị và phù hợp với xu thế phát triển hiện nay của ngành công nghiệp enzyme, nhờ sự chỉ dẫn tận tình của quý thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, mà đặc biệt là thầy Lê Văn Việt Mẫn, chúng tôi đã hoàn thành đề tài này. Trong quá trình thực hiện đề tài, không tránh khỏi thiếu sót, kính mong sự góp ý của thầy và để chúng tôi có thêm kinh nghiệm cho các bài báo cáo tiếp theo, và luận văn sau này. Trang 1 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng MỤC LỤC 1. GIỚI THIỆU CHUNG ...................................................................................... 4 2. ĐỊNH NGHĨA – PHÂN LOẠI .......................................................................... 4 2.1 Định nghĩa .................................................................................................... 4 2.2 Phân loại ....................................................................................................... 4 2.2.1 α – amylase .......................................................................................... 5 2.2.2 β – amylase .......................................................................................... 7 2.2.3 Glucoamylase ....................................................................................... 8 2.2.4 Một số amylase khác ......................................................................... 10 3. NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE ................................................ 12 3.1 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật ......................................................... 12 3.2 Thu nhận enzyme từ nguồn vi sinh vật ...................................................... 13 4. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AMYLASE TỪ MÔI TRƯỜNG LỎNG .............. 13 A. Sơ đồ quy trình công nghệ .......................................................................... 14 B. Giải thích quy trình ..................................................................................... 15 4.1 Chọn giống vi sinh vật ................................................................................ 15 4.2 Nhân giống vi sinh vật ................................................................................ 16 4.2.1 Môi trường nhân giống ..................................................................... 16 4.2.2 Phương pháp và điều kiện nhân giống ............................................. 16 4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống ............................. 17 4.2.4 Thiết bị nhân giống ........................................................................... 17 4.3 Chuẩn bị môi trường lên men .................................................................... 18 4.4 Tiệt trùng môi trường ................................................................................ 19 4.4.1 Mục đích ............................................................................................. 19 4.4.2 Những biến đổi trong quá trình tiệt trùng ........................................ 19 4.4.3 Thiết bị ............................................................................................... 19 4.5 Lên men sinh tổng hợp enzyme .................................................................. 20 4.5.1 Mục đích ............................................................................................. 20 4.5.2 Các biến đổi xảy ra trong quá trình lên men .................................... 20 4.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ................................... 21 4.5.4 Thiết bị ............................................................................................... 22 4.6 Ly tâm thu nhận chế phẩm enzyme thô .................................................... 24 4.7 Tách và tinh sạch enzyme .......................................................................... 25 4.7.1 Siêu lọc ................................................................................................ 25 4.7.2 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel ................................... 27 Trang 2 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng 4.8 Sấy ............................................................................................................... 32 5. CHẾ PHẨM AMYLASE ................................................................................. 34 5.1 Yêu cầu chế phẩm enzyme amylase trong công nghiệp ........................... 34 5.2 Các dạng chế phẩm enzyme ...................................................................... 35 5.3 Một số chế phẩm amylase thương mại ..................................................... 35 6. THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ .......................................................................... 38 6 α – amylase Bacillus subtilis .................................................................................. 38 6.2 Sản xuất enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus niger theo phương pháp nuôi cấy bề sâu từ hai nguồn nước thải trong công nghiệp thực phẩm .......... 43 7. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 47 Trang 3 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng 1. GIỚI THIỆU CHUNG Hệ enzyme amylase là một trong những hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp thực phẩm, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân khác. Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về amylase nói riêng được bắt đầu từ những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi nhà bác học Nga – Viện sĩ K.S Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết malt nảy mầm và nhận thấy trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. 19 năm sau, tức là vào năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp Payen và Persoz đã tách được chất phân giải tinh bột thành đường từ dịch chiết malt, hai ông đã dùng rượu để kết tủa nó và thu được enzyme dưới dạng bột, đồng thời đặt tên nó là diastase. Sau này, theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột được gọi là amylase. Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của con người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Hiện nay, người ta chủ yếu sản xuất amylase từ vi khuẩn và nấm mốc. Những nghiên cứu về amylase vi sinh vật đã đặt nền móng cho việc sản xuất chế phẩm amylase và là cơ sở khoa học để áp dụng chúng trong sản xuất và đời sống, đồng thời cũng mở ra những phương hướng mới, triển vọng mới to lớn đối với nền kinh tế quốc dân. 2. ĐỊNH NGHĨA – PHÂN LOẠI 2.1 Định nghĩa Amylase thuộc nhóm hydrolase, phân giải liên kết glycoside, enzyme này làm nhiệm vụ thủy phân tinh bột thành các phân tử có chiều dài mạch ngắn hơn như dextrin, oligosaccharide, glucose, … 2.2 Phân loại Dựa theo tính chất và cách thức tác dụng lên tinh bột, có thể chia amylase thành các loại sau: Trang 4 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng 2.2.1 α – amylase Hình 2.2.1.1: Cấu trúc không gian của α – amylase  Đặc điểm và hoạt động:  α – amylase (α – 1,4 – glucan – 4glucanohydrolase) là một endo enzyme. Nó xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α – 1,4 – glycoside nằm bên trong phân tử của các cơ chất amylase, amylopectin và glycogen.  α – amylase được tìm thấy trong cơ thể của động vật, thực vật và tế bào vi sinh vật.  Tùy theo nguồn gốc mà phân tử lượng của enzyme sẽ thay đổi, thường dao động trong khoảng 45 – 60kDa. Có một số trường hợp đặc biệt như α – amylase từ loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130kDa.  Tất cả các α – amylase đều là metalloenzyme. Người ta tìm thấy Ca2+ trong phân tử enzyme với hàm lượng từ 1 – 30g.nguyên tử/1g.mol enzyme. Nếu chúng ta tách toàn bộ Ca 2+ ra khỏi α – amylase, enzyme sẽ bị vô hoạt.  Nhìn chung, tỷ lệ tryptophan và tyrosin trong phân tử của các amylase là khá cao. Riêng thành phần acid glutamic và acid aspartic có thể chiếm tới 25% trọng lượng phân tử. Ngoài thành phần protein, một số enzyme amylase từ nấm mốc còn có phân đoạn glucid có chứa mannose, xylose và hexosamine. Chức năng của thành phần glucid này hiện này còn chưa rõ.  Một đặc điểm cần lưu ý là hầu hết các α – amylase khá bền với các tác động của các protease như peppin, trypsin, papain, … Bảng bên dưới giới thiệu tính chất của 1 số chế phẩm α – amylase từ vi sinh vật. Trang 5 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Bảng 2.2.1.1: Một số tính chất của α – amylase từ vi sinh vật (Fogarty, 1983) Phân tử lượng (kDa) Tên vi sinh vật pH T opt opt Bacillus acidocaldarius 3.5 75 68 Bacillus stearothermophilus 4.5 – 6.5 65 – 73 48 Bacillus subtilis 5.3 – 6.4 50 47 Acinetobacter sp.I 7.0 50 – 55 55 Acinetobacter sp.II 7.0 50 – 55 65 Bacteirodes amylophilus 6.3 43 92 Micrococcus halobius 6.0 – 7.0 50 – 55 89 Streptomyces hygroscopicus 5.0 – 6.0 50 – 55 48 Streptomyces aureofaciens 4.6 – 5.3 40 40 Thermonospora curvata 5.5 – 6.5 65 62 Aspergillus oryzae 5.5 – 5.9 40 52 Mucor pusillus 3.5 – 4.0 65 – 70 48 Lipomyces kononenkaae 5.5 40 38 Schwaniomyces castellii 6.0 60 40  Dựa trên quá trình thủy phân tinh bột thành đường glucose, người ta tạm thời chia α – amylase thành hai nhóm: enzyme dịch hóa và enzyme đường hóa. o α – amylase dịch hóa - Sản phẩm thủy phân tinh bột bởi các amylase dịch hóa chủ yếu là các dextrin. - Enzyme này thường được sử dụng trong giai đoạn đầu của quá trình thủy phân tinh bột, nhằm hỗ trợ cho quá trình hồ hóa và dịch hóa. o α– α– oligosaccharide. - Tùy . Trang 6 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng ưα– Aspergillus oryzae ủy 2 (maltose 3 (maltotriose α– Bacillus subtilis thủy 6 (malitohexaose 9. α – amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae bền vững đối với acid hơn α – amylase của malt và vi khuẩn Bacillus subtilis. , tùy thủy α– thủy . 2.2.2 β – amylase Hình 2.2.1.2: Cấu trúc không gian của β – amylase  Đặc điểm và hoạt động:  β – amylase là một exo enzyme, thủy phân từ đầu không khử của mạch amylose, amylopectin và glycogen. Chúng phân cắt liên kết α – 1,4 – glycoside từ đầu không khử của mạch tinh bột tạo ra maltose (dạng β – anomeric).  Enzyme này không thủy phân được liên kết α – 1,6 – glycoside ở amylopectin nên sản phẩm cuối cùng thường gồm 50 – 60% maltose và β – dextrin.  β – amylase không tác dụng lên tinh bột nguyên thể nhưng tác dụng lên tinh bột đã hồ hóa, enzyme này vẫn giữ được hoạt tính khi không có Ca2+.  Điều kiện hoạt động:  β – amylase bền trong môi trường acid (kể cả pH 3 – 4), enzyme này hoạt động mạnh trong môi trường có pH 4.5 – 5.5.  β – amylase kém bền dưới tác dụng của nhiệt độ cao, bị vô hoạt hoàn toàn dưới tác dụng của nhiệt độ 700C, nhưng trong dịch nấu, topt là 60 – 650C. Trang 7 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng 2.2.3 Glucoamylase Hình 2.2.1.3: Cấu trúc không gian của glucoamylase  Đặc điểm và hoạt động:  Glucoamylase ( – ủy – c – – amylase.  .  5– 48 – bên dưới . Trang 8 Công nghệ lên men thực phẩm 2.2.3.1: Gratreva, 1987) Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng a glucoamylase t Topt pHopt pH (oC) (kDa) Aspergillus awamori 4.5 60 83.7 – 88 3.7 Aspergillus niger 1 4.5 – 5.0 - 99 3.4 Aspergillus niger 2 4.5 – 5.0 - 112 4.0 Aspergillus oryzae 1 4.5 60 76 5.6 Aspergillus oryzae 2 4.5 50 38 5.6 Aspergillus oryzae 3 4.5 40 38 5.6 Aspergillus saitoi 4.5 - 90 3.9 Cephalosporium eichhorniae 4.2 45 – 62 26.85 - Lipomyces kononenkoae 4.5 50 81.5 6.1 Mucor rouxianus 1 4.6 55 59 8.4 Mucor rouxianus 2 5.0 55 49 8.4 Penicillium oxalicum 1 5.0 55 – 60 84 7.0 Penicillium oxalicum 2 4.5 60 86 7.45 Rhizopus delemar 4.5 40 100 - Rhizopus javanicis 5.0 – 5.2 - 48 7.5 – 8.0 Endomycopsis sp. 20-9 5.7 – 5.9 50 53 3.8 Endomyces JF 00111 4.8 – 5.0 - 55 4.8 – 5.5  Nhận xét: o Đa số các chế phẩm glucoamylase của vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc) và của mô động vật đều có pH tối ưu ở vùng acid: pH 3.5 – 5.5. Trang 9 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng o T0opt của glucoamylase là 50 – 600C, nhưng hầu hết các glucoamylase bị mất hoạt tính khi đun nóng trên 700C. o So với α – amylase, glucoamylase bền acid hơn, nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu, acetone, không được bảo vệ bằng Ca2+. Bảng 2.2.3.2: Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến glucoamylase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau Nguồn thu glucoamylase Chỉ số Rhizopus detemar Aspergillus niger pHopt 4.5 3.8 pH bảo đảm độ bền cho enzyme trong 1 3.5 – 8.0 2.2 – 7.5 ngày ở 300C Nhiệt độ cao nhất (0C) mà enzyme có thể chịu được trong 15 phút ở pH 5.5 55 70 Điểm đẳng điện pI 7.4 6.5 2.2.4 Một số amylase khác Bên cạnh 3 loại amylase trên, các enzyme thủy phân liên kết nhánh cũng được sử dụng nhiều trong công nghiệpt thủy phân tinh bột. α – glucosidase thủy phân từ đầu không khử các liên kết α – 1,4 – glycoside và α – 1,6 – glycoside của các gốc glucopyranose để tạo ra α – D – glucose. Enzyme này thủy phân rất tốt đường đôi và các oligosaccharide, có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong chuyển hóa syrup giàu maltose sang syrup giàu glucose. Enzyme thủy phân liên kết α – 1,6 – glycoside trong phân tử amylopectin, glycogen và một số polymer khác như pullulanase, exopullulanase, isomaltose. Enzyme này thường được sử dụng kết hợp với β – amylase, glucoamylase trong sản xuất một số sản phẩm syrup hay glucose với mục đích tăng hiệu suất thủy phân. Kể từ khi Robyt và Ackerman phát hiện amylase thủy phân tinh bột thành maltotetraose năm 1971, một số amylase của vi khuẩn đã được công bố có khả năng tạo ra các sản phẩm từ DP2 đến DP6. Hiện nay, các enzyme thủy phân tinh bột tạo các malto – oligosaccharide đang được quan tâm. Malto – oligosaccharide có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược và công nghiệp hóa chất tinh khiết. Những sản phẩm từ DP2 đến DP6 đã được sử dụng trong việc chẩn đoán lâm sang để xác định sự có mặt của α – amylase. Những chất này đều tan rất tốt, tạo ra một dung dịch nhớt và là một thực phẩm tuyệt hảo cho trẻ sơ sinh cũng như người già. Tuy nhiên, giá thành của những sản phẩm này khá đắt do những khó khăn trong việc sản xuất chúng. Trang 10 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng  Amylase tạo maltotriose: Lần đầu tiên, Wako mô tả một exo – amylase từ Streptomyces griceus có khả năng thủy phân tinh bột từ đầu không khử, cho sản phẩm chủ yếu là maltotriose, không có glucose và maltose. Gần đây, một số công bố về khả năng tạo maltosetriose của α – amylase từ chủng Bacillus subtilis với hàm lượng 56%. Enzyme này không tác dụng lên pullutan và cyclodextrin, khi sử dụng cùng pullulanase, lượng maltosetriose có thể tăng lên 73% (Forgaty 1990, Hebeda 1995).  Amylase tạo maltotetraose:  Đặc điểm và hoạt động: Hoạt tính này được tìm thấy ở amylase của Pseudomonas stutzeri. Đây là một exo – amylase ngoại bào, nó tấn công tinh bột từ đầu không khử của mạch và phân cắt liên kết α – 1,4 – glycoside thứ tư để tạo maltotetraose.  Điều kiện hoạt động: o pHopt 8.0. o Bị mất hoạt tính ở 400C. Một số tác giả thử nghiệm sản xuất maltotetraose liên tục bằng cách sử dụng amylase từ Pseudomonas stutzeri NRRLB – 3389, được cố định trên các hạt xốp resin kị nước. Gen sinh tổng hợp exo – maltotetraose của chủng Pseudomonas sacharophila cũng đã nghiên cứu biểu hiện ở E.coli với hoạt tính enzyme thu được cao gấp 4 lần chủng bình thường (Duedahl – Olesen 2000, Gerhartz 1990).  Αmylase tạo maltopentaose: Maltopentaose được sử dụng như cơ chất để nhận biết serum α – amylase. Nó cũng được sử dụng làm thức ăn cho người bị bệnh thận hoặc suy dinh dưỡng. α – amylase từ ngoại bào của Bacillus cereus có thể tạo ra pentaose với hàm lượng 44% từ tinh bột. Một số chủng Pseudomonas từ đất cũng có khả năng tạo maltopentaose, đặc biệt trong giai đoạn đầu của quá trình thủy phân (Duedahl – Olesen 2000, Forgaty 1990).  Amylase tạo maltohexaose:  Đặc điểm và hoạt động: Acetobacter aerogenes (Klebsiella pneumonia) tổng hợp một exo – enzyme có khả năng tạo maltohexaose từ tinh bột, amylopectin và amylase. Khi thủy phân amylopectin và glycogen, ngoài maltohexaose, còn có một lượng dextrin giới hạn, các β – limit dextrin sau đó tiếp tục được thủy phân tạo ra các oligo phân nhánh.  Điều kiện hoạt động: o pHopt 5.8 – 6.0. o t0opt = 50 – 520C. Trang 11 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Enzyme này có hoạt tính transferase tạo maltohexaose từ maltotetraose. α – amylase của Bacillus circulans và Bacillus amyloliquefacines cũng có khả năng thủy phân tinh bột đến 30 – 34% maltohexaose. Sự có mặt của pullanase có thể tăng lượng maltohexaose thêm 12%. 3. NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE 3.1 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật Từ lâu, người ta đã biết sử dụng các loại enzyme từ hạt nảy mầm để sử dụng trong ngành chế biến thực phẩm (mạch nha), nước giải khát (bia), … hoặc sản xuất bột enzyme amylase để bổ sung vào các loại bột dinh dưỡng cho trẻ em, người già, những người bị suy tiêu hóa. Hạt ngũ cốc được cho nảy mầm, tách bỏ phần rễ và thân mầm, sấy khô ở nhiệt độ thấp để giữ nguyên hoạt tính của enzyme được gọi là malt. Malt có thể được sản xuất từ nhiều loại hạt ngũ cốc như đại mạch, lúa, ngô, đậu, … mà chủ yếu là từ đại mạch, lúa,…  Đại mạch (Hordeum sativum): Các enzyme có vai trò rất quan trọng: nó tham gia xúc tác tất cả các phản ứng sinh hóa trong suốt quá trình sản xuất malt và sản xuất bia. Trong hạt khô, enzyme phần lớn ở dạng liên kết, chúng chỉ được giải phóng và hoạt động khi hạt đi vào giai đoạn nảy mầm và các quá trình đường hóa sau đó. Các enzyme thủy phân tinh bột: chủ yếu là amylase gồm có – amylase và – amylase. Quá trình nảy mầm của đại mạch là giai đoạn chuyển các enzyme từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động, đồng thời còn tổng hợp nên hàng loạt các enzyme mới và trong giai đoạn này cần chú ý không làm giảm nhiều chất khô của hạt bằng cách đảo trộn thường xuyên để tạo độ thóang khí. Hạt đại mạch trước khi ngâm không có hoạt lực của enzyme - amylase. Khi hạt trải qua 3 – 4 ngày trong giai đoạn nảy mầm thì hoạt lực của enzyme đạt đến mức cực đại vào ngày thứ 7, sau đó sẽ giảm xuống.  Lúa (Oryza sativa L.): Hệ enzyme amylase trong hạt lúa gồm – amylase và – amylase Trong quá trình nảy mầm hoạt động của các enzyme tăng cao thúc đẩy cho các quá trình sinh tổng hợp các loại enzyme và các quá trình sinh hóa gần giống ở đại mạch, chỉ khác về mức độ tạo thành enzyme và tốc độ phản ứng. Khi hạt chưa nảy mầm, các enzyme tồn tại ở dạng liên kết. Khi hạt nảy mầm, các enzyme này chuyển sang hoạt động. Trang 12 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng 3.2 Thu nhận enzyme từ nguồn vi sinh vật Trong ba nguồn sinh vật (động vật, thực vật, vi sinh vật) để khai thác và thu nhận enzyme thì nguồn vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất, do nguồn enzyme khai thác từ vi sinh vật có ưu điểm sau: - Có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác. - Hệ enzyme từ vi sinh vật vô cùng phong phú. - Khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính của các enzyme rất mạnh. - Vi sinh vật có tốc độ sinh sản nhanh. - Giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật đơn giản, rẻ tiền, … - Sản xuất enzyme từ vi sinh vật được thực hiện theo quy mô công nghiệp và dễ dàng kiểm soát quá trình sản xuất. Các giống vi sinh vật được sử dụng trong công nghiệp sản xuất amylase trong môi trường lỏng: - Nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Rhizopus delemar. - Nấm men: Candida, Saccharomyces. - Vi khuẩn: Bacillus subtilis, Bacillus polymixa, Bacillus macerans. 4. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AMYLASE TỪ MÔI TRƯỜNG LỎNG Trang 13 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng A. Sơ đồ quy trình công nghệ Nguyên liệu Chuẩn bị môi trường Giống VSV Tiệt trùng Nhân giống Cấy giống Lên men sinh tổng hợp enzyme Ly tâm Sinh khối Tách và tinh sạch enzyme Tạp chất Sấy Chế phẩm enzyme Trang 14 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng B. Giải thích quy trình 4.1 Chọn giống vi sinh vật  Chọn nấm mốc Aspergillus oryzae do các ưu điểm sau: - Không sinh tổng hợp độc tố. - Khả năng sinh tổng hợp sản phẩm chính cao. - Khả năng thích nghi nhanh và tốc độ sinh trưởng mạnh. - Điều kiện nuôi cấy: đơn giản. - Môi trường nuôi cấy: rẻ tiền, dễ tìm. - Dễ dàng tách được khỏi môi trường nuôi cấy lỏng để thu nhận enzyme ngoại bào.  Đặc điểm về hình thái của nấm mốc Aspergillus oryzae: Aspergillus oryzae hay còn gọi là mốc hoa cau, được nghiên cứu sớm nhất bởi ông bà Jokichi Takamine (1854 – 1922, người Nhật). Aspergillus oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes (nang khuẩn). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5 – 7 m, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang chia sợi thành nhiều bào tế bào (nấm đa bào). Hình 4.1.1: Hình thái của Aspergillus oryzae Trang 15 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở đầu có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Aspergillus oryzae thường dài 1.0 – 2.0 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử dính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Aspergillus oryzae có màu vàng lục, chính là màu ta thường thấy ở mốc tương. Nấm sợi thường có màu vàng khi già nên còn được gọi là nấm sợi màu vàng. Khi mới phá triển, hệ sợi có màu trắng, sau đó chuyển dần sang màu lục và khi già thì chuyển hẳn sang màu vàng. Nấm mốc Aspergillus oryzae có khả năng sinh tổng hợp enzyme rất mạnh, trong đó có enzyme amylae. 4.2 Nhân giống vi sinh vật Giống sản xuất thường được bảo quản để tránh giảm hoạt tính. Do đó, việc cấy giống trên môi trường thạch nghiêng trước khi nhân giống là việc làm rất cần thiết. Có thể coi đây là việc “đánh thức” chủng giống, đồng thời để kiểm tra hoạt tính của giống sau một thời gian bảo quản ở nhiệt độ thấp. Từ những những tế bào hoặc bào tử riêng rẽ của chủng bảo quản, cấy ra một số canh trường, những canh trường này được nhân giống trong phòng thí nghiệm và được kiểm tra hoạt tính. Nếu có sự khác nhau thì dùng canh trường có hoạt tính mạnh nhất để gây nguyên liệu cấy và tạo thành chủng mới. 4.2.1 Môi trường nhân giống o 3% saccharose o 0.3% NaNO3 o 0.1% KH2PO4 o 0.05% MgSO4.7H2O o 0.05% KCl o 0.001% FeSO4 o 10 – 20mL dịch tự phân nấm men o 1000mL nước cất o 0.3% agar 4.2.2 Phương pháp và điều kiện nhân giống Nhân giống trên môi trường rắn xốp (thường áp dụng đối với nấm sợi như Aspergillus oryzae, với mục đích thu nhận bào tử) với các thông số kỹ thuật sau: - Độ ẩm của môi trường : 45 – 50%. - Nhiệt độ : 27 – 300C. - Thời gian : 30 – 36 giờ. - Độ ẩm của không khí : 85 – 95%. Trang 16 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Aspergillus oryzae là vi sinh vật hiếu khí, chỉ phát triển bình thường khi đầy đủ oxy. Để đáp ứng điều kiện nuôi này, môi trường nuôi phải xốp, rải thành lớp không dày quá 2.5 – 3cm. Theo thực nghiệm, để thỏa mãn cho sự hô hấp của Aspergillus oryzae trong toàn bộ chu kỳ phát triển, cứ 1kg môi trường cần khoảng 1.7m3 không khí. Aspergillus oryzae phát triển bình thường khi nồng độ CO2 trong khí quyển lên tới 8%. Đôi khi khả năng sinh bào tử của nấm mốc bị yếu hoặc mất hẳn. Để khôi phục khả năng này, có thể nuôi nấm mốc trong ánh sáng khuếch tán trong một vài thế hệ. Trong sản xuất công nghiệp hiện nay, quá trình nhân giống vi sinh vật thường được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh (nuôi cấy theo từng mẻ - batch culture). 4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống  Nhiệt độ: Nếu tiến hành nhân giống vi sinh vật ở nhiệt độ thấp hoặc cao hơn khoảng nhiệt độ tối ưu (topt = 27 – 300C) thì vi sinh vật sinh trưởng chậm hơn và hằng số tốc độ sinh trưởng của giống (µexpo) sẽ giảm xuống.  Oxy: Đối với nhóm vi sinh vật hiếu khí bắt buộc như Aspergillus oryzae, việc cung cấp oxy cho môi trường là rất cần thiết để giúp vi sinh vật tổng hợp năng lượng, duy trì các hoạt động trao đổi chất và tổng hợp sinh khối. Cụ thể: cứ 1kg môi trường cần khoảng 1.7m3 không khí.  Sự khuấy trộn: Đối với nấm mốc sử dụng trong chế biến thực phẩm, giống thường được sử dụng dưới dạng bào tử. Khi đó, người ta thường nhân giống trên môi trường rắn xốp. Nếu sử dụng thiết bị nhân giống dạng khay – hình hộp chữ nhật (cuvet), sự đảo trộn môi trường sẽ khó thực hiện hoặc không đạt hiệu quả cao. Trong trường hợp này, sử dụng thiết bị nhân giống dạng hình trụ ngang và có thể quay quanh trục của nó, quá trình đảo trộn môi trường có thể thực hiện một cách tự động và canh trường nuôi đạt được độ đồng nhất cao hơn.  Thời gian: Theo lý thuyết, vào thời điểm đầu của giai đoạn ổn định, số lượng tế bào thu được trong canh trường là cao nhất và chúng có hoạt tính sinh lý ổn định. Do đó, ta kết thúc quá trình nhân giống để thu nhận sinh khối vào thời điểm này để đạt được hiệu quả kỹ thuật và kinh tế cao nhất. Thông thường thời gian nhân giống từ 30 – 36 giờ. 4.2.4 Thiết bị nhân giống  Nhân giống giai đoạn phòng thí nghiệm: Sau khi chuẩn bị môi trường, tiến hành tiệt trùng môi trường ở 1210C trong 40 phút. Môi trường sau khi tiệt trùng được lắc đều nhằm làm cho môi trường được tơi xốp và làm nguội đến nhiệt độ phòng. Trang 17 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Hình 4.2.4.1: Máy lắc ổn nhiệt (Personal – 11 , TAITEC) Giống được nuôi trên môi trường thạch nghiêng, và giữ ở nhiệt độ phòng.  Nhân giống giai đoạn phân xưởng: Nếu sử dụng thiết bị nhân giống dạng khay – hình hộp chữ nhật (cuvet), sự đảo trộn môi trường sẽ khó thực hiện hoặc không đạt hiệu quả cao. Trong trường hợp sử dụng thiết bị nhân giống dạng hình trụ ngang và có thể quay quanh trục của nó, quá trình đảo trộn môi trường có thể thực hiện một cách tự động và canh trường nuôi đạt được độ đồng nhất cao hơn. 4.3 Chuẩn bị môi trường lên men Để nuôi Aspergillus oryzae 3 – 9 – 15 với mục đích thu – amylase, Fenikxova và Dvatxatova (1959, 1960) chọn môi trường có 65% bột ngô; 0.9% NaNO3; 0.005% MgSO4 và 10% nước chiết mầm mạch (100g/1 lít nước), pH môi trường 6 – 7.  Nguồn glucid:  Ngoài bột ngô, môi trường cần chứa maltose và dextrin.  Các loại đường: Sự có mặt của glucose, fructose và saccharose có tác dụng giúp cho sự phát triển của nấm mốc, nhưng lại hạn chế sự tích tụ amylase. Ngược lại, khi thêm lactose và MgO vào môi trường thì nấm mốc kém phát triển hơn nhưng lại tích tụ nhiều amylase.  Nguồn carbon được vi sinh vật sử dụng để đáp ứng các nhu cầu sinh sản và phát triển: - Cung cấp năng lượng cho vi sinh vật. - Cung cấp các tiền chất cho vi sinh vật. - Tạo các quá trình oxy hóa nhờ vi sinh vật. Trang 18 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng  Các yếu tố khác: Sự tạo thành và tích tụ amylase còn gắn với sự có mặt của các ion Mg2+, Ca2+, và sự có mặt của các nguyên tố phosphor, đặc biệt là magie. - Trong môi trường thiếu MgSO4, amylase hầu như không được tạo thành, hàm lượng MgSO4 cần thiết chỉ vào khoảng 0.005%. Sau magie là phosphor, nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành acid nucleic. Hàm lượng của muối KH2PO4 vào khoảng 0.1 – 0.2%. - Calci có trong thành phần của α – amylase. Mỗi phân tử α – amylase có 2 hoặc 3 ion calci, mà tính chịu nhiệt của enzyme này lại phụ thuộc vào số ion calci có trong phân tử. - Lưu huỳnh cũng đóng vai trò quan trọng không kém. Hoạt độ amylase gắn liền với sự có mặt của nhóm – SH; mặt khác còn tham gia vào thành phần của acid amin cấu thành enzyme. Hàm lượng lưu huỳnh trong canh trường chứa 0.04g/100ml bảo đảm cho hoạt độ amylase cực đại và bằng 360 đơn vị/100ml. Nếu giảm tới 0.004%, hoạt độ amylase của Aspergillus oryzae 3 – 9 – 45 chỉ còn 50% và bằng 180 đơn vị/100ml. - Các nguyên tố vi lượng như đồng, thiếc molipden, borac, mangan, sắt, coban,… làm tăng hoạt độ của nhiều enzyme. 4.4 Tiệt trùng môi trường 4.4.1 Mục đích Bảo quản: vô hoạt enzyme, ức chế vi sinh vật. 4.4.2 Những biến đổi trong quá trình tiệt trùng  Biến đổi vật lý: Sự thay đổi về thể tích, khối lượng, tỉ trọng (nước bốc hơi), … Độ nhớt của dung dịch giảm.  Biến đổi hóa học: Thay đổi tốc độ các phản ứng hóa học (sự oxy hóa vitamin C, các chất màu).  Biến đổi hóa lý: Độ hòa tan tăng, sự bốc hơi nước.  Biến đổi hóa sinh: Enzym bị vô hoạt.  Biến đổi sinh học: Ức chế, tiêu diệt vi sinh vật.  Biến đổi về mặt cảm quan: Sự tổn thất của một số cấu tử mẫn cảm với nhiệt (vitamin, …). 4.4.3 Thiết bị  Dùng thiết bị trao đổi nhiệt dạng bản mỏng. Trang 19 Công nghệ lên men thực phẩm  Thông số công nghệ:  : 1210C.  : 20 – Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng . 4.5 Lên men sinh tổng hợp enzyme Sử dụng phương pháp lên men bề sâu. 1. Thùng trộn môi trường dinh dưỡng. 7. Thùng dịch lên men. 2. Nồi tiệt trùng. 8. Thùng lên men. 3. Thùng chứa. 9. Lọc khí sơ bộ. 4. Van xả. 10. Nén khí. 5. Thiết bị trao đổi nhiệt. 11. Lọc khí bước hai. 6. Bơm ly tâm. 12. Thùng canh trường thành phẩm. Hình 4.5.1: Sơ đồ nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp bề sâu 4.5.1 Mục đích Khai thác: tạo điều kiện cho mốc phát triển đều trên môi trường nuôi cấy để hình thành hệ enzyme amylase. 4.5.2 Các biến đổi xảy ra trong quá trình lên men  Biến đổi vật lý: sự tăng nhiệt độ do quá trình hô hấp của nấm mốc.  Biến đổi hóa sinh: sự tổng hợp enzyme amylase.  Biến đổi sinh học: sự gia tăng sinh khối. Trang 20