HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
HUỲNH VĂN CHƢƠNG
KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ
CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ
VÀ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC
SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
HUỲNH VĂN CHƢƠNG
KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ
CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ VÀ NGHIÊN CỨU
CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC
SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ
Chuyên ngành : Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
Mã số
: 62 64 01 02
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Đinh Thị Bích Lân
2. PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam
HÀ NỘI, 2017
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng để bảo vệ
lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn,
các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 28 tháng 7 năm 2017
Tác giả luận án
Huỳnh Văn Chƣơng
i
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận đƣợc sự
hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng
nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn
sâu sắc tới thầy cô PGS.TS. Đinh Thị Bích Lân, PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam đã tận tình
hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ
môn Bệnh lý, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Miễn dịch học
và vắc xin, Viện Công nghệ sinh học- Đại học Huế đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá
trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án.
Hà Nội, ngày 28 tháng 7 năm 2017
Nghiên cứu sinh
Huỳnh Văn Chƣơng
ii
MỤC LỤC
Lời cam đoan
i
Lời cảm ơn
ii
Mục lục
iii
Danh mục chữ viết tắt
vii
Danh mục bảng
viii
Danh mục hình
ix
Danh mục biểu đồ
xi
Danh mục đồ thị
xi
Trích yếu luận án
xii
Thesis abstract
xiv
PHẦN 1 MỞ ĐẦU
1
1.1
Tính cấp thiết của đề tài
1
1.2
Mục tiêu của đề tài
3
1.3
Phạm vi nghiên cứu
3
1.4
Những đóng góp mới của đề tài
3
1.5
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4
2.1
Giới thiệu về bệnh cầu trùng gà
4
2.1.1
Căn bệnh cầu trùng
4
2.1.2
Đặc điểm dịch tễ
13
2.1.3
Sinh bệnh học
14
2.1.4
Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của gà bị bệnh cầu trùng
15
2.1.5
Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cầu trùng gà
16
2.1.6
Điều trị bệnh cầu trùng gà
18
2.1.7
Miễn dịch chống cầu trùng ở gà
18
2.1.8
Vắc xin phòng bệnh cầu trùng gà
20
2.2
Tổng quan về công nghệ ADN tái tổ hợp
21
2.2.1
Giới thiệu chung về công nghệ ADN tái tổ hợp
21
2.2.2
Đặc điểm của hệ thống vector pET, pGEM-T Easy, tạo dòng và biểu hiện
gene trong E. coli
21
iii
2.3
Công nghệ chế tạo kháng thể lòng đỏ trứng bằng phƣơng pháp gây miễn
dịch cho gà mái
24
2.3.1
Trọng lƣợng phân tử và tính chất lý hóa của IgY (Yolk Immunoglobulin)
24
2.3.2
Cấu trúc của IgY
24
2.3.3
Độ bền của IgY
25
2.3.4
Lợi thế của công nghệ sản xuất IgY
26
2.3.5
Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng gà
27
2.3.6
Những ứng dụng của IgY
28
PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
31
3.1
Địa điểm nghiên cứu
31
3.2
Thời gian nghiên cứu
31
3.3
Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
31
3.3.1
Vật liệu nghiên cứu
31
3.3.2
Thiết bị và hóa chất dùng cho nghiên cứu
31
3.4
Nội dung nghiên cứu
33
3.4.1
Khảo sát các đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà
33
3.4.2
Nghiên cứu tách dòng gene mã hóa kháng nguyên, tạo plasmid mang
gene kháng nguyên, biến nạp vào tế bào E. coli
3.4.3
33
Nghiên cứu biểu hiện gene kháng nguyên, tách chiết, tinh khiết và định
lƣợng kháng nguyên tái tổ hợp
33
3.4.4
Kiểm tra độ tinh khiết và tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp
33
3.4.5
Nghiên cứu sản xuất bột lòng đỏ trứng gà có kháng thể phòng trị bệnh
33
3.5
Phƣơng pháp nghiên cứu
34
3.5.1
Phƣơng pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng và xác định bệnh tích đại thể,
vi thể của gà mắc cầu trùng
34
3.5.2
Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng
34
3.5.3
Phƣơng pháp tách chiết ADN để xác định loài cầu trùng gây bệnh ở gà
35
3.5.4
Phƣơng pháp phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E
35
3.5.5
Nghiên cứu tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên trong vector tạo dòng
và biến nạp vào tế bào vật chủ E. coli TOP10.
3.5.6
Nghiên cứu tạo dòng gene 3-1E trong vector pET200/D-TOPO và biểu
hiện gene kháng nguyên 3-1E
3.5.7
37
39
Phƣơng pháp tách chiết tinh khiết, xác định tính đặc hiệu và định lƣợng
của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp
40
iv
3.5.8
Phƣơng pháp chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh
cầu trùng gà
3.5.9
3.5.10
41
Phƣơng pháp đánh giá hiệu quả phòng và điều trị bệnh cầu trùng của chế
phẩm
42
Phƣơng pháp xử lý số liệu
43
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1
44
Tỷ lệ nhiễm, cƣờng độ nhiễm, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể,
vi thể ở gà mắc cầu trùng
4.1.1
44
Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm cầu trùng gà nuôi tại huyện Phú Vang, Thừa
Thiên Huế
44
4.1.2
Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi ở gà từ 1 đến 42 ngày tuổi
44
4.1.3
Triệu chứng lâm sàng chủ yếu ở gà mắc bệnh cầu trùng
46
4.1.4
Bệnh tích đại thể chủ yếu ở gà mắc bệnh cầu trùng
47
4.1.5
Bệnh tích vi thể chủ yếu ở một số cơ quan của gà mắc bệnh cầu trùng
50
4.2
Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng
54
4.2.1
Một số chỉ tiêu hồng cầu ở gà từ 1-42 ngày tuổi mắc bệnh cầu trùng
55
4.2.2
Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu hệ bạch cầu ở gà mắc bệnh cầu trùng
(35-42 ngày tuổi)
4.2.3
56
Kết quả nghiên cứu hàm lƣợng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầu
trùng (35 - 42 ngày tuổi)
58
4.3
Kết quả phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E
59
4.3.1
Thu và tinh sạch Oocyst cầu trùng gà
59
4.3.2
Xác định loài cầu trùng bằng phƣơng pháp PCR
59
4.3.3
Kết quả tách chiết ARN tổng số
60
4.3.4
Kết quả thực hiện PCR
61
4.3.5
Tinh sạch sản phẩm PCR
62
4.4
Kết quả nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene 3-1E
63
4.4.1
Kết quả tạo dòng gene kháng nguyên 3-1E vào vector tách dòng
63
4.4.2
Phân tích trình tự gene 3-1E
64
4.4.3
Kết quả tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên 3-1E vào vector biểu hiện
pET200/D-TOPO
4.4.4
4.5
66
Kết quả về tinh khiết và khả năng liên kết của kháng nguyên 3-1E cùng
đuôi dung hợp 6His với cột Ni2+
68
Tối ƣu điều kiện biểu hiện của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp
70
v
4.5.1
Kết quả sinh trƣởng của E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp mang gene mã
hóa kháng nguyên 3-1E
70
4.5.2
Kết quả về khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng
71
4.5.3
Kết quả về tỷ lệ tiếp giống tối ƣu
72
4.5.4
Kết quả tốc độ lắc tối ƣu lên khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn E. coli
chủng BL21 (DE3)
73
4.5.5
Kết quả về môi trƣờng biểu hiện tối ƣu
74
4.5.6
Nồng độ tối ƣu của chất cảm ứng IPTG
74
4.5.7
Thời gian cảm ứng của chất cảm ứng tối ƣu
75
4.5.8
Nhiệt độ cảm ứng tối ƣu
76
4.5.9
Mật độ tế bào tối ƣu
77
4.6
Tách chiết, tinh sạch, định lƣợng và xác định tính đặc hiệu của kháng
nguyên 3-1E tái tổ hợp
78
4.6.1
Tách chiết, tinh sạch và định lƣợng kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E
78
4.6.2
Tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp
78
4.7
Chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh cầu trùng gà
79
4.7.1
Xác định liều lƣợng kháng nguyên thích hợp để gây miễn dịch cho gà
79
4.7.2
Nghiên cứu lựa chọn tá chất gây miễn dịch cho gà
80
4.7.3
Định lƣợng kháng thể IgY
81
4.7.4
Xác định hiệu giá kháng thể trong chế phẩm lòng đỏ
82
4.7.5
Đánh giá hiệu quả phòng bệnh của chế phẩm
83
4.7.6
Đánh giá hiệu quả điều trị của chế phẩm
86
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
89
5.1
Kết luận
89
5.2
Kiến nghị
89
Danh mục các công trình đã công bố
91
Tài liệu tham khảo
92
Phụ lục
106
vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
Tiếng Anh
Tiếng Việt
Bp
Base pair
Cặp ba zơ
BSA
Bovine serum albumin
Albumin huyết thanh bò
cDNA
Complementary Deoxyribonucleic acid
Sợi ADN bổ sung
DNA
Deoxyribonucleic acid
A xít Deoxyribonucleic
ELISA
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ
gắn enzyme
HI
Hemagglutination inhibition
Ức chế ngƣng kết hồng cầu
IgY
Yolk Immunoglobulin
Kháng thể long đỏ trứng
IPTG
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside
kDa
Kilo dalton
Kilo dalton
NC
Negative control
Đối chứng âm
OD
Optical density
Mật độ quang học
PBS
Phosphate buffer saline
Dung dịch muối đệm phốt phát
PCR
Polymerase chain reaction
Phản ứng chuỗi trùng hợp
RIA
Radioimmunoassay
Phƣơng pháp miễn dịch phóng
xạ
RT – PCR
Reverse transcription polymerase chain
Phản ứng chuỗi trùng hợp
reaction
phiên mã ngƣợc
SARS
Severe acute respiratory syndrome
Hội chứng viêm phổi cấp tính
SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide
Điện di trên gel polyacrylamide
gel electrophoresis
WSF
Phần hòa tan trong nƣớc
Water soluble fraction
vii
DANH MỤC BẢNG
STT
4.1
Tên bảng
Trang
Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm cầu trùng trên đàn gà tại một số xã của huyện Phú
Vang
44
4.2
Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi của gà
45
4.3
Triệu chứng lâm sàng ở gà mắc bệnh cầu trùng
46
4.4
Kết quả mổ khám gà bị mắc bệnh cầu trùng
48
4.5
Tần suất xuất hiện các giai đoạn phát triển của cầu trùng gà trên tiêu bản vi thể
các cơ quan gà bệnh
50
4.6
Chỉ tiêu hồng cầu ở gà mắc bệnh cầu trùng
55
4.7
Chỉ tiêu hệ bạch cầu của gà mắc bệnh cầu trùng
57
4.8
Hàm lƣợng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầu trùng
58
4.9
Tỷ lệ nhiễm các loài cầu trùng gây bệnh ở gà
60
4.10
Sinh trƣởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên
3-1E ở các môi trƣờng khác nhau
4.11
70
Sinh trƣởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên
3-1E ở các tỷ lệ tiếp giống khác nhau
4.12
Sinh trƣởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên
3-1E ở các tốc độ lắc khác nhau
4.13
73
Kết quả kiểm tra lƣợng kháng thể trong long đỏ trứng của gà đƣợc gây miễn
dịch với kháng nguyên có bổ sung tá chất
4.14
84
So sánh tỷ lệ chết ở gà đƣợc và không đƣợc phòng bệnh bằng kháng thể
kháng kháng nguyên 3-1E
4.16
80
So sánh tỷ lệ mắc bệnh cầu trùng ở gà đƣợc và không đƣợc phòng bệnh bằng
kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E
4.15
73
85
So sánh sinh trƣởng của gà đƣợc không đƣợc phòng bệnh bằng kháng thể
kháng kháng nguyên 3-1E
85
4.17
Lƣợng Oocyst trong phân gà trƣớc và sau điều trị
86
4.18
Tỷ lệ khỏi bệnh của gà sau điều trị
86
4.19
Ảnh hƣởng của kháng thể kháng sinh lên sinh trƣởng của gà
87
viii
DANH MỤC HÌNH
STT
Tên hình
Trang
2.1
So sánh cấu trúc phân tử của IgY gà và IgG thỏ
25
4.1
Gà mắc bệnh cầu trùng, phân lẫn máu, đứng co cụm, mào yếm nhợt nhạt
47
4.2
Gà chết khi bị mắc bệnh cầu trùng
47
4.3
Manh tràng căng phồng đỏ sẫm bên trong có máu
49
4.4
Manh tràng bên trong xuất huyết màu đỏ sẫm
50
4.5
Oocyst cầu trùng, 20x
52
4.6
Chất chứa lẫn máu trong ruột gà mắc cầu trùng, màu đỏ tƣơi, HE 10x
52
4.8
Giai đoạn tiền Schizont của cầu trùng trong ruột gà, HE.40x
53
4.7
Hồng cầu tràn ngập trong ruột gà mắc cầu trùng, HE. 40x
53
4.9
Megatozit và Schizont 2 (liệt tử) trong ruột gà, HE. 40x
54
4.10
Thâm nhiễm bạch cầu ái toan ở hạ niêm mạc ruột của gà mắc cầu
trùng, HE. 40x.
54
4.11
Oocyst thu đƣợc bằng phƣơng pháp phù nổi
59
4.12
Sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho một số loài Eimeria
59
4.13
Ảnh điện di ARN tổng số trên agarose gel 1% có sử dụng
formaldehyde để biến tính.
61
4.14
Ảnh điện di sản phẩm PCR trên agarose gel 1
62
4.15
Ảnh điện di sản phẩm sau tinh sạch trên agarose gel1%
62
4.16
Ảnh nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng chọn lọc
63
4.17
Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm plasmid pGEM T-easy-3-1E trong
chủng E. coli TOP10 trên agarose gel1%
4.18
Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi M13 trên agarose
gel 1%
4.19
64
64
Mức độ tƣơng đồng giữa gene 3-1E đƣợc phân lập với gene 3-1Eđã
đƣợc công bố (AF13613)
65
ix
4.20
Mức độ tƣơng đồng của trình tự amino a xít của kháng nguyên 31E đã phân lập và kháng nguyên 3-1E đã đƣợc công bố
(AAD39362)
65
4.21
Tế bào E. coli BL21 (DE3) mang gene 3-1E
67
4.22
Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm plasmid TOPO-3-1E sau khi tách từ
chủng E. coli BL21 (DE3)
4.23
67
Biểu hiện của protein 3-1E trong E. coli BL21 tái tổ hợp trên gel
SDS-PAGE 15%.
68
4.24
Ảnh tinh sạch và khả năng liên kết giữa đuôi 6xHis với phối tử Ni2+
69
4.25
Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene
mã hóa kháng nguyên 3-1E
4.26
72
Ảnh hƣởng của môi trƣờng lên mức độ biểu hiện kháng nguyên tái
tổ hợp 3-1E
4.27
74
Kết quả biểu hiện kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp ở các nồng độ
IPTG khác nhau
4.28
75
Ảnh hƣởng thời gian cảm ứng của IPTG lên sản xuất kháng nguyên
tái tổ hợp 3-1E
76
4.29
Ảnh hƣởng của nhiệt độ cảm ứng lên sản xuất kháng nguyên 3-E
76
4.30
Ảnh hƣởng của mật độ tế bào trƣớc khi bổ sung chất cảm ứng
77
4.31
Lƣợng kháng nguyên 3-1E thu đƣợc sau khi tinh sạch bằng gel
ProBondTM Nickel-Chelating Resin
78
4.32
Kết quả Western blot kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên 3-1E
79
4.33
Ảnh điện di định lƣợng kháng thể IgY trên gel SDS-PAGE 12%
82
4.34
Bột lòng đỏ trứng sau khi đông khô
83
4.35
Ảnh kết quả ELISA một số mẫu kháng thể IgY3-1E
83
4.36
Oocyst phát triển thành dạng gây nhiễm
84
x
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
STT
4.1.
Tên biểu đồ
Trang
Kết quả kiểm tra lƣợng kháng thể trong trứng của gà đƣợc gây miễn dịch với
các tá chất khác nhau
81
DANH MỤC ĐỒ THỊ
STT
4.1.
Tên đồ thị
Trang
Kết quả ELISA khảo sát lƣợng kháng thể kháng 3-1E
xi
80
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN
Họ và tên nghiên cứu sinh: Huỳnh Văn Chƣơng
Tên luận án: Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu
chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị
Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi;
Mã số: 62 64 01 02
Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của gà mắc bệnh cầu trùng tại Thừa
Thiên Huế và tạo ra chế phẩm sinh học chứa kháng thể IgY đặc hiệu kháng kháng
nguyên 3-1E của cầu trùng gà, sử dụng cho đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh cầu
trùng gà.
Phƣơng pháp nghiên cứu
Luận án sử dụng các phƣơng pháp: Các biểu hiện lâm sàng đƣợc xác định bằng
phƣơng pháp thƣờng quy, thu Oocyst cầu trùng bằng phƣơng pháp phù nổi và kiểm tra trên
kính hiển vi. Tất cả những gà chết do cầu trùng đƣợc mổ khám thu mẫu bệnh phẩm để xác
định bệnh lý đại thể và vi thể, mẫu bệnh phẩm đƣợc cố định trong dung dịch formon 10 ,
tiêu bản vi thể đƣợc làm theo quy trình tẩm đúc parafin và nhuộm bằng HaematoxylinEosin. Một số chỉ tiêu huyết học đƣợc xác định bằng máy tự động Cell Dyn 3700.
ARN tổng số của cầu trùng gà đƣợc phân lập bằng Kit “SV Total RNA Isolation
System (Promega)” tổng hợp sợi ADN bổ sung từ khuôn ARN đƣợc thực hiện bằng Kit
“First Strand cDNA Synthesis (Fermentas) ” và đƣợc sử dụng làm khuôn để khuếch đại
bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (topo3-1E.F: 5’-CACCATGGGTGA AGA
GGC TGA TAC-3’; topo3-1E.R: 5’TTA GAA GCGCCCTGGTACA-3’). Sản phẩm PCR
đƣợc gắn vào vector pGEM-T Easy (Promega), gene 3-1E đƣợc cắt từ vector pGEM-T
Easy/3-1E và tinh sạch bằng Kit “Wizard® SV Gel and PCR CleanUp System (Promega)”,
sau đó gắn vào vector biểu hiện pET200 D-TOPO, phản ứng gắn đƣợc thực hiện ở 4°C
qua đêm.
Mức độ biểu hiện của protein 3-1E đƣợc xác định bằng SDS-PAGE (15% w/v), sau
đó gel đƣợc nhuộm với Coomassie Blue R-250. Protein 3-1E đƣợc tinh sạch bằng Kit
“ProBondTM Puriication System (Invitrogen, USA)”, theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Kết quả chính và kết luận
Gà mắc bệnh cầu trùng biểu hiện các triệu chứng chủ yếu nhƣ: ủ rũ, ít vận động,
xii
tiêu chảy, phân có màng nhầy, có bọt và lẫn máu.
Biến đổi bệnh lý chủ yếu tập trung ở ruột non và manh tràng xuất huyết, manh tràng
căng phồng lên và lớp niêm mạc bị bào mòn. Các tổn thƣơng vi thể nhƣ sung huyết,
xuất huyết nặng, thoái hóa, hoại tử tế bào, thâm nhiễm tế bào viêm tại manh tràng,
ngoài ra cũng có các tổn thƣơng bệnh lý tại hồi tràng và trực tràng. Trên tiêu bản vi thể
quan sát đƣợc các giai đoạn phát triển khác nhau của cầu trùng ở tế bào biểu mô ruột.
Gà mắc bệnh cầu trùng dẫn đến các chỉ tiêu hệ hồng cầu giảm, số lƣợng bạch cầu
tăng, công thức bạch cầu cũng thay đổi, số lƣợng bạch cầu trung tính và ái toan tăng, trong
khi số lƣợng tế bào lympho giảm. Protein tổng số, lƣợng Albumin và tỷ lệ A G đều giảm.
Phân lập đoạn mã hóa gene 3-1E từ Oocyst cầu trùng thu đƣợc đoạn gene có chiều
dài là 513 bp, mã hóa chuỗi polypeptide chứa 170 amino a xít, tƣơng đồng 99
so với
gene3-1E đƣợc công bố trên GeneBank (mã số: AF113613). Phân tích điện di SDS cho
thấy protein dung hợp 3-1E có khối lƣợng phân tử khoảng 26 kDa.
Môi trƣờng nuôi cấy LB cho khả năng sinh trƣởng tốt nhất với tỷ lệ tiếp giống 2
(OD600 = 0,8), lắc 200 vòng phút ở 37ºC sau 11 giờ nuôi cấy. Tuy nhiên, mức độ biểu
hiện của protein dung hợp 6xHis-3-1E lại cho kết quả tốt nhất trên môi trƣờng YJ trong
cùng một điều kiện tối ƣu (nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,8 mM, nuôi lắc ở 200
vòng phút, nhiệt độ cảm ứng 20ºC trong thời gian 10 giờ). Sắc ký lọc gel 6xHis cho
thấy sản phẩm protein dung hợp 6xHis-3-1E có khối lƣợng phân tử khoảng 26 kDa.
Bằng phƣơng pháp đông khô đã thu đƣợc 6-7g bột lòng đỏ từ mỗi quả trứng, sau khi
hoàn nguyên với PBS theo tỷ lệ 1:9 (w w), chế phẩm có hiệu giá kháng thể đặc hiệu đạt
1 280.000. Sử dụng bột lòng đỏ chứa kháng thể kháng 3-1E tái tổ hợp cho kết quả tốt
trong phòng và điều trị bệnh cầu trùng do Eimeria acervulina, Eimeria tenella,
Eimeria maxima ở gà, nhƣ làm giảm tỷ lệ mắc bệnh, giảm tỷ lệ chết, giảm thải Oocyst,
tăng tỷ lệ khỏi bệnh và tăng khả năng sinh trƣởng ở gà.
xiii
THESIS ABSTRACT
PhD candidate: Huynh Van Chuong
Thesis title: Research on pathological characteristics of chicken infected with coccidia
and development of bioproduct for prevention and treatment of coccidiosis in chicken
Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals
Code: 62 64 01 02
Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives
Survey on some mainly pathological characteristics of chicken infected with
coccidiosis in Thua Thien Hue provine and produce a bioproduct containing specific
IgY antibodies against 3-1E antigen of chicken coccidia used in for prevention,
treatment efficacy of coccidiosis in chicken.
Materials and Methods
The clinical parameters were determined by conventional method, Oocyst
isolation by flotation method. All died chickens caused by coccidiosis were slaughtered
to collect the samples for determination of both macroscopic and microscopic
pathological changes. Tissue samples were fixed in 10% neutral buffered formalin and
stained with Haematoxylin- Eosin stain. The change of several hematological
parameters were determined by automated Cell Dyn 3700 sytem.
Total RNA of coccidia was isolated by SV Total RNA Isolation System Protocol
(Promega). First strand cDNA from RNA templates was made First Strand cDNA Synthesis
Kit (Fermentas) and was then used as template in PCR amplification with the specific primers
(topo3-1E.F: 5’-CACCATGGGTGA AGA GGC TGA TAC-3’; topo3-1E.R: 5’TTA GAA
GCGCCCTGGTACA-3’). PCR products (3-1E gene) were ligated into pGEM-T Easy vector
(Promega), The 3-1E gene was cut from pGEM-T Easy/3-1E vector, and purified by
Wizard® SV Gel and PCR CleanUp System Kit (Promega),they were then ligated into
pET200/D-TOPO expression vector, The ligation mix was incubated at 4°C overnight.
Expression levels of 3-1E protein were determined by sodium dodecyl sulfate-15%
polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE, 15% w/v). The gel slice was then stained
with Coomassie Blue R-250. The 3-1E protein was purified by ProBondTM Purification
System kit (Invitrogen, USA), according to the manufacturer’s instructions.
Main findings and conclusions
Chickens infected with coccidia consist of mainly clinical signs such as: droop,
xiv
inactiveness, watery diarrhea with mucus, bloody or creamy exudate feces.
The main macroscopic lesions of infected chickens showed hemorrhagic and huge
necrosis in intestine and caecum, distended caecum and eroded mucosal layer. The
microscopic lesions consisted of severe hemorrhage, necrosis, degeneration of epithelial
cells, inflammatory infiltrations in caecum, on the other side, pathogenic characteristics
could also be observed in ileum and rectum. The different stages of coccidia were also
observed in the epithelial cells.
Erythro-system parameters decreased, leukocytes number increased and its formula
was changed, number of neutrophils and eosinophils increased, in case of lymphocytes
decreased. The protein total of serum, its formula and A/G ratio were decreased.
We cloned and expressed a gene coding 3-1E antigen from Eimeria isolated from
Thua Thien Hue province, Vietnam. The open reading frame of 3-1E gene has 513 bp in
length, encoding a polypeptide chain with 170 amino acid residuces. Homology search
showed that our 3-1E gene is 99% similarity with 3-1E gene of Genebank (accession
number: AF113613). SDS electrophoresis showed that expression of the 3-1E gene in
E. coli BL21 (DE3) produced a fusion protein with molecule of ~26 kDa.
Improvement of the recombinant antigen expression level in E. coli strain BL 21
Star TM (DE3) encoding gene 3-1E of Eimeria was conducted. The result showed that
LB medium has given the best growth of E. coli BL 21 (DE3) in comparison with other
media in the same 2% initial seed inoculum size (OD600 = 0.8), shaking 200 rpm at
37oC for 11hrs. However, the highest level of fusion protein (6xHis-3-1E) was obtained
from YJ medium in the same optimum culture condition (0.8 mM IPGT-Isopropyl β-D1-thiogalactopyranoside for 10hrs at 20oC). Molecular weight of purified 6xHis-3-1E
protein from 6xHis affinity chromatography was about 26 kDa.
By using lyophilized method, 6-7g of powder from 1 egg, after reverting with PBS
(1: 9, w/w) the solution presented specific antibody titer reaching 1/128.000. Using egg
yolk powder containing antibodies against recombinant 3-1E antigen showed good
results in prevention and treatment of coccidiosis that caused by E. acervulina, E.
tenella, E. maxima in chicken, such as: reducing morbidity, mortality, Oocyst shedding
as well as increasing recovery rate and growth performance.
xv
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Bệnh cầu trùng gà là nguyên nhân chính gây thiệt hại lớn cho ngành chăn
nuôi gia cầm (Allen and Fetterer, 2002). Trên toàn thế giới hàng năm ƣớc tính
thiệt hại trên 2 tỷ USD (Williams, 1998). Bệnh có khả năng lây lan rất nhanh, tỷ
lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao ở gà con (30 - 100 ), làm tăng số gà còi cọc, giảm
tốc độ tăng trƣởng cho toàn đàn, giảm sản lƣợng trứng ở gà đẻ từ 20 - 40%, giảm
chất lƣợng thịt và tăng tiêu tốn thức ăn (Edgar, 1955; Tyzzer, 1932). Bệnh gây ra
bởi ký sinh trùng đơn bào (Protozoa), thuộc phân lớp Coccidia, họ Eimeriidae và
chi Eimeria (Finlay et al., 1993; Lillehoj and Lillehoj, 2000). Gà ở tất cả các lứa
tuổi đều có thể nhiễm cầu trùng, trong đó thƣờng gặp nhất là gà ở giai đoạn 2- 3
tuần tuổi (Lillehoj and Lillehoj, 2000; Lillehoj et al., 2004).
Hiện nay có nhiều loài Eimeria gây bệnh trên gà, trong đó có 7 loài gây bệnh
chủ yếu: E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. brunetti,
E. praecox và E. mitis (Shirley, 1986). Mỗi một loài Eimeria khác nhau có vị trí gây
bệnh khác nhau trong đƣờng tiêu hóa (Nguyễn Hữu Hƣng, 2010; Fanatico, 2006).
Cho đến nay, để phòng trị bệnh cầu trùng ngƣời chăn nuôi chủ yếu dùng
kháng sinh bổ sung vào trong thức ăn và nƣớc uống. Tuy nhiên, phƣơng pháp
này còn nhiều hạn chế nhƣ: Xuất hiện một số chủng Eimeria có khả năng kháng
kháng sinh (Chapman, 1997), tạo ra một loại thuốc mới đòi hỏi chi phí cao
(Lillehoj and Lillehoj, 2000), bổ sung kháng sinh kéo dài dẫn đến tồn dƣ trong
sản phẩm gia cầm làm ảnh hƣởng đến ngƣời tiêu dùng. Vì vậy, tạo ra các chế
phẩm có tác dụng phòng và trị bệnh cầu trùng, thay thế kháng sinh là nhu cầu cấp
bách của thực tiễn.
Protein 3-1E là một kháng nguyên bề mặt có khung đọc mở dài 513 bp, mã
hóa đoạn polypeptide dài 170 amino a xít với khối lƣợng phân tử là 18.523 kDa,
tồn tại ở giai đoạn Sporozoite và Merozoite của một số loài nhƣ E. acervulina,
E.tenella, E. maxima. Đã có những nghiên cứu sử dụng kháng nguyên 3-1E tái tổ
hợp làm vắc xin chống lại E. acervulina, E. tenella và E. maxima (Lillehoj et al.,
2000). Tiêm chủng bằng vắc xin ADN dựa trên gene 3-1E cũng gây đƣợc đáp
ứng miễn dịch chống lại cầu trùng gà (Lillehoj et al., 2000; Ma et al., 2011).
1
Áp dụng công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp
3-1E và dùng kháng nguyên này để gây tối miễn dịch cho gà sẽ tạo đƣợc kháng
thể có khả năng chống lại đồng thời nhiều loài cầu trùng. Đây là lợi thế của
phƣơng pháp tiếp cận mới có áp dụng công nghệ cao so với các phƣơng pháp
tách chiết kháng nguyên truyền thống.
Công nghệ chế tạo kháng thể truyền thống dùng cho điều trị bệnh ở ngƣời
và động vật thƣờng sử dụng các gia súc lớn nhƣ ngựa, cừu. Tuy nhiên, công nghệ
này có nhƣợc điểm là kích thƣớc động vật lớn, đòi hỏi lƣợng kháng nguyên để
gây miễn dịch phải nhiều, để có kháng thể phải lấy máu động vật tách huyết
thanh hoặc huyết tƣơng rồi tinh chế kháng thể với qui trình chế tạo phức tạp, việc
lấy máu động vật không đƣợc thƣờng xuyên dẫn đến sản lƣợng kháng thể thu
đƣợc từ mỗi cá thể động vật không nhiều (Hoàng Ngọc Hiển và Nguyễn Văn
Việt, 1998; Lê Thu Hồng, 2004).
Loài gà có khả năng sinh kháng thể tƣơng tự nhƣ động vật có vú. Trong số
các kháng thể trong máu gà mái có một lớp kháng thể đƣợc chuyển qua và tích tụ
trong lòng đỏ trứng, đƣợc gọi là IgY (yolk immunoglobulin). Muốn sản xuất
kháng thể IgY chỉ cần gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch trứng. Gà mái ở độ
tuổi đẻ ổn định, việc thu hoạch trứng đƣợc thực hiện hàng ngày với lƣợng kháng
thể thu đƣợc từ mỗi quả trứng rất lớn so với kích thƣớc của gà mẹ. Kỹ thuật tách
chiết tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng cũng tƣơng đối đơn giản, từ đó công nghệ
chế tạo IgY bằng cách gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch kháng thể từ lòng
đỏ trứng do gà đẻ ra trở nên đặc biệt hấp dẫn cho yêu cầu sản xuất lƣợng lớn
kháng thể sử dụng cho chẩn đoán và điều trị bệnh ở động vật cũng nhƣ cho ngƣời
(Dias da Silva and Tambourgi, 2010; Schade et al., 2005).
Kháng thể lòng đỏ trứng gà đã đƣợc nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu và
hiệu quả của nó trong phòng và trị bệnh nhiều bệnh truyền nhiễm đã đƣợc chứng
minh. Mặt khác, kháng thể lòng đỏ có giá thành thấp, dễ bảo quản, có độ an toàn
và tính đặc hiệu cao, đặc biệt là chỉ tác động lên mầm bệnh, không ảnh hƣởng
đến vi sinh vật có lợi trong cơ thể, không gây ra hiện tƣợng kháng thuốc và
không làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng của thực phẩm. Bên cạnh đó việc dùng
kháng thể trong phòng và điều trị bệnh là một giải pháp đƣợc lựa chọn hàng đầu
trong định hƣớng phát triển của ngành chăn nuôi, để hạn chế lạm dụng kháng
sinh trong phòng trị bệnh ở vật nuôi.
2
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Xác định đƣợc các đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà trên đàn gà
đƣợc nuôi tại Phú Vang- Thừa Thiên Huế.
Sản xuất đƣợc kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E làm nguyên liệu tạo kháng thể
kháng cầu trùng gà.
Xác định đƣợc hiệu quả phòng trị bệnh cầu trùng gà của chế phẩm sinh học
chứa kháng thể IgY đặc hiệu kháng kháng nguyên 3-1E.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Về thời gian: Các nghiên cứu đƣợc thực hiện từ 2012-2015, tại Viện công
nghệ sinh học- Đại học Huế và Bộ môn bệnh lý, Khoa thú y- Học viện Nông
nghiệp Việt Nam.
Về không gian: Đề tài tiến hành khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh
cầu trùng ở gà Tre nuôi thịt tại địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế và nghiên cứu chế
tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị.
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Kết quả luận án cho thấy triệu chứng lâm sàng, tổn thƣơng đại thể, vi thể và
thay đổi các chỉ tiêu huyết học của gà Tre mắc bệnh cầu trùng tại thừa Thiên
Huế. Đồng thời, xuất phát từ lợi thế của công nghệ sản xuất globulin miễn dịch
từ lòng đỏ trứng (kháng thể IgY), từ nhu cầu có các chế phẩm kháng thể đặc hiệu
thay thế cho thuốc kháng sinh chống lại bệnh cầu trùng gà. Đề tài đƣợc tiến hành
để tạo ra một chế phẩm sinh học có chứa kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên
3-1E của cầu trùng gà. Điểm mới trong nghiên cứu này là ứng dụng công nghệ
sinh học để tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E và gây miễn dịch cho gà mái đẻ.
Sau đó thu trứng có chứa kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên 3-1E. Thành
công trong nghiên cứu này là đã chế tạo đƣợc bột lòng đỏ trứng có chứa kháng
thể kháng kháng nguyên 3-1E của cầu trùng gà và sử dụng trong phòng và điều
trị bệnh cho kết quả tốt nhƣ: Làm giảm tỷ lệ mắc bệnh, giảm tỷ lệ chết, giảm thải
Oocyst, tăng tỷ lệ khỏi bệnh và tăng khả năng sinh trƣởng của gà.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Đây là một công trình nghiên cứu trong lĩnh vực sinh học phân tử để tạo ra
kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E, làm nguyên liệu cho việc sản xuất kháng thể để
phòng và điều trị bệnh cầu trùng cho gà, góp phần làm giảm thiệt hại kinh tế và nâng
cao hiệu quả cho ngành chăn nuôi gia cầm.
3
- Xem thêm -