Tài liệu Nghiên cứu chiết xuất alcaloid toàn phần và phân lập từ nuciferin từ lá sen

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ----- 0 ---- NGUYỄN THỊ THU HƯỜNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ALCALOID TOÀN PHẦN VÀ PHÂN LẬP NUCIFERIN TỪ LÁ SEN (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ) HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ----- 0 ---- NGUYỄN THỊ THU HƯỜNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ALCALOID TOÀN PHẦN VÀ PHÂN LẬP NUCIFERIN TỪ LÁ SEN (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ) Người hướng dẫn: DS. Trần Ngọc Bảo Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp dược Trường đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình làm khóa luận, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, góp ý từ thầy cô, gia đình và bạn bè. Nhờ đó, em đã hoàn thành khóa luận và có thêm sự hiểu biết về tư duy trong nghiên cứu khoa học. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến DS. Trần Ngọc Bảo - người thầy trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình làm khóa luận. Em xin trân trọng cám ơn TS. Nguyễn Văn Hân đã giúp đỡ hướng dẫn, giúp cho em nâng cao nhận thức và phương pháp luận khi làm thực nghiệm. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô bộ môn Công nghiệp Dược, các anh chị kĩ thuật viên đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn bộ giảng viên và cán bộ trong trường, những người đã dìu dắt, truyền cho em ngọn lửa đam mê với khoa học trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên và giúp đỡ em rất nhiều để em hoàn thành tốt khóa luận. Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2014. Nguyễn Thị Thu Hường MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN................................................................................ 2 1.1. Tổng quan về cây sen .............................................................................. 2 1.1.1. Đặc điểm hình thái của cây sen ..................................................... 2 1.1.2. Phân bố .......................................................................................... 2 1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến ................................................ 3 1.1.4. Thành phần hóa học ...................................................................... 3 1.1.5. Tác dụng sinh học của lá sen.......................................................... 5 1.2. Tổng quan về nuciferin.............................................................................. 6 1.2.1. Công thức hóa học, tính chất ............................................................ 6 1.2.2. Nguồn gốc ........................................................................................ 6 1.2.3. Tác dụng dược lí .............................................................................. 6 1.3. Một số phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần và tinh chế nuciferin từ lá sen .............................................................................................. 8 1.3.1. Phương pháp chiết alcaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực .......................................................................................... 8 1.3.2. Phương pháp chiết alcaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid hoặc ethanol acid ....................................................................... 8 1.3.3. Phương pháp tinh chế nuciferin ...................................................... 11 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ........................................................................... 12 2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................... 12 2.1.2. Máy móc thiết bị ............................................................................. 13 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 14 2.2.1. Khảo sát quy trình chiết alcaloid toàn phần từ lá sen. .................... 14 2.2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết ................................... 14 2.2.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết ........................................ 14 2.2.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết..................................... 14 2.2.2. So sánh phương pháp chiết bằng dung môi dầu hỏa và EtOH 96% ................................................................................................................... 14 2.2.2.1. So sánh độ tan ........................................................................... 14 2.2.2.2. So sánh hiệu suất chiết: ............................................................ 14 2.2.3. Tinh chế nuciferin ........................................................................... 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 15 2.3.1. Phương pháp định lượng................................................................. 15 2.3.1.1. Định lượng alcaloid toàn phần trong lá sen .............................. 15 2.3.1.2. Định lượng alcaloid toàn phần trong tủa thô bằng phương pháp chuẩn độ acid - base ............................................................................... 16 2.3.1.3. Định lượng nuciferin bằng phương pháp HPLC ...................... 16 2.3.1.4. Định lượng nuciferin bằng phương pháp đo quang.................. 18 2.3.2. Phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần .................................... 18 2.3.2.1. Chiết bằng dung môi dầu hỏa ................................................... 18 2.3.2.2. Chiết bằng dung môi EtOH 96% .............................................. 19 2.3.3. Phương pháp tinh chế nuciferin ...................................................... 19 2.3.4. Kiểm tra độ tinh khiết, khẳng định cấu trúc sản phẩm ................... 20 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................... 22 3.1. Xác định hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá sen ........................... 22 3.2. Khảo sát quy trình chiết alcaloid toàn phần từ lá sen. ......................... 22 3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết.......................................... 22 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết .............................................. 24 3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết ........................................... 25 3.3. So sánh phương pháp chiết bằng dung môi dầu hỏa và EtOH 96% .. 26 3.3.1. So sánh độ tan ................................................................................. 26 3.3.1.1. Xác định khoảng tuyến tính ...................................................... 27 3.3.1.2. Kết quả đo độ tan ...................................................................... 28 3.3.2. So sánh hiệu suất............................................................................. 28 3.4. Tinh chế nuciferin .................................................................................... 29 3.5. Đánh giá độ tinh khiết, khẳng định cấu trúc sản phẩm. ...................... 31 3.6. Đề xuất quy trình chiết xuất alcaloid toàn phẩn, tinh chế nuciferin .. 35 3.6.1. Sơ đồ quy trình................................................................................ 35 3.6.2. Mô tả quy trình ............................................................................... 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Kí hiệu, chữ viết tắt Giải thích 1 ACN Acetonitril 2 alc tp Alcaloid toàn phần 3 dd Dung dịch 4 DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV 5 DMSO Dimethyl sulfoxid 6 1 7 HPLC H – NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân High performance liquid chromatography (Sắc kí lỏng hiệu năng cao) 8 IR Phổ hồng ngoại 9 m Khối lượng 10 MS Phổ khối lượng 11 Rf Hệ số lưu giữ 12 SKLM Sắc kí lớp mỏng 13 Tb Trung bình 14 TEA Triethylamin DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung bảng Trang 2.1 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu 12 2.2 Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực 13 nghiệm 3.1 Hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá sen. 22 3.2 Hàm lượng alcaloid toàn phần và hiệu suất chiết theo 23 thời gian 3.3 Hàm lượng alcaloid toàn phần và hiệu suất chiết theo số 24 lần chiết. 3.4 Hàm lượng alcaloid toàn phần và hiệu suất chiết theo 25 nhiệt độ. 3.5 Độ hấp thụ của dung dịch nuciferin trong EtOH 96% 27 3.6 Độ tan của nuciferin trong dầu hỏa và trong EtOH 96% 28 3.7 So sánh 2 phương pháp chiết xuất bằng dung môi EtOH 28 960 và dung môi dầu hỏa 3.8 Khối lượng alcaloid toàn phần thu được, hàm lượng 30 nuciferin và hiệu suất tinh chế 3.9 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của nuciferin (IR, 32 KBr) 3.10 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 33 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ STT Danh mục các hình ảnh, đồ thị Trang 1 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất chiết 23 vào thời gian chiết. 2 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất chiết 24 vào số lần chiết. 3 Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất chiết 26 vào nhiệt độ chiết. 4 Hình 3.4. Đồ thị biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp 27 thụ 5 Hình 3.5. Sắc kí đồ của dung dịch nuciferin chuẩn. 30 6 Hình 3.6. Sắc kí đồ của mẫu nuciferin tinh chế. 31 7 Hình 3.7. Sắc kí đồ của mẫu alcaloid toàn phần. 31 8 Hình 3.8. Sắc kí đồ nuciferin tinh chế được với các hệ dung 32 môi. 9 Hình 3.9. Sơ đồ chiết xuất alcaloid toàn phần và tinh chế 35 nuciferin. 10 Hình 3.10. Hình ảnh alcaloid toàn phần. 36 11 Hình 3.11. Hình ảnh nuciferin tinh khiết. 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn, Nelumbonaceae) là một dược liệu quý mà tất cả các bộ phận đều được dùng làm thuốc. Trong đó, lá sen là 1 vị thuốc hay được dùng trong y học cổ truyền với tên gọi liên diệp. Trong y học hiện đại, lá sen được sử dụng với các tác dụng: an thần, chống mất ngủ, chống loạn nhịp tim. Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã chỉ ra tác dụng an thần, chống mất ngủ có liên quan đến alcaloid chính trong lá sen là nuciferin. Ngoài ra, nuciferin còn có tác dụng giải thắt co cơ trơn, ức chế thần kinh trung ương, chống viêm yếu, giảm đau, giảm ho, kháng serotonin và có hoạt tính phong bế thụ thể adrenergic [4]. Trong ngành hóa dược, nuciferin là nguyên liệu dùng để bán tổng hợp một số chất có hoạt tính sinh học cao. Nguồn dược liệu lá sen ở nước ta rất dồi dào nên hiện nay trên thị trường đã có nhiều sản phẩm thuốc an thần làm từ cao lá sen. Tuy nhiên, các sản phẩm này không đảm bảo về tiêu chuẩn chất lượng, khó kiểm soát hàm lượng, không an toàn cho người sử dụng. Dạng cao lá gây khó khăn trong quá trình dập viên. Do đó, việc chiết xuất nuciferin tinh khiết là rất cần thiết. Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu chiết xuất alcaloid toàn phần và tinh chế nuciferin trong lá sen nhưng các nghiên cứu đó mới chỉ tập trung ở quy mô phòng thí nghiệm, chủ yếu sử dụng dung môi chiết là ethanol với quy trình tinh chế phức tạp, rất khó triển khai ở quy mô công nghiệp, chưa có nghiên cứu về chiết xuất bằng dung môi dầu hỏa. Vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất alcaloid toàn phần và phân lập nuciferin từ lá sen” với mục đích làm cơ sở cho việc ứng dụng chiết xuất trên quy mô công nghiệp. Đề tài gồm các mục tiêu sau: 1, Xây dựng được quy trình chiết alcaloid toàn phần từ lá sen bằng dầu hỏa. 2, Xây dựng được quy trình tinh chế nuciferin. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây sen Cây sen có tên khoa học là Nelumbo nucifera Gaertn, thuộc họ Sen Nelumbonaceae. Ngoài ra, cây còn có tên gọi khác là Liên, Quỳ [6]. 1.1.1. Đặc điểm hình thái của cây sen [4] Cây thảo, sống ở nước, to khoẻ, cao hơn một mét. Thân rễ (ngó sen) mập, mọc dài trong bùn, đính rễ ở những mấu, từ đó mọc lên thân và lá. Lá hình tròn, vượt lên khỏi mặt nước, đường kính 30-40cm, màu lục xám, nếp nguyên lượn sóng, giữa lá thường trũng xuống, mặt sau đôi khi điểm những đốm màu tía, nhân hình khiên, hằng rõ. Cuống lá đính vào giữa lá, dài một mét hay hơn, có nhiều gai cứng nhọn. Hoa to, mọc riêng lẻ trên cuống dài và thẳng, phủ đầy gai nhọn, đường kính 8-12cm, màu hồng, đỏ hoặc trắng. Lá đài 3-5cm, màu lục nhạt, rụng sớm. Cánh hoa nhiều, những cánh phía ngoài to, khum lòng mán, cánh giữa ở trong nhỏ hẹp dần. Nhị rất nhiều, màu vàng, chỉ nhị mảnh, có phần phụ (gạo sen) màu trắng và thơm. Bộ nhụy gồm nhiều lá noãn rời nằm trên một đế hoa hình nón ngược (gương sen). Quả bế có núm nhọn, thường gọi là hạt sen, phần ngoài mỏng và có màu lục tía, phần giữa mềm chứa tinh bột màu trắng ngà và phần trong là lá mầm dài màu lục sẫm. Mùa hoa: tháng 5-6, mùa quả: tháng 7-9. 1.1.2. Phân bố [4] Trên thế giới, do ưa khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới nên sen được trồng ở hầu hết các nước khu vực Đông Nam Á đến Nam Á như Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ và một số tỉnh phía nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, sen mọc hoang dại và chủ yếu ở vùng Đồng Tháp Mười, thuộc tỉnh Đồng Tháp và An Giang tạo nên cảnh quan sinh thái đặc biệt của vùng ngập nước Đồng Tháp Mười. Bên cạnh quần thể hoang dại, sen cũng 3 được trồng phổ biến ở các tỉnh đồng bằng và trung du trong các vùng ao hồ nước nông và trung bình. 1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến [2], [4]  Lá sen thu hái vào mùa thu bỏ cuống (liên diệp).  Quả thu hái lúc quả chín (liên thạch)  Quả bóc vỏ ngoài lấy hạt (liên nhục).  Tâm sen là chồi mầm trong hạt sen (liên tâm).  Gương sen đã lấy quả (liên phòng).  Tu sen bỏ hạt ở đầu (liên tu).  Thân rễ gọi là ngó sen (liên ngẫu). Tất cả đều phơi khô hay sấy khô. 1.1.4. Thành phần hóa học [2], [4], [8], [15] Lá sen có nhiều alcaloid đã được phân lập và xác định cấu trúc: nuciferin, anonain, roemerin, pronuciferin, N-nornuciferin, O-nornuciferin, nepherin, liriodenin, dehydroemerin, armepavin, N-norarmepavin, dehydronuciferin, dehydroanonain, N-methylisococlaurin, N-methylcoclaurin. Trong đó, nuciferin là alcaloid chính. Ngoài alcaloid, lá sen còn có các flavonoid: quercetin, isoquercitrin, leucocyanidin, leucodelphinidin… 4 Công thức hóa học của một số alcaloid chính có trong lá sen: pronuciferin liriodenin Armepavin R= R1= R2= CH3 CH3 CH3 N-methylcoclaurin CH3 Neferin H H CH3 CH3 CH3 Nuciferin R= CH3 R1= R2= CH3 CH3 N- nornuciferin CH3 CH3 CH3 O- nornuciferin H CH3 CH3 Anoanin - CH2- H Roemetin - CH2- CH3 Liensinin Isoliensinin Neferin R= CH3 R1= R2= H H H H CH3 CH3 H CH3 5 1.1.5. Tác dụng sinh học của lá sen Trong y học cổ truyền lá sen vị đắng, tính chát, quy vào 3 kinh can, tỳ, thận. Công năng giải thử, kiện tỳ, lương huyết, chỉ huyết. Chủ trị trúng thử, háo khát, ỉa chảy do thử thấp, huyết lị, nôn máu, đổ máu cam, đái máu do huyết nhiệt. Liều dùng: ngày dùng từ 3-9g dược liệu khô, 15-30g dược liệu tươi, dùng dạng thuốc sắc hoặc hoàn tán [3]. Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự, dịch chiết và alcaloid toàn phần của tâm và lá sen có tác dụng an thần, tăng trương lực và co bóp cơ tử cung thỏ, chống co thắt cơ trơn ruột gây nên bởi lustamin và acetylcholine. Lá sen có tác dụng chống choáng phản vệ. Tác dụng an thần của tâm sen yếu hơn lá sen [4]. Lá sen có tác dụng bảo vệ đối với các rối loạn nhịp tim gây nên do calci clorid, làm giảm số chuột chết và chuột bị rung tâm thất. Lá sen cũng có tác dụng chống loạn nhịp tim gây nên do bari clorid và kích thích điện. Cao cồn có tác dụng mạnh hơn cao nước. Cơ chế chống loạn nhịp tim của lá sen là do làm tăng ngưỡng kích thích tâm trương và tăng giai đoạn trơ của cơ tâm nhĩ và tâm thất. LD50 của lá sen tiêm phúc mạc trên chuột nhắt trắng là 17g/kg thể trọng. Alcaloid toàn phần của lá sen có tác dụng ức chế loạn nhịp tim thực nghiệm, tác dụng này của alcaloid lá sen có phần tốt hơn ajmazin [4]. Một trong những tác dụng của lá sen đang rất được quan tâm hiện nay là tác dụng hạ mỡ máu, chống béo phì. Flavonoid ở dịch chiết lá sen có khả năng ngăn ngừa mỡ máu và giảm nhẹ tác hại đến gan khi ăn chế độ nhiều chất béo, tương tự như các thuốc hay dùng là sillymarin và simvastatin [13], [19]. Ngoài ra, các nghiên cứu trên thế giới gần đây cho thấy thành phần trong dịch chiết lá sen còn có nhiều hoạt tính dược lí khác như viêm gan [11]; chống oxy hóa [12], [18]; chống ung thư [20]; kháng HIV [23]. 6 1.2. Tổng quan về nuciferin 1.2.1. Công thức hóa học, tính chất  Công thức hóa học của nuciferin:  Công thức phân tử: C19H21NO2.  Phân tử lượng: 295,38.  Tên khoa học: 1,2-dimethoxy-6-methyl5,6,6a,7-tetrahydro-4H-dibenzo[de,g]quinolin.  Tính chất lí – hóa: Nuciferin là chất kết tinh, tinh thể hình khối, màu vàng nhạt, không mùi, không vị, tan tốt trong cloroform, methanol, ethanol nóng, hầu như không tan trong nước.  Nhiệt độ nóng chảy T0nc: 164 – 1650C .  Phổ UV đo trong methanol cho λmax tại bước sóng 210nm, 228nm, 270nm [7]. 1.2.2. Nguồn gốc Nuciferin được tìm thấy ở các bộ phận của cây sen là tâm sen, lá sen và gương sen. Tuy hàm lượng alcaloid toàn phần trong tâm sen là cao nhất (1,23%), trong lá sen (0,89%) và gương sen (0,24%) nhưng hàm lượng nuciferin trong lá sen lại nhiều hơn tâm sen do nuciferin là alcaloid chính trong lá sen, alcaloid chính trong tâm sen là liensinin và neferin [8]. 1.2.3. Tác dụng dược lí Nuciferin chiết từ lá sen có tác dụng giải thắt co cơ trơn, ức chế thần kinh trung ương, chống viêm yếu, giảm đau, giảm ho, kháng serotonin và có hoạt tính phong bế thụ thể adrenergic. Nuciferin ít độc, liều LD50 là 330 mg/kg thể trọng chuột. Nuciferin có tác dụng tăng cường quá trình ức chế các tế bào thần kinh vùng vỏ não cảm giác – vận động và thể lưới thân não trên thỏ thí nghiệm, có tác dụng an thần và kéo dài giấc ngủ của pentobarbital trên chuột thí nghiệm [2]. 7 Tiến sĩ Nguyễn Thị Nhung năm 2001 đã tiến hành thử tác dụng sinh học và kết luận nuciferin với liều 60 mg/kg thể trọng chuột nhắt trắng, không gây đột biến nhiễm sắc thể. Nuciferin dùng cho chuột nhắt trắng có chửa với 3 liều 1,32 mg/kg trong 1, 2 hoặc 3 ngày liên tục không ảnh hưởng đến sức khỏe của chuột mẹ và không gây những bất thường trong quá trình phát triển của phôi thai. Kết quả thử tác dụng của nuciferin lên điện tim và điện não thỏ cho thấy nuciferin với liều 100mg/kg thể trọng/ngày qua đường uống trong 4 ngày liền có tác dụng tăng cường ức chế các tế bào thần kinh vùng vỏ não cảm giác – vận động và thể lưới thân não [8]. Trong một nghiên cứu năm 2012, các nhà khoa học đã chỉ ra nuciferin chiết từ Nelumbo nucifera có tác dụng kích thích tiểu đảo tụy tiết insulin, chống bệnh đái tháo đường theo cơ chế đóng các kênh K+-ATP. Tác dụng của nuciferin bị bất hoạt bởi diazoxide và nimodipine; bị giảm bởi chất ức chế protein kinase A, protein kinase C. Nuciferin kích thích tế bào INS – 1E tiết insulin ở cả nồng độ glucose 3,3 và 16,7 mM. So với glibenclamid, nuciferin có tác dụng mạnh hơn và ít độc với tế bào hơn. Tuy nhiên, khả năng gắn với receptor sulfonylurea của nuciferin yếu hơn glibenclamid [14]. Theo Yoshiki Kashiwada và các cộng sự, nuciferin và 1 số alcaloid có ở dịch chiết lá sen trong cồn 95% có tác dụng kháng HIV. Trong đó, nồng độ 50% tác dụng tối đa (EC50) = 0,8 µg/ml; chỉ số trị liệu (TI) = 36,3 [23]. * Với những tác dụng đó, cùng với nhu cầu sử dụng thuốc an thần và thuốc hỗ trợ điều trị đái tháo đường ngày một tăng, nuciferin có tiềm năng trở thành nguồn nguyên liệu đóng vai trò quan trọng trong ngành dược không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới. 8 1.3. Một số phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần và tinh chế nuciferin từ lá sen 1.3.1. Phương pháp chiết alcaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực [1]. Sử dụng dung môi chiết là các dung môi hữu cơ. Trong phòng thí nghiệm thường dùng benzen, cloroform, ether + cloroform. Trong sản xuất công nghiệp, phải chú ý dùng dung môi rẻ tiền, ít độc, khó cháy. Có thể dùng chiết nguội hoặc chiết nóng. Tinh chế thu các alcaloid bằng cách chuyển dạng muối với acid – base và phân chia chúng giữa hai pha để loại tạp chất không phải là alcaloid.  Ưu điểm: Hiệu suất chiết các hoạt chất từ dược liệu cao do dịch chiết rút ra sạch, dễ tinh chế các loại tạp đi kèm. Các dung môi hữu cơ không phân cực thường là dung môi có khả năng chiết chọn lọc đối với các alcaloid ở dạng base.  Nhược điểm: Dung môi hữu cơ thường đắt tiền. Khi sử dụng các dung môi này chiết đòi hỏi các thiết bị phức tạp, đầu tư cho thiết bị lớn. Một số dung môi hữu cơ dễ cháy nổ. 1.3.2. Phương pháp chiết alcaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid hoặc ethanol acid [1] Các alcaloid trong dược liệu ở dạng muối tan trong các dung môi thân nước, thông thường dùng nước nóng hoặc ethanol có các nồng độ khác nhau. Dịch chiết sau đó đem lọc, kiềm hóa về dạng base, cô dung môi dưới áp suất giảm. Dùng dung môi hữu cơ thích hợp để chiết lấy alcaloid dạng base. Cất thu hồi dung môi hữu cơ rồi sấy khô sẽ thu được hỗn hợp alcaloid thô. 9 Chuyển dạng alcaloid từ base sang muối và ngược lại để loại tạp, thu lấy alcaloid tinh khiết.  Ưu điểm: Thiết bị chiết xuất đơn giản, đầu tư ít. Nước ta lại có sẵn nguồn nguyên liệu này.  Nhược điểm: Đối với các loại dược liệu chứa nhiều chất nhầy, việc sử dụng nước làm dung môi chiết sẽ gặp khó khăn trong việc rửa dịch chiết và tinh chế. * Hiện nay trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về chiết xuất alcaloid toàn phần của lá sen với mục đích lựa chọn phương pháp chiết đạt hiệu suất cao, an toàn, chi phí thấp. Có một số phương pháp đã được nghiên cứu như:  Chiết bằng dung môi ethanol [5], [7], [8], [21] Ở nước ta và trên thế giới, phần lớn các nghiên cứu đã công bố đều sử dụng dung môi ethanol theo phương pháp đun nóng hồi lưu. Đây được coi như phương pháp truyền thống để chiết alcaloid toàn phần từ lá sen. Quy trình như sau: Bột dược liệu được sấy khô, làm ẩm với NH4OH. Đem đun hồi lưu cách thủy với ethanol, để nguội, thu lấy dịch chiết. Lọc dịch chiết, đem cô thu hồi dung môi để loại hết ethanol. Thêm HCl 5%, khuấy đều, đun nóng để tăng độ tan của alcaloid dạng muối sau đó chiết 3 lần với ether dầu hỏa để loại tạp. Lọc, kiềm hóa bằng NH4OH tới pH=10-11. Chiết 5 – 6 lần đồng lượng bằng cloroform, cô đến cắn rồi đem sấy khô ở 600 trong 3 giờ thu được alcaloid toàn phần. Wang GH, Zhang BX, Nie QX, Li H, Zang C (2008) đã nghiên cứu lựa chọn được các thông số để tiến hành chiết nuciferin bằng ethanol như sau: + Ethanol: 75% – 80%. + Tỷ lệ dược liệu/ dung môi (kg/l): gấp 20 – 25 lần so với dược liệu. + Thời gian chiết: 2 giờ, chiết 2 lần. 10 Ethanol là một dung môi ít độc, an toàn, có thể cất thu hồi để tái sử dụng nhưng là dung môi không chọn lọc, sản phẩm chứa nhiều tạp gây khó khăn cho quá trình tinh chế.  Chiết bằng dung môi siêu tới hạn CO2 [17] Juan Xiao, Binqiang Tian, Bijun Xie, Erning Yang, John Shi, Zhida Sun (2010) đã khảo sát phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần trong lá sen bằng dung môi CO2 siêu tới hạn, sử dụng HPLC để phân tích thành phần dịch chiết. Các tác giả tìm ra điều kiện tối ưu cho quy trình chiết xuất là: áp suất khí đẩy dòng CO2 30 mPa, nhiệt độ chiết 70°C, chất cho thêm là 10% diethylamine và 1% nước trong methanol, thời gian chiết là 2 giờ, tốc độ dòng CO2 là 1,2ml/phút. Ưu điểm của phương pháp: thân thiện với môi trường, có thể áp dụng cho hoạt chất không bền, khả năng hòa tan tốt một số chất và có thể tái sử dụng. Nhược điểm: yêu cầu phải có thiết bị chuyên dùng, giá thành đắt; điều kiện tối ưu để chiết thành công.  Chiết xuất bằng vi sóng sử dụng dung môi ion lỏng [22] Gần đây phương pháp chiết xuất bằng vi sóng sử dụng dung môi ion lỏng đã được phát triển nghiên cứu để chiết xuất 3 alcaloid là N-nornuciferin, O-nornuciferin và nuciferin từ lá sen. Quy trình chiết: trộn 0,5 g bột dược liệu với 10 ml dung dịch ion lỏng thành hỗn dịch, chiết xuất hỗn dịch bằng cách chiếu sóng ngắn vào hỗn dịch. Sau đó, làm lạnh xuống nhiệt độ phòng, rửa giải bằng 50ml nước đã loại ion, lọc qua màng lọc 0,45 µm rồi đem phân tích bằng HPLC. Wenyan Ma, Yanbin Lu, Ruilin Hu, Jihang Chen, Zizhang Zhang, Yuanjiang Pan đã nghiên cứu lựa chọn các thông số cho quy trình chiết như sau: dung môi chiết 1-hexyl-3-methylimidazoliumbromid [C6MIM]Br, năng lượng sóng 280W, thời gian chiết 2 phút, tỉ lệ dược liệu/dung môi = 1/30. 11 Phương pháp này không những đơn giản, cho hiệu suất cao, mà thời gian giảm từ 2 giờ xuống 2 phút nên rất có tiềm năng phát triển rộng rãi tuy nhiên ở nước ta vẫn còn khá mới mẻ. * Qua tham khảo các tài liệu, ta thấy có rất nhiều các phương pháp khác nhau để chiết alcaloid toàn phần từ lá sen, mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu về phương pháp chiết lá sen bằng dung môi dầu hỏa nên chúng tôi thực hiện nghiên cứu xây dựng quy trình chiết bằng dầu hỏa để xem xét khả năng ứng dụng vào quy mô công nghiệp. 1.3.3. Các phương pháp tinh chế nuciferin Các tài liệu đã công bố chủ yếu sử dụng phương pháp sắc kí cột để phân lập nuciferin từ alcaloid toàn phần.  Hoàng Thị Tuyết Nhung (2011): Hòa tan alcaloid toàn phần trong cloroform, nhồi cột silicagel, sử dụng hỗn hợp dung môi rửa giải là n-Hexan : aceton : NH3 đặc (3 : 1 : 0,1) sau đó đem bốc hơi dung môi lấy cắn rồi đem sấy khô thu được nuciferin [7].  Nguyễn Thị Kiều Trang (2009): Cân cao khô alcaloid toàn phần, thêm 5 phần bột silicagel, trộn đều trong cối, đổ bột đó vào cột, dùng đũa san bằng, lấy một ít ethylacetat rửa cối, chày, đổ vào cột. Rửa giải bằng ethylacetat, thu lấy dịch đem đi kết tinh trong 24 giờ sau đó lọc tủa, sấy khô thu được nuciferin tinh khiết [10]. * Các phương pháp tinh chế trên đều sử dụng thiết bị phức tạp và dung môi độc hại, chi phí cao nên rất khó thực hiện trong quy mô công nghiệp. Vì thế chúng tôi nghiên cứu thực hiện phương pháp kết tinh bằng cồn để tinh chế nuciferin, đây là phương pháp đơn giản, sử dụng dung môi ít độc, chi phí thấp, dễ ứng dụng trong công nghiệp.