Tài liệu Nghiên cứu đặc tính kháng thuốc và mối liên hệ di truyền của các chủng campylobacter spp., salmonella spp. phân lập từ người và động vật (tóm tắt)

MỞ ĐẦU Campylobacter spp., Salmonella spp. là hai trong những tác nhân vi khuẩn hàng đầu gây bệnh tiêu chảy trên thế giới và là tác nhân phổ biến gây bệnh viêm ruột kết có nguồn gốc từ vật nuôi và có phổ vật chủ khá rộng, gồm người, động vật, bò sát…Trong khi tình hình nhiễm ngày càng gia tăng ở khắp nơi trên thế giới, tình hình kháng thuốc của hai loại vi khuẩn này cũng không ngừng tăng lên, đặc biệt với fluoroquinolone (FQ), erythromycin riêng với Campylobacter và Cephalosporin thế hệ 3 riêng với Salmonella.Tình hình kháng kháng sinh đã được báo cáo ở nhiều nước [1, 4, 24], nhưng thông tin ở nước ta còn giới hạn và cần cập nhật. Nhằm tình hiểu thêm tình hình kháng thuốc ở bệnh tiêu chảy và mối liên quan di truyền đối với hai loại vi khuẩn trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc tính kháng thuốc và mối liên hệ di truyền của các chủng Campylobacter spp. và Salmonella spp. phân lập từ người và động vật”, nhằm: 1. Mô tả đặc điểm kháng thuốc và cơ chế kháng thuốc ở Campylobacter và Salmonella phân lập ở người và động vật (heo, heo rừng, gà, vịt, cầy hương). 2. Khảo sát mối liên quan về mặt di truyền của Campylobacter và Salmonella phân lập ở người và động vật. CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Campylobacter spp. 1.1.1. Giới thiệu Campylobacter là vi khuẩn gram âm, không tạo bào tử. Tế bào của Campylobacter nhỏ, có dạng cong hình chữ S hay có dạng xoắn (dài 0,5-5 µm và rộng 0,2-0,8 µm). Chúng di động với một tiêm mao nằm ở một đầu hay hai đầu của tế bào tạo nên một kiểu di động xoắn ốc. Campylobacter là vi khuẩn vi hiếu khí nhưng đôi khi là hiếu khí tùy ý. C. jejuni và C. coli là những vi sinh vật vi hiếu khí và ưa nhiệt. Nhiệt 1 độ phát triển tốt nhất là 42oC và đòi hỏi nồng độ oxy từ 3-15% và nồng độ CO2 là 3-5%. Ưa nhiệt được xem là đặc điểm giúp chúng thích nghi với môi trường trong ruột của động vật và chim. 1.1.2. Bệnh học, chẩn đoán và điều trị Bệnh do Campylobacter là một bệnh nhiễm lây từ động vật sang người. Bệnh thường được biết đến là bệnh viêm dạ dày - ruột xảy ra ở người do sử dụng thức ăn hay nước bị nhiễm khuẩn. Liều nhiễm gây bệnh thấp, trung bình khoảng 10cfu/ml - 500cfu/ml, Campylobacter không phải là vi sinh vật thường được tìm thấy trong ruột người nên khả năng lây truyền giữa người và người thường thấp. Chần đoán và điều trị: Bệnh cảnh lâm sàng của nhiễm Campylobacter là tiêu chảy, đau bụng, sốt, đau đầu, suy nhược. Tuy nhiên, các biểu hiện này khó phân biệt với nhiễm trùng đường ruột do những vi khuẩn khác như Salmonella, Shigella và E.coli 0157:H7. Phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống luôn là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán bệnh. Nuôi cấy C. jejuni và C. coli cần điều kiện vi hiếu khí và nhiệt độ ủ là 42oC để kìm hãm sự phát triển của một số loài Campylobacter không chịu nhiệt. Ngoài ra, để phát hiện nhanh trong mẫu phân, người ta có thể sử dụng các phương pháp như PCR hay ELISA vì những phương pháp này có độ nhạy và độ chính xác cao. Hiện nay, macrolide được xem như kháng sinh tối ưu điều trị nhiễm Campylobacter. Ngoài ra, FQ (Ciprofloxacin) cũng thường được sử dụng để điều trị là do triệu chứng bệnh giống với triệu chứng của bệnh viêm dạ dày - ruột do các vi khuẩn khác như Salmonella, Shigella [85]. 1.1.3. Tình hình nhiễm Campylobacter spp. ở Việt Nam và trên thế giới. - Ở Việt Nam: Trong một nghiên cứu đoàn hệ kéo dài 1 năm trên trẻ em dưới 1 tuổi ở khu vực TP. HCM cho thấy Campylobacter chiếm tỷ 2 lệ đến 20% chỉ sau rotavirus và norovirus [14]. Gần đây hơn trong một khảo sát kéo dài 1 năm tại 3 bệnh viện lớn điều trị trẻ em cho thấy cùng với Shigella và Salmonella, Campylobacter cũng là nhóm gây bệnh đáng chú ý trong nhóm vi khuẩn gây tiêu chảy [31]. Khảo sát trên động vật, được xem là nguồn gốc của nhiễm khuẩn Campylobacter, cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn trên gia cầm - gia súc ở vùng đồng bằng sông Mekong là 31.9%, 23.9% và 53.7% lần lượt trên gà, vit, heo [24] và tỷ lệ kháng kháng sinh rất cao. Trước đó khảo sát vào năm 2007 cho thấy trên 100 mẫu thịt gà (ức) từ các chợ ở Hà Nội thì 31% nhiễm với đa số là C. jejuni (45.2%) và C.coli (25.8%). Tương tự trong khảo sát của Viện Dinh Dưỡng Hà Nội cho thấy 28.3% nhiễm C. jejuni [58, 89]. - Trên thế giới: Ở các nước đang phát triển vùng nhiệt đới, bệnh do Campylobacter chưa phải là vấn đề nghiêm trọng ở người lớn nhưng là bệnh dịch ở trẻ em, đặc biệt là trẻ nhỏ hơn hai tuổi [16]. Tình trạng nhiễm Campylobacter không triệu chứng bệnh xảy ra phổ biến ở cả người lớn và trẻ em.Tuy nhiên, vì ở các nước đang phát triển không có các chương trình giám sát quốc gia về bệnh nhiễm Campylobacter nên không có các số liệu về tần suất bệnh trong dân số. Mặc dù thiếu các dữ liệu nhưng các nghiên cứu bệnh - chứng dựa trên cộng đồng ở các nước đang phát triển được ước tính tỉ lệ nhiễm Campylobacter ở trẻ em dưới 5 tuổi là từ 40.000 đến 60.000 ca/ 100.000 dân . Tỉ lệ phân lập Campylobacter ở các nước đang phát triển là từ 5 đến 20% [16, 32, 111]. 1.1.4. Tình hình kháng kháng sinh của Campylobacter spp. - Ở Việt Nam: Trong khoảng thời gian 1996 – 1999, chỉ có 7% mẫu Campylobacter phân lập được từ trẻ em dưới 5 tuổi ở Việt Nam kháng với FQ [34]. Theo một nghiên cứu mới nhất ở Cần Thơ, Việt Nam, tỉ lệ Campylobacter phân lập từ thịt gà ở Cần Thơ kháng FQ đã tăng lên đến 64% đối với C. jejuni và lên đến 100% đối với C. coli [114]. 3 - Trên thế giới: Trong thập kỉ qua, tình hình kháng FQ ở Campylobacter tăng nhanh cùng với tỉ lệ phân lập được chúng trên khắp thế giới. Ở Châu Âu có khoảng 17% - 99% các chủng Campylobacter phân lập từ người và động vật kháng với FQ [10, 76, 86]. Campylobacter kháng FQ cũng trở nên phổ biến ở cả Châu Phi và Châu Á. 1.2. Tổng quan về Salmonella spp. 1.2.1. Giới thiệu Salmonella spp. là giống vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, bao gồm nhiều vi khuẩn gây bệnh trên người và động vật. Salmonella được chia thành 2 loài là enterica và bongori [38, 145]. Salmonella enterica được chia thành 6 phân loài enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae and indica, với hơn 2500 týp huyết thanh khác nhau [82]. Salmonella spp. là các vi khuẩn gram âm, kị khí tùy ý, hình que, oxidase âm, không tạo bào tử và có khả năng di động. Salmonella có kích thước chiều rộng từ 0.7-1.5μM và chiều dài khoảng 2-5μM [145]. Trong phạm vi bài này, Salmonella spp. hay Salmonella dùng để chỉ tất cả những týp huyết thanh Salmonella gây bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột và nhiễm trùng xâm lấn trên người hoặc động vật, ngoại trừ S. Typhi và S. Paratyphi A. 1.2.2. Bệnh học, chẩn đoán và điều trị Salmonella thường lây lan qua đường tiêu hóa. Đa số các trường hợp mắc bệnh là do ăn uống phải thực phẩm, nước uống bị nhiễm khuẩn không được nấu chín, hoặc do ăn phải thức ăn tươi được rửa bằng nguồn nước bị nhiễm khuẩn như nước sông, ao hồ, cống rãnh. Salmonella có thể hiện diện ở các môi trường sau: nước, sữa nhiễm khuẩn, thịt nhiễm khuẩn, sò, ốc, hến. Nhiễm Salmonella có thể có nhiều bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, phụ thuộc mối tương tác giữa vi khuẩn và vật chủ. Kết quả của mối 4 tương tác giữa chủng Salmonella và vật chủ phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như týp huyết thanh của vi khuẩn, liều nhiễm, khả năng miễn dịch và hệ vi sinh vật đường ruột của vật chủ. Chần đoán và điều trị: các triệu chứng của nhiễm trùng dạ dày ruột do Salmonella thường tương tự như các triệu chứng tiêu chảy do các tác nhân gây bệnh khác. Trẻ em tiêu chảy thường bị mất nước và rối loạn điện giải. Chẩn đoán chính xác chỉ có thể có được bằng cách phân lập tác nhân gây bệnh. Ở bệnh nhân bị nhiễm trùng dạ dày ruột, việc cấy phân hoặc mẫu phết trực tràng là dương tính ở hầu hết người bị nhiễm. Tiêu lỏng và nôn ói nhiều lần làm cơ thể người bệnh bị mất nước nhanh chóng, đặc biệt là ở trẻ sơ sinh, trẻ nhỏ ở vùng khí hậu nóng và có kèm sốt. Phác đồ điều trị tiêu chảy theo khuyến cáo của Tổ chức y tế thế giới là bù nước và chất điện giải bằng dung dịch oresol, cho uống kèm viên kẽm [27]. Riêng việc điều trị bằng kháng sinh vẫn đang là vấn đề tranh cãi. Ngoài FQ (ciprofloxacin), Cephalosporin cũng thường được sử dụng để điều trị là do triệu chứng bệnh giống với triệu chứng của bệnh viêm dạ dày - ruột do các vi khuẩn khác như E.coli, Shigella…[85]. 1.2.3. Tình hình nhiễm Salmonella spp. ở Việt Nam và trên thế giới. - Ở Việt Nam: một số ít các nghiên cứu dịch tễ về những tác nhân gây tiêu chảy ở Hà Nội trên bệnh nhi dưới 5 tuổi cho thấy bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột do Salmonella spp. đang tăng nhanh từ 0% năm 2004 lên 3,6% năm 2007 [63] và 7% năm 2008 [62]. Các dữ liệu này cho thấy Salmonella đang là một trong những tác nhân vi khuẩn chính gây tiêu chảy ở Hà Nội. Các nghiên cứu trên động vật cho thấy tỉ lệ nhiễm Salmonella trên thịt (heo, bò, gà) và hải sản (tôm) ở đồng bằng Sông Cửu Long là khá cao, dao động từ 21% đến 69,9% [107]. - Trên thế giới: hàng năm, trên thế giới có khoảng 93,8 triệu ca nhiễm trùng dạ dày ruột do Salmonella, với tỉ lệ tử vong là 155.000 5 ca. Trong đó khoảng 80,3 triệu ca là do ngộ độc thực phẩm [91]. Ở Hoa Kỳ, ước tính hàng năm có khoảng 1,4 triệu ca ngộ độc thực phẩm gây ra bởi Salmonella [97, 129]. Hai týp huyết thanh gây bệnh ở người phổ biến nhất là S. Enteritidis và S. Typhimurium [27]. S. Enteritidis là týp huyết thanh phổ biến toàn cầu, đặc biệt là châu Âu (chiếm 80% số ca bệnh) và châu Á (38% số ca bệnh). Đại dịch S. Enteritidis được ghi nhận lần đầu vào cuối thập niên 80 thế kỉ trước và có nguồn gốc từ trứng gia cầm bị nhiễm khuẩn [56]. 1.2.4. Tình hình kháng kháng sinh của Salmonella spp. - Ở Việt Nam: theo một nghiên cứu giữa trường Đại học Úc kết hợp với Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam, tỉ lệ phân lập Salmonella trên thực phẩm tươi sống ở các chợ trên 50% (91 mẫu dương/180 mẫu), có tỉ lệ kháng kháng sinh khá cao, đặc biệt số chủng Salmonella đa kháng chiếm 50,5% [128]. Nghiên cứu của Hùng và cộng sự (04/2015) phân lập Salmonella từ 145 bệnh nhân tiêu chảy cấp tại Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương Hà Nội và Bệnh viện 103 cho kết quả tỉ lệ kháng kháng sinh rất cao: 100% với ampicillin; 88,89% với chloramphenicol và 66,67% với trimethoprim - sulfamethoxazole [3]. - Trên thế giới: nghiên cứu phân lập và kiểm tra mức độ kháng thuốc Salmonella ở 3.570 trẻ em bị tiêu chảy ở Gaza, Palestine cho thấy tỉ lệ kháng thuốc ampicillin, trimethoprim - sulfamethoxazole, chloramphenicol, cephalexin lần lượt là 62%, 35%, 35% và 26% [6]. Một nghiên cứu tương tự ở Tehran, Iran, Salmonella có tỉ lệ kháng nalidixic acid là 42,3% và ceftazidime là 23,4% [65]. 1.2.5. Phương pháp phân loại Campylobacter spp. và Salmonella spp. Sử dụng phương pháp MLST (Multilocus sequence typing) bằng cách khuếch đại 7 phân đoạn gen giữ nhà (house keeping genes). Các phân đoạn gen từ mỗi một loci trong 7 loci được giải trình tự và các 6 alen sẽ được cho một con số dựa vào thứ tự thời gian chúng được xác định. Bảy alen tại 7 loci gen này hình thành nên một kiểu trình tự trọn vẹn - sequence type (ST) mà cũng được cho một con số dựa vào thời điểm chúng được xác định. Alen đầu tiên được xác định ở locus aspA sẽ là aspA1 và trình tự ST đầu tiên sẽ là ST-1…. Cũng như sử dụng thuật toán BURST (Based Upon Related Sequence Types - một thuật toán chuyên phân tích dữ liệu về trình tự MLST) để xác định clonal complex (CC); các mẫu phân lập được xác định thuộc clonal complex nhất định nếu mỗi mẫu phân lập có chung ít nhất 4 trong 7 alen so với kiểu trình tự (ST) trung tâm giả định của clonal complex đó (clonal complex mang tên của kiểu trình tự trung tâm). CHƯƠNG 2 - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU: - Campylobacter spp. - Salmonella spp. 2.1.1. Phân lập từ người Chủng Campylobacter spp. và Salmonella spp. trong nghiên cứu này được phân lập từ 1500 mẫu phân của các bệnh nhi bị tiêu chảy cấp nhập viện và được điều trị tại bệnh viện: Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới, Bệnh viện Đa Khoa Trung ương Huế, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Khánh Hòa, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Đồng Tháp và Bệnh viện Đa Khoa tỉnh Đắk Lắk. Các bệnh nhi tham gia nghiên cứu đều nhập viện vì bệnh tiêu chảy, thường trú tại các tỉnh và thành phố nêu trên. 2.1.2. Phân lập từ gia súc (heo, heo rừng, cầy hương) và gia cầm (gà, vịt) Chủng Campylobacter spp. và Salmonella spp. trong nghiên cứu này được phân lập từ mẫu thu thập theo phương pháp vớ dậm của thú y từ 250 trang trại và các hộ chăn nuôi cá thể tại tỉnh Đồng Tháp, tỉnh Đắk Lắk (gồm 274 mẫu). (Nghiên cứu này là một phần của dự án khảo sát về bệnh lây từ động vật - VIZIONS của đơn vị chủ quản) 7 2.1.3. Qui trình thực nghiệm Qui trình phân lập, định danh và phân tích kiểu gen của các chủng Campylobacter, Salmonella được tóm tắc theo Sơ đồ 2.1. Sơ đồ 2.1. Qui trình thực hiện nghiên cứu CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP THEO VÙNG Việc phân lập, định danh Campylobacter spp. và Salmonella spp. được tiến hành từ đầu năm 2012 đến cuối năm 2013 ở người tại 5 Bệnh viện (Bệnh viện Đa khoa Trung ương Huế, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Khánh Hoà, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Đắk Lắk, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Đồng Tháp và Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh) và ở động vật tại 2 tỉnh (Đồng Tháp, Đắk Lắk) và thu được kết quả chi tiết theo Bảng 3.1 và Bảng 3.2. 8 Bảng3.1. Kết quả phân lập Campylobacter spp. theo vùng Địađiểm ĐắkLắk Nguồn Người Heo 1/150 (0,67%) - Heo rừng 5/14 (35,71%) Đồng Tháp Khánh Hòa 3/150 1/150 (2%) (0,67%) 24/45 (53,33%) - 25/45 (55,56%) 26/120 25/45 Vịt (21,67%) (55,56%) Cầy 0/5 hương (0%) 32/289 77/285 1/150 Tổng số (11,07%) (27,02%) (0,67%) Gà - Tp. Hồ Chí Minh 40/1000 (4%) - Thừa Thiên Huế 1/50 (2%) - - - - - - - - - 40/1000 (4%) 1/50 (2%) Tổng số 46/1500 (3,07%) 24/45 (53,33%) 5/14 (35,71%) 25/45 (55,56%) 51/165 (30,91%) 0/5 (0%) 151/1774 (8,51%) Bảng3.2. Kết quả phân lập Salmonella spp. theo vùng Địa điểm Đắk Lắk Nguồn Người Heo Heo rừng 4/150 (2,67%) 4/14 (28,57%) Đồng Tháp 12/150 (8%) 38/45 (84,44%) - Tp. Hồ Chí Minh 13/150 64/1000 (8,67%) (6,4%) Khánh Hòa - - - - - - 42/45 (93,33%) 40/120 41/45 Vịt (33,33%) (91,11%) 4/5 Cầy hương (80%) 52/289 133/285 13/150 64/1000 Tổng số (17,99%) (46,67%) (8,67%) (0,64%) Gà Thừa Thiên Huế 25/50 (50%) - 25/50 (50%) Tổng số 118/1500 (7,87%) 38/45 (84,44%) 4/14 (28,57%) 42/45 (93,33%) 81/165 (49,09%) 4/5 (80%) 287/1774 (16,18%) Kết quả ở cho thấy tỉ lệ cấy dương tính Campylobacter từ các mẫu ở động vật cao gấp gần 12,5 lần so với tỉ lệ cấy dương tính Campylobacter từ các mẫu ở người Bảng 3.1. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê p<0,005, một lần nữa xác định động vật như gia cầm 9 (gà vịt), gia súc (heo) là nguồn chứa tự nhiên vi khuẩn Campylobacter. Qua phân tích số liệu ở cho thấy tỉ lệ cấy dương tính Salmonella từ các mẫu ở động vật cao gấp gần 8 lần so với tỉ lệ cấy dương tính Salmonella từ các mẫu ở người (p< 0,005) Bảng 3.2. Tương tự như các nghiên cứu khác trên thê giới, kết quả phân lập của nghiên cứu này cho thấy gia súc và gia cầm là nguồn chứa vi khuẩn Campylobacter, Salmonella trong tự nhiên. Trong khuôn khổ giới hạn của nghiên cứu này chúng tôi không khảo sát từ môi trường như nước hay thực phẩm thịt sống, sữa… 3.2. KẾT QUẢ KHÁNG KHÁNG SINH Kết quả nghiên cứu cho thấy, các chủng Campylobacter, Salmonella phân lập từ động vật có tỉ lệ kháng các kháng sinh nhóm FQ, beta lactams, trimethoprim - sulfamethoxazole và tetracyline cao hơn các chủng phân lập từ người, với khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) ở Biểu đồ 3.1 và Biểu đồ 3.2. Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ kháng kháng sinh của Campylobacter spp. 10 Biểu đồ 3.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh của Salmonella spp. Nguyên nhân của hiện tương kháng kháng sinh cao có thể do việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị bệnh nhân làm gia tăng áp lực thuốc hay sử dụng kháng sinh quá rộng rãi trong chăn nuôi trong mục đích tăng trọng vật nuôi. Điều đáng lưu ý là các chủng phân lập ở người trong nghiên cứu này đều nhạy cảm hoàn toàn với chloramphenicol, gentamicin và erythromycin. Điều này có thể gợi ý là sau một thời gian dài được ngưng sử dụng các kháng sinh này (giảm áp lực thuốc), đặc biệt là với chloramphenicol thì vi khuẩn có thể trở lại nhạy cảm. Cần lưu ý rằng, nếu vi khuẩn kháng với các kháng sinh thuộc họ FQ, tức có đột biến ở gen gryA hay “vùng qui định kháng quinolone” (Quinolone resistance determining region - QRDR) thì tính kháng này sẽ ổn định và di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Một khi đã bị kháng FQ thì chỉ còn cách sử dụngkháng sinh mới khác. Ngược lại, tình hình kháng erythromycin có thể được đảo ngược nếu dừng sử dụng thuốc [13, 95, 96, 103]. Các chủng Salmonella phân lập từ người trong nghiên cứu này đều nhạy cảm hoàn toàn với ciprofloxacin trong khi đó, Salmonella ở động vật bắt đầu kháng với loại thuốc nêu trên. Nhìn chung, tỷ lệ kháng kháng sinh thường sử dụng ở động vật trong nghiên cứu này cao hơn tỷ lệ ở người nhưng thấp hơn khu vực khác và các tỉnh phía Bắc. 11 3.3. Tính đa kháng kháng sinh của Campylobacter spp. Bảng 3.8. Kết quả kháng các nhóm kháng sinh của Campylobacter spp. Nguồn Nhóm kháng sinh FQ (NA, OFX, CIP) Cephalosporin (CRO, CAZ) Macrolide (AZM, Ery) FQ, Cephalosporin FQ, Macrolide Cephalosporin, Macrolide FQ, Cephalosporin, Macrolide Người Heo Heo rừng 38/46 (82,61%) 40/46 (86,96%) 3/46 (6,52%) 32/46 (69,57%) 1/46 (2,17%) 0/46 (0%) 2/46 (4,35%) 24/24 (100%) 24/24 (100%) 8/24 (33,33%) 16/24 (66,67%) 1/24 (4,17%) 0/24 (0%) 7/24 (29,17%) 3/5 (60%) 3/5 (60%) 0/5 (0%) 3/5 (60%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) Gà Vịt 23/25 48/51 (92%) (94,12%) 25/25 51/51 (100%) (100%) 3/25 1/51 (12%) (1,96%) 20/25 47/51 (0%) (92,16%) 0/25 0/51 (0%) (0%) 0/25 0/51 (0%) (0%) 3/25 1/51 (12%) 1,96% Qua kết quả trình bày cho thấy tỷ lệ kháng riêng rẽ từng nhóm FQ hay cephalosporins ở người khá cao lần lượt 82% và 86% ở động vật lại còn cao hơn từ 60% đến 94% khiến tỷ lệ cùng kháng cả hai nhóm là khoảng 70% đến 94%. Ngược lại, kháng macrolide ở người vẫn còn thấp khoảng 2% còn động vật <10% chỉ có các chủng Campylobacter phân lập từ heo kháng macrolide >30%. Tình hình đa kháng kháng sinh trên Campylobacter từ động vật luôn được theo dõi. Gần đây nhất, khảo sát tại Trung Quốc do các nhà nghiên cứu ở Trường Đại Học Nông Nghiệp Đại Học Bắc Kinh phối hợp với Đại Học Thú Y Iowa Hoa Kỳ cho thấy C. jejuni và C. coli đề kháng với FQ rất cao > 95%. Với macrolides tình hình còn tệ hơn với C. coli có 73% chủng từ gà và 54% chủng từ heo đã kháng erythromycine. Các tác giả đã phát hiện có một sự gia tăng rất có ý nghĩa của tỷ lệ C. coli kháng macrolide từ 2008 - 2014 trong khi tỷ lệ kháng của C. jejuni từ gà có giảm bớt. Nguyên nhân có thể do sử dụng 12 gia tăng và rộng rãi macrolides gồm tylosin, tilmicosin, erythromycin, kitasamycin và tulathromycin, trong công nghiệp nuôi gà và heo [136]. Theo các tác giả sự gia tăng đa kháng kháng sinh đe dọa khả năng điều trị Campylobacter bằng nhóm kháng sinh duy nhất còn nhạy cảm là macrolides trên bệnh nhân vì đa số các trường hợp nhiễm là từ động vật. 3.4. Tính đa kháng kháng sinh của Salmonella spp. Bảng 3.10. Kết quả kháng các nhóm kháng sinh của Salmonella Nguồn Người Heo rừng Heo Nhóm kháng sinh FQ 11/118 7/38 0/4 (NA, OFX, CIP) (9,32%) (18,4%) (0%) Cephalosporin 3/118 2/38 1/4 (CRO, CAZ) (2,54%) (5,26%) (25%) Beta lactams 23/118 16/38 2/4 (AMC) (19,5%) (42,1%) (50%) 0/118 0/38 0/4 FQ, Cephalosporin (0%) (0%) (0%) 7/118 4/38 0/4 FQ, Beta lactams (5,93%) (10,5%) (0%) Cephalosporin, 2/118 1/38 1/4 Beta lactams (1,69%) (2,63%) (25%) FQ, Cephalosporin, 2/118 1/38 0/4 Beta lactams (1,69%) (2,63%) (0%) Gà Vịt Cầy hương 12/42 (28,57) 4/42 (9,52%) 24/42 (57,14%) 0/42 (0%) 9/42 (21,43%) 2/42 (4,76%) 2/42 (4,76%) 22/81 (27,2%) 4/81 (4,94%) 28/81 (34,6%) 0/81 (0%) 10/81 (12,4%) 1/81 (1,23%) 3/81 (3,7%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 1/4 (25%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) 0/4 (0%) Bảng 3.10 cho thấy rằng: ở người có 9,32% (11/118) chủng kháng ít nhất từ 2 đến 3 nhóm kháng sinh thường dùng để điều trị nhiễm khuẩn do Salmonella là FQ (nalidixic acid, ofloxacin, ciprofloxacin), cephalosporin (ceftriaxone, ceftazidime) và beta lactams (amoxicillin - acid clavulanic). Bên cạnh đó, có tổng số 34 chủng từ heo, heo rừng, gả và vịt trong tổng số 169 cũng kháng ít nhất từ 2 đến 3 loại kháng sinh nêu trên chiếm tỉ lệ 20,12%. Như vậy, với tình hình này, trong một tương lai gần không chỉ xuất hiện vi khuẩn siêu kháng thuốc ở Samonella cũng như Campylobacter mà còn nhiều loại vi khuẩn khác nữa. 13 Ở cả người cũng như động vật, tỷ lệ Salmonella kháng nhóm FQ hay Cephalosporins thấp hơn nhóm beta lactams. Trong khi đó, tỷ lệ kháng [FQ, beta lactams] cao hơn [FQ, Cephalosporins] và [Cephalosporins, beta lactams]. 3.5. Cơ chế kháng FQ (Ciprofloxacin) ở Campylobacter spp. Kết quả khảo sát cho thấy trong 71 chủng C. jejuni kháng FQ từ người, heo, gà và vịt có 57 chủng mang đột biến trên gen gyrA ở codon 86 với kiểu đột biến điểm là C257T làm thay đổi Threonin thành Isoleucine trên cấu trúc protein. Thêm vào đó, có 30 chủng có đột biến gen cmeR mã hóa cho hệ thống bơm đẩy thuốc CmeABC. Trong đó, đột biến hệ thống bơm đẩy thuốc ở C. jejuni phân lập từ người, gà và vịt khá đa dạng. Trường hợp C. jejuni mang cả 2 đột biến trên người, gà và vịt chiếm tỷ lệ khá cao, gần 50%. Bảng 3.13. Kết quả phân tích Campylobacter kháng FQ Đối tượng Đột biến gyrA Đột biến cmeR Đột biến gyrA và cmeR 36 21 21 Heo (n=25) 22 02 02 Gà (n=25) 23 07 07 Vịt (n=25) 22 15 13 Tổng số 103 45 43 Người (n=46) Kết quả khảo sát cho thấy các chủng C. coli phân lập được từ động vật (heo, gà, vịt) chỉ có 13/50 chủng có đột biến gyrA ở codon 86 với kiểu đột biến điểm là C257T (thay Threonin bằng Isoleucine), nhưng có đến 33/50 chủng có đột biến điểm là T227G (thay Threonin bằng Methionine). Trong khi đó, C.coli ở người chỉ có duy nhất một kiểu đột biến điểm là C257T (n=11). 14 Như vậy, so với C. jejuni, C. coli còn có thêm đột biến T227G. Hiện tượng đột biến làm thay đổi Threonin thành Methionine khá phổ biến trên C. coli phân lập từ cả heo, gà, vịt. Đây là kiểu đột biến hoàn toàn chưa được công bố từ trước đến nay. Nghiên cứu này có thể cho thấy đột biến T227G hiện chỉ mới lây truyền theo chiều dọc. 3.6. Cơ chế kháng macrolide (erythromycin) ở Campylobacter Kết quả phân tích gen kháng erythromycin trên Campylobacter có phát hiện kiểu đột biến đôi mới là [A-2074-C, A-2075-C] và [A-2075G, A-2076-C] là những kiểu đột biến chưa được công bố ở các nơi khác trên thế giới. Bảng 3.18. Bảng liệt kê các đột biến trên trình tự gen rrnB Loài Đột biến được công bố [71, 134] C. jejuni A-2230-G T-2268-C A-2230-G, T-2268-C Đột biến tìm được _ C. coIi A-2230-G A-2074-C A-2074-G A-2075-G A-2230-G, T-2268-C A-2075-G [A-2074-C, A-2075-C] [A-2075-G, A-2076-C] Theo kết quả nghiên cứu trước đây cho nếu MIC của erythromycin ≥ 128 µg/mL (đối với các chủng có tính kháng cao) thì khi giải trình tự phát hiện đột biến tại vị trí A2075G của gen rrNB, nếu MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) của erythromycin < 128 µg/mL (đối với các chủng có tính kháng thấp) thì có khả năng mang đột biến tại vị trí A2074C hoặc không mang đột biến [11, 122]. Trong nghiên cứu này, khi so sánh kết quả MIC của erythromycin với vị trí đột biến trên gen rrnB cho thấy với 11 chủng có MIC erythromycin ≥ 256 µg/mL (11 chủng C. coli) thì có có 8 chủng mang đột biến tại vị trí A2075G (heo=5 gà=1 và vịt=2); nhưng có 3 chủng mang 2 đột biến, bao gồm 3 kiểu 15 sau: A2074C & A2075C; A2075G & A2076C ở heo và A2075G & A2076C ở gà. 3.7. Cơ chế kháng thuốc Cephalosporin ở Salmonella spp. Kết quả khảo sát các chủng Salmonella spp. mang gen mã hóa ESBL tiết enzym ESBL-TEM và ESBL-OXA bằng kỹ thuật PCR ở Bảng 3.19 cho thấy cả 8 chủng Salmonella thuộc nhóm B kháng ceftriaxone, ceftazidime và amoxicilline - acid clavulinic (Augmentin) đều có mang gen mã hóa ESBL bao gồm 6 chủng phân lập từ động vật (3 chủng ở Đồng Tháp và 3 chủng ở Đắk Lắk) và 2 chủng phân lập từ người (1 chủng ở Khánh Hòa và 1 chủng ở Tp. Hồ Chí Minh). Bảng 3.19. Bảng phân tích đặc điểm gen ESBL ở Salmonella spp. Địa điểm Nguồn CTX(485bp) OXA(564bp) TEM(269bp) SHV(713bp) Đồng Tháp Heo (n=2) - - + - Đồng Tháp Gà (n=1) - - + - Đắk Lắk Vịt (n=2) - + + - - - + - Người (n=1) - + + - Khánh Người Hòa (n=1) - - + - Đắk Heo rừng Lắk (n=1) HCMC Như vậy, những chủng Salmonella trong nghiên cứu này lần đầu tiên được phát hiện mang gen mã hóa ESBL trên plasmid (ESBL-TEM và ESBL-OXA) ở người cũng như động vật tại tỉnh Đắk Lắk và Đồng Tháp. Những chủng Salmonella này kháng các kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 và rất có nguy cơ chuyển gen kháng kháng sinh từ thế hệ này sang thế hệ khác (chuyển gen theo chiều dọc) hoặc 16 chuyển gen kháng kháng sinh từ loài vi sinh vật này sang loài vi sinh vật khác trong nhóm vi khuẩn đường ruột (chuyển gen theo chiều ngang). 3.8. MỐI LIÊN HỆ DI TRUYỀN 3.8.1. Mối liên hệ di truyền của Campylobacter spp. Phân loại di truyền bằng phương pháp MLST của 100 chủng Campylobacter gồm 40 chủng ở người và 60 chủng ở động vật cho thấy có tất cả 76 kiểu trình tự (ST) được xác định. Ở người, kiểu trình tự ST-1919 chiếm ưu thế với 10% (4 chủng phân lập) nhưng kiểu trình tự này không được tìm thấy ở động vật. Trong khi đó, ở động vật không có kiểu trình tự cụ thể nào chiếm ưu thế rõ ràng. Các kiểu trình tự xuất hiện ở người cũng như động vật gồm có: ST-161, ST-354, ST2865, ST-4403. Tuy nhiên, số lượng các chủng phân lập được có kiểu trình tự này không nhiều. Phức hợp dòng (CC) trong nghiên cứu này được tìm thấy ở nhóm động vật và người là 8 CC. Trong đó, có đến 6 CC xuất hiện ở cả người và động vật gồm có CC-828, CC-353, CC354, CC-443, CC-460, CC-52 chiếm tỉ lệ giống nhau 75% (6 CC/ 8 CC). Mặc dù có thể là do số lượng CC của chủng phân tích thu được ở động vật cao và người giống nhau, không nhiều nhưng cho thấy rằng các chủng Campylobacter phân lập từ người và động vật (gia súc, gia cầm) tương đồng về mặt kiểu gen ( giống nhau về ST cũng như CC). Hình 3.10 và Hình 3.11 mô tả cách phân nhóm của 76 kiểu trình tự xác định được của các chủng Campylobacter bằng Minimum spanning tree (MST - cây bao trùm tối thiểu), vẽ bằng phần mềm Bionumerics (version 5.0; Applied Maths). Mỗi kiểu trình tự được đại diện bởi một vòng tròn. Kích thước của mỗi vòng tròn thể hiện số lượng các chủng tạo nên kiểu trình tự đó. Nếu các kiểu trình tự có 1 hoặc 2 alen khác nhau, chúng sẽ nằm chung một nhóm, liên kết với nhau bằng đường kẻ đậm và có vòng bao quanh (ví dụ: cụm có vòng bao màu hồng gồm các nhóm AA, AC, AD, AE). Nếu chúng khác 17 nhau từ 3 alen trở lên, chúng sẽ được liên kết bằng đường kẻ đứt nét. Các con số biểu thị số lượng các alen khác nhau trong 7 alen giữa hai kiểu trình tự. Những chủng phân lập từ người được đánh dấu bằng màu xanh và những chủng phân lập từ heo tô màu đỏ, những chủng từ vịt có màu hồng và những chủng từ gà có màu nâu.Vòng tròn có từ 2 màu trở lên chứng tỏ kiểu trình tự đó được tìm thấy ở cả 2 loài trở lên. Các con số biểu thị các alen khác nhau trong 7 alen giữa 2 kiểu trình tự. Màu nền bao xung quanh các vòng tròn thể hiện các kiểu trình tự thuộc cùng một nhóm và các kiểu trình tự trong một nhóm không khác nhau quá 3 alen trong 7 alen. Kết quả (ở Hình 3.10 và Hình 3.11) mô tả đặc điểm di truyền trong quần thể Campylobacter phân lập từ người và động vật. Kết hợp với kết quả phân lập, phân tích ST và CC cho thấy rằng xuất phát điểm C. coli là từ động vật (heo) và như vậy, có thể nói rằng C. coli có thể lan truyền từ heo sang gà, vịt và từ gia súc, gia cầm sang người. Phức hợp dòng (CC) xuất hiện ở cả trên người, gia súc và gia cầm là ST-828 (ở C. coli). Hình 3.10. Cây bao trùm tối thiểu vẽ từ dữ liệu MLST của C. coli. Hình 3.11. Cây bao trùm tối thiểu vẽ từ dữ liệu MLST của C. jejuni. Khác với C. coli, C. jejuni có thể xuất phát từ gà và lan truyền sang heo, vịt cũng như ngưởi. Phức hợp dòng (CC) xuất hiện ở cả trên 18 người, gia súc và gia cầm là ST-460 ở C. jejuni. Thêm vào đó ST-460 (ở C. jejuni) hay ST-574 (tuy chỉ được tìm thấy ở người trong nghiên cứu này) đã được xác định là những kiểu trình tự ở Campylobacter gây bệnh trên người, gà ở các nước Châu Âu [77, 90]. Hiện nay phương pháp MLST là phương pháp khá phổ biến và đáng tin cậy để khảo sát dịch tễ học phân tử và di truyền dân số của Campylobacter [30, 41, 118]. Đây là lần đầu tiên phương pháp này được sử dụng để khảo sát Campylobacter ở Việt Nam. Như kết quả đã cho thấy các kiểu trình tự ST cũng như phức hợp dòng CC khá phân tán. Điều này có thể giải thích là mẫu thu thập từ bệnh nhân đa số từ TP. Hồ Chí Minh, nguồn nhiễm Campylobacter như thịt gà vịt, thịt heo đa dạng từ nhiều tỉnh nên số lượng ST sẽ thay đổi. Do những giới hạn khách quan, mẫu từ động vật lại chỉ bao gồm 2 tỉnh Đồng Tháp đại diện cho vùng đồng bằng sông Mê Kông và Đắk Lắk cho Tây Nguyên, nên có thể giải thích tại sao sự tương đồng giữa các ST và CC không cao khi phân tích bằng MLST. Một điểm nữa cần lưu ý là gần đây người ta bổ sung thêm phương pháp phối hợp với giải trình tự bộ gen whole - genome sequencing - MLST (wgMLST) có độ tin cậy cao hơn nữa vì phương pháp MLST chỉ dựa vào 7 gen trong khi wgMLST phân tích đến 1391- 1644 vị trí các gen [30, 73, 82, 117]. Vì tầm quan trọng của Campylobacter trong tiêu chảy nên trong các cuộc điều tra dịch tể hiện nay MLST/wgMLST được sử dụng phối hợp với các yếu tố dịch tể khác như địa điểm, thời gian, đi lại… nhằm xác định nguồn dịch. 3.8.2. Mối liên hệ di truyền của các chủng Salmonella spp. Phân loại di truyền bằng phương pháp MLST có tất cả 59 kiểu trình tự (ST) được xác định trong 261 chủng Salmonella, trong đó có 15 kiểu trình tự được tìm thấy ở trên người cũng như ở trên động vật là: 11, 17, 19, 34, 40, 46, 203, 292, 359, 423, 469, 1499, 1541, 1544, 1547. Ở người, kiểu trình tự 34 chiếm ưu thế với 18,75% (18 chủng 19 phân lập) so với 2,42% ( 8 chủng phân lập) ở động vật. Trong khi đó, ở động vật kiểu trình tự 17 chiếm ưu thế với 8,48% (14 chủng phân lập) so với 2,08% (2 chủng phân lập) ở người. Tuy nhiên, kiểu trình tự phổ biến nhất ở động vật là 1500 (9,70% với 16 chủng phân lập) nhưng lại không tìm thấy ở người. Từ kết quả kiểu di truyền được thu nhận, dựa vào thông tin đi chung với kiểu trình tự trên trang web để cho ra týp huyết thanh. Dựa vào dữ liệu toàn cầu giúp xác định được týp huyết thanh của hầu hết các chủng trong nghiên cứu này. Số lượng kiểu di truyền cũng như týp huyết thanh ở nhóm động vật đa dạng hơn ở nhóm người. Kết quả này có thể do số lượng chủng phân tích thu được ở động vật cao hơn ở người. Theo kết quả, S. Typhimurium là týp huyết thanh gây bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột phổ biến nhất với tỉ lệ lên đến 39,58% (38 chủng) ở người và 10,91% (18 chủng) ở động vật, kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu trên thế giới khi S. Typhimurium luôn là chủng gây bệnh hiện diện phổ biến ở khắp các châu lục. Trong khi, S. Enteritidis là týp huyết thanh liên quan đến dịch bệnh từ trứng gia cầm nhiễm khuẩn ở các nước phát triển như Hoa Kỳ hay Canada [65, 70] phân lập được rất ít trong nghiên cứu này chỉ có 5 chủng ở người và 3 chủng ở động vật. Hình 3.12. Cây bao trùm tối thiểu vẽ từ dữ liệu MLST của Salmonella 20