Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giáo dục - Đào tạo Cao đẳng - Đại học Nghiên cứu biến đổi của một số gen ty thể ở bệnh ung thư vú...

Tài liệu Nghiên cứu biến đổi của một số gen ty thể ở bệnh ung thư vú

.PDF
28
500
123

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Tú Linh NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CỦA MỘT SỐ GEN TY THỂ Ở BỆNH UNG THƢ VÚ Chuyên ngành: Mã số: Nhân chủng học 62310302 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2016 Công trình đƣợc hoàn thành tại: Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trịnh Hồng Thái PGS. TS. Tạ Văn Tờ Phản biện:………………………………………… Phản biện:………………………………………… Phản biện:………………………………………… Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại……………………………………… vào hồi: giờ ngày tháng năm 20.. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong các loại ung thư ở nữ giới (Globocan 2012), tuy nhiên, tỉ lệ sống sót có thể được cải thiện nếu bệnh nhân được chẩn đoán ở giai đoạn sớm của bệnh (Anderson, 2008). Đối với sàng lọc và chẩn đoán sớm ung thư vú, chụp nhũ ảnh và thăm khám vú vẫn là phương pháp chuẩn trong lâm sàng (Vahabi, 2003), tuy nhiên nguy cơ phát hiện dương tính giả cao (Elmore, 2010). Điều này cho thấy cần phải có các chỉ thị sinh học đặc hiệu đối với sàng lọc và phát hiện sớm bệnh. ADN ty thể từ lâu đã được cho là có mối liên quan với quá trình phát sinh ung thư vú (Carew, 2002), trong đó có sự thay đổi về số lượng bản sao, biến đổi mức độ biểu hiện và hoạt động của các tiểu đơn vị của chuỗi hô hấp và các đột biến điểm của ADN ty thể (Tseng, 2006; Fan, 2009). Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu trên các nhóm bệnh nhân khác nhau vẫn còn gây tranh cãi. Trên đối tượng bệnh nhân người Việt Nam, nghiên cứu về về biến đổi của các gen ty thể còn ít và chưa có tính hệ thống. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành chọn đề tài: “Nghiên cứu biến đổi của một số gen ty thể ở bệnh ung thư vú” nhằm mục tiêu sau: (1) Cung cấp dữ liệu có tính hệ thống ban đầu về biến đổi của một số gen ty thể, bao gồm biến đổi số bản sao ADN ty thể, mức độ mất đoạn lớn, biến đổi của gen ATP6, tARN, ND1 và ND3, trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam; (2) Xác định được mối liên quan giữa các biến đổi này với các đặc điểm bệnh học của ung thư vú. Kết quả thu được của luận án là tiền đề có thể phát triển để sử dụng trong đánh giá nguy cơ, hỗ trợ chẩn đoán cũng như tiên lượng bệnh. 1 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ UNG THƢ VÚ 1.1.1. Tình hình mắc ung thƣ vú trên thế giới và ở Việt Nam Trong các loại ung thư ở nữ giới, ung thư vú là dạng ung thư phổ biến nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới cũng như tại Việt Nam (Globocan, 2012; Duc, 2010). 1.1.2. Các yếu tố nguy cơ gây ung thƣ vú Các yếu tố nguy cơ được cho là nguyên nhân gây ung thư vú bao gồm phóng xạ ion hóa, virus, các hóa chất gây ung thư, chế độ ăn uống, hoạt động thể chất, hormone ngoại sinh và một số yếu tố sinh sản ở nữ giới. Các yếu tố này gây đột biến các gen tiền ung thư hoặc gen ức chế ung thư, từ đó gây ra sự mất ổn định của tế bào trong sửa chữa các lỗi di truyền và dẫn đến hoạt hóa các gen gây ung thư. 1.1.3. Các giai đoạn của ung thƣ vú Đánh giá giai đoạn của ung thư vú dựa vào hệ thống phân loại TNM, trong đó dựa vào kích thước và mức độ lan rộng của khối u thể hiện qua 3 yếu tố: T (Tumor) – u nguyên phát, N (Node) – hạch tại vùng và M (Metastase) – di căn xa (Edge, 2010). 1.1.4. Các chỉ thị sinh học của ung thƣ vú Các chỉ thị sinh học hiện nay của ung thư vú được áp dụng chủ yếu cho chẩn đoán, lựa chọn phương pháp và theo dõi điều trị (Ludwig, 2005). Thăm khám vú và chụp nhũ ảnh là phương pháp chuẩn trong sàng lọc và chẩn đoán sớm, tuy nhiên lại có tỉ lệ phát hiện dương tính giả cao (Vahabi, 2003; Elmore, 2010). Do đó, cần 2 phải tìm kiếm các chỉ thị sinh học đặc hiệu sử dụng trong sàng lọc và phát hiện sớm bệnh. 1.2. TỔNG QUAN VỀ ADN TY THỂ NGƢỜI ADN ty thể là phân tử mạch vòng, bao gồm 16.569 bp, chứa 37 gen mã hóa cho 13 protein của phức hệ phosphoryl hóa oxi hóa (OXPHOS), 22 tARN và 2 rARN. 1.3. BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ Biến đổi của các gen ty thể được cho là có liên quan với quá trình tạo u bởi vì các tế bào ung thư sử dụng con đường OXPHOS ít hơn so với tế bào bình thường (Warburg, 1956). Biến đổi này bao gồm: thay đổi số bản sao ADN ty thể, giảm biểu hiện của các gen ty thể hoặc biến đổi hoạt tính enzyme của ty thể và các đột biến soma hoặc đột biến dòng mầm của ADN ty thể (Kulawiec, 2008; Brandon, 2006). 1.4. MỘT SỐ BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ Ở BỆNH UNG THƢ VÚ 1.4.1. Biến đổi số bản sao của ADN ty thể Các phân tử ADN ty thể dễ bị tổn thương hơn trong các tế bào ung thư, và do đó ty thể thay đổi số lượng bản sao ADN của chúng để phản ứng lại với hiện tượng này (Pelicano, 2004). Đối với ung thư vú, số bản sao ADN ty thể được cho là giảm ở mô u so với mô không ung thư (Tseng, 2006) và có liên quan với độ tuổi, độ mô học, tình trạng của thụ thể estrogen và progesteron, kích thước khối u (Yu, 2007; Fan, 2009; Bai, 2011). Ngược lại, số bản sao ADN ty thể có xu hướng tăng trong mẫu máu của các bệnh nhân ung thư vú so với đối chứng và được cho là có liên quan với độ tuổi, giai đoạn bệnh (Shen, 3 2009; Lemnrau, 2015). Các kết quả này cho đến nay vẫn còn gây tranh cãi và còn nhiều điều vẫn cần được làm sáng tỏ. 1.4.2. Mất đoạn lớn của ADN ty thể Hệ gen ty thể được đặc trưng bởi một số ít các trình tự lặp đóng vai trò là các điểm cắt để tạo ra các mất đoạn lớn của ADN ty thể (Dakubo, 2010). Mất đoạn 4977 bp (∆mtDNA4977), dạng biến đổi thường gặp nhất, tạo ra phân tử ADN ty thể nhỏ hơn bình thường nhưng vẫn có thể sao chép được và được tích lũy với tỉ lệ khác nhau ở các mô sau nguyên phân. Trong nghiên cứu của Zhu (2004), ∆mtDNA4977 được cho là không đặc trưng ở ung thư vú. Ngược lại, ∆mtDNA4977 được tìm thấy trong 28/60 mẫu mô vú thường (47%) trong khi đó chỉ có 3/60 mẫu u (5%) là có mất đoạn này (Tseng, 2006). Các kết quả thu được vẫn còn nhiều mâu thuẫn, do đó vẫn cần phải tiếp tục nghiên cứu để đưa ra được kết luận chính xác hơn. 1.4.3. Biến đổi của gen ATP6 Gen ATP6, nằm từ vị trí 8527 – 9207 trên ADN ty thể, mã hóa cho dưới đơn vị a của tiểu phần F0 thuộc phức hệ tổng hợp ATP. Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú, Sharp (1992) không phát hiện thấy có biến đổi nào trên gen ATP6. Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác lại phát hiện thấy tỉ lệ biến đổi của gen ATP6 trong khoảng từ 72% – 82,14%, trong đó có một số biến đổi được cho là làm tăng nguy cơ mắc ung thư vú (Grzybowska-Szatkowska, 2014a; Ghaffarpour, 2014; Thapa, 2016). 1.4.4. Biến đổi của gen tARN ty thể Đột biến các gen tARN ty thể thường làm suy giảm hoạt tính aminoacyl hóa của phân tử tARN, từ đó ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp và biểu hiện protein và chức năng của các enzyme 4 OXPHOS (Abbott, 2014). Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú, Grzybowska-Szatkowska (2012) cho rằng 6 biến đổi A15924G, A12308G, T7581C, A8348G, T10034C và T10463C đều có mối liên quan với ung thư vú. Ngược lại, Meng (2015) cho rằng các biến đổi T7581C và A12308G có vai trò tiềm năng trong biểu hiện lâm sàng của ung thư vú, còn các biến đổi khác thì không. Có thể thấy hiểu biết về vai trò của các biến đổi gen tARN ty thể trên bệnh ung thư vú còn rất hạn chế, do đó gây khó khăn trong việc dự đoán tác động đến biểu hiệu lâm sàng của bệnh. 1.4.5. Biến đổi của gen ND3 Biến đổi A10398G làm thay đổi trình tự axít amin từ Threonine thành Alanine trong sản phẩm của gen ND3 ty thể. Các nghiên cứu trước đây đã phân tích mối liên quan giữa biến đổi A10398G và nguy cơ mắc ung thư vú, tuy nhiên kết quả thu được cho đến nay còn mâu thuẫn và gây nhiều tranh cãi (Canter, 2005; Bai, 2007) 1.4.6. Biến đổi của gen ND1 Gen ND1 của ty thể mã hóa cho một trong 7 tiểu đơn vị của phức hệ hô hấp I và là bước đầu tiên trong chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể. Biến đổi gen ND1 được cho là làm thay đổi cấu trúc và chức năng của protein NADH dehydrogenase subunit 1, từ đó thúc đẩy quá trình phát sinh khối u. Một số biến đổi của gen ND1 được báo cáo có liên quan với ung thư vú như T3398C, T4216C, A3796G và được coi như là chỉ thị sinh học mới trong phát hiện sớm ung thư vú (Tan, 2002; Grzybowska-Szatkowska, 2014b; Thapa, 2015). Ngược lại, nghiên cứu khác lại cho rằng biến đổi của các gen thuộc phức hệ V thường gặp hơn so với gen ND1 ở bệnh nhân ung thư vú. 5 Do đó cần tiếp tục tiến hành nghiên cứu biến đổi của gen này trên các nhóm đối tượng khác để cho kết quả chính xác hơn. 1.5. NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ Ở VIỆT NAM Tại Việt Nam, các nghiên cứu về biến đổi của gen ty thể trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú còn ít và chưa có tính hệ thống. Do đó, nghiên cứu này được thực hiện với mục đích xác định các biến đổi của một số gen ADN ty thể trên bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam và phân tích mối liên quan với các đặc điểm lâm sàng của bệnh, góp phần làm sáng tỏ vai trò của ADN ty thể đối với bệnh ung thư vú và cung cấp dữ liệu có tính hệ thống ban đầu cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm hỗ trợ cho đánh giá nguy cơ, hỗ trợ chẩn đoán cũng như tiên lượng bệnh hiệu quả hơn. Chƣơng 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Đối tƣợng Mẫu mô u (được lấy tại vị trí khối u) và mô lân cận u (cách vị trí có khối u từ 5 – 10 cm) của 102 bệnh nhân ung thư vú; mẫu mô u và mô máu của 20 bệnh nhân mắc u xơ vú và mẫu máu của 65 người cho máu khỏe mạnh. 2.1.2. Hóa chất Các hóa chất được mua từ các hãng tin cậy (Sigma, Merk) và đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử. 6 2.1.3. Thiết bị Các thiết bị được sử dụng thuộc phòng Proteomics và sinh học cấu trúc (KLEPT) và Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN đều có độ chính xác và tin cậy cao. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số 2.2.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô Mẫu mô được tách chiết bằng QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất. 2.2.1.2. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu Mẫu máu được tách chiết bằng GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit theo quy trình của nhà sản xuất. 2.2.2. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose và polyacrylamide 2.2.3. Khuếch đại đoạn gen quan tâm bằng phƣơng pháp PCR 2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR Sử dụng ExoSAP-IT (Affymetrix) theo quy trình của nhà sản xuất. 2.2.5. Phân tích PCR-RFLP Các đột biến điểm trong ADN ty thể được phát hiện bằng kỹ thuật PCR-RFLP sử dụng các enzyme giới hạn NlaIII, DdeI, Hin6I, SatI, FspBI (Thermo Scientific) theo quy trình của nhà sản xuất. 7 2.2.6. Nhân dòng và tách chiết ADN plasmid Nhân dòng bằng vector pJET1.2/blunt Cloning Vector theo kit của Fermentas. Tách chiết ADN plasmid sử dụng QIAprepSpin Miniprep Kit (Qiagen) và thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất. 2.2.7. Định lƣợng ADN bằng realtime PCR Định lượng số bản sao và mất đoạn lớn trong ADN ty thể bằng phương pháp realtime PCR dựa trên gen HBB đại diện cho ADN nhân), gen ND1 (nằm trong vùng ít mất đoạn) và gen ND4 (nằm trong vùng hay xảy ra mất đoạn) đại diện cho ADN ty thể. Hiệu suất khuếch đại của phản ứng realtime PCR được xác định dựa vào đường chuẩn theo công thức: % Hiệu suất = (10-1/slope – 1) x 100% Trong đó: slope là hệ số góc của đường chuẩn định lượng. Công thức xác định số bản sao tương đối của ADN ty thể là: Số bản sao tƣơng đối của ADN ty thể = 2(Ct HBB – Ct ND1) Mức độ mất đoạn của ADN ty thể được xác định bằng công thức: Mức độ mất đoạn = (1 – 2(Ct ND1 – Ct ND4))*100% 2.2.8. Định lƣợng ADN bằng HPLC Phương pháp HPLC được sử dụng để định lượng số bản sao ADN ty thể dựa trên gen ACTB đại diện cho ADN nhân và gen ND1 đại diện cho ADN ty thể. Tỉ số bản sao của ADN ty thể so với ADN nhân được tính toán dựa theo công thức: Số bản sao tƣơng đối của ADN ty thể = k x S1/S2 Trong đó: k = 1,235. S1: Diện tích đỉnh sắc ký của sản phẩm gen ND1. S2: Diện tích đỉnh sắc ký của sản phẩm gen ACTB 8 2.2.9. Xử lý số liệu và tính toán thống kê Sử dụng các công cụ tin sinh: BioEdit v7.0, BLAST, ClustalX, chương trình RNAfold WebServer để phân tích số liệu. Xử lý các số liệu thu được theo các phương pháp thống kê thường dùng: phép thử χ², Shapiro-Wilk (Expanded) Test, Mann-Whitney U Test và Kruskal – Wallis Test. Ước tính nguy cơ gây bệnh được biểu thị bằng tỉ số odds (OR) và khoảng tin cậy 95% (95% CI). Tất cả các kiểm định thống kê được ghi nhận theo 2 chiều và giá trị p < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MẪU MÔ VÀ MẪU MÁU ADN tổng số được tách chiết từ 102 cặp mẫu mô u và lân cận u của bệnh nhân mắc ung thư vú, 20 cặp mẫu mô u và mẫu máu của bệnh nhân mắc u xơ vú và 65 mẫu máu của người khỏe mạnh. 3.2. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI SỐ BẢN SAO CỦA ADN TY THỂ Trong nghiên cứu này, biến đổi số bản sao của ADN ty thể được tiến hành phân tích định lượng đồng thời bằng HPLC và realtime PCR nhằm so sánh kết quả thu được khi thực hiện bằng cả hai phương pháp. 3.2.1. Kết quả định lƣợng số bản sao của ADN ty thể bằng HPLC Sử dụng kỹ thuật PCR, đã khuếch đại thành công đoạn đoạn ADN của gen ND1 có kích thước 433 bp đại diện cho ADN ty thể và đoạn ADN của gen ACTB có kích thước 107 bp đại diện cho ADN nhân. Sản phẩm được nhân dòng bằng vector pJET1.2 và biến nạp vào E. Coli DH5 và giải trình tự để khẳng định chính xác. Sau đó, 9 tiến hành xây dựng đường chuẩn giữa tỉ số hàm lượng ADN của gen ND1/ACTB và tỉ số băng HPLC thu được. Kết quả thu được đường chuẩn với hệ số tương quan cao (R2 = 0,9961). Tiến hành định lượng số bản sao của ADN ty thể trong các mẫu nghiên cứu sử dụng sản phẩm PCR đa mồi của gen ACTB và ND1. Kết quả thu được cho thấy giảm số bản sao ADN ty thể ở mô u (2,9 ± 3,9) so với mô lân cận u (4,1 ± 4,8) và giảm số bản sao ở mô u xơ (2,7 ± 3,1) so với mô lân cận u của bệnh nhân ung thư vú. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Kết quả định lượng số bản sao của ADN ty thể trong các mẫu nghiên cứu được thể hiện trong Hình 3.9. Hình 3.1. Biến đổi số bản sao mtDNA xác định bằng phƣơng pháp HPLC (*: p < 0.05) Giảm số bản sao ADN ty thể được cho là liên quan đến sự hình thành khối u ở bệnh nhân ung thư vú do ảnh hưởng đến chức năng điều hòa quá trình chết theo chương trình của tế bào, từ đó làm cho các tế bào đột biến gây ung thư thoát khỏi chết theo chương trình để trở thành tế bào bất tử. 10 3.2.2. Kết quả định lƣợng số bản sao của ADN ty thể bằng realtime PCR Các plasmid mang đoạn gen HBB và ND1 đã tách dòng và tinh sạch được pha loãng với hệ số 10, từ 109 đến 101 bản sao/µl, để xây dựng đường chuẩn và xác định giới hạn phát hiện của phản ứng. Kết quả cho thấy giới hạn phát hiện của phương pháp là khoảng 20 bản sao ADN trong một phản ứng với đường chuẩn có hệ số tương quan R2 = 0.999 và 0.9934 đối với gen ND1 và HBB tương ứng. Hiệu suất khuếch đại tương ứng của gen ND1 và HBB là 96.69% và 93.08%. Kết quả định lượng số bản sao của ADN ty thể trong các mẫu nghiên cứu được thể hiện trong Hình 3.15. Hình 3.2. Biến đổi số bản sao ADN ty thể trong các loại mô nghiên cứu (*: p < 0.05) Kết quả cho thấy số bản sao của ADN ty thể trong mô u thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với mô lân cận u (p = 0,0173). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho rằng số bản sao ADN ty thể giảm ở mô u so với mô lân cận u ở bệnh nhân ung thư vú (Fan, 2009; Bai, 2011; Hu, 2016). Số bản sao ADN ty thể trong mô của bệnh nhân mắc u xơ thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với mô u (p = 11 0,0143) và mô lân cận u (p = 0,0001) của bệnh nhân mắc ung thư vú. Bên cạnh đó, số bản sao của ADN ty thể trong máu của bệnh nhân u xơ cao hơn có ý nghĩa thống kê so với số bản sao trong máu của người khỏe mạnh bình thường với mức ý nghĩa 0,05 (p = 0,0003). Trong các nghiên cứu trước đây, số bản sao của ADN ty thể trong máu cao hơn được cho là làm tăng nguy cơ mắc ung thư vú (Shen, 2009; Lemnrau, 2015). So sánh sự thay đổi số bản sao ADN ty thể theo các đặc điểm lâm sàng cho thấy không có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa số bản sao của ADN ty thể theo độ tuổi (< 50 hoặc ≥ 50), kích thước khối u (< 5 hoặc ≥ 5 cm3), số hạch (< 10 hoặc ≥ 10), kích thước hạch (< 0,5 hoặc ≥ 0,5 cm), giai đoạn hạch N, mức độ biệt hóa và giai đoạn bệnh. Tuy nhiên, số bản sao ADN ty thể thấp hơn có ý nghĩa thống kê ở giai đoạn T3-4 so với giai đoạn T1-2 (p = 0,0058) ở nhóm bệnh nhân ung thư vú. Tương tự với nghiên cứu của Mambo và cs (2005), kết quả không thấy có mối liên quan giữa biến đổi số bản sao với độ mô học của khối u và di căn, do đó biến đổi này được cho là xảy ra ở giai đoạn sớm của quá trình phát sinh khối u và có thể được sử dụng như là một công cụ chẩn đoán phân tử để xác định các bất thường di truyền của khối u. 3.3. PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ MẤT ĐOẠN LỚN CỦA ADN TY THỂ 3.3.1. Xác định mất đoạn 4977 bp Xác định ∆mtDNA4977 được dựa trên phản ứng nhân bản các đoạn gen ND1 đại diện cho vùng không mất đoạn của ADN ty thể, gen ND3 thuộc vùng mất đoạn 4977 bp và đoạn ADN nằm ngoài các trình tự lặp 13 bp (ngoài vùng mất đoạn 4977 bp) bằng phương pháp PCR lồng. 12 Thực hiện phân tích trên các mẫu xác định được tỉ lệ của ∆mtDNA4977 là 61.76% (63/102 mẫu) ở mô u, 77.45% (79/102 mẫu) ở mô lân cận u và 15.38% (10/65 mẫu) trong máu của người bình thường. Bên cạnh đó, tỉ lệ mất đoạn 4977 bp được xác định thấp hơn có ý nghĩa thống kê ở mô u so với mô lân cận u, và giữa máu của người bình thường so với mẫu mô u và lân cận u của bệnh nhân ung thư vú (OR = 8,88, 95% CI = 1,2 – 5,7, p < 0,05). Kết quả này cũng thống nhất với một số kết quả nghiên cứu trước đây (Dani, 2004; Tseng, 2006; Ye, 2008), từ đó ủng hộ quan điểm ∆mtDNA4977 đóng vai trò vào sự phát sinh khối u và tiến triển của ung thư vú. Nguyên nhân của hiện tượng giảm số bản sao ở mô u có thể do sự mở rộng của dòng tế bào ung thư trong quá trình phát triển hoặc các tế bào có đột biến ∆mtDNA4977 bị loại bỏ đi bởi quá trình apoptosis (Wu, 2005). Phân tích mối liên quan giữa tỉ lệ mất đoạn 4977 bp với các đặc điểm bệnh học của bệnh ung thư vú cho thấy mất đoạn 4977 bp có mối liên quan có ý nghĩa thống kê với di căn hạch (thấp hơn ở giai đoạn N0 so với giai đoạn N1-2) (p = 0,0416). Bên cạnh đó, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tần số của mất đoạn 4977 bp và các đặc điểm bệnh học khác. 3.3.2. Xác định các mất đoạn lớn khác ở bệnh nhân ung thƣ vú Kết quả của phản ứng PCR lồng cũng phát hiện thấy các băng có kích thước khác với băng 381 bp đại diện cho mất đoạn 4977 bp. Một số trường hợp thể hiện đồng thời nhiều mất đoạn với kích thước khác nhau. Các băng lạ có kích thước lớn hơn và nhỏ hơn 381 bp được tinh sạch, giải trình tự và so sánh với trình tự chuẩn của ADN ty thể. Hình 3.18 minh họa một số mất đoạn lớn khác của ADN ty thể xác định được thông qua giải trình tự trực tiếp. 13 Hình 3.3. Mất đoạn lớn khác 4977 bp của ADN ty thể đƣợc xác định thông qua giải trình tự trực tiếp (A): vị trí nối sau khi mất đoạn 4977 bp. (B): mất đoạn 5156 bp. (C): mất đoạn 5266 bp. (D): mất đoạn 5012 bp. Mũi tên chỉ vị trí nối sau khi mất đoạn, trình tự lặp màu xanh: 13 bp (A), 3 bp (B) Kết quả thu được ngoài mất đoạn 4977 bp, đã phát hiện thấy 18 mất đoạn lớn trên mô u, 11 mất đoạn lớn trên mô lân cận u của bệnh nhân ung thư vú chưa được công bố trước đây trên cơ sở dữ liệu của MITOMAP. Các mất đoạn lớn khác được tìm thấy với tỷ lệ 52,94% (54/102 mẫu) ở mô u, 45,1% (45/102 mẫu) ở mô lân cận u và 27,69% (18/65 mẫu) ở mẫu máu đối chứng. Sự tăng dần của các mất đoạn lớn ở máu bình thường, mô lân cận u và mô u khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Tuy nhiên, kết quả này chưa đủ cơ sở để trả lời câu hỏi rằng liệu các biến đổi của ADN ty thể có phải là các yếu tố góp phần vào quá trình phát sinh ung thư hay các đột biến này chỉ đơn giản phát sinh như một phần của hiệu ứng phụ trong quá trình tiến triển của ung thư bởi vì nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong số đó có mức độ của 14 các mất đoạn này trong mô. Do đó, để trả lời câu hỏi vai trò của các mất đoạn lớn này đến ung thư vú như thế nào thì cần phải tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. 3.3.3. Xác định mức độ mất đoạn lớn bằng realtime PCR Mức độ mất đoạn lớn của ADN ty thể được xác định bằng phương pháp realtime PCR dựa trên sự có mặt của gen ND1 (nằm trong vùng ít xảy ra mất đoạn) và gen ND4 (nằm trong vùng hay xảy ra mất đoạn). Mức độ mất đoạn trong các loại mẫu khác nhau được thể hiện trong Hình 3.20. Hình 3.20. Mức độ mất đoạn lớn của ADN ty thể trong các loại mô nghiên cứu (*: p < 0.05) Kết quả cho thấy mức độ mất đoạn lớn của ADN ty thể cao nhất ở mô u (54,6 ± 6,69) rồi giảm dần ở mô lân cận u (53,7 ± 7,00), máu của người bình thường (51,7 ± 5,77), máu của bệnh nhân u xơ (51,5 ± 3,94) và thấp nhất trong mô của bệnh nhân mắc u xơ (45,3 ± 7,24). Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa mức độ mất đoạn lớn của mô u và lân cận u của bệnh nhân ung thư vú, cũng như giữa máu của bệnh nhân mắc u xơ và máu của người bình thường. Ngược 15 lại, mức độ mất đoạn ít hơn ở mẫu mô u xơ (45,3 ± 7,24) so với mẫu máu của bệnh nhân u xơ (51,5 ± 3,94) và ít hơn ở mô u xơ so với mô u và lân cận u của bệnh nhân ung thư vú (54,6 ± 6,69 và 53,7 ± 7,00) là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Kết quả này trái ngược với nghiên cứu của Ye và cs (2008) khi không tìm thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về mức độ mất đoạn 4977 bp giữa mô u và lân cận u ở bệnh nhân mắc ung thư vú và u xơ. Nie và cs (2015) lại thấy tỉ lệ mất đoạn lớn trong máu của bệnh nhân ung thư vú cao hơn có ý nghĩa thống kê so với trong máu của bệnh nhân mắc u vú lành tính (p < 0,001). Như vậy có thể thấy mức độ mất đoạn của ADN ty thể giảm có thể là kết quả của quá trình tiến triển ung thư thông qua phân chia tế bào một cách nhanh chóng hoặc là kết quả của tác động chọn lọc thông qua một cơ chế nào đó (ví dụ như chết theo chương trình) dẫn đến các tế bào có mức độ mất đoạn lớn bị loại bỏ đi trong các mô ung thư (Wu, 2005). Trong nghiên cứu này, khi so sánh mức độ mất đoạn lớn của ADN ty thể trong mô u với các đặc điểm bệnh học của ung thư vú, kết quả cho thấy mức độ mất đoạn cao hơn ở những bệnh nhân có kích thước hạch lớn (≥ 0,5 cm) so với các bệnh nhân có kích thước hạch nhỏ hơn 0,5 cm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p = 0,024. Trong các nghiên cứu trước đây, mức độ mất đoạn lớn của ADN ty thể, cụ thể là ∆mtDNA4977, được thấy giảm cùng với giai đoạn tiến triển của ung thư đại trực tràng (p = 0,031) tuy nhiên số bản sao của ADN ty thể lại thấy tăng lên (Chen, 2011b). Ngược lại, trong nghiên cứu của Ye (2008), mức độ mất đoạn 4977 bp lại được thấy không có mối liên hệ có ý nghĩa thống kê với các đặc điểm lâm sàng của ung thư vú như độ tuổi, độ mô học, giai đoạn của khối u và tình trạng 16 của ER/PR ở cả bệnh nhân ung thư vú và bệnh nhân mắc u lành tính. Sự mâu thuẫn này có thể liên quan đến các kỹ thuật sử dụng trong phân tích và đặc điểm của nhóm mẫu khác nhau (ví dụ mẫu mô đông lạnh so với mẫu đã được cố định bằng formalin, độ tuổi và nhóm bệnh nhân khác nhau, loại mẫu mô hay máu) (Ye, 2008). 3.4. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN ATP6 Đoạn ADN chứa gen ATP6 được tiến hành nhân bản và giải trình tự trực tiếp. Kết quả giải trình tự đã xác định được 20 biến đổi trên mẫu mô u, trong đó có 13 biến đổi làm thay đổi trình tự axít amin, và 13 biến đổi trên mẫu máu của người bình thường, trong đó có 12 biến đổi đã được công bố và 1 biến đổi mới (9183insC). Trong đó, biến đổi làm thay đổi trình tự axít amin có tần suất cao hơn ở mô u so với mô máu là G9053A (22,86%, 8/35 mẫu) được lựa chọn để sàng lọc trong các mấu nghiên cứu. Kết quả xác định thấy tỉ lệ dạng biến đổi 9053A là 21,57% (22/102 trường hợp) ở mô của bệnh nhân ung thư vú và 11,76% (12/65 trường hợp) ở mẫu máu của người khỏe mạnh bình thường. Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Kết quả phân tích cũng cho thấy không có mối liên quan giữa biến đổi G9053A với các đặc điểm bệnh học của ung thư vú như độ tuổi, kích thước u, số hạch, kích thước hạch, mức độ xâm lấn, di căn hạch, mức độ biệt hóa và giai đoạn bệnh. 3.5. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN tARN TY THỂ 3.5.1. Xác định tần suất biến đổi của gen tARN ty thể Đoạn ADN chứa 8 gen: MT-TI (tARNLeu), MT-TQ (tARNGln), MT-TM (tARNMet), MT-TW (tARNTrp), MT-TA (tARNAla), MT-TN (tARNAsn), MT-TC (tARNCys) và MT-TY (tARNTyr) được nhân bản và giải trình tự trực tiếp. Kết quả đã xác định được tổng số 12 biến đổi 17 trong 20,4% bệnh nhân (10/49 trường hợp) thuộc 7 gen tARN nghiên cứu, trừ gen MT-TM (mã hóa cho tARNMet). Hầu hết các biến đổi tập trung trên gen MT-TA (mã hóa cho tARNAla) (41,67%, 5/12 biến đổi). Đáng chú ý là có 3 biến đổi thuộc gen MT-TW (A5536T), MTTA (G5645T) và MT-TN (A5724G) chưa được công bố trên cơ sở dữ liệu Mitomap trước đây. Đây có thể là các biến đổi mới của gen tARN ty thể trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam. Mặt khác, các biến đổi này được phát hiện với tần suất thấp do đó các biến đổi này có thể là các biến đổi hiếm trong nhóm bệnh nhân này. Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tần suất của các biến đổi này với đặc điểm bệnh học của ung thư vú. 3.5.2. Dự đoán sự thay đổi cấu trúc bậc 2 của phân tử tARN có biến đổi Để nghiên cứu sâu hơn tác động của các biến đổi mới chưa được công bố (A5536T, G5645T và A5724G) lên cấu trúc bậc 2 của phân tử tARN, chúng tôi sử dụng chương trình dự đoán cấu trúc bậc 2 RNAfold WebServer. Sự tác động của các biến đổi này lên cấu trúc bậc 2 của các phân tử tARN tương ứng được thể hiện trong Hình 3.27. Theo đó, chỉ có 2 biến đổi A5536T và G5645T làm thay đổi cấu trúc bậc 2 của phân tử tARNTrp và tARNAla, trong khi đó biến đổi A5724G không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của phân tử tARNAsn. Tuy nhiên, trong số đó chỉ có biến đổi A5536T làm giảm năng lượng tự do tối thiểu (MFE) đối với phân tử tARNTrp, điều này cho thấy rằng biến đổi A5536T có thể đóng một vai trò quan trọng trong bệnh ung thư vú. A. MFE: -9,60 kcal/mol MFE: -10,00 kcal/mol 18
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan