Tài liệu Khóa luận tìm hiểu quy trình phát hiện vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM       KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐÔNG LẠNH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ VI SINH Sinh viên thực hiện MSSV: 0811110055 : Phạm Thị Bích Ngọc Lớp: 08CSH1 TP. Hồ Chí Minh, 2011 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, khóa luận tốt nghiệp “Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu sử dụng trong khóa luận là trung thực và có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng. Nội dung khóa luận có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các sách, tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu của khóa luận. Sinh viên thực hiện Phạm Thị Bích Ngọc SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc  i Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................1  1.1. Đặt vấn đề .........................................................................................................1 1.2. Mục đích ...........................................................................................................2 1.3. Mục tiêu đề tài ..................................................................................................2 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN ....................................................................................3 2.1. Vai trò của thủy hải sản, tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới .....................................................................................................................3 2.1.1. Vai trò của thủy hải sản trong đời sống con người....................................3 2.1.2. Tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới.................4 2.2. Giới thiệu về Vibrio spp...................................................................................7 2.2.1. Lịch sử phát hiện Vibrio spp. ...................................................................7 2.2.2. Phân loại Vibrio spp và phân bố...............................................................9 2.2.2.1. Phân loại Vibrio spp ...........................................................................9 2.2.2.2. Phân bố .............................................................................................10 2.2.3. Đặc điểm hình thái Vibrio spp. ...............................................................10 2.2.3.1. Đặc điểm chung ................................................................................10 2.2.3.2 Đặc điểm của từng loài....................................................................11 2.2.4. Cấu trúc Vibrio spp. ................................................................................14 2.2.5. Yếu tố độc lực ...........................................................................................15 2.2.6. Cơ chế gây bệnh ......................................................................................18 2.2.7. Triệu chứng gây bệnh.............................................................................21 2.2.7.1. Trên người.........................................................................................21 2.2.7.2 Trên động vật .....................................................................................23 2.2.8. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh ở Việt Nam và trên thế giới ...................................................................................24 2.2.8.1. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh ở Việt Nam.......................................................................................................24 SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc ii Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh 2.2.8.2. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh trên thế giới .....................................................................................................24 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐÔNG LẠNH ...........................................................................................................26 3.1. Phương pháp truyền thống.............................................................................26 3.1.1. Phương pháp định tính............................................................................26 3.1.1.1. Nguyên tắc. .......................................................................................26 3.1.1.2. Thiết bị và dụng cụ............................................................................26 3.1.1.3. Môi trường và hóa chất ....................................................................26 3.1.1.4. Quy trình phân tích. ..........................................................................28 3.1.1.5. Thuyết minh quy trình .......................................................................29 3.2. Phương pháp hiện đại ....................................................................................42 3.2.1. Phương pháp miễn dịch học – Elisa (Enzyme Linked mmunosorbent Assays)................................................................................................................42 3.2.1.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) ......................................................43 3.2.1.2. Sandwich ELISA................................................................................44 3.2.1.3. ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA) ...........................................45 3.2.2. Kỹ thuật PCR chuẩn (Polymerase Chain Reaction) ...............................46 3.2.2.1 Nguyên tắc ........................................................................................47 3.2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR ...................................................47 3.2.3. Kỹ thuật PCR phức ( Multiplex PCR ) ...................................................51 3.2.4. Kỹ thuật DNA microarray ......................................................................52 3.2.4.1. Vật liệu và phương pháp...................................................................53 3.2.4.2. Các bước thực hiện ..........................................................................54 3.2.5. Kỹ thuật RAPD ........................................................................................54 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................59 PHỤ LỤC..................................................................................................................61 SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc iii Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADH: Antidiuretic hormone APW :Canh pepton kiềm Alkaline Peptone Water cDNA: Complementary Acid Deoxyribo Nucleic DNA: Acid Deoxyribo Nucleic ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assays EU: Liên minh Châu Âu FDA: Food and Drug Administration HACCP: Hazard Analysis and Critical Control Points HLG :Canh Hugh Leifson Glucose KCN:Khu công nghiệp KI:Thạch Kligler Iron KIA: : Klingler Iron Agar KL: Khuẩn lạc KNXK: Kiêm ngạch xuất khẩu LDC: Linguistic Data Consortium NAFIQAVED: Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng NST: Nhiễm sắc thể NTTS: Nuôi trồng thủy sản OPNG: o-nitrophenyl-D-galactoside ORF: Open reading frame PCA: Polymerase Chain Reaction TCBS :Thạch Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose TSA: Thạch Tryptone Soya TSI: Triple Sugar Iron agar WHO: Tổ chức Y tế Thế giới SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc iv Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Kim ngạch xuất khẩu thủy sản Việt Nam qua các thời kỳ ..................... 4 Bảng 2.2: Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam vào thị trường EU............................. 4 Bảng 2.3: So sánh khả năng gây bệnh của các nhóm vi khuẩn tả............................ 19 Bảng 2.4: Các loài Vibrio bị cho là gây bệnh ở người............................................. 20 Bảng 3.1. Các đặc điểm sinh hóa của Vibrio cholerea và Vibrio parahaemolyticus.......................................................................................... 31 Bảng 3.2. Phân biệt V. cholerae O1 và V. cholerae non - O1 ................................. 41 Bảng 3.3. Phân biệt các kiểu huyết thanh chủng V.choleraeO1 .............................. 41 SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc v Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1: Vibrio harvey........................................................................................... 9 Hình 2.2: V.parahaemolyticus.................................................................................. 12 Hình 2.3: V.cholerae ................................................................................................ 13 Hình 2. 4: V. vulnificus............................................................................................. 13 Hình 2.5: Vi Khuẩn tả Vibrio cholerae.................................................................... 19 Hình 2.6: Cơ chế gây bệnh của Vibrio bên trong cơ thể con người......................... 21 Hình 2.7: Bệnh nhân bị dịch tả................................................................................. 22 Hình 2.8: Đuôi tôm sú bị mòn cụt do nhiễm vi khuẩn Vibrio……………………...23 Hình 2.9: Lớp vỏ kitin của tôm mềm và có màu xanh............................................. 23 Hình 3.1: Phân lập Vibrio trên CHROMagar........................................................... 29 Hình 3.2: Phân lập Vibrio trên môi trường MacConkey.......................................... 30 Hình 3.3: Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio spp trên môi trường TCBS……………..30 Hình 3.4: Kết quả thử nghiệm TSI/ KIA.................................................................. 32 Hình 3.5: Vibrio cholerae ........................................................................................ 33 Hình 3.6: Phát hiện vi sinh vật hiếu khí có lên men carbohydrate .......................... 35 Hình 3.7: Phát hiện vi sinh vật kỵ khí có lên men carbohydrate ............................. 35 Hình 3.8: Kết quả thử nghiệm carbohydrate............................................................ 36 Hình 3.9: Kết quả thử nghiệm decarboxylase/dehydrolase ..................................... 37 Hình 3.10:Kết quả thử nghiệm Urea ........................................................................ 38 Hình 3.11: Cơ chế thử nghiệm ONPG……………………………………………..38 Hình 3.12: Hình thử nghiệm ONPG ........................................................................ 39 Hình 3.13: ELISA gián tiếp. .................................................................................... 44 Hình 3.14: Các bước trong Sandwich ELISA.......................................................... 45 Hình 3.15: ELISA cạnh tranh................................................................................... 46 Hình 3.16: Các giai đoạn trong phản ứng PCR........................................................ 48 SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc vi Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng, các chất dinh dưỡng cần thiết để con người sống và phát triển. Thế nhưng thực phẩm cũng là nguồn truyền bệnh nguy hiểm, nếu như không bảo đảm được vệ sinh và an toàn. Vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP) là vấn đề xã hội đang được rất nhiều người quan tâm, bởi lẽ VSATTP tác động trực tiếp đến sức khỏe cũng như chất lượng cuộc sống con người và ảnh hưởng đến chất lượng phát triển của xã hội và nòi giống. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hiện có hơn 400 căn bệnh lây truyền qua thực phẩm không an toàn. VSATTP đã được đặt lên hàng đầu nghị trình tại nhiều hội nghị y tế và sức khỏe cộng đồng toàn cầu, nhưng tình hình gần như không được cải thiện bao nhiêu, nhất là khi thế giới liên tiếp xảy ra thiên tai và nguồn nước sạch ngày càng hiếm. Khi người dân không có đủ miếng ăn thì việc kiểm tra chất lượng những gì mà họ ăn đã trở thành điều khá xa vời. Tiến sĩ Margaret Chan, Tổng Giám đốc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cho biết mỗi tháng Liên hiệp quốc nhận được khoảng 200 báo cáo từ 193 quốc gia về các trường hợp thực phẩm bị nhiễm độc. Chất lượng VSATTP hiện nay rất đáng lo ngại, đã được rất nhiều các phương tiện thông tin đại chúng phản ánh. Việc sử dụng không an toàn về phân bón, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc tăng trọng, kháng sinh, hóa chất trong chăn nuôi trồng trọt nông nghiệp, thủy hải sản hiện nay còn khá phổ biến. Có rất nhiều nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, nhưng chủ yếu là người bị ngộ độc đã hấp thu phải thực phẩm độc hại, ví dụ ăn thức ăn đã bị ôi thiu, thức ăn chế biến không hợp vệ sinh, không đạt yêu cầu hoặc do bảo quản không tốt. Khi đó, các loại vi sinh vật (vi khuẩn, virus), nấm mốc và ký sinh vật có điều kiện hoành hành. Vi sinh vật là yếu tố cơ bản gây ra ô nhiễm, mất vệ sinh an toàn thực phẩm và có tới gần 50% trường hợp bị ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật. Trong nhóm vi sinh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc  1 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh vật nguy hiểm thì các vi khuẩn chủng Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, Vibrio spp, E. Coli và Listeria là đáng sợ nhất. Một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm đáng lo ngại nhất hiện nay đó là ngộ độc do nhóm vi khuẩn tả Vibrio spp gây ra trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh (tôm, cá, mực…). Chúng có thể nhiễm vào thực phẩm thủy hải sản bất kỳ lúc nào và được xem là nguồn gốc gây ngộ độc nghiêm trọng trên thế giới. Vibrio spp gây bệnh dịch tả ở người, độc tố của vi khuẩn này gây tiêu chảy nặng và mất nước. Bệnh tả do vi khuẩn này gây ra có khả năng bùng phát thành đại dịch trong thời gian rất ngắn và trên phạm vi rất rộng. Dịch tả tấn công vào nước Anh vào năm 1848 – 1848 làm hơn 70.000 người chết, đại dịch năm 1854 đã cướp đi 1/8 dân số thành phố London. Dịch tả vào Peru vào năm 1991, lan truyền sang Ecuador, Colombia, Mexico và Nicaragua kết quả hơn 12.000 người chết. Nếu hiểu biết đúng và kịp thời chúng ta có thể ngăn ngừa nguồn lây nhiễm để bảo vệ mình và cộng đồng xung quanh. Xuất phát từ thực trạng trên, được sự chấp nhận của Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, chúng tôi xin tiến hành thực hiện khóa luận “Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh”. 1.2. Mục đích Nghiên cứu, đi sâu tìm hiểu về vi khuẩn Vibrio spp và đưa ra một số phương pháp xác định vi khuẩn Vibrio spp. 1.3. Mục tiêu đề tài • Khảo sát về cấu trúc của Vibrio spp. • Khảo sát về sự phân bố của Vibrio spp. • Tình hình nhiễm Vibrio spp trong sản phẩm thủy sản trên thế giới và Việt Nam hiện nay. • Một số phương pháp xác định Vibrio spp. SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 2 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 2.1. Vai trò của thủy hải sản, tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới 2.1.1. Vai trò của thủy hải sản trong đời sống con người Trong những năm qua, ngành thủy sản luôn khẳng định là ngành kinh tế mũi nhọn có những đóng góp quan trọng cho sự phát triển kinh tế - xã hội nước nhà. Tạo công ăn việc làm cho hàng trăm ngàn lao động, cung cấp thực phẩm thủy sản cho đời sống người dân, và đang phấn đấu trở thành ngành sản xuất hàng hóa lớn, sản phẩm thủy sản có sức cạnh tranh cao trên thị trường để tiếp tục phát triển nhanh, ổn định và bền vững. Thực phẩm thuỷ hải sản còn giữ vai trò an ninh lương thực quốc gia và góp phần xoá đói giảm nghèo. Thực phẩm thuỷ hải sản được đánh giá là nguồn cung cấp chính đạm động vật cho người dân Việt Nam. Năm 2001, mức tiêu thụ trung bình mặt hàng thuỷ sản của mỗi người dân Việt Nam là 19,4 kg, cao hơn mức tiêu thụ trung bình sản phẩm thịt heo (17,1 kg/người) và thịt gia cầm (3,9 kg/người). Số lao động của ngành thuỷ sản tăng liên tục từ 3,12 triệu người (năm 1996) lên khoảng 3,8 triệu người năm 2001 (kể cả lao động thời vụ), như vậy, mỗi năm tăng thêm hơn 100 nghìn người. Xuất khẩu thực phẩm thủy hải sản cũng góp phần giúp các quốc gia khác bù đắp lượng thiếu hụt về lương thực, thực phẩm. Kim ngạch xuất khẩu toàn ngành nông nghiệp Việt Nam năm 2008 là 16,237 tỷ USD (Nông sản: 8,42 tỷ; Thủy sản: 4,502 tỷ; Lâm sản: 2,996 tỷ). Trong những mặt hàng xuất khẩu của Việt Nam thì thủy sản luôn đứng ở vị trí cao. Trong số các nước có kim ngạch xuất khẩu thủy sản lớn thì Việt Nam là nước có tốc độ tăng nhanh nhất. Tỷ lệ tăng trưởng trung bình thời kỳ 1992 - 2003 là 20,4%, mức tăng bình quân năm đạt 9,97%. Đến năm 2003, Việt Nam đứng thứ 7 trong số các nước xuất khẩu thủy sản lớn nhất thế giới. Năm 1992 xuất khẩu thủy sản đạt 308 triệu USD, nhưng tới năm 2003 là 2,2 tỷ USD; năm 2005 vượt mức 2,5 tỷ USD và dự tính đến năm 2006 kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 2,8 tỷ USD. SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 3 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh Bảng 2.1: Kim ngạch xuất khẩu thủy sản Việt Nam qua các thời kỳ (đơn vị: triệu USD) Năm 1992 1996 2000 2001 2002 2003 2005 KNXK 308 697 1479 1778 2023 2200 2500 126,3 112,2 20,2 13,8 8,7 13,6 % tăng so với năm trước Nguồn: Trung tâm tin học- Bộ Thuỷ sản. Bảng 2.2: Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam vào thị trường EU Năm 2000 Kim ngạch 71,8 2001 90,7 2002 73,7 2003 116,7 2004 2005 231,5 367,3 73.459,2 110.911,2 (triệu USD) Khối 20.290,8 26.659,1 28.612,8 38.186,8 lượng(tấn) Nguồn: Trung tâm tin học- Bộ Thuỷ sản 2.1.2. Tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới Trong những năm qua, ngành thủy sản đã có những bước chuyển biến hết sức căn bản về công tác quản lý an toàn vệ sinh trong khu vực chế biến để đáp ứng các yêu cầu ngày càng cao về chất lượng sản phẩm thủy sản của các thị trường. Số lượng nhà máy chế biến thuỷ sản được cấp chứng nhận HACCP cũng như số doanh nghiệp được phép xuất khẩu thuỷ sản sang các thị trường tăng lên. Số lượng các lô hàng bị nhiễm hoá chất, dư lượng kháng sinh đã giảm đi rất nhiều so với các năm trước đây. SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 4 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh • Ở Việt Nam Trong 3 tháng đầu năm 2006, thuỷ sản xuất khẩu qua kiểm tra chất lượng đạt 84.800 tấn, tăng 15% so với cùng kì năm trước trong đó khối lượng hàng kiểm tra chứng nhận chất lượng các chỉ tiêu dư lượng kháng sinh, hoá chất là 54.400 tấn, chiếm 62,27%. Hàng xuất khẩu qua kiểm tra chiếm tỷ trọng lớn vẫn là thị trường EU (30%), Nhật Bản (17%), Mỹ (12%). Các trung tâm vùng cũng đã cấp 25 giấy chứng nhận xuất khẩu cho 337,35 tấn tôm xuất khẩu vào Mỹ, 17 giấy chứng nhận tôm không thu hoạch cho xuất khẩu tôm vào thị trường Oxtraylia. Chất lượng hàng thuỷ sản qua kiểm tra chất lượng chứng nhận ổn định. Trong 6 tháng đầu năm 2006, tổng sản lượng đạt 1.697.300 tấn bằng 49,34% kế hoạch năm 2007 và 108,1% so với cùng kì năm trước, xuất khẩu đạt 1,409 tỷ USD, bằng 50,32% so với kế hoạch, và tăng 29,03% so với cùng kì năm trước trong đó thị trường Nhật Bản chiếm 23,31%; EU: 23,26%; Mỹ: 18,21%, hai sản phẩm chính là tôm và cá trong đó tôm chiếm 38,3% và cá chiếm 37,4% tỷ trọng xuất khẩu thuỷ sản. Chất lượng hàng thuỷ sản Việt Nam đã được cải thiện rất nhiều và đang dần ngang tầm với các nước lớn trên thế giới. Tuy nhiên, bên cạnh những thành tựu đạt được của ngành thủy sản về sản lượng sản xuất, giá trị thủy sản, kim ngạch xuất khẩu thì hiện nay ngành thủy sản còn tồn tại những yếu kém chất lượng sản phẩm thủy sản Chất lượng và an toàn vệ sinh nguyên liệu thủy sản vẫn chưa đáp ứng được các yêu cầu ngày càng cao của thị trường, công tác quản lý đối với khu vực sản xuất và thương mại ở khâu trước chế biến thể hiện nhiều bất cập. Hậu quả là chất lượng sản phẩm thủy sản của Việt Nam chưa ngang tầm với thế giới, xuất khẩu tuy vẫn tăng hàng năm nhưng tỷ lệ tăng trưởng không ổn định và tiềm ần nhiều nguy cơ. Hiện nay vấn đề lớn nhất đối với chất lượng sản phẩm thuỷ sản Việt Nam đó là nguyên liệu thuỷ sản có lẫn tạp chất hoá học và việc sử dụng các loại hoá chất, kháng sinh trong nguyên liệu thuỷ sản. SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 5 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh Về thực trạng thuỷ sản nhiễm tạp chất vào nguyên liệu thuỷ sản. Đã xuất hiện hoạt động gian lận thương mại nhằm kiếm lời bất chính từ năm 1983- 1995, bắt đầu từ việc đưa đinh hoặc chì vào thân tôm tại 3 tỉnh Sóc Trăng, Cà Mau, Bạc Liêu. Vào những năm 1996- 1997 tình trạng bơm các loại chất lỏng vào nguyên liệu tôm bắt đầu xuất hiện và lan nhanh đến mức trở thành phổ biến ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long. Đầu năm 2005, thị trường EU đã phát hiện 30 lô hàng bị nhiễm malachite green và leucomalachite green, 2 lô hàng nhiễm fluoroquinolone; thị trường Canada phát hiện 48 lô hàng nhiễm malachite green và leucomalachite, 5 lô hàng nhiễm fluoroquinolone. Tại thị trường Hoa Kì, qua kiểm tra của Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho thấy hàng thuỷ sản nhập khẩu từ Việt Nam có tỷ lệ nhiễm hoá chất, kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng. Đến tháng 11/2005 đã có 9 lô hàng nhiễm chloramphenicol, 7 lô hàng nhiễm malachite green và leuco malachite green, 7 lô hàng nhiễm fluoroquinolone. Đến cuối năm 2005, chất lượng các lô hàng xuất khẩu đã được cải thiện. Tuy nhiên, số lô hàng đi EU vẫn được duy trì kiểm soát dư lượng kháng sinh chloramphenicol (CAP), nitrfurans (NTRs) và malachite Green (MR), leucomalachite green (LMG). Tại thị trường Hoa Kì, thông qua hoạt dộng kiểm tra chứng nhận đối với các lô hàng thuỷ sản xuất khẩu vào Mỹ, NAFIQAVED đã thực hiện kiểm tra 995 lô hàng (14.473 tấn) phát hiện 12 lô không đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm xuất khẩu, chủ yếu do bị phát hiện dư lượng MG, LMG, CAP, trong đó có 3 lô cá basa, 9 lô tôm đông lạnh. Tại thị trường Canada, NAFIQAVED đã thực hiện kiểm tra và cấp giấy chứng nhận đẻ xuất khẩu vào Canada cho 191 lô hàng (2,739 tấn) và phát hiện 1 lô tôm đông lạnh có chứa dư lượng CAP. Qua thực trạng về chất lượng thuỷ sản nói trên có thể thấy chất lượng thuỷ sản Việt Nam nhìn chung chưa đáp ứng được các tiêu chuẩn về chất lượng của các thị trường tiêu thụ, thuỷ sản cung cấp chưa đem lại lòng tin với các nhà nhập khẩu. Đó là còn tồn tại nhiều lô hàng còn dư lượng kháng sinh, hoá chất… những chất được coi là ảnh hưởng tới sức khoẻ người tiêu dùng. SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 6 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh • Trên thế giới Theo dự báo của Trung tâm Thuỷ sản Thế giới, đến năm 2020, các nước đang phát triển sẽ chiếm tới 77% tổng tiêu thụ thuỷ sản toàn cầu và 79% tổng sản lượng thuỷ sản thế giới. Như vậy là, từ năm 1997 đến năm 2020, tiêu thụ thuỷ sản ở các nước đang phát triển sẽ tăng từ 62,7 triệu tấn lên 98,6 triệu tấn (57%), trong khi các nước phát triển sẽ chỉ tăng 4%, từ 28,1 triệu tấn lên 29,2 triệu tấn. Tại Canada, người dân sống ven sông và vùng duyên hải thường có thú đào vớt nghêu sò. Tuy nhiên ít người ý thức rằng các loại thủy sản này đôi khi là mối đe dọa về sức khỏe. Cũng như bất cứ loài thủy sản nào khác, sò ốc cũng có thể bị nhiễm bởi các loại vi khuẩn như E. coli spp, Salmonella spp, Vibrio vulniculus, Vibrio parahaemolyticus và các loại virus như virus Norwalk( Norovirus) và virus bệnh viêm gan A. Hiện nay, bệnh tả vẩn còn xuất hiện trên thế giới quanh năm với số bệnh nhân nhỏ hơn. Năm 2005, có 131.943 trường hợp bệnh xãy ra trong 52 quốc gia trên thế giới được báo cáo với tổ chức Y Tế Quốc Tế. 94% trường hợp bệnh xãy ra ở những quốc gia Phi Châu nghèo khổ. Năm 1992, một trận dịch hoàn toàn bất ngờ của một thể bệnh giống như dịch tả, gây bởi Vibrio cholerae nhóm O139. Bệnh khởi phát ở Madras, Ấn Độ và lan ra theo vịnh Bengal thuộc Bengladesh. Sau đó, dịch lan ra toàn Á Châu và vài trường hợp xâm nhập vào các quốc gia đã phát triển do người bệnh mang vào. 75% nguyên do dịch tả do sự yếu kém về vệ sinh phòng dịch liên quan đến nguồn nước được người dân sử dụng và kiểm soát thực phẩm hải sản tươi sống, và 25% do thói quen xấu của người dân tại địa phương về cách ăn uống. 2.2. Giới thiệu về Vibrio spp. 2.2.1. Lịch sử phát hiện Vibrio spp. Người ta cho rằng bệnh tả xuất hiện tại châu Á từ 600 năm trước Công nguyên. Bệnh tả được ghi nhận lần đầu tiên trong y văn vào năm 1563 tại Ấn Độ. Trận “đại chiến” đầu tiên của dịch tả với con người vào năm 1817- 1821 nổ ra tại nơi này. SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 7 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh Dịch tả lan rộng ra theo các tuyến vận tải vào nước Nga, tiếp theo là châu Âu và Bắc Mỹ. Nó trở thành căn bệnh mang tính toàn cầu đầu tiên của nhân loại, hoành hành khắp nơi chỉ trừ Nam cực. Trận đại dịch tả tấn công nước Anh vào năm 1848-1849 đã làm 70.000 người tử vong. Đại dịch năm 1854 đã cướp đi sinh mạng 1/8 dân số thành phố London chỉ trong một thời gian ngắn. Cũng trong khoảng thời gian này nước Pháp cũng hứng chịu những tổn thất nặng nề. Năm 1832, gần 40.000 người dân Paris đã mắc dịch tả và phân nửa trong số đó đã tử vong. Năm 1848-1849, một số lượng người tương tự cũng đã chết vì dịch bệnh. Phải đợi đến năm 1883, người ta mới biết được khuôn mặt của “kẻ giết người” nhờ công trình nghiên cứu của Robert Koch. Heinrich Hermann Robert Koch (1843 – 1910) là một bác sĩ người Đức. Ông là người đã tìm ra trực khuẩn bệnh than, trực khuẩn lao và vi khuẩn bệnh tả. Trước đó (1854) nhà khoa học Ý Pacini đã nhắc đến loại vi khuẩn gây bệnh tả Vibrio chorelae khi đại dịch tả tấn công thành Florence. Năm 1883 Robert Koch được cử tới Ai Cập làm Chủ tịch Ủy ban về bệnh tả của Đức, để điều tra về dịch tả đang bùng phát ở đó. Ông đã phát hiện ra vi khuẩn Vibrio chorela là nguyên nhân gây bệnh tả, ngoài ra ông cũng nghiên cứu vụ vi khuẩn tả ở Ấn Độ. Ông đã hệ thống hóa nguyên tắc để kiểm soát dịch tả (1893) và nó đã trở thành nền móng cho việc kiểm soát dịch tả ngày nay. Ông đã phát hiện ra vi khuẩn tả gây ra dịch tả ở người có nhiều nhất ở trong phân của người bệnh, trong nước thải có chứa phân. Ngoài ra cá, các thực phẩm khác từ nước nhiễm khuẩn nếu không được nấu chín cũng là nguồn gây bệnh. Vibrio parahaemolyticus : được Fujino phát hiện lần đầu tiên vào mùa hè năm 1951 tại vùng ven biển Nhật Bản sau các vụ ngộ độc do ăn cá, hào… Người ta đã xác định đuợc 21 loài thuộc giống Vibrio, trong đó có 4 loài thuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm: Vibrio cholera, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus. SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 8 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh 2.2.2. Phân loại Vibrio spp và phân bố 2.2.2.1. Phân loại Vibrio spp a. Phân loại theo khoa học Vibrio spp thuộc : • Giới (regnum): Bacteria • Nghành (phylum): Proteobacteria • Lớp (class) : Gamma Proteobacteria • Bộ (order): Vibrionale • Họ (family): Vibrionaceae • Chi (genus): Vibrio. • Loài (species): Hiện nay có khoảng 28 loài Vibrio như Vibrio natriegens, Vibrio harveyi , Vibrio fischeri , Vibrio parahaemolytycus…Trong đó, 3 loại Vibrio thường gây bệnh cho người nhất là Vibrio parahaemolytycus, Vibrio cholera, Vibrio vulnificus.   Hình 2.1: Vibrio harvey b. Phân loại theo kháng nguyên • Vibrio cholera nhóm 01 (gọi tắt là V.cholerae 01): gồm các vi khuẩn gây dịch tả. • Vibrio cholerae non O1/non-O139: SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 9 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh Gồm các vi khuẩn có tính chất sinh vật hoá học giống V.cholerae O1, nhưng không ngưng kết với kháng huyết thanh O1. Có thể gây bệnh lẻ tẻ và nhẹ, không thành dịch. Đặc điểm chủ yếu của những chủng này là không sản xuất độc tố tả và không liên quan tới dịch tiêu chảy. Những chủng này được phân lập tình cờ từ những trường hợp tiêu chảy do ăn tôm cua hoặc từ những trường hợp nhiễm trùng ngoài ruột khác như: vết thương, tai, đờm, nước tiểu, dịch não tuỷ. Phẩy khuẩn thuộc nhóm này được tìm thấy ở cửa sông, các nhiễm trùng do các chủng này thường bắt nguồn từ ngoại cảnh. • Vibrio cholerae O139 (chủng Bengal): Lúc đầu, vi khuẩn gây vụ dịch này liên quan tới vi khuẩn tả non-O1 vì nó không ngưng kết với kháng huyết thanh O1 nhưng triệu chứng lâm sàng rất dữ dội và giống tả. Chủng Vibrio cholerae O139 được cho là chủng lai của chủng Vibrio cholerae O1 và chủng non-O1. • Các Vibrio khác: Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, các Vibrio nhóm F. 2.2.2.2. Phân bố Ngoại trừ V.cholerae có thể hiện diện ở vùng nước ngọt, tất cả các loại Vibrio khác đều cần muối để tăng trưởng và thường phân bố rộng ở các khu vực nước mặn, vùng nước ven biển, cửa sông và các khu vực nuôi trồng thủy hải sản. Chúng tồn tại với số lượng lớn trong cả nước và trầm tích của hồ nuôi tôm, đặc biệt là trong nội tạng các sinh vật nuôi trồng thủy hải sản. 2.2.3. Đặc điểm hình thái Vibrio spp. 2.2.3.1. Đặc điểm chung Vibrio có nguồn gốc từ “Vibrae” có nghĩa là dao động, gồm các vi khuẩn có dạng que uốn cong, có dạng dấu phẩy, có một tiên mao. Phần lớn các loài Vibrio sống hoại sinh chỉ một số ít có khả năng lây bệnh cho người. Vibrio cholerae (phẩy trùng tả) gây bệnh cho người, có khả năng sống trong nước đến 3 tuần. SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 10 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae là những loài vi khuẩn Gram (-), hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6μm. Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn. Tất cả những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, vi khuẩn không phát triển trong môi trường không muối (NaCl) và không sinh H2S. Chúng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129. Một số chủng Vibrio có khả năng tiết hemolysine làm tan hồng cầu gây ngộ độc. Chúng sống trong nước ấm và bùn lắng ở đầm hồ và vùng nước lợ ven biển, vi khuẩn bám vào chitin của cua và các loại thân mềm, tồn tại trong thịt hay nội tạng của tôm, cua… Đặc trưng của loài Vibrio là khả năng phát triển trong điều kiện pH rất cao (8,5 – 9,5) và bị tiêu diệt nhanh ở môi trường acid. Vibrio chứa các loại kháng nguyên O, K, H. 2.2.3.2 Đặc điểm của từng loài a. V.parahaemolyticus: phát triển được ở môi trường có 1 2 8% NaCl, tốt nhất 4% NaCl và không sinh trưởng được trong môi trường không có muối (sẽ chết nếu đưa vào nước cất). Chúng không thể sống dưới 4oC nhưng phát triển tốt nhất ở 5 9oC, pH tối ưu sống trong môi trường 7% NaCl. - V.parahaemolyticus: có phản ứng oxidase (+), phát triển được trong canh trypton ở 24oC. Phản ứng ADH (-), LDC (+), có khả năng khử nitrate thành nitrite nhưng không lên men sucrose, sử dụng được một số nguồn carbohydrate khác để lên men nhưng không sinh hơi, không tăng trưởng được trong môi trường không có muối, tăng trưởng tốt trong môi trường có đến 8% muối nhưng bị ức chế trong môi trường chứa 10% muối. SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 11 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh Hình 2.2: V.parahaemolyticus b. V.cholerae: có phản ứng oxidase (+), tăng trưởng được trong môi trường canh trypton ở 42oC, arginine dehydrolase (-), lysine decarboxylase (+), lên men được sucrose (saccharose), khử nitrate thành nitrite, có thể tăng trưởng được trong môi trường chứ 0 – 3% NaCl, không phát triển được trong các môi trường chứa 6, 8, 10% muối. - V.cholerae: là loài vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên. Chúng gây bệnh dịch tả ở người (human cholerae). Bệnh gây ra do nước bẩn và thực phẩm bị nhiễm bệnh. V.cholerae là những trực khuẩn ngắn mảnh, kích thước khoảng 0,5 x 3.10-6 m. Khi mới phân lập, chúng có hình phẩy di động rất nhanh. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng dễ dàng phát triển trong môi trường bình thường mà không cần các yếu tố tăng trưởng. Ở nồng độ 5 - 15 mmol/l sẽ kích thích vi khuẩn mọc tốt hơn. Vi khuẩn này ưa pH 8 – 9,5 nhiệt độ tối ưu là 37oC. Chúng có thể phát triển được trong môi trường có chứa hàm lượng muối cao (trên 6% NaCl). - V.cholerae dễ chết trong môi trường acid, bị tiêu diệt bới chất tẩy rửa, không chịu được độ ẩm thấp. Chúng có thể tồn tại ở 55oC trong 10 phút. Thậm chí chúng có thể sống trong môi trường nước ngọt có hàm lượng Na+ thấp. - V.chlolerae có kháng nguyên H (trong tiên mao). Kháng nguyên này dễ bị tiêu hủy. Ngoài ra chúng còn có kháng nguyên O (phần lipopolysaccharide ở màng vi khuẩn), rất bền nhiệt. Kháng nguyên O (tế bào) là lipopolysaccharit, trong đó phần polysaccharit quy định tính đặc hiệu của kháng nguyên . SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 12 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh - V.cholera có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme. Trong đó có enzyme mucinase. Enzyme này làm tróc vãy biểu bì mô ruột. Neuraminidase thủy phân ganglioside. GD1 và GT1 thành GM1. Vì thế số lượng thụ thể độc tố ruột tăng lên .       Hình 2.3: V.cholerae c. V.vulnificus: không tăng trưởng được trong môi trường có muối và bị ức chế trong môi trường có 8 10% NaCl. Chúng được tìm thấy trong nước biển và hải sản, phần lớn chúng không phát triển được ở nhiệt độ lạnh nên vào mùa đông rất khó phát hiện ra chúng. Chúng có khả năng sinh tổng hợp nội độc tố cytotoxin với trọng lượng phân tử là 56Kda, hemolysin - 36Kda và cytoysin. Nước biển vùng nào cũng có vi khuẩn này, nhưng có nhiều nhất là vào tháng 5 và tháng 10. Chúng là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng máu. Các bệnh nhân thường mắc phải ở lứa tuổi 40 (sức đề kháng của cơ thể giảm) và tỉ lệ tử vong là rất cao ( 60% ). Hình2. 4: V. Vulnificus SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 13