Tài liệu Nghiên cứu biến đổi của một số gen ty thể ở bệnh ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------------- T ị NGHI N ỨU I NĐ I Ủ Ở TS G N T TH NH UNG THƯ ĐẠI TRỰ TR NG Chuyên ngành: S ọ ờ v vật Mã số: 62420104 Ự TH T TẮT UẬN ÁN TI N SĨ SINH HỌC Hà N i - 2016 ô r g trì ng Đ i h i h ớng dẫn khoa h c: ợc hoàn thành t i: ho h nhi n ĐH GH G r nh H ng h i TS. Tô Thanh h Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .............................. Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .............................. Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .............................. Luận án sẽ đ ợc bảo vệ tr ớc Hội đ ng cấp ơ sở chấm luận án tiến sĩ h pt i................................................... vào h i gi phút, ngà th ng năm 201... Có thể tìm hiểu luận án t i: - h viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - h viện Đ i h c Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Ung th đ i tr tràng (U Đ ) là một trong những lo i ung th phổ biến, trên thế giới U Đ xếp thứ 3 s u ung th phổi và ung th tiền liệt tuyến ở nam giới đứng thứ h i s u ung th v ở nữ giới trong tổng số các lo i ung th Ở Việt m U Đ đứng thứ năm s u ung th g n phổi, d dày, vú. Tỷ lệ mắ U Đ hiếm khoảng 8,7% tổng số bệnh nhân ung th (globo n 2012) Có nhiều yếu tố nguy ảnh h ởng đến U Đ nh hế độ ăn uống, nối sống, nghề nghiệp và hội chứng đ pol p theo gi đình Đặc biệt, các nghiên gần đâ đ ho thấ đột biến ADN ty thể là một yếu tố góp phần làm tăng ngu ơ mắc bệnh. Kết quả nghiên cứu về đột biến ADN ty thể cho thấ đâ là h ớng nghiên cứu tiềm năng để tìm các chỉ th ho ung th ( umitr và s 2014; Ann và s 2010) Ở Việt m tr n đối t ợng bệnh U Đ thì nghi n ứu chủ yếu tập trung vào các vấn đề li n qu n đến d ch tễ h lâm sàng và ph ơng ph p điều tr nh ng vẫn h ó ông trình nào nghiên cứu về đột biến ADN ty thể và mối liên quan giữ đột biến ADN ty thể với bệnh U Đ Xuất phát từ th c tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án: “ ” Mụ t u ủ uậ : 1 X đ nh tỷ lệ mất đo n 4977 bp đ nh l ợng mứ độ mất đo n lớn số bản s o A t thể t ơng đối ở mẫu mô mẫu m u ủ bệnh nhân ung th đ i tr tràng mẫu m u ủ ng i h e m nh bình th ng 2. Khảo sát các biến đổi trên một số gen: ND1, ND3, COX-1, COX-2 ở mẫu mô mẫu m u ủ bệnh nhân ung th đ i tr tràng mẫu m u ủ ng i h e m nh bình th ng bằng các kỹ thuật sinh h c phân tử. 3 Đ nh gi mối liên quan giữa các d ng biến đổi của gen, tỷ lệ mất đo n lớn, mứ độ đột biến mất đo n lớn s th đổi số l ợng bản sao ADN ty thể với một số đặ điểm bệnh h c của bệnh nhân U Đ ở Việt Nam. Đố t ợ ứu ủ uậ Nghiên cứu đ ợc th c hiện tr n 86 ặp mẫu mô và 9 mẫu máu của các bệnh nhân b bệnh U Đ ẫu ung th đ ợc cung cấp từ Bệnh viện và ệnh viện iệt Đức Hà Nội từ năm 2012 - 2015. 67 mẫu máu củ ng i kh e m nh bình th ng do Bệnh viện huyết h c và truyền m u rung ơng ung ấp. Ý ĩ k o ọc và thực tiễn củ ề t uậ - Với những kết quả mà đề tài luận n thu đ ợc sẽ góp phần cung cấp một ngu n dữ liệu về các biến đổi trên một số gen ty thể (ND1, ND3, COX-1, COX-2), tỷ lệ và mứ độ mất đo n lớn, s th đối số l ợng bản sao ADN ty thể ở bệnh nhân U Đ tr n ơ sở đó ó thể l a ch n đ ợ đột biến, biến đổi có nhiều tiềm năng để nghiên cứu sâu hơn giúp cho việc hỗ trợ chẩn đo n và điều tr bệnh U Đ Đó -Đ óp ới củ ề tài hảo s t và x đ nh đ ợ tỷ lệ biến đổi nucleotide: A4164G, A10398G, C6340T, G7853A trong hệ gen ty thể của bệnh nhân U Đ - Đ x đ nh đ ợc tỷ lệ đ nh l ợng đ ợ mứ độ mất đo n lớn và s th đổi số l ợng bản sao ADN ty thể ở bệnh nhân U Đ - Đ đ nh gi đ ợc mối liên quan giữ biến đổi nucleotide, tỷ lệ, mứ độ mất đo n lớn và s th đổi số l ợng bản sao ADN ty thể với một số đặ điểm bệnh h c ở bệnh nhân U Đ - Là ông trình đầu tiên phát hiện thấy một số đột biến mất đo n mới: 5094bp 5169 bp và 5104bp HƯƠNG 1. T NG QUAN TÀI LI U 1.1. UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.1.1. Thực tr ng mắ u t i trực tràng Ung th đ i tr tràng (U Đ ) là một trong những lo i ung th phổ biến nhất chiếm tỉ lệ cao thứ b trong tr ng hợp ung th ở nam giới, thứ hai ở n giới (Globocan, 2012). T i Việt lệ mắc mới và tử vong. m U Đ xếp thứ 4 ở nam giới, xếp thứ 5 ở nữ giới về tỷ 1.1.2. Các hệ thố p â o n bệ ou t i trực tràng Có nhiều hệ thống phân gi i đo n ho ung th Đối với U Đ th ng sử dụng phổ biến hai hệ thống là: hân gi i đo n ung th theo d vào í h th ớc của khối u (T), mức độ lâ l n đến các h ch b ch huyết (N) và s hiện diện củ di ăn ( ) ( umor- l mph ode - et st ses ) và phân gi i đo n theo Dukes (Sobnin, 2009) 1.1.3. Các yếu tố uy ây u t trự tr Có rất nhiều yếu tố đ ợc biết có thể làm tăng hoặc giảm ngu ơ U Đ ụ thể: Yếu tố tuổi tác, yếu tố di truyền và tiền sử gi đình tiền sử nhân Đặ biệt một số đột biến tr n A t thể ng đ đ ợ x đ nh làm tăng ngu ơ mắ bệnh 1.2. TY TH NGƯỜI 1.2.1. u tr v ứ ủ ty t ể Ty thể là bào quan có mặt ở tế bào chất của hầu hết các tế bào nhân thật, có nhiều hình d ng khác nhau xong hình d ng đặ tr ng là thon dài với đ ng kính 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm. Bao b c bên ngoài ty thể là hai lớp màng lipoprotein, giữa hai lớp màng là khoang gian màng, bên trong hai màng là chất nền. Màng trong ty thể ăn sâu vào chất nền t o thành các mào răng l ợ t thể là nhà m t o năng l ợng cho tế bào th m gi vào qu trình l o hó qu trình t chết của tế bào và một số qu trình h ủ ơ thể 1.2.2. Hệ gen ty thể Bào quan ty thể có hệ gen riêng và nhân bản độc lập với hệ gen nhân. ADN ty thể ng i t n t i ở d ng m ch vòng, sợi đôi ó í h th ớc 16.569bp, bao g m 37 gen, mã hóa cho 2 phân tử rRNA (12S, 16S), 22 phân tử tRNA và 13 phân tử protein thuộc các phức hợp của chuỗi hô hấp. 1.2.3. Sự di truyền theo dòng mẹ của ADN ty thể S di truyền các gen trên ADN ty thể là di truyền qua tế bào chất (di truyền theo dòng mẹ) g i mẹ truyền hệ gen ty thể ho mới truyền hệ gen đó ho thế hệ tiếp theo. 1.2.4. Hiệ t ợng dị tế bào ch t v ng i con và chỉ có những ng ỡng biểu hiện củ i con gái t biến ADN ty thể Do hệ gen ty thể có nhiều bản sao: vài bản sao trong một ty thể, hàng nghìn bản sao trong một tế bào.Vì vậy, ADN ty thể có một hiện t ợng rất đặc thù - hiện t ợng d tế bào hất (heteropl sm ) tế bào hất là hiện t ợng t n t i đ ng th i cả bản sao ADN ty thể b đột biến và bản sao ADN ty thể ở d ng d i trong cùng một mô, một tế bào. Nếu tất cả các bản sao của ADN ty thể giống nhau thì g i là tính đ ng nhất (homopl sm ) Ở tr ng th i bình th ng phần lớn A t thể t n t i ở d ng đ ng tế bào hất h i niệm ng ỡng biểu hiện củ đột biến đ ợ dùng để chỉ khả năng h u đ ng của tế bào tr ớc một tỷ lệ số bản sao ADN ty thể m ng đột biến trong tổng số bản s o ỷ lệ ty thể đột biến phải đ t đến ng ỡng thì mới gây ra kiểu hình lâm sàng của bệnh ( l và s 1996) g ỡng biểu hiện củ đột biến th đổi phụ thuộc từng lo i đột biến và từng lo i mô ( ll e và cs, 2013). 1.3. Đ T I N N T TH V NH UNG THƯ hiều d ng biến đổi tr n A t thể đ đ ợ x đ nh ó li n qu n đến bệnh ung th . Các biến đổi có thể ở d ng đ hình ng ó thể là đột biến làm th đổi axit amin có thể dẫn đến th đổi cấu trúc của các enzyme thuộc chuỗi hô hấp, dẫn đến việc hông đảm bảo chứ năng ó thể làm ảnh h ởng tới dòng vận chuyển điện tử bình th ng. Các biến đổi thuộ vùng ghi m đặc biệt là các biến đổi trên các gen ND1, ND3, COX-1, COX-2 đ đ ợ x đ nh trên nhiều lo i ung th trong đó ó ung th đ i tr c tràng. ất đo n lớn tr n A t thể trong đó ó mất đo n phổ biến 4977bp đ ợ oi là ngu n nhân hính ủ một số bệnh t thể và ó thể đóng v i tr trung tâm đối với qu trình l o hó goài r mất đo n 4977bp ng đ đ ợ x đ nh ó li n qu n đến nhiều lo i bệnh ung th h nh u nh ung th v niêm m c tử cung, th c quản, d dà đ i tr c tràng, gan, phổi, thận, da và tuyến giáp ( hen và s 2011; e và s 2008; i và s 2006; Demberg, 2015) u nhi n mứ độ ảnh h ởng ủ mất đo n đến biểu hiện bệnh n li n qu n đến mứ độ ủ mất đo n o trong mỗi tế bào ó từ hàng tr m đến hảng nghìn bản s o A t thể s th đổi số l ợng bản sao ADN ty thể đ ợc coi là một dấu hiệu quan tr ng của bệnh ung th u nhiên, vai trò của s th đổi số l ợng bản sao ADN ty thể xảy ra trong gi i đo n đầu, gi i đo n tiến triển của bệnh ung th nói hung và U Đ nói ri ng vẫn n h thống nhất. 1.4. Á HƯƠNG HÁ HÁT HI N Đ T BI N GEN TY TH Để x đ nh và đ nh l ợng biến đổi tr n A t thể th ng p dụng một số ph ơng ph p s u: PCR-RFLP giải trình t gen e ltime H L và một số ph ơng ph p h ph ơng ph p ó thể dùng ết hợp với nh u để tăng độ hính x ủ ết quả phân tí h HƯƠNG 2. NGU N I UV HƯƠNG HÁ NGHI N ỨU 2.1. NGUYÊN LI U 2.1.1. Mẫu nghiên cứu 86 mẫu mô ung th g m mô u và lân cận u của bệnh nhân U Đ ng i Việt Nam, 9 bệnh nhân có mẫu máu kèm theo. Các mẫu mô và máu của bệnh nhân ung th đ ợc thu thập từ bệnh viện K và bệnh viện Việt Đức Hà Nội từ năm 2012 đến năm 2015 67 mẫu máu củ ng i kh e m nh đến cho máu đ ợc thu thập từ Viện huyết h c và truyền m u rung ơng mẫu m u đ ợc thu thập từ năm 2012 - 2015. Các mẫu nghiên cứu đều đ ợc bảo quản ở tủ - 800C. 2.1.2. ó t ợ s ụ Các cặp m i dùng ho phân tí h tro - FL x ứu đ nh mất đo n, HPLC, Realtime PCR (IDT, Invitrogen (Mỹ), Maxima Hot Start PCR Master Mix 2x (Thermo Scientific, Mỹ, qPCR BIO SyGreen Mix LO-ROX 2X (Biosystem), Các enzyme cắt giới h n Ferment s (Đứ ) và một số hó hất h đều đ t độ tinh hiết ho phân tí h sinh h phân tử 2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THI T BỊ Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao g m: máy NanoDropTM 2000c (Thermo Scientific), máy nhân gen PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ), máy nhân gen PCR Biorad (Mỹ), máy Realtime PCR Mygopro (IT-IS Life Science (Anh), máy ly tâm 5417 (l tâm 1 5mlendorf Đức), thiết b điện di ng ng điện di đứng (Biorad) và hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc (Biorad), tủ l nh -20OC và -80OC (Nuaire, Mỹ) và m mó thiết b h thuộ ph ng roteomi s và inh h ấu tr thuộ ph ng thí nghiệm tr ng điểm ông nghệ en me và rotein- r ng ĐH H hi n. 2.3. HƯƠNG HÁ NGHI N ỨU 2.3.1. T ết N tổng số từ mẫu ôu t i trự tr v ẫu u Tiến hành tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô mẫu m u bằng it t h hiết QIAamp A ini it IA mp lood mini it ( IAGE Đứ ) b ớ t h hiết theo h ớng dẫn ủa nhà sản xuất . 2.3.2. Tách chiết ADN plasmid A pl smid đ ợc tách và tinh s ch bằng kit QIAprep-miniprep củ b ớ tiến hành theo theo h ớng dẫn ủ nhà sản xuất 2.3.3. Đ ện di kiể tr v ị ợng ADN tổng số i gen sản phẩm S có mặt của ADN tổng số điện di trên gel agarose pol 2.3.4. Nhân bả đ ợc kiểm tra bằng ph ơng ph p r l mide nhuộm ethidiumbromie o n gen ty thể chứ t biến bằng kỹ thuật PCR đo n ADN thuộc các gen ND1, ND3, COX-1, COX-2, mất đo n 4977bp thuộc ADN ty thể đ ợc sàng l đột biến/đ hình đ ợc khuế h đ i bằng phản ứng PCR với các cặp m i đặc hiệu (bảng 2). Khuôn cho phản ứng PCR là ADN tổng số đ ợc tách chiết từ mẫu mô, máu của bệnh nhân U Đ và mẫu máu củ ng ì 2.3.5. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật i kh e m nh. ều o n cắt giới h n (PCR-RFLP) Trong nghiên cứu này, các biến đổi (đột biến điểm/đ hình) tr n A phát hiện bằng kỹ thuật PCR- FL (và đ ợc khẳng đ nh bằng kỹ thuật x t thể đ ợc đ nh trình t nu leotide) en me đ ợ sử dụng g m: NlaIII, DdeI, HincII, HincII (bảng 2. 1). Phản ứng cắt đ ợc th c hiện với các thành phần theo h ớng dẫn của nhà sản xuất Tên Trì ả 2. 1. tự â zy ết enzyme ớ tro Vị tr ứu Sả (gen) ế p ắt ổ ô ế ổ NlaIII DdeI 5'- A G↓-3' 5’-C↓TNAG-3’ A4164G, T4216C  202bp; 133bp (T4216C)  335bp  185bp; 150bp (A4164G) (ND1)  203 185 150 133bp ( 4216 và A4164G) A10398G  38 bp 50bp và 158 bp  50 bp và 196 bp  113 bp 144 bp và 215bp  257 bp và 215 bp  161bp  128bp và 33bp (ND3) HincII BccI 5’-GTY↓RAC-3’ G7853A R=G, A; Y=T, C (COX-2) 5’CCATC(N4) ↓3' C6340T (COX-1) ả 2.2. C T p tro G t vị tr qu tâm p ND1.1 COX-1.1 op ả ứ COX-1/ C6340T COX-2.1 p mtDNA ớ Trì bp) (v trí) ND1/ T4216C, A4164G ND3/ A10398G ND3 ứu 335 (4015-4349) CGA CCC TAC TTC TAA CC CGA CCC TAC TTC TAA CC 246 (1030710552) 161 CTG CCA CTA ATA GTT ATG TC GAT ATG AGG TGT GAG CGA TA 472 GAA GAA GGT GGT GTT GAG GTT G TCC CTC TCT CCT ACT CTA AGA TAG AGG CCT GTT C AGA CAC CTG CTA Rx 433 (3457-3889) 496 (8167-13639) 381 (8196 -13553) 4977-1 4977-2 p o ợ 5’-3’) R-RFLP op ả ứ ND1 tự xuô (5’-3’) R ể ị t o GAC GCC ATA AAA CTC TTC AC TCA ATG CTC TGA AAT CTG TGG ACA GTT TCA TGC CCA TCG TC ả trì CCC TCT CTC CTA CTC CTG CTC GGT TGG TCT CTG CTA GTG TG GTT GAC CTG GGG TGA GAA G GCG TTT GTG TAT GAT TTT GC tự trự t ếp COX1.2 COX-1 1745 (5851-7595) CTT TAG ATT TAC GT CCA ATG CTT CATGTGCCATTA AGATATATA GGAT COX2.2 COX-2 1050 (7375-84340 ACC TGG AGT GAC TAT ATG GAT GAT GAG GAA TAG TGT AAG GAG 2.3.6. Nhân dòng trực tiếp o n gen chứ Nhân dòng phân tử g m một nhóm  Phân lập một đo n gen (A t biến vào vector pJet1.2 ph ơng ph p nhằm: ) đặc hiệu từ một hỗn hợp các phân tử A b n đầu đ ợc tách chiết từ các mẫu sinh h c có thành phần phức t p.  Nhân bản đo n trình t A đ ợc quan tâm lên một l ợng đủ lớn để có thể tiến hành phân tích về cấu trúc và chứ năng gen t ơng ứng. 2.3.7. G ả trì tự o ứ t biến ết quả - FL đ ợ hẳng đ nh bằng ph ơng ph p giải trình t gen 2.3.8. Đ ện di ADN trên gel polyacrylamide - ùng để x đ nh s dụng trong ph ơng ph p ó mặt ủ - FL và băng A đ ợ nhân l n từ băng ủ sản phẩm ắt en me ặp m i sử 2.3.9. Tinh s ch sản ph m PCR inh s h sản phẩm rodu t le nup 2.3.10. Đị bằng ít IAqui gel extr tion và Exo A -I ùng để thu sản phẩm tinh s h ho gi it rình t A ợ ứ t o tr tiếp v số bản sao ADN ty thể bằng kỹ thuật Realtime PCR D a trên giá tr Ct, số bản sao ADN ty thể so với số bản sao ADN nhân (giá tr t ơng đối) tính toán theo công thức: -∆C Trong đó: ∆Ctc= CtND1.3 - CtHBB Mứ độ mất đo n đ ợc tính theo công thức m t o n (%) = (1-1 2Δ t ) *100% Mứ Trong đó: Δ td = tND4.2 − CtND1.3 ặp m i dùng ho phân tí h đ nh l ợng mứ độ mất đo n và số bản s o A t ơng đối bằng ph ơng ph p e ltime đ ợ trình bà rong bảng 2 3 ả 2.3. Trì tự p s ụ op ả ứ R â o t thể N ể â T G t ớ xuô (5’-3’) ( bp) p o â ND1.2 ND1 293 HBB.1 HBB 272 p ND1.3 or ND1 t 115 ể ự ờ ợ 5’-3’) u CCT AGC CAT CAT TCT ACT ATC AACA GAA AAT AGA CCA ATA GGC AGA GAG A ACC CTC ACC ACT ACA ATC TTC C GTC AGA AGC AAA TGT AAG CAA TAGA AGT GGC TCC TTT GGT TGG TCT CTG R HBB.2 HBB 104 ND4.2 ND4 128 AAG GAG TG GGA GAA GTC TGC CGT CAA C CCT ATT TAG CTG TCT CCC AA hu trình nhiệt và thành phần ho phản ng re ltime hiện riêng biệt cho từng cặp m i. Hỗn hợp phản ứng tí h 10μl b o g m: 2X CTA CAC GA CCT TAA ACC TGT CTT GTA CGG AA GTG ATA GTG GTT CCA TGG ATA AGT : hản ứng đ ợc th c đ ợc th c hiện trong tổng thể Green I: 5μl 0 2µ mỗi m i, 0,1~0,2 (ng/ µl) khuôn ADN tổng số. Chu trình nhiệt cho phản ứng e ltime : 95° trong 2 ph t s u đó 40 hu kỳ g m 95°C trong 10 giây, 60°C trong 30giây. Ch èm theo h ơng trình phân tích đỉnh chả ( elting urve) để x đ nh độ đặ hiệu ủ m i: tr ớc tiên bu ng ủ nhiệt sẽ đ nhiệt độ lên 950C trong 60 giây biến tính hoàn toàn tất cả các sản phẩm khuế h đ i. u đó h nhiệt độ xuống 600 trong 60 giâ để tất cả các sản phẩm khuế h đ i này thành sợi đôi u đó th c hiện h ơng trình phân tí h nhiệt độ chảy (melt- urve) đ nhiệt độ bu ng ủ từ 600C lên 970C với tố độ ra nhiệt 0,10 /1 giâ gi p phân tí h độ đặc hiệu của m i. HƯƠNG 3. 3.1. T ố ẫu k ệ ọ â s v kết quả t ết N tổ số từ ứu đặ điểm bệnh h bệnh viện ung ấp 800 T QU VÀ TH O LUẬN lâm sàng ủ bệnh nhân đ ợ tổng hợp từ h sơ bệnh n do mẫu mô đ ợ bảo quản trong ni tơ l ng hoặ trong tủ l nh sâu - ho tới hi phân tí h trung bình 58 71 13 hóm bệnh nhân nghi n ứu g m 41 n m 45 nữ độ tuổi heo v trí ung th g m ó 41 bệnh nhân ung th tr bệnh nhân ung th đ i tràng và đ i tr tràng tràng 45 ệnh nhân đ ợ phân gi i đo n bệnh theo g m ó: gi i đo n 1 (n=30) gi i đo n 2 (n=21) gi i đo n 3 và 4 (n=33) heo mứ đô biệt hó g m mứ độ biệt hó r (n=10) mứ độ biệt hó vừ (n=39) mứ độ biệt hó thấp (n=6) ADN tổng số của mẫu máu và mẫu mô U Đ đ ợ t h hiết bằng kit tách chiết th ơng phẩm củ h ng i gen ết quả t h hiết đ ợ minh h trong hình 3 1 Hình 3.1 cho thấy sản phẩm ADN tổng số thu đ ợ từ các mẫu nghiên cứu đều có một băng A r nét hứng t ADN tổng số t h đ ợ đều nguyên vẹn Hàm l ợng ADN trung bình (ng/µl) trên mô u, mô lân ận u và tr n mẫu m u t ơng ứng lần l ợt là 50,69 và 41,67 và 17,78 ng/µl. Hì 3.1: ện di ADN tổng số ợc tách chiết từ ẫu ứu (điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide) Giếng 1-4; 5-8: ADN tổng số từ mô u, lân cận u của 4 bệnh nhân UTĐTT, giếng 9-12; 13-15: ADN tổng số t h từ ủa người khỏe mạnh, máu của bệnh nhân UTĐTT, Giếng M: thang ADN chuẩn 1kb 3.2. T ệ t o 4977 p tr N ty t ể ở ệ â u t trự tr ằng ph ơng ph p với 4 cặp m i: mtDNA, 4977-1; 4977-2 và 3 trong đó cặp m i mt A bắt ặp đặ hiệu với đo n A thuộ gen ND1 t thể (gen thuộ vùng rất hiếm xả r đột biến mất đo n) dùng để khẳng đ nh s ó mặt ủ A t thể trong mẫu ADN tổng số. Hai cặp m i 4977-1, 4977-2 dùng trong phản ứng PCR l ng để xác đ nh mất đo n 4977 bp trong mẫu nghiên cứu ặp m i 3 nhân đo n A thuộ vùng mất đo n 4977 bp dùng để l i trừ d ơng tính giả (nếu ặp m i 4977-2 hông l n băng 381 bp ùng bệnh nhân đó m i 3 l n băng 246 bp thì hẳng đ nh bệnh nhân đó hông ó mất đo n ết quả PCR với 3 cặp m i ở một số mẫu nghiên cứu đ ợc minh h a theo hình 3.2. Hì 3.2: ện di sản ph m PCR m i mtDNA, 4977-2, ND3 trên t số mẫu nghiên cứu ( ệ tr ros 1 7 % u t r) Hình A: Giếng 1: Đối chứng âm của cặp mồi mtDNA, giếng 2: Sản phẩm PCR mồi mtDNA, giếng M: Thang ADN chuẩn 100bp, giếng 3: Đối chứng âm của cặp mồi 4977-2, giếng 4,5: sản phẩm PCR của cặp mồi 4977-2 của 2 mẫ ô UTĐTT, giếng: 6,7: sản phẩm PCR của cặp mồi 4977-2 của 2 mẫ đối chứng. Hình B: Giếng M: Thang chuẩn ADN 100bp, giếng 1-4: bệnh nhân 1 #16675: (giếng 1,2: sản phẩm PCR với kí h thước 433 bp và 381 bp của mô u; giếng 3,4: sản phẩ PCR tương ứng của mẫu máu). Giếng từ 5-8: bệnh nhân 2 #16678 (giếng 5,6: sản phẩm PCR 433 bp và 381 bp của mô u; giếng 7,8 sản phẩ PCR tương ứng của mẫu máu). : Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 3 ệnh nhân không ó t hiện ng 381 bp rong nghi n ứu nà h ng tôi x đ nh thấ mất đo n 4977bp là lo i mất đo n phổ biến, tỷ lệ cao (95,35%) ở mô ủ bệnh nhân U Đ ng i Việt Nam và thuộc d ng đột biến sôm (hình 3 2) goài mất đo n 4977 bp, chúng tôi còn phát hiện đ ợc một số mất đo n lớn khác trên ADN ty thể ở mô U Đ với tỷ lệ 38 37 trong đó x đ nh chính xác 3 mất đo n mới (5169bp 5094bp 5104bp) (hình 3 3 và hình 3 4) Hì có m t o 3.3: Sản ph m PCR m 4977-2 tr ẫu mô k t o 4977 p k t ớ k 381 p) ệ tr ros 1 5% u t r) M: Thang ADN chuẩn 100bp, Giếng 1: Sản phẩm PCR mồi t , giếng : Đối hứng ương ủa ệnh nhân hứa t đoạn p đ đư kh ng đ nh ng giải tr nh t Giếng 3 -16: Sản phẩ PCR ủa ặp ồi nh ng ệnh nhân hứa t đoạn kh t đoạn p Hì 3.4: o n trình tự ADN ty thể của bệnh nhân UTĐTT t o A: m t đoạn 4977bp (bệnh nhân #4169B), B: m t đoạn 5169bp (bệnh nhân #36924), C: m t đoạn 5094bp (bệnh nhân #42308), D: m t đoạn 5104bp (bệnh nhân # 10731 ( ũi tên hỉ v trí nối sau khi m t đoạn T ệ t o 4977 p t o ể ệ ọ â s heo độ tuổi: ỷ lệ mất đo n ở nhóm bệnh nhân ít hơn 50 tuổi là 100 o hơn so với nhóm bệnh nhân tr n 50 tuổi (93 9 ) ỷ lệ mất đo n ở n m giới là 97 6 o hơn so với nữ giới (93 3 ) ở nhóm ung th đ i tràng và đ i tr tràng ó tỷ lệ mất đo n t ơng đ ơng với nhóm ung th tr tràng heo mứ độ biệt hó ở nhóm bệnh nhân ó mứ độ biệt hó r và biệt hó ém ó tỷ lệ mất đo n 100 o hơn so với nhóm bệnh nhân ở mứ độ biệt hó vừ (94 9 ) heo í h th ớ hối u ở nhóm bệnh nhân ó í h th ớ u nh hơn 3 m ó tỷ lệ mất đo n o nhất (100 ) s u đó đến nhóm bệnh nhân ó í h th ớ hối u lớn hơn 3 5 m thấp nhất ở nhóm bệnh nhân ó í h th ớ hối u từ 33,5cm. heo gi i đo n tỷ lệ mất đo n giảm dần theo thứ t lần l ợt là 98 ở gi i đo n No, 96 4 ở gi i đo n 1 và 75 ở gi i đo n 2 heo gi i đo n : tỷ lệ mất đo n ở nhóm bệnh nhân ở gi i đo n 1 o nhất (100 ) tiếp đó đến nhóm bệnh nhân ở gi i đo n 3 và 4 (97 5 ) thấp nhất ở nhóm bệnh nhân thuộ gi i đo n 2 (94 3 ) heo gi i đo n bệnh: tỷ lệ mất đo n ở nhóm bệnh nhân thuộ gi i đo n II o nhất (100 ) tiếp đến là ở nhóm bệnh nhân gi i đo n I (96 7 ) thấp nhất ở nhóm bệnh nhân thuộ gi i đo n III và I Sử dụng test chính xác củ Fisher và iểm đ nh hi bình ph ơng ( HI E ) để đ nh giá mối liên quan giữa mất đo n 4977 bp với đặ điểm bệnh h c lâm sàng của bệnh U Đ ết quả iểm đ nh bằng ả h i ph ơng ph p đều ho thấy mất đo n 4977 bp hông li n qu n đến đặ điểm bệnh h c bao g m: độ tuổi, giới tính í h th ớc khối u, v trí ung th mứ độ biệt hó gi i đo n 3.3. Mứ m t o ớ tr ứ độ mất đo n lớn tr n A gi i đo n bệnh ủ bệnh nhân (p>0 05). N ty t ể ở ệ â u t trự tr t thể đ ợ đ nh l ợng bằng ph ơng ph p re ltime Để x đ nh độ hính x ổn đ nh ủ ph ơng ph p h i đ ng huẩn đ ợ hiệu là đ ng 1 và đ ng H đ ợ h ng tôi xâ d ng trong nghi n ứu nà vào hệ số t ơng qu n giữ số bản s o b n đầu và hu ỳ ng ỡng ủ re time hiệu quả huế h đ i hệ số biến thi n theo hu ỳ ng ỡng giữ đ nh gi độ hính x và ổn đ nh ủ ph ơng ph p lần lặp l i ủ đ ng huẩn để h ng tôi đ d ng đ ợ đ ng chuẩn ND1 với ph ơng trình: = -3,40x + 33,27, giá tr của hệ số t ơng qu n 2 giữa số bản sao ADN ty thể và số chu kỳ ng ỡng là 0,999, hiệu quả là 96 8 độ dố là 3 40 (hình 3 5) ơng t đ ng huẩn H ng đ ợ d ng ó ph ơng trình: = -3,5x + 36,2, giá tr của hệ số t ơng qu n 2 giữa số bản sao ADN ty thể và số chu kỳ ng ỡng là 0,993, hiệu quả là 91 độ dố là -3 56 (hình 3 5 ) Hì 3.5: ểu khuế v p trì củ o n gen ND1 (A), HBB (B) ờng chu n Đị ợng mứ m t o n trên các mẫu nghiên cứu D a vào chu kỳ ng ỡng, công thức tính mứ độ mất đo n đ n u ở phần ph ơng ph p h ng tôi đ x đ nh đ ợ 52/86 ( hiếm 60 46 ) bệnh nhân U Đ ó mứ độ mất đo n ở mô u o hơn so với mô lân cận, có 34/86 (39,54%) bệnh nhân có mất đo n ở mô u thấp hơn mô lân ận u. Mứ độ mất đo n trung bình ở mô u (55,93%±6,55) t ơng đ ơng với mô lân cận u (55,69±8,01). Giá tr trung v mứ độ mất đo n ở mô u là 56,02 (52,70 – 58,81) mô lân cận u là 55,05(51,15-59,51). Trên mẫu mô U Đ phần lớn bệnh nhân có mứ độ mất đo n thuộc khoảng 45%-70%. Trên mô u mứ độ mất đo n lớn nhất là 78,15%, nh nhất là 26 t ơng ứng trên mô lân cận u là 81,86 % và 31,65%. Sử dụng test Wilcoxon Signed-Rank để so sánh s khác biệt về mứ độ mất đo n giữa mô u và lân cận u chúng tôi không nhận thấy có s khác biệt m ng (p=0,163) nghĩ thống kê Mứ độ mất đo n trên mẫu máu của 9 bệnh nhân U Đ đ ợc cung cấp kèm theo mẫu mô và 67 mẫu máu củ ng i kh e m nh làm đối chứng t ơng ứng là 64 63 8 67 và (52,08% ±6,25). Sử dụng test thống kê Mann-Whitney, nhận thấy có s khác biệt mang ý nghĩ thống kê về mứ độ mất đo n giữa mẫu máu của bệnh nhân U Đ với mẫu máu đối chứng (P<0,001) Mối liên quan gi a mứ m t o n ADN ty thể t ối vớ ểm bệnh học lâm sàng Sử dụng ph ơng ph p thống kê g m: Man-Whitney, Kruskal-Wallis Test với k=3 để phân tích mối liên quan giữa mứ độ mất đo n ADN ty thể với đặ điểm nh tuổi, giới tính đặ điểm bệnh h lâm sàng nh v trí u í h th ớc u, mứ độ biệt hóa, gi i đo n gi i đo n gi i đo n bệnh trên 86 bệnh nhân U Đ ả 3.1: ố qu ứ ệ Đ ểm t o vớ UTĐTT Số bệnh nhân ứ Mô LCU 18 66 57,67 ±7,90 55,19 ± 8,13 t số t o U Tuổi < 50 >= 50 Giới tính Nam Nữ í h th ớc u (cm) <3 >=3, <=3,5 >3,5 V trí khối u ể ệ ọ ủ P theo d/theo mô u 0,095/0,163 55,35±3,88 56,02±7,19 0,232/0,315 41 45 55,82± 8,51 55,58 ± 7,62 56,3±7,81 55,59±5,2 0,704/0,172 21 16 42 54,41 ± 8,07 57,23± 6,64 55,70 ± 8,89 56,15±5,48 59,22±6,49 55,10±6,78 0,06/0,173 Tr c tràng 41 Đ i tràng + Đ i tr c tràng 45 Mứ độ biệt hóa Cao 10 Vừa 39 Thấp 6 Mứ độ xâm lấn của khối u (T) T1 9 T2 35 T3+T4 40 H h di ăn ( ) N0 51 N1+N2 32 Gi i đo n bệnh (TNM) I 30 II 21 III+IV 33 t t op p p 55,59 ± 5,80 56,92±6,22 55,79 ± 9,66 54,84±6,79 0,687/0,559 57,03 ±10,33 56,22 ± 7,86 58,03 ±12,03 54,82±3,58 56,9±5,03 55,77±8,16 0,019/0,447 52,61± 5,32 56,88 ± 6,45 55,47 ± 9,69 58,64±6,76 56,05±4,91 55,85±6,15 55,80 ± 8,36 55,73 ± 7,84 55,41±4,78 55,72±6,80 0,0968/0,0261 0,532/0,198 55,93 ± 6,89 55,38 ±10,26 55,84 ± 7,74 55,97±5,29 54,67±3,86 57,47±6,85 pháp Man-Whitney, *: p tính theo p d= s bản sao mô U-s bản sao mô lân cận u p p krusk waliss. ảng 3 1 ho thấ mứ độ mất đo n hông li n qu n đến đặ điểm bệnh h lâm sàng g m: độ tuổi giới tính í h th ớ hối u mứ độ biệt hó gi i đo n gi i đo n bệnh ( >0 05) nh ng li n qu n với gi i đo n ủ bệnh (p<0 05) 3.3.4. Sự t y ổ số bản sao ADN ty thể t o ể ệ ọ â s ủ ệ UTĐTT ố bản s o A t thể t ơng đối đ ợ x đ nh bằng ph ơng ph p re ltime PCR. Số bản s o t ơng đối ủ A t thể đ đ ợ x đ nh tr n 86 ặp mẫu mô U Đ 67 mẫu m u đối chứng ết quả đ nh l ợng iểm tr độ đặc hiệu của m i đ ợc minh h a qua biểu đ khuế h đ i và biểu đ phân tí h đỉnh chảy (hình 3.6). Hì 3.6: Biểu khuế i, biểu ỉnh chảy của phản ứng realtime PCR với cặp mồi ND1 (A), cặp mồi HBB (hình B) của một số bệnh nhân UTĐTT (đường hiển th đậm, nổi là của bệnh nhân #3035) vào ông thứ tính số bản s o n u ở phần ph ơng ph p ch ng tôi đ x đ nh đ ợc 49/86 bệnh nhân U Đ hiếm 56,97% số bệnh nhân có số bản s o t ơng đối ở mô u thấp hơn so với mô lận u 37/86 bệnh nhân hiếm 43,03% có số bản s o t ơng đối ở mô u o hơn so với mô lận cận u. Giá tr trung bình số bản sao ADN ty thể t ơng đối trên mô lân cận u (1237 46 1051 12) o hơn so với mô u (1038 50 743 36) (bảng 3 2) Giá tr trung v trên mô lân cận u là 906,43 (604,30-1544,88), trên mô u là 858,37 (516,77-1333,04). Giá tr số bản s o t ơng đối lớn nhất trên mô lân cận u mô u t ơng ứng là 7455,04 và 3999,20 giá tr số bản s o t ơng đối nh nhất trên mô lân cận u, mô u t ơng ứng là 63,32 và 65,64. Số bản s o t ơng đối trên mô u (1038,51±743,36) o hơn so với m u đối chứng (189,27±112,30) và máu của bệnh nhân U Đ (149,49±80,85). S khác biệt về số bản s o t ơng đối giữa mẫu mô và mẫu máu trên cùng một bệnh nhân, giữa mẫu mô ung th và m u ủ ng i kh e m nh ó nghĩ thống kê (P<,0.001), tuy nhiên, l i không có s khác biệt m ng nghĩ thống kê khi so sánh giữa máu U Đ và m u đối chứng (P>0,05) th đổi số bản sao ADN ty thể t ơng đối theo đặ điểm bệnh h lâm sàng ó xu h ớng giảm dần theo s biểu hiện tăng dần của bệnh U Đ ố bản sao ADN ty thể không phụ thuộc vào một số đặ điểm nh tuổi, giới tính nh ng phụ thuộc và giai đo n và gi i đo n N của bệnh U Đ (bảng 3 2) ả 3.2: Số ả s o N ty t ể t ủ Đ ệ u t ì )t o ể ọ Mô LCU P tính theo d/theo mô u ối U 0,135/ 0,209 Tuổi < 50 >= 50 18 66 1393,96 ± 1678,52 1193,61± 835,28 889,36± 689,59 1092,72±763,05 Nam 41 Nữ 45 t ớc u (cm) <3 21 >=3, <=3,5 16 >3,5 42 Vị trí khối u Tr c tràng 45 Đ i tràng +Đ i tr c tràng 41 Mứ biệt hóa Cao 10 Vừa 39 Thấp 6 Mứ xâm l n của khối u (T) T1 9 T2 35 T3+T4 40 H N) N0 51 N1+N2 32 G o n bệnh (TNM) I 30 II 21 III+IV 33 1128,04 ±862,49 1337,17 ± 1198,67 1011,03±738,73 1063,55±755,00 0,176 /0,2709 Giới tính Ghi chú: ệ trự tr Số bản sao ADN ty thể t Số bệnh nhân ểm ố tru t t p p p 0,239/ 0,759 * 934,70 ± 576,38 1375,04 ± 1170,37 1361,71 ± 1248,03 938,48± 479,52 1043,14± 928,22 1054,02± 832,25 0,050/ 0,050 1357,19 ± 1291,09 959,83± 772,90 1128,38 ± 770,39 1110,19± 716,52 0,524/ 0,425* 1141,60 ± 858,09 935,75 ± 581,73 1175,65 ± 662,21 1058,58± 719,17 834,94± 654,13 716,63± 370,13 <0,0001/ 0,489 * 1287,33± 948,09 1377,56± 1436,38 1082,76± 623,29 1208,56± 577,00 1068,83± 807,71 1010,58± 727,74 1394,81±1245,58 991,22 ± 624,51 1130,74±841,79 923,53± 548,71 0,173/ 0,192 0,565/ 0,398 * 1594,64 ±1501,33 1132,49 ± 669,20 977,12 ± 619,99 p p -W t 1215,00± 848,70 1055,34± 836,48 912,04± 544,08 y *: p t t op p p krusk w ss. = số bản sao mô U-số bản sao mô lân cận u 3.5. M T S 3.5.1. Các biế tràng BI N Đ I THU C CÁC GEN ND1, ND3, COX-1, COX-2 TY TH ổ T4216 4164G ủ ND1 ở bệ â u t i trực ử dụng ặp m i 1 1và en me NlaIII để x đ nh biến đổi t i v trí 4216 và 4164. Kết quả PCR- RFLP của một số mẫu đ i diện trong nghiên cứu đ ợc minh h a trong hình 3.7. Hì 3.7: ện di sản ph m PCR và sản ph m cắt bằng enzyme giới h n NlaIII ện di gel agarose 1.5%, nhu m ethidium bromide) Giếng M: Thang ADN chuẩn 100bp. Hình A: Giếng (1; 2), (3; 4): sản phẩm PCR; cắt n ô , ân ận tương ứng ủa 3 1 Giếng (5;6): sản phẩm PCR, cắt enzyme mẫ đối chứng. Hình B: Giếng (1; 2), (3; 4), (5;6): sản phẩm PCR, cắt n ô , ân ận , ẫ tương ứng ủa ng ột ệnh nhân 1 1 Kết quả - FL x đ nh ó 11/86 mẫu ( hiếm 12 79 ) hi điện di sản phẩm cắt thu đ ợ 2 băng ó í h th ớ t ơng t nh giếng 4 hình 3.7A. Từ kết quả đó h ng tôi b ớ đầu kết luận rằng, có thể có biến đổi 4216 hoặc biến đổi A4164G trong những mẫu nghiên cứu nà goài r h ng tôi ng thu đ ợc 1 mẫu mà sản phẩm PCR sau khi cắt bằng en me ho 3 băng ó í h th ớc lần l ợt khoảng 335bp (đ i diện cho những bản sao không mang biến đổi t i v trí 4216 và 4164), 220,133bp hoặ 185 150bp (đ i diện cho bản sao có biến đổi t i v trí 4216 hoặc 4164) - giếng số 4 hình 3 7 Đâ là mẫu có hiện t ợng d tế bào chất. ơng t ó 8/67 (11 94 ) mẫu m u ủ ng i h e m nh và 2/9 (22 22 ) mẫu m u bệnh nhân U Đ m ng biến đổi t i v trí 4216 hoặ 4164 tr n gen ND1. Để khẳng đ nh kết quả PCR-RFLP, 11 mẫu có biến đổi và một mẫu không chứa biến đổi đ ợc tiến hành nhân dòng và giả trình t . Kết quả giải trình t A đ hỉ ra rằng tất cả 11 mẫu phân tí h nà đều không có biến đổi t i v trí 4216 mà có biến đổi t i v trí 4164 (hình 3 8).