Tài liệu Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của virus gây tiêu chảy thành dịch (porcine epidemic diarrhea) trên lợn và một số đặc điểm bệnh lý của bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ---------- ---------- NGUYỄN THỊ THANH NGA NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS GÂY TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH (PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA) TRÊN LỢN VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, 2015 BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ---------- ---------- NGUYỄN THỊ THANH NGA NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS GÂY TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH (PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA) TRÊN LỢN VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y MÃ SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LAN HÀ NỘI, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, do tôi nghiên cứu, có sự giúp đỡ của tập thể các đồng nghiệp và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ nghiên cứu khoa học nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Mọi sự giúp đỡ đã được cảm ơn. Hà Nội, ngày 5 tháng 11 năm 2015 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh Nga i LỜI CẢM ƠN Cho đến nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Nhân dịp này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới các thầy, cô giáo. Trước tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Lan đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn bệnh lý, Khoa Thú y, cám ơn các cán bộ phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi dành sự biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, những người đã luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 5 tháng 11 năm 2015 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh Nga ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục đích của đề tài 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. 3 Những nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy 1.1.1. Đặc điểm tiêu hóa của lợn con 4 1.1.2. Một số nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn 5 1.2. Lịch sử và tình hình nghiên cứu bệnh tiêu chảy thành dịch trên lợn (Porcine Epidemic Diarrhea – PED) 10 1.2.1. Tình hình nghiên cứu bệnh tiêu chảy thành dịch do virus PED gây ra trên thế giới 10 1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh tiêu chảy thành dịch do virus PED gây ra ở 1.3. trong nước 11 Căn bệnh 11 1.3.1. Phân loại và hình thái của virus gây bệnh PED 11 1.3.2. Cấu trúc phân tử của virus gây bệnh 12 1.3.3. Sức đề kháng của virus gây bệnh PED 15 1.4. Truyền nhiễm học 15 1.4.1. Loài vật mắc bệnh 15 1.4.2. Phương thức truyền lây của virus PED 15 1.4.3. Cơ chế gây bệnh 16 1.5. 17 Triệu chứng và bệnh tích 1.5.1. Triệu chứng lâm sàng 17 iii 1.5.2. Bệnh tích 18 1.6. Chẩn đoán 18 1.7. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) 19 1.7.1. Nguyên lý của phản ứng PCR 19 1.7.2. Các bước tiến hành phản ứng PCR 21 1.8. 21 Kỹ thuật giải trình tự gen 1.8.1. Giải trình tự DNA theo phương pháp Maxam và Gilbert 21 1.8.2. Giải trình tự DNA theo phương pháp dideoxy 22 1.8.3. Giải trình tự DNA bằng máy tự động 24 Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Vật liệu nghiên cứu 25 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25 2.3. Nội dung nghiên cứu 25 2.4. Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.1. Phương pháp thống kê sinh học 25 2.4.2. Phương pháp mổ khám 26 2.4.3. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng Parafin, nhuộm Haematoxylin – Eosin (HE) 26 2.4.4. Phương pháp tách chiết RNA tổng số bằng hóa chất 29 2.4.5. Phương pháp tiến hành phản ứng RT-PCR 30 2.4.6. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR 31 2.4.7. Phương pháp giải trình tự 31 2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu 33 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1. Kết quả phản ứng RT-PCR chẩn đoán lợn mắc PED 34 3.2. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu ở lợn mắc PED 37 3.3. Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể ở lợn mắc PED 42 3.4. Kết quả nghiên cứu bệnh tích vi thể ở lợn mắc PED 46 iv 3.5. Kết quả giải trình tự gen, so sánh thành phần và sự tương đồng nucleotide, axit amin của các chủng virus PED nghiên cứu và một số chủng virus PED tham chiếu 49 3.5.1. Kết quả so sánh sự tương đồng nucleotide của các chủng virus PED nghiên cứu 49 3.5.2. Kết quả so sánh sự tương đồng nucleotide của các chủng virus PED nghiên cứu được với một số chủng virus PED trên thế giới. 52 3.5.3. Kết quả so sánh sự tương đồng axit amin của các chủng virus PED nghiên cứu 58 3.5.4. Kết quả so sánh sự tương đồng về thứ tự axit amin của các chủng virus 3.6. PED nghiên cứu được với một số chủng tham chiếu trên thế giới 59 Kết quả xây dựng cây phả hệ 62 KẾT LUẬN 65 ĐỀ NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC ẢNH 71 1. MỘT SỐ HÌNH ẢNH BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ CỦA LỢN MẮC PED 71 2. MỘT SỐ HÌNH ẢNH BỆNH TÍCH VI THỂ 72 v DANH MỤC VIẾT TẮT Cs : Cộng sự FMDV : The foot-and-mouth disease virus M : Membrain protein N : Nuclecapxit protein NXB : Nhà xuất bản ORF3 : Open reading flame PED : Porcine epidemic diearrhea PEDV : Porcine epidemic diearrhea virus Pp : Page paper PRRSV : Porcine reproductive and respiratory syndrome virus RT-PCR : Reverse transcription polymerase chain reaction S : Spike protein TGEV : Transmissible gastroenteritis virus Tr : Trang vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả phản ứng RT-PCR trên lợn ở các tỉnh 34 Bảng 3.2. Kết quả phản ứng RT-PCR 35 Bảng 3.3. Kết quả theo dõi một số biểu hiện về triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PED 38 Bảng 3.4. Bệnh tích đại thể trên một số cơ quan của lợn mắc PED 42 Bảng 3.5. Bệnh tích vi thể của lợn mắc PED 46 Bảng 3.6. Sai khác về vị trí nucleotide của các chủng virus PED nghiên cứu 51 Bảng 3.7. Sự tương đồng về nucleotide giữa các chủng virus PED nghiên cứu (%) 51 Bảng 3.8. Một số thông tin về các chủng virus PED tham chiếu 53 Bảng 3.9. Sự tương đồng về nucleotide giữa các chủng virus PED nghiên cứu với một số chủng virus PED trên thế giới (%) 57 Bảng 3.10. Sai khác về thứ tự axit amin được mã hóa ở gen M của các chủng virus PED nghiên cứu 59 Bảng 3.11. Sự tương đồng về thứ tự axit amin được mã hóa của gen M giữa các chủng virus PED nghiên cứu (%) 59 Bảng 3.12. Sự tương đồng về thứ tự axit amin ở gen M giữa các chủng virus PED nghiên cứu với một số chủng virus PED trên thế giới (%) vii 61 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Những không bào trong bào tương của một tế bào hấp thu ở ruột non lợn, chứa các hạt virus PED có đường kính từ 90190 nm (x20.000). 12 Hình 1.2. Virus PED chủng KPEDV-9 phân lập tại Hàn Quốc nhuộm với urany acetat 2%. Chiều dài thanh nằm ngang tương đương 100nm. 12 Hình 1.3. Mô hình cấu trúc bộ gen virus PED 13 Hình 1.4. Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR 20 Hình 3.1. Kết quả phản ứng RT-PCR 36 Hình 3.2. Lợn sút cân, gầy còm 41 Hình 3.3. Lợn nôn mửa 41 Hình 3.4. Lợn nằm dồn đống 41 Hình 3.5. Phân dính hậu môn, chân 41 Hình 3.6. Phân lỏng màu vàng 41 Hình 3.7. Phân màu xi măng 41 Hình 3.8. Dạ dày, ruột căng, thành mỏng 45 Hình 3.9. Hạch màng treo ruột sưng to 45 Hình 3.10. Thành ruột mỏng, xuất huyết 45 Hình 3.11. Ống dưỡng chất sung huyết 45 Hình 3.12. Biểu mô dạ dày đứt nát (HE 10X) 48 Hình 3.13. Ruột non sung huyết, xuất huyết (HE 10X) 48 Hình 3.14. Tĩnh mạch chứa nhiều hồng cầu (HE 10X) 48 Hình 3.15. Lớp đệm nhiều bạch cầu, lông nhung đứt nát (HE 10X) 48 Hình 3.16. Lông nhung ruột đứt nát (HE 10X) 48 Hình 3.17. Thâm nhiễm tế bào viêm ở ruột (HE 40X) 48 Hình 3.18. So sánh thành phần nucleotit chuỗi gen giải trình tự 50 viii Hình 3.19. So sánh thành phần nucleotide giữa các chủng virus PED nghiên cứu với một số chủng virus PED trên thế giới 56 Hình 3.20. So sánh thành phần axit amin được mã hóa của chuỗi gen giải trình tự 58 Hình 3.21. So sánh thành phần axit amin giữa các chủng virus PED nghiên cứu với một số chủng virus PED trên thế giới 60 Hình 3.22. Cây phả hệ của các chủng virus PED nghiên cứu dựa trên trình tự nucleotide (hiển thị dạng cây theo boot trap) 62 Hình 3.23. Cây phả hệ của các chủng virus PED nghiên cứu dựa trên trình tự nucleotide (hiển thị dạng cây theo cây gốc) ix 63 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Xét trên bình diện thế giới, nhất là với các nước châu Á, chăn nuôi luôn là một ngành kinh tế nông nghiệp quan trọng. Hệ thống nông nghiệp Việt Nam đã đạt được thành tích đáng ghi nhận không chỉ ở lĩnh vực lương thực và cây công nghiệp mà còn ở lĩnh vực chăn nuôi gia súc và thủy sản. Cùng với sự phát triển của quá trình công nghiệp hóa – hiện đại hóa đất nước, công nghệ hiện đại ngày càng được áp dụng sâu rộng đã giúp cho năng suất chăn nuôi ngày càng tăng cao, thời gian nuôi được rút ngắn, do đó lợi nhuận thu được từ chăn nuôi cũng có xu hướng tăng. Bên cạnh đó, mức sống của con người ngày càng nâng cao kéo theo sự thay đổi trong cơ cấu tiêu dùng thức ăn, xu hướng tiêu dùng sản phẩm trồng trọt giảm đi, nhanh chóng nhường chỗ cho sản phẩm chăn nuôi. Nhu cầu về thịt trên thị trường ngày càng tăng lên, đặc biệt là nhu cầu về sản phẩm thịt lợn. Tình hình trên chính là động lực để thúc đẩy ngành chăn nuôi lợn ngày càng phát triển mạnh mẽ. Chăn nuôi lợn là ngành chăn nuôi không mới nhưng trong điều kiện Việt Nam hiện nay, đó lại là ngành chăn nuôi có triển vọng nhất. Tuy nhiên, ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng cũng gặp không ít khó khăn, đặc biệt là vấn đề dịch bệnh đã mang lại những thiệt hại không nhỏ cho người chăn nuôi. Bệnh tiêu chảy thành dịch ở trên lợn do virus PED (Porcine Epidemic Diarrhea) - một virus thuộc họ Coronavirus đang là một trong những vấn đề rất được quan tâm hiện nay do bệnh đã gây thiệt hại nghiêm trọng trên đàn lợn. Bệnh PED xảy ra quanh năm, nhưng thường phổ biến hơn vào mùa đông và trên 90% ca bệnh xảy ra ở lợn dưới 10 ngày tuổi. Bệnh xuất hiện lần đầu tiên ở nước Anh vào năm 1972, sau đó lây lan ra nhiều quốc gia ở châu Âu và châu Á như Trung Quốc, vũng lãnh thổ Đài Loan, Nhật, Hàn Quốc và Thái Lan. Năm 2008, virut PED đã được phát hiện trong một số đàn lợn bị tiêu chảy ở Việt Nam. 1 Cho tới nay, ở Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh tiêu chảy thành dịch ở trên lợn do virus PED cũng như nghiên cứu đặc điểm bệnh lý, sinh học phân tử của virus PED, đặc biệt là ở khu vực phía Bắc Việt Nam. Bên cạnh đó, có một thực tế đặt ra là: các biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở trên lợn ốm do nhiễm virus PED giống và rất dễ nhầm lẫn với các biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở lợn bị nhiễm virus gây viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGEV). Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của virus gây tiêu chảy thành dịch (Porcine epidemic diarrhea) trên lợn và một số đặc điểm bệnh lý của bệnh” 2. Mục đích của đề tài - Xác định được các đặc điểm bệnh lý chủ yếu (bao gồm triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể, vi thể) của lợn mắc bệnh tiêu chảy thành dịch do virus PED gây ra. - Xác định được mối quan hệ di truyền của chủng virus PED nghiên cứu tại Việt Nam so với các chủng tham chiếu trên thế giới dựa trên trình tự gen M của virus gây bệnh. 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Những nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy Tiêu chảy là một biểu hiện lâm sàng của quá trình bệnh lý đặc thù ở đường tiêu hóa. Biểu hiện lâm sàng tùy theo đặc điểm, tính chất, diễn biến, độ tuổi mắc bệnh. Tùy theo yếu tố nào được xem là nguyên nhân chính mà nó được gọi với nhiều tên khác nhau: Bệnh lợn con ỉa phân trắng, bệnh tiêu chảy sau cai sữa, chứng khó tiêu, chứng rối loạn tiêu hóa hay Colibacillosis, Salmonellosis,… hoặc tiêu chảy là triệu chứng thường gặp ở nhiều bệnh ký sinh trùng, bệnh do virus, bệnh do vi khuẩn. Tiêu chảy thường gặp ở gia súc, đã và đang gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi. Trong lịch sử nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy, nhiều tác giả đã nghiên cứu, tìm hiểu nguyên nhân gây ra hội chứng tiêu chảy. Tuy nhiên, tiêu chảy là một hiện tượng bệnh lý, có liên quan đến rất nhiều các yếu tố, có yếu tố là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát. Việc phân biệt rạch ròi nguyên nhân gây tiêu chảy không đơn giản. Ngày nay, người ta thống nhất rằng, phân loại nguyên nhân gây tiêu chảy chỉ có ý nghĩa tương đối, chỉ nêu lên yếu tố nào là chính, xuất hiện đầu tiên, yếu tố nào là phụ xuất hiện sau, từ đó vạch ra phác đồ phòng và điều trị bệnh có hiệu quả. Nhưng cho dù bất cứ nguyên nhân nào dẫn đến tiêu chảy thì hậu quả của nó cũng gây ra viêm nhiễm, tổn thương thực thể đường tiêu hóa và cuối cùng là nhiễm trùng. Theo Fairbrother J.M. (1992) tiêu chảy là một bệnh gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn. Theo Trịnh Văn Thịnh (1995), Lê Minh Chí (1995) lợn bị tiêu chảy thường mất nước, mất chất điện giải và kiệt sức. Những lợn khỏi thường bị còi cọc, thiếu máu, chậm lớn hoặc hiện tượng viêm nhiễm, tổn thương thực thể đường tiêu hóa và cuối cùng là quá trình nhiễm trùng dẫn đến lợn chết với tỷ lệ cao, gây thiệt hại lớn về kinh tế. Đó cũng là nguyên nhân làm cho hiệu quả chăn nuôi không cao. 3 Sử An Ninh (1993), Phan Thanh Phượng và cs. (1995) cho biết ở nước ta bệnh tiêu chảy xảy ra quanh năm, đặc biệt vào vụ đông xuân, khi thời tiết thay đổi đột ngột và vào những giai đoạn chuyển mùa trong năm. Khi nghiên cứu về tình hình dịch tễ, các nhà khoa học đã nhận xét bệnh tiêu chảy xảy ra ở mọi nơi, mọi lúc trên thế giới (Lecce J.G., 1976); (Griffin J.F.T., 1989). Kết quả nghiên cứu của Hoàng Văn Tuấn và cs. (1998) cho thấy bệnh tiêu chảy xảy ra ở mọi lứa tuổi, từ sơ sinh cho đến độ tuổi sinh sản, nhưng trầm trọng nhất là ở lợn sơ sinh đến cai sữa. 1.1.1. Đặc điểm tiêu hóa của lợn con Ở gia súc non sau khi sinh ra, chức năng của các cơ quan trong cơ thể nhất là cơ quan tiêu hóa chưa hoàn chỉnh, nồng độ HCl và các men tiêu hóa chưa đảm nhiệm đầy đủ chức năng tiêu hóa, rất dễ gây rối loạn trao đổi chất, hậu quả dễ nhận biết là rối loạn tiêu hóa, gây tiêu chảy, còi cọc, thiếu máu và chậm lớn. Trong dịch vị của gia súc non chưa có đủ axit HCl tự do nên không hoạt hóa được men pepsin vì vậy không tiêu hóa hết sữa mẹ, trong khi đó sữa mẹ lại là môi trường phát triển tốt của nhiều loại vi khuẩn. Ở lợn con, có giai đoạn không có HCl trong dạ dày, đây được coi là giai đoạn thích ứng cần thiết tự nhiên. Chính nhờ sự thích ứng này, cơ thể lợn con mới có khả năng hấp thu được kháng thể miễn dịch qua sữa đầu. Trong giai đoạn này dịch vị lại không có hoạt tính phân giải protein mà chỉ có hoạt tính làm vón sữa đầu và sữa. Albumin và Globulin được chuyển xuống ruột và thẩm thấu vào máu. Nhưng trên 14 - 16 ngày tuổi, tình trạng thiếu HCl ở dạ dày không còn là sự cần thiết sinh lý bình thường nữa. Việc tập ăn cho lợn con sớm và cai sữa sớm đã rút ngắn được giai đoạn thiếu HCl, hoạt hóa hoạt động tiết dịch, giúp tăng khả năng tạo các đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Nhưng giai đoạn sau cai sữa là một giai đoạn khó khăn đối với lợn con khi chuyển từ sữa mẹ sang thức ăn ở dạng rắn. Điều đó có thể gây mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột tạo điều kiện cho vi khuẩn có hại phát triển và cũng là nguyên nhân gây ra bệnh, dẫn đến kết quả là lợn con chậm lớn và có thể chết. 4 Ngoài ra, lợn con còn chịu nhiều tác động của lợn mẹ, sự thay đổi ngoại cảnh cũng góp phần làm tăng stress của lợn con. 1.1.2. Một số nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn Tiêu chảy là một hiện tượng bệnh lý có liên quan đến nhiều yếu tố, có yếu tố là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát. Vì vậy, việc phân biệt rạch ròi giữa các nguyên nhân gây tiêu chảy là rất khó khăn. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về nguyên nhân gây nên hội chứng tiêu chảy, có thể là nguyên phát hay thứ phát. Dưới đây là một số nguyên nhân cơ bản: 1.1.2.1. Do môi trường ngoại cảnh Môi trường ngoại cảnh là một trong 3 yếu tố cơ bản gây ra bệnh dịch, mối quan hệ giữa cơ thể - mầm bệnh - môi trường là nguyên nhân của sự không ổn định về sức khỏe, đưa đến phát sinh bệnh (Nguyễn Như Thanh, 2001). Môi trường ngoại cảnh bao gồm các yếu tố: nhiệt độ, ẩm độ, các điều kiện về chăm sóc nuôi dưỡng, vệ sinh chuồng trại, sự di chuyển, thức ăn, nước uống… Khi gia súc bị nhiễm lạnh kéo dài làm giảm phản ứng miễn dịch, giảm tác dụng thực bào, làm cho gia súc dễ bị nhiễm khuẩn và gây bệnh. Khẩu phần ăn cho vật nuôi không thích hợp, thức ăn kém chất lượng như thối, mốc và nhiễm các tạp chất, các vi sinh vật có hại dễ dẫn đến rối loạn tiêu hóa kèm theo viêm ruột, ỉa chảy ở gia súc. Đào Trọng Đạt và cs. (1995); Phạm Khắc Hiếu và cs. (1998) cũng cho rằng các yếu tố stress lạnh, độ ẩm ảnh hưởng rất lớn đến lợn sơ sinh, lợn con vài ngày tuổi. Độ ẩm thích hợp cho lợn là từ 75% đến 85%. Việc làm khô và giữ ấm chuồng nuôi là vô cùng quan trọng. Sử An Ninh và cs. (1981); Niconxki V.V. (1986); Phạm Khắc Hiếu và cs. (1998) cho rằng các yếu tố khí hậu, thời tiết không thuận lợi là yếu tố tác động rất mạnh đến quá trình loạn khuẩn ở lợn và là nguyên nhân gây ra bệnh tiêu chảy. Như vậy, nguyên nhân môi trường ngoại cảnh gây tiêu chảy không mang tính đặc hiệu mà mang tính tổng hợp. Lạnh và ẩm gây rối loạn hệ thống điều tiết trao đổi nhiệt của cơ thể lợn, dẫn đến rối loạn quá trình trao đổi chất, làm giảm 5 sức đề kháng của cơ thể, từ đó các mầm bệnh trong đường tiêu hóa có thời cơ tăng cường độc lực và gây bệnh. 1.1.2.2. Chế độ chăm sóc nuôi dưỡng không đúng kỹ thuật Thức ăn kém chất lượng, ôi thiu, khó tiêu… là nguyên nhân gây ỉa chảy ở gia súc. Thức ăn thiếu các chất khoáng, vitamin cần thiết cho cơ thể, đồng thời phương thức chăn nuôi không phù hợp sẽ làm giảm sức đề kháng của cơ thể gia súc và tạo cơ hội cho các vi khuẩn đường tiêu hóa phát triển và gây bệnh (Hồ Văn Nam và cs., 1997). Theo Hoàng Văn Tuấn (1998); Đoàn Kim Dung (2004); cho rằng: Tỷ lệ mắc tiêu chảy trong một số cơ sở chăn nuôi lợn phụ thuộc vào điều kiện chăm sóc, vệ sinh thú y, còn tỷ lệ chết, mức độ trầm trọng của bệnh ở một đàn phụ thuộc vào giai đoạn mắc bệnh. Theo Trịnh Văn Thịnh (1995); Đào Trọng Đạt và cs. (1995) trong quy trình kỹ thuật chăm sóc, nuôi dưỡng lợn thì công tác chăm sóc, nuôi dưỡng lợn con và lợn mẹ đúng kỹ thuật phù hợp với lứa tuổi là yếu tố quan trọng quyết định đến tỷ lệ tiêu chảy cao hay thấp, trong thành phần và sự cân đối các chất dinh dưỡng trong khẩu phần đóng vai tò quan trọng. 1.1.2.3. Tiêu chảy do vi khuẩn Trong đường tiêu hóa của gia súc có hệ vi khuẩn gọi là hệ vi khuẩn đường ruột, được chia thành 2 loại, trong đó vi khuẩn có lợi tác dụng lên men phân giải các chất dinh dưỡng giúp cho quá trình tiêu hóa được thuận lợi và vi khuẩn có hại thì khi có điều kiện thuận lợi sẽ gây bệnh. Họ vi khuẩn đường ruột là họ vi khuẩn cộng sinh thường trực trong đường ruột. Họ vi khuẩn này muốn từ vi khuẩn cộng sinh trở thành vi khuẩn gây bệnh thì phải có 3 điều kiện. - Trên cơ thể vật chủ có cấu trúc giúp cho vi khuẩn thực hiện được chức năng bám dính. - Vi khuẩn phải có khả năng sản sinh các yếu tố gây bệnh, đặc biệt sản sinh độc tố, trong đó quan trọng nhất là độc tố đường ruột Enterotoxin. 6 - Có khả năng xâm nhập vào lớp tế bào biểu mô của niêm mạc ruột và từ đó phát triển lên. Một số vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột là E.coli, Salmonella sp.shigella, Klebsiella, Clostridium perfringens…đó là những vi khuẩn quan trọng, gây rối loạn tiêu hóa, viêm ruột tiêu chảy ở người và nhiều loài động vật. Đào Trọng Đạt và cs. (1996) cho biết: chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn đường ruột gây tiêu chảy là E.coli (45,6%). Cũng theo tác giả, vi khuẩn yếm khí C. perfringens gây bệnh khi có điều kiện thuận lợi và khi nó trở thành vai trò chính. Cù Hữu Phú và cs. (2004) khi nghiên cứu về E.coli và Salmonella ở lợn tiêu chảy cho biết tỷ lệ phát hiện E.coli độc trong phân là 80 -90% số mẫu xét nghiệm. Phan Thanh Phượng và cs. (1996) vi khuẩn yếm khí C. perfringens là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng trong hội chứng tiêu chảy của lợn ở lứa tuổi từ 1-120 ngày tuổi. Ở lợn con theo mẹ, tỷ lệ mắc bệnh do vi khuẩn này gây ra có thể đến 100% và tỷ lệ chết là 60%. Hồ Văn Nam và cs. (1997) nhấn mạnh: vi khuẩn đường ruột có vai trò không thể thiếu được trong hội chứng tiêu chảy. Nguyễn Như Pho (2003) cho rằng, khả năng gây bệnh của các loại vi khuẩn đối với lứa tuổi lợn khác nhau. Đối với lợn con theo mẹ, lợn sau cai sữa hoặc giai đoạn đầu nuôi thịt thì tỷ lệ mắc tiêu chảy do Salmonella cao hơn; giai đoạn lúc sơ sinh đến sau cai sữa thường do E. coli; lứa tuổi 6-12 tuần tuổi thì thường do xoắn khuẩn Treponema hyodysenterriae; vi khuẩn yếm khí C. perfringens thường gây bệnh nặng cho lợn con theo mẹ trong khoảng 1 tuần tuổi đến cai sữa. 1.1.2.4. Tiêu chảy do virus Virus cũng là tác nhân gây bệnh tiêu chảy ở lợn. Sự xuất hiện của virus làm tổn thương niêm mạc ruột, làm suy giảm sức đề kháng của cơ thể và thường gây ỉa chảy ở dạng cấp tính với tỷ lệ chết cao. 7 Khooteng Hoat (1995) đã thống kê có hơn 10 loại virus có tác động làm tổn thương đường tiêu hóa, gây viêm ruột ỉa chảy như: Enterovirus, Rotavirus, Coronavirus, virus dịch tả lợn... Rotavirus và Coronavirus là những virus gây tiêu chảy quan trọng ở gia súc non mới sinh như nghé, dê, cừu con, lợn con, ngựa con và đặc biệt là bê do những virus này có khả năng phá hủy màng ruột và gây tiêu chảy nặng (Archie.H, 2000). Lecce J.G (1976); Nilson O (1984) nghiên cứu về virus gây bệnh đường tiêu hóa đã xác định được vai trò của Rotavirus trong hội chứng tiêu chảy ở lợn. Các nghiên cứu trong nước của Nguyễn Như Pho (2003) cũng đã cho rằng: Rotavirus và Coronavirus gây bệnh tiêu chảy chủ yếu cho lợn con trong giai đoạn theo mẹ, với các triệu chứng tiêu chảy cấp tính, nôn mửa, mất nước với tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao. Theo Bergenland H.U (1992) trong số những mầm bệnh thường gặp ở lợn trước và sau cai sữa bị bệnh tiêu chảy có rất nhiều loại vi rút, 29% phân lợn bệnh tiêu chảy phân lập được Rotavirus, 11,2% có vi rút TGE, 2% có Enterovirus, 0,7% có Parvovirus. 1.1.2.5. Tiêu chảy do nấm mốc Thức ăn khi chế biến hoặc bảo quản không đúng kỹ thuật dễ bị nấm mốc. Một số loài như: Aspergillus, Penicillium, Fusarium…có khả năng sản sinh nhiều loại độc tố Afratoxin (Afratoxin B1, B2, G1, G2, M1). Độc tố Afratoxin gây độc cho người và gia súc gây bệnh nguy hiểm nhất cho con người là ung thư gan, hủy hoại gan, độc cho thận, sinh dục và thần kinh. Afratoxin gây độc cho nhiều loài gia súc, gia cầm, mẫn cảm nhất là vịt, gà, lợn và các gia súc khác. Lợn khi nhiễm độc thường bỏ ăn, thiếu máu, vàng da, ỉa chảy, ỉa chảy ra máu. Nếu trong khẩu phần có 500 - 700µg Afratoxin/kg thức ăn sẽ làm cho lợn con chậm lớn, còi cọc, giảm sức đề kháng với các bệnh truyền nhiễm khác (Lê Thị Tài và cs., 1997). 8 1.1.2.6. Tiêu chảy do ký sinh trùng Có nhiều loại ký sinh trùng gây bệnh tiêu chảy ở lợn như: Cầu trùng Eimeria, Isospora suis, Crystosporidium, Ascaris suum, Trichuris suis…hoặc một số loài giun tròn lớp Nematoda (Ascaris suum, Trichuris suis, Strongloides, Haemonchus, mecistocirrus…). Bệnh do Isospora suis, Crytosporidium thường tập trung vào giai đoạn lợn con từ 5 - 25 ngày tuổi, còn ở lợn trên 2 tháng tuổi do cơ thể đã tạo được miễn dịch đối với bệnh cầu trùng, nên lợn chỉ mang mầm bệnh mà ít khi xuất hiện triệu chứng tiêu chảy (Nguyễn Như Pho, 2003). Cầu trùng và một số loại giun tròn (giun đũa, giun tóc, giun lươn) là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn sau cai sữa nuôi trong các hộ gia đình tại Thái Nguyên (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2006a). Đặc điểm chủ yếu của tiêu chảy do ký sinh trùng là con vật mắc bệnh tiêu chảy nhưng không liên tục, có sự xen kẽ giữa tiêu chảy và bình thường, cơ thể thiếu máu, da nhợt nhạt, gia súc kém ăn, thể trạng sa sút. Tác giả Nguyễn Kim Thành (1999) cho biết trong đường ruột của lợn tiêu chảy đã tìm thấy giun đũa ký sinh với lượng không nhỏ. Theo Phan Địch Lân và Phạm Sỹ Lăng (1995) giun đũa ký sinh trong ruột non của lợn là loài Ascarissuum. Giun đũa lợn phát triển và gây bệnh không cần vật chủ trung gian, lợn trực tiếp nuốt phải trứng (ấu trùng gây nhiễm), khi vào cơ thể lợn trứng sẽ thực hiện quá trình di hành và phát triển thành giun trưởng thành ký sinh ở đường tiêu hóa. Theo Phạm Văn Khuê và Phạm Lục (1996) sán lá ruột lợn và giun đũa lợn trong đường tiêu hóa, chúng làm tổn thương niêm mạc đường tiêu hóa gây viêm ruột ỉa chảy. Như vậy, có thể thấy có rất nhiều nguyên nhân gây tiêu chảy, nhưng theo chuyên gia chuyên nghiên cứu về bệnh tiêu chảy ở lợn như Lê Văn Tạo (1993) thì dù nguyên nhân nào gây tiêu chảy cho lợn thì cuối cùng cũng là quá trình nhiễm khuẩn, vi khuẩn kế phát làm viêm ruột, tiêu chảy nặng thêm, có thể dẫn đến chết hoặc tiêu chảy viêm ruột mạn tính. 9