Tài liệu Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu tách chiết flavonoid lá cây diếp cá houttuynia cordata thunb

LỜI CẢM ƠN Kết thúc bốn năm học tập và nghiên cứu tại Viện Công nghệ Sinh học, trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam, đƣợc sự cho phép của nhà trƣờng em đã có thể tiến hành làm khóa luận với đề tài: “Nghiên cứu tách chiết flavonoid lá cây Diếp cá Houttuynia cordata Thunb)”. Để có thể hoàn thành tốt bài luận này không thể không kể đến sự giúp sức của quý Thầy Cô đang công tác và giảng dạy tại Viện Công nghệ Sinh học, trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam, gia đình cũng nhƣ bạn bè đã ở bên, đồng hành và ủng hộ em trong suốt quãng thời gian dài. Lời đầu tiên, cho phép em đƣợc gửi lời biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến cô giáo trực tiếp hƣớng dẫn khóa luận - Thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Hằng ngƣời Thầy khoa học đã định hƣớng và tận tình chỉ bảo, đã truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong cách nghĩ, các tiếp cận và cách giải quyết vấn đề, tác phong làm việc, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp và hoàn thành khoá luận này. Em xin phép đƣợc gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô giáo và chị Nguyễn Thị Hồng Nhung của Bộ môn Công nghệ Vi sinh Hóa sinh đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện về trang thiết bị, điều kiện thực nghiệm một cách tốt nhất để em có thể hoàn thành khóa luận này.Đƣợc sự chỉ bảo tận tình của ThS. Nguyễn Thị Thu Hằng và các Thầy Cô trong Viện cùng với sợ nỗ lực của bản thân đã cố gắng để hoàn thiện luận văn này, song kiến thức,kinh nghiệm của em còn hạn chế ,vậy nên bản báo cáo khoa học này không tránh đƣợc những sai sót, nhƣng mong các thầy cô đóng góp ý kiến đánh giá, để bản báo cáo của em đƣợc hoàn thiện hơn. Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn! i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i MỤC LỤC ............................................................................................................. ii DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................... iv DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... v ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1 PHẦN 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................ 2 1.1. Giới thiệu về cây Diếp cá ............................................................................... 2 1.1.1. Khái quát chung về cây Diếp cá.................................................................. 2 1.1.2. Nguồn gốc và đặc điểm thực vật ................................................................. 2 1.1.3. Thành phần hóa học .................................................................................... 3 1.2. Tổng quan về flavonoid ................................................................................. 8 1.2.1. Khái niệm .................................................................................................... 8 1.2.2. Cấu trúc chung và phân loại ....................................................................... 8 1.2.3. Tính chất lý hóa ......................................................................................... 14 1.2.4. Tính chất sinh học của flavonoid .............................................................. 14 1.3. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất các chất flavonoid ................ 17 1.3.1. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất trên thế giới ....................... 17 1.3.2. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất ở trong nƣớc. ..................... 17 PHẦN 2 NỘI DUNG MỤC TIÊU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 18 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 18 2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 18 2.3. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 18 2.3.1. Vật liệu thực vật ........................................................................................ 18 2.3.2. Vật liệu vi sinh vật .................................................................................... 19 2.3.3.Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật ................................................................. 19 2.4. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu ........................................................ 19 2.4.1 Thiết bị ....................................................................................................... 19 ii 2.4.2 Dụng cụ ...................................................................................................... 19 2.4.3 Hóa chất...................................................................................................... 20 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 20 2.5.1. Xác định độ ẩm của lá và tạo nguyên liệu bột lá cây Diếp Cá ................. 20 2.5.2. Xác định phƣơng pháp tách chiết .............................................................. 21 2.5.3. Xác định loại alcohol thích hợp cho quá trình tách chiết.......................... 22 2.5.4. Xác định nồng độ dung môi ...................................................................... 22 2.5.5. Tách chiết hợp chất flavonoid theo phƣơng pháp trích ly ........................ 23 2.5.6. Xác định sự có mặt của flavonoid trong dịch chiết................................... 24 2.5.7. Định tính flavonoid bằng phƣơng pháp chạy sắc ký ................................ 25 2.5.8. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của flavonoidchiết xuất từ lá .......... 26 PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 27 3.1. Xác định độ ẩm của lá và tạo nguyên liệu bột lá Diếp cá ............................ 27 3.2. Xác định phƣơng pháp tách chiết ................................................................. 28 3.3 Xác định loại Alcohol thích hợp cho quá trình tách chiết ............................ 29 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố công nghệ đến khả năng trích ly theo phƣơng pháp ngâm chiết. ........................................................................ 30 3.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ ethanol ................................. 30 3.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu / dung môi ethanol 32 3.4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian chiết bằng ethanol. ............. 34 3.5. Định tính các chất Flavonoid có trong nguyên liệu bằng các phản ứng hóa học. ...................................................................................................................... 35 3.6. Định tính flavonoid bằng sắc ký lớp mỏng .................................................. 36 3.7. Khả năng kháng khuẩn của cao flavonoid chiết xuất từ lá Diếp cá ............. 38 PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 40 4.1 Kết luận ......................................................................................................... 40 4.2 Kiến nghị ....................................................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học của cây Diếp cá ................................................... 3 Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của lá Diếp cá .............................................. 27 Bảng 3.2 Kết quá xác định phƣơng pháp tách chiết ........................................... 28 Bảng 3.3 Kết quả đo OD của các loại Alcohol ................................................... 29 Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid ................................................................................................. 31 Bảng 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu / dung môi ethanol đến hiệu suất trích ly .............................................................................. 32 Bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian chiết bằng ethanol đến hiệu suất trích ly .................................................................................................. 34 Bảng 3.7. Kết quả định tính nhóm chất flavonoid chiết xuất từ lá Diếp cá ........ 36 Bảng 3.8. Hoạt tính kháng của một số chủng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết lá Diếp cá ............................................................................................................. 39 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hoa và lá của cây Diếp cá ..................................................................... 2 Hình 1.3. Thành phần alkaloid trong Diếp cá ....................................................... 7 Hình 1.4. Cấu trúc của flavonoid .......................................................................... 8 Hình 1.5. Cấu trúc của Anthocyanidin .................................................................. 9 Hình 1.6. Cấu trúc của Flavan 3-ol ....................................................................... 9 Hình 1.7. Cấu trúc của Flavan 3,4-diol ............................................................... 10 Hình 1.8. Cấu trúc của Flavanon ......................................................................... 10 Hình 1.9. Cấu trúc của 3- Hydroxyflavanon ....................................................... 11 Hình 1.10. Cấu trúc của flavon ........................................................................... 11 Hình 1.11. Cấu trúc của flavonol ........................................................................ 12 Hình 1.12. Cấu trúc của chalcon ......................................................................... 12 Hình 1.13. Cấu trúc của Dihydrochalcon ............................................................ 12 Hình 1.14. Cấu trúc của Auron ........................................................................... 13 Hình 2.1 Hình ảnh lá và bột lá của cây Diếp Cá ................................................. 18 Hình 3.1. Lá Diếp cá và bột lá Diếp cá .............................................................. 28 Hình 3.2 Dịch chiết các loại Alcohol .................................................................. 29 Hình 3.3. Flavonoid thô thu đƣợc sau khi tách chiết .......................................... 30 Hình 3.4. Biểu đồ ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid .............................................................................................................. 31 Hình 3.5. Biểu đồ ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid .......................................................................................... 33 Hình 3.6. Biểu đồ ảnh hƣởng của thời gian chiết bằng ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid.......................................................................................................... 35 Hình 3.7. Kết quả định tính flavonoid trích ly từ lá Diếp Cá ............................. 36 Hình 3.8. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng của flavonoid quan sát dƣới ánh sáng thƣờng (A) và ánh sáng tử ngoại (B) .................................................................. 37 Hình 3.9. Hoạt tính kháng một số chủng vi sinh vật kiểm định của flavonoid....... 38 v ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới với nguồn dƣợc liệu phong phú và đa dạng. Hệ thực vật Việt Nam có trên 10000 loài trong đó có khoảng 3200 loài cây thuốc. Thuốc chữa bệnh là một thành phần không thể thiếu đƣợc trong cuộc sống. Từ xa xƣa cho đến hiện nay,con ngƣời đã biết sử dụng các cây cỏ vào điều trị bệnh. Mặc dù các loại thuốc tây y chiếm một phần lớn trong phƣơng pháp điều trị nhƣng thuốc có nguồn gốc thảo dƣợc vẫn đứng một vị trí hết sức quan trọng. Trên thế giới, nguồn thực vật vô cùng phong phú và là đối tƣợng nghiên cứu của rất nhiều tác giả trong mục đích tìm kiếm chất mới có hoạt tính sinh học cũng nhƣ tìm ra các nguyên liệu chữa bệnh. Việc nghiên cứu thuốc ở nƣớc ta những năm gần đây đã có nhiều bƣớc phát triển. Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thực vật giúp các nhà khoa học tìm hiểu sâu hơn và sử dụng hiệu quả hơn nguồn dƣợc liệu sẵn có đồng thời góp phần thúc đẩy ngành công nghiệp hóa dƣợc trong nƣớc phát triển, khoa học hóa nền Y học Cổ truyền. Diếp cá là một loại thực vật đƣợc trồng rất phổ biến ở Việt Nam và một số nƣớc châu Á. Trong đông y, Diếp cá đƣợc sử dụng trong các bài thuốc để trị bệnh trĩ, mụn nhọt, lên sởi, đau mắt [12]. Diếp cá là đối tƣợng nghiên cứu của nhiều tác giả khác nhau và đã đƣợc báo cáo là có khả năng kháng khuẩn, kháng viêm, tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch do chứa nhiều thành phần có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt là các hợp chất thuộc nhóm flavonoid nhƣ rutin, quercetine [6]. Các hợp chất có hoạt tính sinh học hiện nay đƣợc nghiên cứu rất nhiều, đặc biệt hƣớng tách chiết chúng từ các loại cây cỏ, thảo dƣợc và ứng dụng vào trong y học. Từ thực tế đó khóa luận tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tách chiết hợp chất flavonoid của lá cây Diếp cá Houttuynia cordata Thunb”. là một hƣớng nghiên cứu cần thiết 1 PHẦN 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Giới thiệu về cây Diếp cá 1.1.1. Khái quát chung về cây Diếp cá Cây Diếp cá còn có tên là cây Giấp cá, lá Giấp, Ngƣ tinh thảo. Tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb. Giới: Plantae Bộ: Piperales Họ: Saururacea Chi: Houttuynia Loài: Houttuynia Cordata 1.1.2. Nguồn gốc và đặc điểm thực vật Diếp cá là một loại cây thảo, sống lâu năm, cao 20 – 40cm, thân ngầm, mọc bò ngang trong đất, màu trắng, hơi có lông, bén rễ ở các mấu. Thân đứng, nhẵn, màu lục hoặc tím đỏ. Lá Diếp cá mọc so le hình tim, đầu nhọn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dƣới màu tím, hơi có lông dọc theo gân lá của cả hai mặt, gân chính 7; cuống lá dài, có bẹ, lá kèm có lông ở mép. Cụm hoa hình bông dài 2 – 2,5cm, mọc ở ngọn thân, mang nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt; dài 4-6cm, rộng 3-4cm, có 5-7 gân gốc [3]. Hình 1.1. Hoa và lá của cây Diếp cá 2 Hoa Diếp cá nở vào tháng 5 – 8, cụm hoa hình bông dài 2,5cm bao bởi 4 lá bắc màu trắng, trong chứa nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt. Cây Diếp cá có toàn bộ bề ngoài của cụm 4 hoa và lá bắc giống nhƣ một cái hoa đơn độ và quả nang mở ở đỉnh, hạt hình trái xoan, nhẵn. Diếp cá phân bố từ Nhật Bản, Trung Quốc tới Nêpan, Ấn Độ, các nƣớc Đông Dƣơng và Indonesia. Ở Việt Nam cây mọc rất phổ biến, thƣờng gặp mọc hoang nơi ẩm ƣớt trên các bãi ven suối, bờ sông. Diếp cá là loại rau rất quen thuộc trong các bữa ăn hàng ngày của các gia đình Việt Nam, thƣờng dùng làm rau ăn sống, làm gia vị cùng các loại rau khác [3]. 1.1.3. Thành phần hóa học Thành phần hóa học của Diếp cá gồm có : flavonoid, tinh dầu, alkaloid và một số thành phần khác [2, 6] Bảng 1.1. Thành phần hóa học của cây Diếp cá STT Thành phần hóa học Hàm lƣợng (trong 100g) 1 Nƣớc 91,5g 2 Protid 2,9g 3 Glucid 2,7g 4 Lipit 0,5g 5 cellulose 1,8g 6 Dẫn suất không protein 2,2g 7 Kháng toàn phần 1,1g 8 Vitamin C 68mg 9 Carotene 1,26mg 10 Kali 0,1mg 11 Calcium 0,3mg 3 Flavonoid Diếp cá có chứa thành phần flavonoid hết sức phong phú. Các flavonoid đang chú ý trong Diếp cá có thể kể đến nhƣ quercetin, quercetrin, isoquercetrin ngoài ra còn một số flavonoid cũng không kém phần quan trọng -quercetin-3-O-β-D-galactosid-7-O-β-D-glucosid - quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosid - kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranosid - phloretin-2’-O-β-D-glucopyranosid (phloridzin) - quercetin-3-O-α-L-arabinofuranosid (avicularin) - quercetin-3-O- β-D-galactopyranosid (hyperin) 4 Hình 1.2. Thành phần flavonoid trong Diếp cá Tinh dầu Thành phần chủ yếu của tinh dầu Diếp cá là các nhóm aldehyd và các dẫn xuất ceton nhƣ methyl n-nonyl ceton (đây là chất làm cho Diếp cá khi vò có mùi tanh), L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất: α-pinen, camphen, myrcen, limonen, linalol, bornyl acetat, geraniol and caryophylen. Ngoài ra, tinh dầu còn chứa acid caprinic, lauryl aldehyd, benzamid, acid hexadecanoic, acid decanoic, acid palmitic, acid linoleic, acid oleic, acid stearic, aldehyd capric, acid clorogenic, lipid và vitamin K [10]. Một số công bố gần đây cho thấy thành phần và hàm lƣợng tinh dầu Diếp cá khác nhau tuỳ theo nguồn gốc và quá trình phơi sấy khô: 5 - Tinh dầu Diếp cá khô mọc tại miền Bắc Việt Nam có 31 hợp chất, trong đó có 4 hợp chất chiếm thành phần chủ yếu gồm β-pinen (3,15%), 2-undecanon (15,15%), propen 1-methoxy-2 methyl (12,12%), 1R-α-pinen (11,03%). Tinh dầu Diếp cá tƣơi có 34 thành phần, và hàm lƣợng tinh dầu trong Diếp cá tƣơi gấp 4,3 lần hàm lƣợng tinh dầu trong Diếp cá khô [7]. - Tinh dầu Diếp cá mọc tại miền Nam có 19 hợp chất trong đó thành phần chủ yếu là 2(10) – pinen, (1S, 5S)-(-) (82,84%); ocimen (6,15%); keton methyl nonyl (6,44%) [5]. - Diếp cá tƣơi mọc tại Trung Quốc có 38 thành phần, trong khi đó thành phần tinh dầu trong Diếp cá khô chỉ có 22 hợp chất: β-mycen (3,47%), Lnonanol (6,21%), α-terpineol (13,24%), methyl nonyl keton (35,2%), bornyl acetat (5,52%), n-decanoic acid (10,58%), caryophyllen (3,41%), docosanoic acid ethyl ester (5,34%) [13]. Alkaloid Một số alkaloid có hoạt tính sinh học đƣợc tìm thấy trong cây Diếp cá là: aristolactam A, aristolactam B, piperolactam A, norcepharadion B, cepharadion A, cepharadion B, splendidin [15]. aristolactam A aristolactam B piperolactam A norcepharadion B cepharadion A cepharadion B splendidin [15]. 6 Hình 1.3. Thành phần alkaloid trong Diếp cá 7 1.2. Tổng quan về flavonoid 1.2.1. Khái niệm Flavonoid là nhóm hợp chất tự nhiên thƣờng gặp trong thực vật, tạo màu cho rất nhiều loại rau, hoa và quả. Flavonoid là hợp chất phenol có cấu trúc khung cơ bản là 1,3diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen (vòng A và B) nối với nhau qua một mạch 3 carbon (vòng pyron - vòng C). Phần lớn flavonoid có màu vàng nhạt, một số có mà đỏ, xanh tía và các dạng không màu [8]. Hình 1.4. Cấu trúc của flavonoid 1.2.2. Cấu trúc chung và phân loại Dựa trên mức độ oxy hóa của mạch 3 C và vị trí của gốc aryl (vòng B) liên kết với vòng benzopyrano chia flavonoid thành các loại khác nhau nhƣ: Flavonoids (2- phenylbenzopyrans): gồm có các nhóm phụ flavan, flavan 3ol (catechin), flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, anthocyanidin, flavanone, flavone, flavonol, 3-hydroxy flavanon, chalcon, dihidrochalcon, aurone. Isoflavonoid (3-benzopyrans) gồm các nhóm phụ: iso flavan, iso flavan-4ol, isoflavon, isoflavanon, rotenoid…Thƣờng gặp nhất là isoflavon trong cây họ đậu. Neoflavonoid (4- benzopyrans) gồm các nhóm phụ 4-aryl-chroman, 4arylcoumarin, dalbergion. . Ngoài ra các nhà khoa học còn phân loại flavonoid thành flavonoid, biflavonoid (những flavonoid dimer), triflavonoid (cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid) và flavonlignan (những flavonoid mà phân tử có cấu trúc lignan. 8 1.2.2.1. Flavonoids Anthocyanidin: hay 2 phenylbenzopyrilium đây cũng là sắc tố phổ biến trong thực vật.Trong cây các sắc tố này đều ở dạng glycoside (anthocyanin=anthocyanosid) nằm trong dịch tế bào. Khi đun anthocyanin trong dung dịch HCl 20% thì phần đƣờng trong phân tử (thƣờng nối vào OH ở C-3) bị cắt và cho phần aglycon đƣợc gọi là anthocyanidin. Ở trong dung dịch acid (pH 1-4) tạo muối có màu đỏ, ở môi trƣờng kiềm (pH>6) là anion cũng tạo đƣợc muối với các chất kiềm có màu xanh. Dung dịch anthocyanidin mất màu bởi bisulfit kiềm và dễ bị oxi hóa nên ít đƣợc dùng làm phẩm màu [2, 8, 12]. Hình 1.5. Cấu trúc của Anthocyanidin Flavan 3-ol: tùy theo các nhóm thế đính vào 2 vòng A và B mà có những dẫn chất flavan 3-ol khác nhau. Catechin, gallocatechin và những đồng phân của chúng là những dẫn chất của flavan 3-ol nhiều trong thực vật nhƣ cây diếp cá. Hình 1.6. Cấu trúc của Flavan 3-ol Các nhà khoa học đã xác định đƣợc những dẫn xuất của flavan 3-ol ở dạng dimer, trimer, tetramer, pentamer và đƣợc gọi là tannin, thƣờng có trong loại trà Camellia sinensis CV.viridis [3–5, 15]. 9 Flavan 3,4-diol: các dẫn chất flavan 3,4-diol đều không màu, có tính quang hoạt, khi đun sôi với acid thì dễ chuyển thành anthocyanidin có màu đỏ. Vì dễ bị oxi hóa và trùng hợp nên việc phân lập chất tinh khiết gặp khó khăn. Phần lớn chúng thƣờng ở dạng dimmer. Các đơn phân đƣợc xác định bằng cách chuyển thành các dẫn chất anthocyanidin tƣơng ứng [ 2, 8, 25 ]. Hình 1.7. Cấu trúc của Flavan 3,4-diol Flavanon: flavanon là những chất không màu nhƣng khi làm phản ứng cyaniding thì cho màu rõ hơn flavon, ngoài ra flavanon có điểm chảy thấp hơn flavon tƣơng ứng, dựa vào đây có thể sơ bộ nhận biết. Nhóm này thƣờng có nhiều trong cây cam thảo (liquiritin và isoliquiritin). Hesperidin, naringin là những flavanon gặp nhiều trong một số vỏ cây Citrus. Naringin có vị đắng bằng 1/5 quinin, tuy nhiên aglycon thì không đắng ngoài ra nếu thay đƣờng neohesperidose bằng đƣờng rutinose thì lại mất vị đắng. Nếu mở vòng C của naringin để tạo thành chalcon rồi hydrogen hóa tạo thành dihydro chalcon thì dẫn chất này có vị ngọt bằng saccharin [11, 15, 20]. Hình 1.8. Cấu trúc của Flavanon 10 3- Hydroxyflavanon (dihydroflavanol = flavanonol): có 2 carbon bất đối ở C2 và C3. Phần lớn dihyroflavonol ở dạng aglycon, cũng có một số ở dạng glycoside. Dihydroflavonol khó phân lập vì kém bền, dễ bị oxi hóa. Trong đó có dẫn chất của taxifolin hay gặp nhất [3-5]. Hình 1.9. Cấu trúc của 3- Hydroxyflavanon Flavon: có cấu trúc 2 vòng benzen A và B, với vòng B gắn vào vòng C (pyran) tại vị trí C2, có nối đôi ở vị trí 2-3. Các dẫn chất flavon rất phổ biến trong thực vật, kết tinh không màu đến vàng nhạt. Chỉ tính đến các flavon có nhóm thế OH và/ hoặc OCH3 đã có tới hơn 300 chất. Chất flavon đơn giản nhất không có nhóm thế đã đƣợc phân lập từ cây anh thảo (Primula). Hai flavon hay gặp nhất trong cây là apigenin và lutelin. Hình 1.10. Cấu trúc của flavon Flavonol (flavon 3-ol): khác với flavon thì flavonol có thêm nhóm OH ở C3. Flavonol kết tinh màu vàng nhạt đến vàng. Những dẫn chất flavonol rất phổ biến trong thực vật, đặc biệt là hành, hoa hòe, lúa mạch, rau nghễ, diếp cá. Cho đến năm 1992 đã có tới 380 chất flavonol có nhóm thế hydroxyl và hoặc methoxyl đã đƣợc biết tới. Các chất thƣờng gặp ở thực vật là: kaempferol, quercetin, myricetin [13, 23, 24]. 11 Hình 1.11. Cấu trúc của flavonol Chalcon: có 2 vòng A và B nối với nhau bởi một mạch hở 3C không có dị vòng C nhƣ các flavonoid khác. Đây là những chất có màu vàng đến vàng cam. Chalcon có chủ yếu trong một số hoa thuộc họ Cúc–Asteraceae. Để nhận biết chalcon có thể dùng hơi ammoniac hoặc khói kiềm của thuốc lá, màu sẽ chuyển sang đỏ cam hoặc cam đỏ hay đỏ. Chalcon cũng có thể ở trong các bộ phận khác nhƣ vỏ, lá, rễ, quả (ví dụ: isoliquiritigenin trong rễ cam thảo). Hình 1.12. Cấu trúc của chalcon Dihydrochalcon: các chất này ít gặp trong tự nhiên. Ví dụ nhƣ phloridin có trong một loài Malus, chất này có độc tính ngăn sự hấp thu glucose ở ruột non và ngăn sự tái hấp thu glucose ở tiểu quản thận. Một số dihydrochalcon có vị rất ngọt ví dụ nhƣ neohesperidosid có vị ngọt gấp 2000 lần đƣờng mía. Hình 1.13. Cấu trúc của Dihydrochalcon 12 Auron: là nhóm flavonoid có màu vàng sáng. Khung của auron cũng có 15 C nhƣ các flavonoids khác nhƣng dị vòng C có 5 cạnh. Số lƣợng cũng nhƣ sự phân bố trong cây cũng bị hạn chế. Chất điển hình là auresidin gặp phổ biến trong hoa của một số họ: Asteraceae, Scrophulariaceae, Plumbaginaceae, Oxalidaceae và ở dạng 4- glucosid hay 6-glucosid. Hình 1.14. Cấu trúc của Auron 1.2.2.2. Isoflavonoid Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3, gồm nhiều nhóm khác nhau nhƣ isoflavan, isoflava-3-ene, isoflavan 4-ol, isoflavanon; isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3-arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, các chất này thƣờng gặp trong các cây họ đậu- Fabaceae. + Isoflavan: glabridin là một thành phần flavonoid gặp trong rễ cam thảo. + Isoflavan-3-ene: flabren có trong cam thảo. + Isoflavon: là nhóm lớn nhất của isoflavonoid. Hiện nay, hơn 364 chất đã đƣợc xác định, chúng có nhiều tác dụng trong y học thƣờng gặp trong các họ Rosaceae, Amaranthaceae, Iridacea, ví dụ daizein trong sắn dây, forrmonometin trong cam thảo [2, 8, 12, 21]. Rotenoid: cho đến nay hơn 75 chất thuộc nhóm chất này đã đƣợc phân lập và xác định đƣợc cấu trúc. Cấu trúc của nhóm rotenoid là C6-C4-C6 vì có thêm 1C do oxy hóa đóng vòng. Điển hình là rotenon có tác dụng diệt sâu bọ. 1.2.2.3. Neoflavonoid Neoflavonoid các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4, gồm nhóm chất có khung 4-arylchroman và 4-aryl coumarin, các chất này chỉ có giới hạn trong một số loài thực vật [2, 8, 12]. 13 1.2.3. Tính chất lý hóa Trong thực vật, flavonoid tồn tại ở 2 dạng: dạng tự do (gọi là aglycon) và dạng liên kết với đƣờng (glycoside). Các glycoside khi bị thủy phân bằng acid hoặc enzyme sẽ giải phóng ra đƣờng và aglycon. Các đƣờng thƣờng gặp nhất là Dglucose, Dgalactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose [9]. Tính tan: aglycon kém tan trong dung môi kém phân cực (hexan, benzen, ether dầu hỏa), tan trong dung môi phân cực vừa và mạnh (ethyl acetate, dimethyl ether, methanol, ethanol), tan trong kiềm loãng, kém tan trong dung dịch acid. Glycoside: tan trong ethanol, methanol. Các glycoside càng có nhiều nhóm đƣờng và mạch đƣờng càng dài thì tan tốt trong nƣớc nóng. Các flavonoid glycoside có nhóm -OH tại vị trí C7 còn tan đƣợc trong dung dịch NaOH, Na2CO3, NaHCO3 do có tính acid. Các flavonoid dạng aglycon thƣờng dễ kết tinh, trong khi các glycoside thƣờng khó kết tinh hơn [9]. Các flavonoid thƣờng có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol có màu vàng đến vàng nhạt; chalcon có màu vàng đến cam đỏ. Các isoflavon, flavanon, flavanonol, leucoanthocyanidin, catechin kết tinh không màu. Anthocyanidin thƣờng hiện diện ở dạng glycosid: pelargonidin, cyanidin, delphinidin…tạo màu xanh dƣơng, đỏ, tím cho hoa và trái [7,9]. Các flavonoid dễ tạo muối tan trong nƣớc với các hydroxyd kiềm, nhạy cảm với pH, nhiệt độ và ánh sáng. Có khả năng tạo phức với các ion kim loại cho sản phẩm có màu đặc trƣng. Hệ thống nối đôi liên hợp tạo ra bởi 2 vòng benzen và vòng pyron làm cho flavonoid có khả năng hấp thụ tia tử ngoại. Thƣờng thu đƣợc 2 dải hấp thu cực đại, dải 1 có λmax = 320 - 380 nm, dải 2 có λmax = 240 - 280 nm [9]. 1.2.4. Tính chất sinh học của flavonoid 1.2.4.1. Tác dụng chống oxi hóa Gần đây, các hợp chất flavonoid đã đuợc coi là chất chống oxi hóa mạnh mẽ trong ống nghiệm và đƣợc chứng minh là chất chống oxi hóa mạnh hơn vitamin C, vitamin E và carotenoids [17]. 14 Chất chống oxi hóa là các hợp chất có thể trì hoãn, ức chế hoặc ngăn chặn quá trình oxi hóa gây ra bởi các gốc tự do và giảm bớt tình trạng stress oxi hóa [5, 21]. Stress oxi hóa là một trạng thái mất cân bằng do số lƣợng gốc tự do sản sinh quá nhiều vƣợt qua khả năng chống oxi hóa nội sinh, dẫn đến quá trình oxi hóa của một loại đại phân tử sinh học, nhƣ các enzym , Protein. DNA và lipid [5, 17]. Stress oxi hóa là nguyên nhân quan trọng trong sự phát triển của các bệnh thoái hóa mãn tính bao gồm bệnh mạch vành tim, ung thƣ và lão hóa [17, 21]. Khả năng chống oxi hóa của flavonoid có thể đƣợc giải thích dựa vào các đặc điểm cấu trúc phân tử của chúng : ▪ Trong phân tử flavonoid có chứa các nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với vòng thơm có khả năng nhƣờng hydro giúp chúng có thể tham gia vào các phản ứng oxi hóa khử, bắt giữ các gốc tự do. ▪ Chứa các vòng thơm và các liên kết bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ liên hợp giúp chúng có thể bắt giữ, làm bền hóa các phần tử oxi hoạt động và các gốc tự do. ▪ Chứa nhóm có thể tạo phức chuyển tiếp với các ion kim loại nhƣ catechol…giúp làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxi hoạt động [17, 21]. 1.2.4.2. Tác dụng ức chế vi sinh vật, chống viêm nhiễm Dịch chiết flavonoid từ lá cây Diếp cá cho thấy khả năng ức chế đối với sự phát triển của S. aureus, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Candida albicans với đƣờng kính vòng ức chế tƣơng ứng là 23, 21, 26 và 29 mm [13]. Kết quả tƣơng tự đối với dịch chiết flavonoid của cây diếp cá trên sự phát triển của E. coli, P. aeruginosa, B. subtilis và S. aureus với giá trị MIC lần lƣợt là 100, 200, 200 và 50 µg/ml [29]. Quercetin làm giảm đáng kể tình trạng viêm nhiễm và sự peroxyd lipid gây ra bởi Helicobacter pylori trong niêm mạc dạ dày của chuột bạch [10]. 15