BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LÊN MEN NƯỚC CÀ RỐT
BẰNG VI KHUẨN ACID LACTIC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:
ThS. HUỲNH XUÂN PHONG
SINH VIÊN THỰC HIỆN:
NGUYỄN THỊ ÁI XUÂN
MSSV: 3082569
Lớp: CNSHTT K34
Cần Thơ, Tháng 05/2013
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
Th.S Huỳnh Xuân Phong
Nguyễn Thị Ái Xuân
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày
tháng 5 năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34
Trường ĐHCT
LỜI CẢM TẠ
Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, động
viên, tận tình giúp đỡ từ phía Ban Giám đốc, Quý Thầy Cô Viện Nghiên cứu và Phát
triển Công nghệ Sinh học, cán bộ phòng thí nghiệm và gia đình, bạn bè.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cố vấn học tập PGS. TS Nguyễn Hữu Hiệp đã
tận tình truyền dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học và hoàn thành luận văn tốt
nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Ngô Thị Phương Dung và anh Huỳnh Xuân
Phong, cán bộ hướng dẫn, anh đã tận tâm chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực
hiện từng thí nghiệm và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Cảm ơn anh Nguyễn Ngọc
Thạnh và anh Phạm Hồng Quang, cán bộ phòng thí nghiệm, thường xuyên hướng dẫn,
hỗ trợ tôi hoàn thành luận văn.
Xin được gửi lời cám ơn chân thành đến tất cả các quý Thầy Cô đã tận tình truyền
dạy cho tôi kiến thức hữu ích để phục vụ đề tài.
Xin chân thành cảm ơn các bạn sinh viên cùng khóa và các anh chị học viên cao
học của phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình
thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình và người thân đã động
viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời
gian qua để tôi vững tin thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Kính chúc Quý Thầy Cô được nhiều sức khỏe, thành đạt trên nhiều lĩnh vực và
luôn có những cống hiến quý báu cho sự nghiệp giáo dục và đào tạo.
Xin chân thành cảm ơn!
.Cần Thơ, ngày tháng 5 năm 2013
Nguyễn Thị Ái Xuân
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường Đại học Cần Thơ
TÓM LƯỢC
Với mục đích để tận dụng nguồn nguyên liệu có sẵn, rẽ tiền và giá trị dinh
dưỡng cao cũng như đa dạng hóa sản phẩm chế biến có đặc tính tốt, đề tài “Sản
xuất nuớc cà rốt lên men bằng vi khuẩn acid lactic” được thực hiện qua hai giai
đoạn. Giai đoạn đầu tiến hành phân lập, định danh và tuyển chọn các dòng vi
khuẩn acid lactic được phân lập từ nước cà rốt lên men. Kết quả thu được 4 dòng vi
khuẩn acid lactic phân lập từ nước cà rốt lên men và so sánh với 6 dòng từ nghiên
cứu của Lương Phước Trường (2012) được phân lập từ bột men tiêu hoá. Kết quả
tuyển chọn được dòng Lactobacillus helveticus cho kết quả tốt nhất (hàm lượng
acid 1,46% w/v). Ở giai đoạn hai, tiến hành nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp
với chủng vi khuẩn được tuyển chọn. Dịch cà rốt lên men đã xác định được tỉ lệ pha
loãng dịch cà rốt 30% và đường phối chế là 15% (w/v) thích hợp để sản xuất nước
cà rốt lên men. Với mật số giống chủng ban đầu là 5 log CFU/mL sau 24 giờ ủ ở
37°C sản xuất được sản phẩm đảm bảo yêu cầu của một sản phẩm probiotic với sự
đánh giá cao của hội đồng đánh giá cảm quan. Mùi, vị và mật số vi khuẩn vẫn được
đảm bảo khi được tồn trữ ở 4°C trong 4 tuần và vẫn đảm bảo yêu cầu của một sản
phẩm probiotic (mật số vi khuẩn lớn hơn 6 log CFU/mL).
Từ khóa: Lactobacillus helveticus, nước cà rốt, probiotic, vi khuẩn acid lactic.
Chuyên ngành Công nghệ Snh học
i
Viện NC&PT Công nghệ Snh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường Đại học Cần Thơ
MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƯỢC....................................................................................................................... i
DANH SÁCH BẢNG........................................................................................................ v
DANH SÁCH HÌNH........................................................................................................ vi
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................ vii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài..............................................................................................2
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................................ 3
2.1. Sơ lược về vi khuẩn acid lactic......................................................................3
2.1.1. Sơ lược về vi khuẩn acid lactic............................................................3
2.1.2 Một số giống vi khuẩn acid lactic.........................................................4
2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn acid lactic ..........7
2.1.4 Một số ứng dụng của vi khuẩn acid lactic (LAB) .................................9
2.2 Lên men acid lactic..................................................................................... 10
2.2.1 Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men acid lactic................................ 10
2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men...................................... 12
2.2.3 Ý nghĩa thực tế của lên men acid lactic .............................................. 13
2.3 Probiotic ...................................................................................................... 14
2.3.1 Giới thiệu chung ................................................................................ 14
2.3.2. Vai trò của probiotic ......................................................................... 14
2.4 Nguyên liệu cà rốt........................................................................................ 15
2.4.1 Giới thiệu chung về cây cà rốt............................................................ 15
2.4.2 Thành phần hóa học của cà rốt ........................................................... 16
2.4.3 Lợi ích của cà rốt ............................................................................... 18
Chuyên ngành Công nghệ Snh học
ii
Viện NC&PT Công nghệ Snh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP...................................................... 19
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP...................................................... 19
3.1. Phương tiện................................................................................................. 19
3.1.1. Thời gian và địa điểm........................................................................ 19
3.1.2. Phương tiện....................................................................................... 19
3.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 20
3.2.1. Phân lập và định danh mức độ giống các dòng vi khuẩn acid lactic... 20
3.2.2. Khảo sát khả năng chịu pH thấp của vi khuẩn acid lactic được phân lập
................................................................................................................... 21
3.2.3. Khảo sát khả năng ứng dụng trong sản xuất nước cà rốt lên men bằng
vi khuẩn acid lactic ..................................................................................... 21
3.2.4. Định danh dòng vi khuẩn acid lactic có khả năng lên men nước ép cà
rốt tốt nhất .................................................................................................. 22
3.2.5. Khảo sát tỷ lệ pha loãng dịch cà rốt và phối chế đường saccharose ... 23
3.2.6. Khảo sát mật số giống chủng, nhiệt độ và thời gian lên men ............. 25
3.2.7. Khảo sát nhiệt độ và thời gian tồn trữ sản phẩm ................................ 27
3.2.8. Xử lý thống kê .................................................................................. 27
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................... 28
4.1 . Phân lập và định danh mức độ giống các dòng vi khuẩn acid lactic........... 28
4.2. Khả năng chịu pH thấp của vi khuẩn acid lactic được phân lập ................... 31
4.3. Khả năng ứng dụng trong lên men nước cà rốt bằng vi khuẩn acid lactic..... 33
4.4. Kết quả định danh dòng vi khuẩn acid lactic được tuyển chọn cho lên men
nước cà rốt......................................................................................................... 34
4.5. Tỉ lệ pha loãng dịch cà rốt và phối chế đường saccharose trong quy trình sản
xuất dịch cà rốt lên men ..................................................................................... 35
4.6. Ảnh hưởng của mật số giống chủng, nhiệt độ và thời gian lên men ............. 39
4.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tồn trữ sản phẩm................................. 44
Chuyên ngành Công nghệ Snh học
iii
Viện NC&PT Công nghệ Snh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................... 46
5.1. Kết luận ...................................................................................................... 46
5.2. Đề nghị ....................................................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 47
Chuyên ngành Công nghệ Snh học
iv
Viện NC&PT Công nghệ Snh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Đặc điểm của các dòng vi khuẩn acid lactic............................................... 6
Bảng 2. Nhiệt độ phát triển của một số dòng vi khuẩn acid lactic ............................ 9
Bảng 3. Thành phần hóa học của cà rốt ..................................................................17
Bảng 4. Thành phần vitamin và muối khoáng của cà rốt.........................................17
Bảng 5. Tỷ lệ thành phần của môi trường MRS agar .............................................20
Bảng 6. Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn acid lactic ...............................29
Bảng 7. Mật số vi khuẩn trong môi trường MRS lỏng có pH thấp...........................32
Bảng 8. Một số chỉ tiêu sau lên men nước cà rốt.....................................................32
Bảng 9. Một số chỉ tiêu sản phẩm dịch cà rốt lên men ............................................37
Bảng 10. Kết quả đánh giá cảm quan nước cà rốt lên men theo tỉ lệ pha loãng và
nồng độ đường.............................................................................................40
Bảng 11. Kết quả khảo sát ảnh hưởng mật số giống chủng và nhiệt độ, thời gian lên
men............................................................................................................. 42
Bảng 12. Kết quả khảo sát nhiệt độ và thời gian tồn trữ sản phẩm ..........................46
Chuyên ngành Công nghệ Snh học
v
Viện NC&PT Công nghệ Snh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Lactobacillus bulgaricus............................................................................. 5
Hình 2. Lactobacillus cacei ..................................................................................... 5
Hình 3. Streptococcus lactis .................................................................................... 5
Hình 4. Streptococcus thermophilus ........................................................................ 5
Hình 5. Pediococcus pentosaceus ............................................................................ 6
Hình 6. Bifidobacterium .......................................................................................... 6
Hình 7. Lá cà rốt.....................................................................................................15
Hình 8. Củ cà rốt ...................................................................................................16
Hình 9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ pha loãng dịch cà rốt và phối chế
đường saccharose.........................................................................................24
Hình 10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát mật số giống chủng, nhiệt độ và thời gian
lên men ........................................................................................................26
Hình 11. Khuẩn lạc vi khuẩn acid lactic..................................................................28
Hình 12. Vi khuẩn phân lập được từ dịch cà rốt Trung Quốc dưới KHV (X100) ....28
Hình 13. Vi khuẩn phân lập được từ dịch cà rốt Đà Lạt dưới KHV (X100).............29
Hình 14. Hình nhuộm Gram vi khuẩn phân lập được dưới KHV (X100) ................30
Hình 15. Hình thử nghiệm catalase âm tính ............................................................30
Hình 16. Khả năng phân giải CaCO3 của dòng phân lập DLII3...............................30
Hình 17. Sự thay đổi hàm lượng acid lactic theo nồng độ đường và tỉ lệ pha loãng
dịch cà rốt....................................................................................................38
Hình 18. Sự thay đổi mật số vi khuẩn acid lactic theo nồng độ đường và tỉ lệ pha
loãng dịch cà rốt ..........................................................................................38
Hình 19. Hàm lượng acid thay đổi theo mật số giống chủng, thời gian lên men và
nhiệt độ ủ.................................................................................................... 43
Hình 20. Mật số vi khuẩn thay đổi theo mật số giống chủng, thời gian lên men và
nhiệt độ ủ ....................................................................................................43
Hình 21. Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm mật số giống chủng, thời gian lên
men và nhiệt độ ủ ........................................................................................45
Chuyên ngành Công nghệ Snh học
vi
Viện NC&PT Công nghệ Snh học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 34- 2013
Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
CFU
Colony forming unit
KHV
Kính hiển vi
LAB
Lactic acid bacteria
Lb.
Lactobacillus
Ln.
Leuconostoc
MRS
De Man, Rogosa and Sharpe
S.
Streptococcus
Chuyên ngành Công nghệ Snh học
vii
Viện NC&PT Công nghệ Snh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 34-2013
Trường Đại học Cần thơ
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Cùng với nhiều lĩnh vực khoa học phục vụ lợi ích của con người, cuộc cách mạng
khoa học kỹ thuật đưa con người bước vào nền văn minh hiện đại. Khi những nhu cầu
về vật chất được đáp ứng, đời sống con người ngày càng nâng cao cho nên ăn no và ăn
nhiều không còn là nhu cầu chính mà nhu cầu thưởng thức và tìm hiểu tác dụng của
thực phẩm đối với sức khỏe được đặt lên hàng đầu. Từ đó, mối quan hệ giữa các sản
phẩm thực phẩm và chế độ dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe cũng như giúp cơ thể
chống lại được bệnh tật đã trở thành khuynh hướng nghiên cứu của các chuyên gia
dinh dưỡng và các nhà khoa học nhằm tạo ra các sản phẩm có giá trị cao về mặt sinh
học, được gọi là sản phẩm “probiotic” (chế phẩm sinh học). Sản phẩm probiotic được
định nghĩa là “những vi sinh vật không gây bệnh có khả năng tồn tại sau quá trình tiêu
hóa có tác động tích cực đến sức khỏe và sinh lý của vật chủ”.
Vi khuẩn acid lactic (LAB) có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta
từ hơn 2000 năm qua. Chúng được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm probiotic như
sữa chua, nem chua, rau cải muối chua,… Những sản phẩm này không chỉ dùng để ăn
uống mà còn dùng để chữa bệnh đường ruột, dạ dày, do vi khuẩn acid lactic có khả
năng tạo ra kháng sinh ngăn chặn, tiêu diệt các vi khuẩn và vi trùng gây bệnh. Chúng
có khả năng bám vào tế bào; loại trừ hoặc làm giảm sự bám của mầm bệnh; bảo tồn và
nhân nhanh số lượng; sản sinh acid, H2O2, chất kháng sinh có khả năng ngăn chặn sự
phát triển của mầm bệnh; tập hợp và hình thành hệ vi sinh vật bình thường, cân bằng.
Ở Việt Nam, các sản phẩm bổ sung probiotic còn rất hạn chế, chủ yếu được bổ
sung vào sữa. Trong khi đó nước trái cây có thể xem như một môi trường tốt để nuôi
dưỡng những chế phẩm sinh học bởi vì chúng rất giàu chất chống oxy hóa, vitamin,
chất xơ ăn được và khoáng chất. Trong các loại rau quả thì cà rốt khá phổ biến trong
bữa ăn hàng ngày. Ở Việt Nam hiện nay đã có nhiều sản phẩm từ cà rốt xuất hiện trên
thị trường như mứt cà rốt, cà rốt đóng hộp, bánh cà rốt, nước ép cà rốt. Các nghiên cứu
cho thấy, cà rốt rất giàu dinh dưỡng rất tốt cho sức khỏe con người,… Cà rốt còn là
một loại nguyên liệu phổ biến, dễ trồng, giá thành rẻ.
Nhằm để tận dụng nguồn nguyên liệu có sẵn, rẻ tiền và giá trị dinh dưõng cao
cũng như làm đa dạng hoá các sản phẩm chế biến có đặc tính tốt. Chính vì thế, đề tài
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
1
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 34-2013
Trường Đại học Cần thơ
này thực hiện nhằm mục đích phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn acid lactic có
khả năng ứng dụng trong sản xuất nước cà rốt lên men để tạo ra sản phẩm có giá trị về
mặt sinh học.
1.2. Mục tiêu đề tài
Phân lập, tuyển chọn, định danh và nghiên cứu điều kiện lên men nước cà rốt
bằng các dòng vi khuẩn acid lactic để tạo ra sản phẩm có giá trị về mặt sinh học.
Nội dung thực hiện
Để thực hiện mục tiêu trên, đề tài được thực hiện thông qua các bước sau:
-
Phân lập và định danh mức độ giống các dòng vi khuẩn acid lactic.
-
Khảo sát khả năng chịu pH thấp của vi khuẩn acid lactic được phân lập.
-
Khảo sát khả năng ứng dụng trong sản xuất nước cà rốt lên men bằng vi
khuẩn acid lactic.
-
Định danh dòng vi khuẩn có khả năng lên men nước ép cà rốt tốt.
-
Khảo sát tỷ lệ pha loãng dịch cà rốt và tỷ lệ phối chế đường tinh luyện.
-
Khảo sát mật số giống chủng, nhiệt độ và thời gian lên men.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
2
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 34-2013
Trường Đại học Cần thơ
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về vi khuẩn acid lactic
2.1.1. Sơ lược về vi khuẩn acid lactic
Vi khuẩn acid lactic có tên gọi đầy đủ là vi khuẩn acid lactic (Lactic acid bacteria
– LAB) đóng vai trò quan trọng trong một số thực phẩm lên men. LAB là vi khuẩn
Gram (+), oxidase (-), catalase (-), hình cầu hoặc hình que, không hình thành bào tử.
Chúng tạo ra acid lactid như là sản phẩm chính của quá trình lên men carbohydrate
(glucose và lactose). Theo Lương Đức Phẩm (2002) thì vi khuẩn acid lactic thường có
dạng hình cầu (hoặc hình ovan) và hình que. Đường kính của các dạng cầu lactic từ
0,5-1,5 μm, các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích
thước tế bào vi khuẩn acid lactic từ 1-8 μm, vi khuẩn đứng riêng lẻ hoặc kết thành
chuỗi.
Các vi khuẩn ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng thích hợp là 35ºC, các loài ưa nhiệt
có nhiệt độ thích hợp ở 40-45ºC, ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (5ºC
hoặc thấp hơn). Khi gia nhiệt tới 60-80ºC hầu hết chúng bị chết sau 10-30 phút. Trong
tự nhiên vi khuẩn acid lactic thường gặp trong đất, không khí, trong nước nhưng chủ
yếu ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (trên các loại rau, quả, sữa, thịt,…) (Lương
Đức Phẩm, 2002).
Theo Axelsson (2004) có một đặc tính quan trọng dùng để phân biệt các giống vi
khuẩn acid lactic là dựa vào phương thức lên men glucose dưới những điều kiện chuẩn
như không giới hạn nồng độ glucose và các yếu tố tăng trưởng (các amino acid, các
vitamin, nucleic acid) nhưng giới hạn oxy. Dưới những điều kiện này, vi khuẩn acid
lactic được chia thành hai nhóm là: vi khuẩn acid lactic đồng hình và vi khuẩn acid
lactic dị hình. Đa số các vi khuẩn acid lactic đồng hình tạo thành acid cao hơn (khoảng
2,0-3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các vi khuẩn này có thể phát triển ở pH trong
khoảng 3,8-4,0. Hoạt lực lên men tốt nhất của vi khuẩn ở vùng pH trong khoảng 5,56,0 (Lương Đức Phẩm, 2002).
● Vi khuẩn acid lactic đồng hình: là những vi khuẩn khi lên men trong các
nguyên liệu có chứa đường tạo ra sản phẩm chủ yếu là acid lactic. Các chủng tham gia
trong kiểu lên men này chủ yếu là hai giống: Lactobacillus và Streptococcus.
+ Giống Lactobacillus với một số loại điển hình như:
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
3
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 34-2013
Trường Đại học Cần thơ
▪ Lactobacillus bulgaricus, nhiệt độ thích hợp cho lên men là 40-42ºC (vi
khuẩn ưa nóng).
▪ Lactobacillus plantarum, nhiệt độ tối ưu cho lên men là 30ºC (vi khuẩn ưa
ấm).
▪ Lactobacillus delbrueckii, nhiệt độ thích hợp cho lên men là 45-50ºC.
▪ Lactobacillus acidophilus, nhiệt dộ tối ưu cho lên men là 37-40ºC.
+ Giống Streptococcus với một số loại điển hình như:
▪ Streptococcus lactis có khả năng lên men sữa, nhiệt độ để phát triển tốt là
30-35ºC.
▪ Streptococcus cremoris, lên men sữa, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và
lên men là 25ºC.
Nhìn chung, hai giống trên lên men tốt monosaccharide và disaccharide nhưng
hoàn toàn không lên men được tinh bột và glucose phức tạp khác (Lương Đức Phẩm,
2001).
● Vi khuẩn acid lactic dị hình: Là những vi khuẩn khi lên men trong các nguyên
liệu có chứa đường nhưng chỉ tạo ra acid lactic với một lượng ít, còn lại là các sản
phẩm khác như ethanol, acid acetic, acid propionic,… Cũng giống như vi khuẩn acid
lactic đồng hình, hai giống (Lacbobacillus và Streptococcus) cũng được nghiên cứu và
ứng dụng nhiều trong lên men với một số loài điển hình như: Lactobacillus brevis,
Lactobacillus pasteurianus, Streptococcus falcalis, Streptococcus cumoris (Nguyễn
Đức Lượng, 2006).
2.1.2 Một số giống vi khuẩn acid lactic
* Lactobacillus
Vi khuẩn Lactobacillus đều là Gram dương, kích thước 0,5-1,1 μm đôi khi lên tới
1,6 μm, dạng trực khuẩn nhỏ, thường kết đôi hoặc chuỗi. Nhiệt độ thích hợp để
Lactobacillus sinh trưởng là 30-40ºC và pH từ 5,5-6,2. Lactobacillus phát triển dưới
điều kiện kỵ khí hoặc thiếu oxy. Khuẩn lạc có dạng bìa liền, lồi, nhẵn, sáng (Kandler
và Weiss, 1986).
Tùy và điều kiện môi trường sống, hình dạng của vi khuẩn Lactobacillus thay đổi
từ que ngắn đến que dài, sắp xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ. Lactobacillus chiếm
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
4
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 34-2013
Trường Đại học Cần thơ
phần lớn nhóm vi khuẩn sinh acid lactic, chúng rất phổ biến và thông thường là có lợi
(Hồ Nhân, 2008).
Hình 1. Lactobacillus bulgaricus
Hình 2. Lactobacillus cacei
(Nguồn:http://www.nsl.hcmus.edu.vn ngày 21/1/2013)
* Streptococcus
Giống Streptococcus có dạng hình cầu hoặc hình ovan, đường kính tế bào
0,5-1,0 μm. Sau khi phân chia chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn.
Streptococcus thuộc dạng lên men acid lactic đồng hình, Gram dương, catalase âm
tính, không sinh bào tử, không di động và kỵ khí tùy ý (Nguyễn Đức Lượng, 2006).
Hình 3. Streptococcus lactis
Hình 4. Streptococcus thermophilus
(Nguồn: http://www.nsl.hcmus.edu.vn ngày 21/1/2013)
* Leuconostoc
Giống Leuconostoc có đường kính từ 0,5-0,8 μm và chiều dài 1,6 μm, trong một
số điều kiện chúng cũng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1,3 μm. Sau khi phân chia
Leuconostoc thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung (Nguyễn Đức
Lượng, 2006).
Leuconostoc thường là vi khuẩn kị khí không bắt buộc và nhu cầu cao về dinh
dưỡng. Leuconostoc phái triển từ 20-30ºC và không phát triển ở 40ºC. Đó là những
giống lây nhiễm thường xuyên trong thực phẩm và gây ra những rủi ro trong quá trình
sản xuất nhất là trong các sản phẩm đường, sản phẩm acid hay trong các sản phẩm
thực vật khác. Leuconostoc có vai trò chính trong quá trình lên men malolactic của
rượu vang và chúng cần thiết cho sự lên men của một và loại phômai. Ngoài ra,
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
5
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 34-2013
Trường Đại học Cần thơ
Leuconostoc cũng tham gia trong việc chế biến các sản phẩm thức ăn gia súc lên men
và trong các sản phẩm rau quả lên men (Roissart và Luquet, 1994; Guiraud, 1998).
Leuconostoc thuộc nhóm lên men dị hình, catalase âm tính. Leuconostoc phát
triển chậm, thường gây nên môi trường có độ nhớt cao mặc dù chúng có thể tạo ra các
hợp chất thơm như axetyle, axetole,... (Larpent, 1997).
* Pediococcus
Pediococcus có dạng tứ cầu hoặc song cầu. Pediococcus cần nhu cầu dinh dưỡng
cao và hoạt tính thủy phân protein yếu. Khuẩn lạc có màu vàng xanh, kích thước
khuẩn lạc 1-3 μm, hình dạng khuẩn lạc trong láng (Nguyễn Thành Đạt, 2001).
Hình 5: Pediococcus pentosaceus
Hình 6: Bifidobacterium
(Nguồn:http://www.google.com.vn/search?num=10&hl=vi&site=imghp&tbm=isch&source=hp&biw
=1280&bih,ngày 21/11/2013)
* Bifidobacterium
Khi mới phân lập, chúng là những trực khuẩn có thể phân nhánh có dạng chữ Y,
V, tập hợp thành khối. Sau nhiều lần cấy truyền, chúng trở thành trực khuẩn thẳng
hoặc hơi uốn cong. Lên men acid lactic và acid acetic.
Bảng 1. Đặc điểm của các nhóm vi khuẩn acid lactic
(Nguồn: Nguyễn Thành Đạt, 2001)
Tế bào
Kiểu lên men
Giống
Hình
Sắp Xếp
Streptococcus
Cầu
Chuỗi
Lactic đồng hình
Pediococcus
Cầu
Tứ cầu
Lactic đồng hình
Lactobacillus
Que
Chuỗi
Lactic đồng hình và di hình
Leuconostoc
Cầu
Chuỗi
Lactic dị hình
Bifidobacterium
Khác nhau tùy loài
Nhiều dạng
Lên men acid lactic và acetic
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
6
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 34-2013
Trường Đại học Cần thơ
2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn acid lactic
a. Dinh dưỡng carbon
Vi khuẩn acid lactic sử dụng nguồn năng lượng chính từ các nguồn đường monovà disaccharide như glucose, lactose, saccharose, maltose và các acid hữu cơ như acid
citric, malic, pyruvic, fumaric,… làm nguồn năng lượng và trao đổi cấu trúc. Khi
không có mặt cơ chất nguồn carbon, vi khuẩn sẽ sử dụng nguồn năng lượng và vật liệu
tế bào là các acid amin (acid glutamic, arginine, tyrosine,…). Khi acid amin được sử
dụng, CO2 sẽ tách ra ngoài. Như là một quy luật, các vi khuẩn không sử dụng nguồn
carbon là polysaccharide (ngoại trừ một loài Lb. delbrueckii).
b. Dinh dưỡng nitơ
Theo nhu cầu dinh dưỡng nitơ, vi khuẩn acid lactic có thể chia làm 3 nhóm:
- Các phức hợp acid amin (nhóm chịu nhiệt Thermobacterium)
- Phát triển trên môi trường có cystein và muối amoni (nhóm Streptobacterium)
- Phát triển trên môi trường có nguồn nitơ duy nhất là muối amoni (nhóm
Streptococcus).
Do phần lớn vi khuẩn acid lactic không có khả năng tổng hợp được các dạng nitơ
hữu cơ phức tạp vì vậy chúng cần hỗn hợp acid amin, dịch thuỷ phân protein từ casein,
bột đậu tương, khô lạc,… làm nguồn pepton, peptid và những hợp chất acid amin khác
nhau có trong môi trường.
c. Nguồn vitamin
Vi khuẩn acid lactic nói chung, đặc biệt là trực khuẩn rất cần vitamin làm nguồn
chất sinh trưởng.
Người ta xác định được rằng, yêu cầu về vitamin riêng biệt của vi khuẩn acid
lactic có thể thay đổi khi trong môi trường có các acid amin hoặc acid béo và
dezoxyribozide khác nhau. Kiềm purine cũng ảnh hưởng tới nhu cầu của vi khuẩn về
acid N-aminobenzoic, nhu cầu về acid folic giảm nhiều nếu như môi trường có chứa
tất cả các acid amin; thymine hoặc thydimine, kiềm purine được tổng hợp nhờ vi
khuẩn trong sự tham gia của acid folic.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
7
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 34-2013
Trường Đại học Cần thơ
d. Các chất vô cơ
Để phát triển và hoạt động sống các vi khuẩn acid lactic cũng cần các hợp chất vô
cơ như đồng, sắt, natri, phospho, iôt, lưu huỳnh, mangan, đặc biệt là mangan có tác
dụng phòng ngừa tế bào bị tự phân.
Vi khuẩn làm giảm độ acid có trong môi trường cần có phức hợp các chất
khoáng. Cầu khuẩn lên men acid lactic dị hình không phát triển được trên môi trường
đã làm sạch các chất khoáng nhờ trao đổi ion. Khi vi khuẩn đã kém hoạt lực có thể cho
chúng hoạt hoá ở môi trường đã được bổ sung ion K+ cùng Mg2+ hoặc Mn2+.
e. Oxy
Vi khuẩn acid lactic không có hệ thống vật chất điện tử tham gia vào hô hấp,
nhưng chúng lại thực hiện được hô hấp nhờ hoạt tính của một số hợp chất có mặt của
hệ flavoprotein.
Quan hệ giữa các loài vi khuẩn với oxy ở mức độ hiếu khí của môi trường khác
nhau là rất khác nhau, thậm chí còn đối nghịch nhau. Trong điều kiện kỵ khí nghiêm
ngặt chỉ làm cho trực khuẩn lên men dị hình chậm phát triển khi ban đầu, còn đối với
trực khuẩn lên men đồng hình sinh trưởng bị giảm 10%, lên men giảm 23%.
Các loài lên men dị hình sinh trưởng tốt nhất ở điều kiện kỵ khí, các loài không
sử dụng pentose thì phát triển rất kém trong điều kiện này.
f. Nhiệt độ
Nhiệt độ phát triển của các vi khuẩn acid lactic khác nhau thì khác nhau, tuy
nhiên đại bộ phận vi khuẩn acid lactic bị ức chế hoạt động ở nhiệt độ 45 oC trở lên.
Riêng loài Lactobacillus delbrueckii là loài chịu ở nhiệt độ 50oC phát triển và hoạt
động mạnh mẽ.
g. pH môi trường
Các chủng vi khuẩn acid lactic chịu được pH thấp khác nhau, đối với vi khuẩn
tách từ rượu vang có thể chịu được pH 3,0-3,5 hoặc thấp hơn, các chủng tách từ dưa,
mắm chua chịu được pH 3,7 trở lên,... (Lê Mỹ Hồng, 2000)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
8
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 34-2013
Trường Đại học Cần thơ
Bảng 2. Nhiệt độ phát triển của một số dòng vi khuẩn acid lactic
Nhiệt độ phát triển (oC)
Loài
Tối thiểu
Tối ưu
Tối đa
Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus
22
45
52
Lb. delbrueckii subsp. Lactic
18
40
50
Lb. helveticus
22
42
54
Lb. acidophilus
27
37
48
Lb. kefir
8
32
43
Lb. brevis
8
30
42
Lb. casei subsp. casei
30
S. thermophilus
22
40
52
Ln. mesenteroides subsp. cremoris
4
20-28
37
Ln. mesenteroides subsp. dextranicum
4
20-28
37
Bifidobacterium (bifidum, infantis,…)
22
37
48
(Nguồn: Lê Xuân Phương, 2005)
2.1.4 Một số ứng dụng của vi khuẩn acid lactic (LAB)
- Trong công nghệ sản xuất acid lactic
Tất cả vi khuẩn acid lactic đều có khả năng tạo acid lactic thông qua lên men các
loại đường. Tuy nhiên, chỉ có những loài lên men đồng hình mới được sử dụng trong
sản xuất acid lactic như Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus bulgaricus,
Lactobacillus helveticus. Acid lactic có thể được sản xuất từ nhiều loại nguyên liệu
khác nhâu như: củ cải đường, rỉ đường, dịch thủy phân tinh bột, cellulose. Các công ty
hàng đầu như: ADM và Purae Biochem hiện sử dụng dich thủy phân bắp làm nguyên
liệu trong sản xuất acid lactic (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2006).
- Trong công nghệ thực phẩm:
+ Sản xuất rau cải muối chua: Trong quá trình lên men các loại rau cải muối chua
LAB làm tăng quá trình chuyển hóa các hợp chất trong nguyên liệu thành các hợp chất
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
9
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 34-2013
Trường Đại học Cần thơ
mong muốn như L- acid lactic hoặc các amino acid, tích luỹ những hợp chất ngon và
làm giảm những hợp chất không mong muốn (Maki, 2004).
+ Sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa: Trong các sản phẩm lên men từ sữa
như: sữa chua, phô mai, bơ,… LAB biến đổi đường lactose có trong sữa thành acid
lactic và một số sản phẩm phụ có tác dụng nâng cao phẩm chất sản phẩm, đặc biệt là
hương vị (Lương Đức Phẩm, 2001).
+ Sản xuất tương: Trong sản xuất tương quá trình lên men acid lactic bởi LAB
tạo pH thích hợp cho sản phẩm và làm tăng hương vị sản phẩm (Nguyễn Đức Lượng,
2006).
+ Sản xuất sản phẩm sinh học dùng trong thực phẩm: Mannitol là một polyol
hoặc sugar alcohol được sản xuất bởi LAB có thể được ứng dụng trực tiếp trong sản
xuất thực phẩm, điều này làm cho các sản phẩm thực phẩm được lên men có giá trị
dinh dưỡng hơn (Wisselink et al., 2002).
+ Trong bảo quản thực phẩm: LAB có hai tác dụng chính.
▪ Một số loài LAB sản xuất kháng sinh sinh học được gọi chung là bacteriocin
có khả năng ức chế sự phát triển của những mầm bệnh như Listeria, Clotridium,
Staphylococcus, Bacillus spp., và Enterococcus spp., làm tăng thời gian sử dụng của
sản phẩm (Soomro et al., 2002).
▪ Hình thành acid lactic làm cho pH môi trường thấp qua đó ức chế sự tăng
trưởng của hầu hết những vi khuẩn gây hư hỏng khác giúp kéo dài thời hạn sử dụng
thực phẩm (Severi et al., 1997).
+ Trong y học: Probiotic là tên gọi chung của các chế phẩm sinh học có chứa
chủng vi khuẩn có lợi mà phổ biến là LAB giúp cải thiện cân bằng vi khuẩn trong
đường ruột (Fuller, 1991).
2.2 Lên men acid lactic
2.2.1 Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men acid lactic
Lên men acid lactic là một trong những quá trình sinh hoá phổ biến trong thiên
nhiên, đó là quá trình chuyển hoá các chất glucose thành acid lactic nhờ hoạt động
sống trực tiếp của hệ vi khuẩn acid lactic.
Trong thiên nhiên, vi khuẩn acid lactic tồn tại dưới hai dạng:
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
10
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -