Tài liệu Luận văn thạc sỹ sinh học- nghiên cứu phân lập nấm purpureocillium lilacinum để phòng trừ tuyến trùng bướu rễ meloidogyne sp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Ngô Thị Thu Hà NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP NẤM PURPUREOCILLIUM LILACINUM ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG BƯỚU RỄ MELOIDOGYNE SP. LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Ngô Thị Thu Hà NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP NẤM PURPUREOCILLIUM LILACINUM ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG BƯỚU RỄ MELOIDOGYNE SP. Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN HỮU PHÚC Thành phố Hồ Chí Minh - 2013 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Hữu Phúc, Th.s Dương Đức Hiếu, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong quá trình làm luận văn này. Em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn vi sinh đã giảng dạy, chỉ dẫn cho em trong suốt quá trình học tập. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị làm việc tạiviện Sinh học Nhiệt Đới đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài. Con xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người đã xin ra con nuôi nấng, dạy dỗ và luôn động viên con trong những lúc con gặp khó khăn. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khoá vi sinh vật 22 đã cùng em chia sẽ những khó khăn trong quá trình học tập. 1 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 1 MỤC LỤC .................................................................................................................... 2 BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT ..................................................................................... 5 MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 6 1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................................ 6 2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................................... 6 3. Nhiệm vụ ......................................................................................................................... 7 4. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................................... 7 5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 7 6. Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu ...................................................................... 7 7. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu ...................................................................... 7 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 8 1.1. Giới thiệu chung về nấm Purpureocillium lilacinum ............................................... 8 1.1.1 Vị trí phân loại..........................................................................................................8 1.1.2. Lịch sử nghiên cứu ..................................................................................................9 1.1.3. Đặc điểm sinh học ...................................................................................................9 1.1.4. Vai trò của Purpureocillium lilacinum ..................................................................10 1.1.5. Tình hình ứng dụng nấm Purpureocillium lilacinum trong phòng trừ tuyến trùng ở Việt Nam và trên thế giới .............................................................................................12 1.2. Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. ..................................................................... 13 1.2.1. Đặc trưng sinh học ................................................................................................13 1.2.2. Các loài quan trọng ...............................................................................................15 1.2.3. Cơ sở phòng trừ tuyến trùng .................................................................................15 1. 3. Các yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh trưởng của nấm sợi ............................ 22 1.3.1. Các phương pháp nuôi cấy nấm sợi .....................................................................22 1.3.2. Môi trường nuôi cấy ..............................................................................................24 1.3.3. Các hợp chất cung cấp nguồn cacbon ...................................................................24 1.3.4. Các hợp chất cung cấp nguồn nitrogen .................................................................24 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 25 2. 1. Vật liệu ...................................................................................................................... 25 2. 2. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................................. 25 2. 3. Hóa chất .................................................................................................................... 25 2 2. 4. Môi trường ................................................................................................................ 26 2.4.1. Môi trường phân lập, giữ giống nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường potato glucose agar-PGA ) ..............................................................................................26 2.4.2. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của pH, nguồn nitơ, nguồn cacbon, đến sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum (môi Czapek-Dox Broth) 26 2.4.3. Môi trường quan sát vi thể nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường YEA) .26 2. 5. Các phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 26 2.5.1. Phương pháp phân lập ...........................................................................................26 2.5.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng .........................................................27 2.5.3. Phương pháp quan sát hình thái và định danh nấm sợi .........................................28 2.5.4. Phương pháp định danh nấm sợi bằng sinh học phân tử ......................................28 2.5.5. Phương pháp lọc tĩnh thu tuyến trùng ..................................................................29 2.5.6. Phương pháp đếm tuyến trùng .............................................................................29 2.5.7. Phương pháp định danh tuyến trùng bằng hình thái ............................................30 2.5.8. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng bởi nấm Purpureocillium lilacinum trong điêù kiện in vitro ..................................................................................31 2.5.9. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum ...........................................................32 2.5.10. Phương pháp xác định sinh khối theo Egorov ...................................................33 2.5.11. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật.............................................33 2.5.11. Các phương pháp khác ........................................................................................33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 34 3.1. Phân lập và định danh chủng nấm có khả năng diệt tuyến trùng ....................... 34 3.1.1. Phân lập .................................................................................................................34 3.1.2. Định danh ..............................................................................................................34 3.2. Kết quả định danh tuyến trùng .............................................................................. 38 3.3. Kết quả khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp. trong diều kiện in vitro ....................................................................................................................... 40 3.3.1. Kết quả khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng cái loài Meloidogyne sp. trong điều kiện in vitro..............................................................................................................40 3.3.2 Kết quả thử nghiệm in vitro nấm Purpureocillium lilacinum trên trứng tuyến trùng Meloidogyne sp. trên cây chuối ......................................................................................42 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum ......................................................... 45 3.4.1 Ảnh hưởng của pH .................................................................................................45 3.4.2 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ và nguồn Cacbon .......................................................49 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 59 3 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 60 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 64 4 BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT C: cacbon N: nitơ PGA: potato glucose agar 5 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam là một nước có nền nông nghiệp lâu đời. Hàng năm chúng ta cung ứng rất nhiều mặt hàng nông sản cho nhu cầu thương mại trong nước và còn xuất khẩu sang các nước. Các mặt hàng nông sản xuất khẩu tiêu biểu như: gạo, cà phê, cao su hay những mặt hàng nông sản trái cây với sản lượng lớn góp phần làm giàu cho nền kinh tế đất nước. Tuy nhiên, sản lượng nông sản thu hoạch hàng năm không ổn định có khi thất thoát. Nguyên nhân gây ra thực trạng trên có thể là do ảnh hưởng của khí hậu, thiên tai và đặc biệt là dịch bệnh. Dịch bệnh ở cây trồng do các tác nhân sinh học gây ra như: virut, nấm, tuyến trùng...thì trong số các đối tượng đó vấn đề bệnh do tuyến trùng gây ra chưa được nghiên cứu nhiều dẫn đến việc phòng bệnh gặp nhiều khó khăn. Tác hại do tuyến trùng gây ra đối với thực vật thường là tương đối nhẹ, tuy nhiên khi mật độ ký sinh lớn chúng có thể gây hại nghiêm trọng, thậm chí chúng có thể gây chết thực vật. Tuyến trùng ký sinh có thể làm giảm 12,5 % sản lượng cây trồng và thiệt hại do tuyến trùng ký sinh đối với cây trồng nông nghiệp ước tính là hàng trăm tỷ USD mỗi năm. Tuyến trùng thực vật sống và ký sinh ở tất cả các phần của thực vật đang phát triển, hoa, lá, hạt, thân và rễ, trong đó rễ là nơi gặp nhiều nhóm tuyến trùng ký sinh nhất. Tiểu biểu như nhóm tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne spp. ký sinh ở rễ một số cây như cà phê, hồ tiêu, cà chua, cà rốt... gây ra những tổn thất đáng kể đặc biệt là những mặt hàng nông sản thế mạnh như cà phê, hồ tiêu. Để phòng trừ bệnh tuyến trùng rễ trên các đối tượng cây trồng trên có các biện pháp như: dùng các tác nhân cơ học, hoá học, sinh học...Trong số các biện pháp trên thì biện pháp phòng trừ tuyến trùng bằng các tác nhân sinh học như dùng các loại vi khuẩn Pasteuria penetrans, nấm (Nematoctonus concurrens và N. haptocladus, Purpureocillium lilacinum...) đang rất được quan tâm. Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu phân lập nấm Purpureocillium lilacinum để phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.”. 2. Mục tiêu của đề tài - Góp phần nghiên cứu khả năng phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.bởi các tác nhân sinh học là nấm Purpureocillium lilacinum. 6 3. Nhiệm vụ - Phân lập nấm Purpureocillium lilacinum từ côn trùng bị bệnh. - Phân loại đến loài chủng nấm Purpureocillium lilacinum. - Phân loại đến giống tuyến trùng Meloidogyne sp. - Thử nghiệm in vitro khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp. của nấm Purpureocillium lilacinum. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển sinh khối và hình thành bào tử nấm Purpureocillium lilacinum. 4. Đối tượng nghiên cứu - Chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ côn trùng bị bệnh. - Tuyến trùng Meloidogyne sp. phân lập từ đất và rễ cây chuối bị bệnh tuyến trùng. 5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Địa điểm: Công ty TNHH Gia Tường, chi nhánh số 7 đại lộ Độc Lập, khu công nghiệp Sóng Thần 1, huyện Dĩ An , tỉnh Bình Dương. Viện sinh học nhiệt đới, Số 9/621 Xa Lộ Hà Nội, KP. 6, P. Linh Trung, Quận Thủ Đức, TP.HCM. Thời gian thực hiện: từ tháng 10/2012 đến tháng 9/2013 6. Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu Góp phần tìm hiểu về đặc điểm sinh học,điều kiện nuôi cấy và khả năng diệt tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp. của Purpureocillium lilacinum. 7. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu Trên cơ sở những kết quả thu được trong quá trình khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng bướu rễ chủng vi sinh Purpureocillium lilacinum từ đó ứng dụng vào sản xuất các chế phẩm đặc trị tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp. cho cây trồng. 7 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về nấm Purpureocillium lilacinum 1.1.1 Vị trí phân loại − Giới (Kingdom) : Nấm − Ngành (Division): Ascomycota − Lớp (Class): Sordariomycetes − Bộ (Order): Hypocreales − Họ (Family): Ophiocordycipitaceae − Chi (Genus) : Purpureocillium (theo Luangsa-ard, Hywel-Jones, Houbraken & Samson (2011)) − Loài: Purpureocillium lilacinum (Thom) Luangsa-ard, Hou- braken, Hywel-Jones & Samson (2011) Tên đồng nghĩa: Paecillium Luangsa-ard, Hywel-Jones & Samson (2007); Penicillium lilacinum Thom (1910); Penicillium amethystinum Wehmer (1923) Spicaria rubidopurpurea Aoki (1941) Purpureocillium lilacinum (Thom) Samson (1974). Purpureocillium là một chi nấm trong họ Ophiocordycipitaceae. Chi đơn loài có chứa loài duy nhất là Purpureocillium lilacinum, là loài nấm sợi hoại sinh phổ biến. Nó đựơc phân lập từ một loạt các môi trưòng sống bao gồm đất trồng và đất bỏ hoang, rừng, đồng cỏ, sa mạc, trầm tích cửa sông, bùn cặn nứơc thải và côn trùng. Nó cũng đã đựơc tìm thấy trong trứng giun tròn, tuyến trùng nang. Ngoài ra nó còn đựơc phát hiện thường xuyên trong vùng rễ của nhiều loại cây trồng. Chúng có thể phát triển ở phạm vi nhiệt độ rộng từ 8-38 oC, và nhiệt độ sinh trưỏng tối ưu trong khoảng 26-30 oC. Nó cũng có khả năng chịu đựng pH rộng 2-10 và có thể phát triển trên nhiều loại bề mặt khác nhau. Purpureocillium lilacinum đựơc cho là có tiềm năng sử dụng để kiểm soát sự phát triển của tuyến trùng rễ [16],[19]. 8 1.1.2. Lịch sử nghiên cứu Các loài đựơc mô tả bởi nhà nấm học người Mỹ Charles Thom vào năm 1910 với tên gọi Penicillium lilacinum. Vào năm 1974 Charles Thom chuyển các loài này thành Paecilomyces. Những ấn phẩm trong thập niên 20 chỉ ra chi Paecilomyces không phải là đơn ngành mà có quan hệ mật thiết với Paecilomyces nostocoides, Isaria takamizusanensis and Nomuraea atypicola. Chi mới Purpureocillium được tạo ra để tổ chức các đơn vị phân loại. Tên gọi chung này đề cập đến các bào tử tím được tạo ra bởi nấm này. 1.1.3. Đặc điểm sinh học Purpureocillium lilacinum tạo thành một sợi nấm dầy đặc làm phát sinh cành bào tử phân sinh. Phần cuối của thể bình mang những bào tử được xếp thành chuỗi. Bào tử nảy mầm khi có độ ẩm và chất dinh dưỡng thích hợp. Khuẩn lạc trong môi trường thạch Malt phát triển nhanh, đạt đuờng kính 5-7cm trong vòng 14 ngày ở 15oC, bao gồm những sợi nấm khí sinh ban đầu có màu trắng nhưng khi hình thành bào tử thì có sự thay đổi sắc thái thành màu đỏ rượu vang. Sợi dinh dưỡng có thành bao trơn, trong suốt, kích thứơc 2.5-4 mm. Cuống sinh bào tử phát sinh từ sợi ký sinh hoặc phát sinh từ sợi nấm khí sinh. Cuống sinh bào tử dài khoảng 400-600 μm. Thể bình gồm một phần đuôi phình to, thon dần ở phần đầu giống như một cái cổ. Bào tử trong chuỗi có nhiều hình dạng từ elip đến hình thoi. Bào tử có thành trơn đến hơi nhám. Không có bào tử chống chịu [19]. 9 Hình 1.1: Khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum (hình bên trái), cấu tạo vi thể nấm Purpureocillium lilacinum (hình bên phải) [36] 1.1.4. Vai trò của Purpureocillium lilacinum a. Tác nhân kiểm soát tuyến trùng Purpureocillium lilacinum là một loài nấm bông phổ biến với phạm vi phân bố rộng trên toàn thế giới (Samson, 1974) và đã được thử nghiệm rộng rãi nhất cho sự kiểm soát của bệnh sần rễ và u nang tuyến trùng. Purpureocillium lilacinum sử dụng chủ yếu trong điều kiện nhiệt đới, ví dụ như, ở Philippines (Jatala, 1986) và Cộng hòa Nam Phi (Neethling, 2002). Loài này có hiệu quả chống lại các loài tuyến trùng khác nhau gây bệnh thực vật, và chủ yếu lây nhiễm trứng và con cái tuyến trùng (Amancho và Sasser năm 1995; Borisov năm 1998; Pandey và Trivedi, 1990; Silva và cộng sự, 1992;. Sosnowska năm 2001; Zaki, 1994). Wang và cộng sự. (2001). Quan sát một số nhiễm trùng giai đoạn ấu trùng ở Đông Trung Quốc có sự khác biệt lớn trong khả năng gây bệnh giữa các chủng Purpureocillium lilacinum (Rodriguez- Kabana et al., 1984). Ở Ba Lan, một dòng nội địa của loại nấm này loài được nghiên cứu như một tác nhân sinh học tiềm năng chống lại tuyến trùng sần rễ trong nhà kính (Sosnowska, 2003). Hiện nay, Purpureocillium lilacinum là loài nấm chỉ có mục đích thương mại để kiểm soát tuyến trùng, sâu bệnh ở châu Âu, và chủng nấm 251 thương mại được đăng ký để bán ở một số nước (Atkins et al., 2005). Bởi vì nó được phân loại như một microbiopesticide [23]. Cơ chế tấn công trứng tuyến trùng: Trứơc khi xâm nhiễm vào trứng tuyến trùng, Purpureocillium lilacinum áp sát vào bề mặt trứng và trở nên sát gần với trứng. Purpureocillium lilacinum sản xuất những tế bào chuyên biệt điển hình để lây nhiễm ở khắp nơi trên bề mặt trứng của tuyến trùng. Những tế bào chuyên biệt tương tự như những mấu lồi ở phần cuối của một sợi nấm giúp áp sát vỏ trứng. Sau khi sợi nấm xâm nhập vào vỏ trứng chúng nhanh chóng phá huỷ ấu trùng bên trong sau đó sợi nấm tạo thành cuống sinh bào tử ra phía ngoài xâm nhiễm các trứng liền kề [19]. 10 Hình 1.2: Cơ chế tấn công trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. bởi nấm Purpureocillium lilacinum [42] Hình 1.3: Trứng của tuyến trùng Meloidogyne javanica bị nhấn chìm bởi sợi nấm Purpureocillium lilacinum b. Sản xuất một số enzym Nhiều enzym đựơc sản xuất bởi Purpureocillium lilacinum đã đựơc nghiên cứu như: serine protease một loại enzym chống lại trứng của tuyến trùng Meloidogyne hapurpureocillium lilacinuma: protease và chitinase có thể làm suy yếu vỏ trứng của tuyến trùng [16],[19]. c. Kháng khuẩn Purpureocillium lilacinum khi được nuôi cấy lên men chìm người ta đã chiết tách được hoạt chất sinh học có tên gọi là leucinostatins. Leucinostatins là một peptide trung tính với cấu trúc gồm: α-aminoisobutyric acid, L-leucine, β-alanine và theo sau bởi 3 acid amin bất thường (L-threo- β-hydroxy leucine, 2-amino-2-hydroxy-4-methyl-8 oxodecanoicacid và cis-4-methyl-L-proline (theo Mori et al. 1982).Leucinostatins có 6 loại đã được môt tả là A, B, C, D, E, F. Leucinostatins có khả năng kháng khuẩn, chống lại vi khuẩn Gram dương và nhiều loại nấm (theo Fukushima et al. 1983 a,b). Tuy nhiên trong cơ chế kiểm soát tuyến trùng không có sự tham gia của loại độc tố này [9]. 11 1.1.5. Tình hình ứng dụng nấm Purpureocillium lilacinum trong phòng trừ tuyến trùng ở Việt Nam và trên thế giới a. Các sản phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum trên thế giới Một số chế phẩm diệt tuyến trùng được sản xuất từ nấm Purpureocillium lilacinum trên thị trường thế giới Hình 1.4: Một số chế phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum trên thị trường thế giới [40] b. Các sản phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum ở Việt Nam + Tuyến trùng: Sử dụng nấm đối kháng Paecilomyces (Palila 500 WP) liều lượng theo khuyến cáo, hoạt chất Cytokinin (Sincosin + Agrispon) 0,2%; Etobon 0,56 SL, tưới gốc nồng độ: 0,125 ml/lít nước; 3.000-5.000 lít nước/ha, Vimoca 10G rải quanh gốc (30g/gốc tưới đẫm nước). PALILA : ( Purpureocillium lilacinum 500 triệu bào tử/g) Sản phẩm đặc trị tuyến trùng, ngăn ngừa bênh chết nhanh chết chậm trên tiêu và nhiều loại cây trồng khác, làm khoẻ lại bộ rễ và hút dinh dưỡng tốt hơn. Đặc biệt thử nghiệm hiệu quả trên cao su, cà phê, hồ tiêu, đã khảo nghiệm và chất lượng đuợc khẳng đinh tại Đơn Dương- Đức Trọng, Chư sê, Daksong…. 12 Trên cây trồng: cải bắp ( sú) , hồ tiêu, cà phê…. [40]. 1.2. Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. Tuyến trùng sần rễ (root-knot nematodes) được coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng nhất. Nhóm tuyến trùng này phân bố rộng khắp thế giới và ký sinh ở hầu hết các cây trồng quan trọng ở các vùng khí hậu khác nhau. Chúng gây nên giảm sản lượng thu hoạch cũng như chất lượng sản phẩm cây trồng. Hiện nay đã thống kê khoảng gần 80 loài ký sinh thuộc chi này, trong đó có 4 loài ký sinh gây hại quan trọng nhất là: M. incognita, M. arenaria, M. javanica và M. hapurpureocillium lilacinuma. Đây là các loài phân bố rộng và gây hại lớn ở các vùng nông nghiệp trên thế giới. Ngoài ra một số loài khác mặc dù cũng gây hại quan trọng nhưng chúng chỉ gây hại ở 1-2 cây trồng và phân bố hẹp [18]. 1.2.1. Đặc trưng sinh học Trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra ngoài trong một bọc gelatine (còn gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt của sần rễ. Đôi khi các bọc trứng này cũng có thể nằm bên trong nốt sần. Sau quá trình phát triển phôi thai, trứng phát triển thành ấu trùng tuổi 1 ngay bên trong trứng. Lần lột xác thứ nhất xảy ra trong trứng và phát triển thành ấu trùng tuổi 2. Trứng nở ra ấu trùng tuổi 2 dạng cảm nhiễm (infective juvenile = IJ2) không cần có sự kích thích của rễ thực vật. Hình 1.5: Tuyến trùng cái Meloidogyne sp. và khối trứng http://www.tstcantho.com.vn/?mod=article&id=193§ion_id=3 Chuẩn bị xâm nhập vào rễ IJ2 tập trung dọc theo các tế bào non ngay tại phía sau vùng đỉnh rễ. IJ2 thường tấn công vào các mô phân sinh ở đỉnh rễ, nơi các rễ bên mọc ra tạo 13 nan điểm xâm nhập cho các IJ2 khác và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương. Khi IJ2 tiếp xúc với bề mặt rễ chúng thường dùng kim hút châm chích và xâm nhập ngay vào trong rễ. Sự xâm nhập của chúng có thể xảy ra ở bất kỳ phía nào của rễ. Sau khi xâm nhập vào trong rễ tuyến trùng di chuyển giữa các tế bào vỏ rễ làm cho các tế bào bị tách dọc ra, sau đó tuyến trùng định vị tại vùng mô phân sinh của vỏ rễ và bắt đầu quá trình dinh dưỡng. Khi dinh dưỡng tuyến trùng cắm phần đầu vào các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm cho quá trình sinh lý sinh hóa của mô rễ thay đổi và hình thành các điểm dinh dưỡng cho tuyến trùng. Vùng này gồm 5-6 tế bào khổng lồ (tế bào có nhiều nhân) được tạo thành trong vùng nhu mô hoặc vùng mô phloem, nơi đầu tuyến trùng. Đây là sự thích nghi chuyên hóa cao của tế bào, chúng được tạo ra và duy trì bằng tuyến trùng ký sinh. Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồ các mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng ký sinh cũng phình to ra tạo thành sần rễ (gall hoặc root-knot). Sần rễ thường được tạo thành trong vòng 1-2 ngày sau khi tuyến trùng xâm nhập. Kích thước của nốt sần liên quan đến cây chủ, số lượng IJ2 xâm nhập và loài tuyến trùng ký sinh [5]. Hình 1. 6: Chu kỳ sống của tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp. http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/Images/Carrots/Root-Knot/Root-KnotCycle.jpg Bản thân tuyến trùng cảm nhiễm, sau khi xâm nhập vào rễ cũng bắt đầu một cách nhanh chóng quá trình thay đổi về hình thái: cơ thể chúng phình ra và các nội quan cũng dần được phát triển. Quá trình phát triển của tuyến trùng trong rễ từ IJ2 trải qua 3 lần lột xác và đạt đến trưởng thành. Lần lột xác cuối cùng là sự biến thái thật sự đối với con đực, từ dạng cuộn gấp khúc trong IJ4 chúng được nở ra và có dạng hình giun, trong khi đó con cái có dạng hình tròn như quả lê hay quả chanh. Tuyến trùng Meloidogyne spp. sinh sản bằng 2 cách: một vài loài sinh sản hữu tính-giao phối bắt buộc (amphimixis) và phần lớn các loài 14 sinh sản lưỡng tính (parthenogenessis) không cần con đực. Đối với các loài hữu tính thì con đực cặp đôi ngay với con cái sau lần lột xác cuối cùng. Tuyến trùng sần rễ có quan hệ mật thiết với các điều kiện môi trường trong đó cây chủ, nhiệt độ và các yếu tố sinh thái đất như độ ẩm, cấu trúc đất, độ thoáng khí, độ kiềm... Có thể phân biệt 2 nhóm sinh thái liên quan đến nhiệt độ là nhóm ưa nóng (các loài điển hình như M. incognita, M. javanica, M. exigua) và nhóm ưa lạnh (các loài điển hình như M. hapla, M. chitwooodi và có thể cả M. naasi) liên quan đến pha chuyển hóa lipid của tuyến trùng xảy ra ở 10 °C. Tác hại do tuyến trùng gây ra đối với cây trồng thường có liên quan đến loại đất kiềm, là môi trường tạo ra các sốc bất lợi (stress) cho thực vật. 1.2.2. Các loài quan trọng M. incognita: là loài phổ biến nhất, ký sinh gây hại trên nhiều cây trồng khác nhau và phân bố trên một vùng địa lý rộng từ 40 vĩ độ bắc đến 33 vĩ độ nam trên phạm vi toàn thế giới. Đây cũng là loài ký sinh gây hại phổ biến nhất trên cây trồng Việt Nam, trong đó chúng ký sinh gây hại phổ biến nhất ở: tiêu, cà phê, cà chua, bí đỏ, đu đủ, các cây họ Cà, họ Đậu, chuối.. M. javanica: là loài phổ biến thứ 2 sau loài trên và có dải phân bố tương tự. Đây là loài có khả năng chịu đựng qua mùa khô hạn trong thời gian 3-6 tháng. Ở Việt Nam, loài này ký sinh tương đối phổ biến sau loài M. incognita, gây hại chính cho các cây đậu phộng, chuối. M. arenaria: là loài phổ biến thứ 3 sau, phân bố khắp thế giới như các loài M. incognita và M. javanica. Đây cũng là loài ký sinh gây hại tương đối phổ biến ở Việt Nam trên các cây họ đậu. M. graminicola: ký sinh gây hại chính cho lúa cạn ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Đông Nam Á, Nam Phi, Mỹ). Ở ta loài này ký sinh tương đối phổ biến trên lúa cạn (giai đoạn lúa non, khi chưa ngập nước) ở đồng bằng sông Cửu Long [18]. 1.2.3. Cơ sở phòng trừ tuyến trùng Mục tiêu phòng trừ là: giảm mật độ quần thể tuyến trùng ban đầu và giảm số cây trồng bị nhiễm tuyến trùng. 15 Nội dung phòng trừ tuyến trùng bao gồm: i) Giết tuyến trùng bằng làm mất nguồn dinh dưỡng để tuyến trùng chết đói; ii) Giết trực tiếp tuyến trùng bằng hóa chất hoặc bất kỳ một kỹ thuật khác được áp dụng trước khi gieo trồng; iii) Sử dụng các hóa chất một cách hợp lý để chống lại tuyến trùng trên đồng ruộng có cây trồng [18]. a. Ngăn ngừa Ngăn ngừa hoặc phòng ngừa là giải pháp đầu tiên quan trọng nhất trong quản lý tuyến trùng, vì nó là biện pháp đơn giản để giải quyết tuyến trùng trước khi chúng trở thành vật hại được xác định trên đồng ruộng. Ngăn ngừa sự phát tán của tuyến trùng có thể cần được xem xét ở các mức độ khác nhau: trang trại (như một đơn vị sản xuất), quốc gia và quốc tế. Ở quy mô quốc tế, các vấn đề kiểm dịch thực vật quan trọng được quản lý bằng các công ước kiểm dịch thực vật [18]. b. Luân canh Luân canh được coi là biện pháp quản lý tuyến trùng đơn giản. Tuyến trùng thực vật là những ký sinh bắt buộc, chúng cần một vật chủ cho sự phát triển và nhân nuôi số lượng. Mỗi loài tuyến trùng thực vật có một phổ vật chủ, phổ này dù có thể là rộng nhất nhưng không bao gồm tất cả các loài cây trồng. Mật độ tuyến trùng tăng ở các cây chủ thích hợp và suy giảm ở cây chủ không thích hợp. Trong luân canh cây trồng để quản lý các cây trồng mẫn cảm với một loài tuyến trùng đã được trồng luân canh với các cây kháng hoặc miễn nhiễm tuyến trùng. Thường các cây trồng kinh tế là các cây mẫn cảm với tuyến trùng và các cây trồng luân canh là các cây kém kinh tế hơn. Sự luân canh cần phải trồng như thế nào để mật độ quần thể tuyến trùng ở mức thấp nhất khi trồng cây trồng chính. Các cây luân canh là cây miễn nhiễm hoặc có khả năng chống chịu cao với một hoặc một vài loại tuyến trùng nào đó. Khả năng miễn nhiễm của chúng có thể là miễn nhiễm tự nhiên [18]. c. Biện pháp canh tác Tùy từng loại tuyến trùng ký sinh và loại cây trồng mà có thể lựa chọn, điều chỉnh một số biện pháp canh tác như: gieo trồng sớm, làm khô ruộng, làm ngập nước, bón chất hữu cơ... cũng có thể giảm mật độ tuyến trùng và tránh một số tác hại gây ra do tuyến trùng. 16 Làm ngập nước: nồng độ O2 giảm, CO2 tăng do sự giảm vi khuẩn hiếu khí, đồng thời trong đất ngập nước cũng xảy ra các phản ứng như: phản ứng nitrat, tích luỹ chất amoni, giảm sắt, mangan và sunfat, tăng các loại acid hữu cơ, methane hydrosulfite. Bón phân hữu cơ: sự phân huỷ chất hữu cơ sẽ giải phóng các hợp chất gây độc cho tuyến trùng ký sinh. Đặc biệt, sự phân giải các chất phế thải thực vật sẽ giải phóng các acid hữu cơ như: acid acetic, propionic, butyric. Nồng độ các chất này có thể lưu giữ một vài tuần trong đất và có thể giết chết một vài loại tuyến trùng ký sinh, nhưng không độc đến các nhóm tuyến trùng sống tự do trong đất. Phân từ động vật nuôi, bùn cống rãnh, chất thải thành phố, rơm rạ và các phế thải sau khi thu hoạch đều có thể sử dụng làm chất bổ sung vào đất để tăng hàm lượng chất hữu cơ. Ở Nigieria, bón vỏ khô của quả ca cao và vỏ gọt sắn cho phòng trừ tuyến trùng gây bướu rễ mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn so với sử dụng thuốc hoá học hoặc bón 3 loại phân hoá học NPK ở liều lượng cao. Ở xí nghiệp Liên hiệp hồ tiêu Tân Lâm Quảng Trị, bón 20 kg phân chuồng ủ hoai mục/ gốc tiêu làm giảm 45-60% tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne incognita so với đối chứng [5]. Một số cây trồng và cây hoang dại cũng đã và đang được dùng làm thuốc thảo mộc phòng trừ tuyến trùng như cây xoan Ấn Độ, hạt cây củ đậu, rễ cây ruốc cá, hạt và lá cây sầu đâu rừng ở Việt Nam do chúng chứa các hợp chất như phenolic, glucid hoặc các alkaloid… có tác dụng gây độc tuyến trùng và một số sâu hại khác.Ở Tân Lâm Quảng Trị với liều dùng 40-60g HBJ hoặc LBJ ( chế phẩm dạng bột chế biến từ quả hoặc lá sầu đâu rừng)/m2 diệt 75-98% tuyến trùng ký sinh (Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Hữu Thanh, 1993; Nguyễn Thị Yến , 1997) [5]. d. Các biện pháp vật lý Lợi ích lớn của biện pháp vật lý phòng trừ tuyến trùng là không để lại dư lượng, độc tố như thuốc hóa học. Bản chất của các biện pháp vật lý là phòng trừ tuyến trùng bằng xử lý nhiệt. Tuyến trùng nhìn chung rất mẫn cảm với nhiệt. Hầu hết tuyến trùng chết ở nhiệt độ cao trên 60 °C. Phương pháp vật lý được áp dụng rộng rãi bằng nhiều biện pháp khác nhau như: xử lý khói, dùng hơi nước nóng xử lý đất, phơi nắng, khử trùng bằng nhiệt điện, bằng 17 nhiệt vi sóng, đốt đồng sau khi thu hoạch, khử trùng nguyên liệu gieo trồng bằng nhiệt, chiếu xạ... [18]. e. Chọn giống kháng và giống chống chịu bệnh - Trồng các cây chống chịu tuyến trùng ký sinh có thể đáp ứng cho một phương pháp lý tưởng là duy trì mật độ quần thể tuyến trùng dưới ngưỡng gây hại. Các cây trồng kháng tuyến trùng có một số ưu điểm vượt trội hơn các phương pháp khác cho mục tiêu quản lý tuyến trùng hại: (a) có thể hoàn toàn ngăn ngừa sự sinh sản của tuyến trùng, không giống một vài phương pháp khác như phòng trừ hóa học; (b) sự áp dụng chúng cần ít hoặc không cần công nghệ và hiệu quả kinh tế; (c) cho phép luân canh trong thời gian ngắn; (d) không để lại dư lượng độc. - Ngoài tính kháng (resistance) với tuyến trùng ký sinh, cây kháng cũng cần phải chống chịu (tolerance); những cây không chống chịu sẽ phải chịu thiệt hại nặng nề nếu trồng trên đất nhiễm tuyến trùng nặng. Các cây chống chịu mà không kháng có xu hướng tăng mật độ quần thể tuyến trùng đến số lượng tuyến trùng cao có thể dẫn đến gây hại [18]. f. Biện pháp hóa học Từ những năm 1950 trở lại đây các loại thuốc hóa học khác nhau đã được sử dụng rộng rãi để phòng trừ tuyến trùng ký sinh thực vật. Tuy nhiên, ngoài những mặt có lợi không thể chối cãi trong việc phòng trừ sâu bệnh hại tăng sản lượng cây trồng, việc sử dụng không hợp lý các chất hóa học cũng gây những hậu quả xấu đối với môi trường và sức khỏe cộng đồng. Đặc biệt, thuốc hóa học cũng làm cho nhiều loại tuyến trùng trở nên kháng thuốc. Mặc dù hiện nay đã sản xuất được nhiều loại thuốc có hiệu quả tốt hơn, chuyên hóa hơn đối với việc phòng trừ tuyến trùng và cũng ít độc hại hơn đối với môi trường. Tuy nhiên cũng chỉ nên dùng thuốc hóa học trong những trường hợp cần thiết được khuyến cáo dưới đây và đặc biệt phải sử dụng chúng một cách hợp lý [18]. g. Biện pháp sinh học Tuyến trùng ký sinh thực vật cũng bị tấn công bằng nhiều thiên địch tồn tại trong đất như virus, vi khuẩn, nấm, Ricketuyến trùngsia, đơn bào, Tardigrade, Tuberlaria, Enchytraeid, ve bét, côn trùng và tuyến trùng ăn thịt. Vì vậy, nghiên cứu sử dụng thiên địch 18