Tài liệu Nghiên cứu điều trị bệnh thiếu máu chi cấp tính trên chuột nhắt trắng bằng ghép đồng loài tế bào gốc trung mô

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ BÍCH NGỌC NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ BỆNH THIẾU MÁU CHI CẤP TÍNH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG GHÉP ĐỒNG LOÀI TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ Chuyên ngành: Sinh lý học Người và Động vật Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh - Năm 2017 Công trình được hoàn thành tại: PTN Nghiên cứu và Ứng dụng tế bào gốc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Tạ Thành Văn Phản biện 1: PGS.TS. Trương Quang Bình .................................................... Phản biện 2: PGS.TS. Nguyễn Văn Thuận ..................................................... Phản biện 3: TS. Trần Hoàng Ngọc Ái ........................................................... Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Lê Văn Đông .................................................. Phản biện độc lập 2: TS. Trần Hoàng Ngọc Ái ............................................... Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TP.HCM vào lúc 09 giờ 00 ngày 31 tháng 05 năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM - Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Thiếu máu cục bộ chi được coi là giai đoạn cuối của bệnh lý về động mạch ngoại biên, ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống. Thiếu máu cục bộ cấp tính chi được xác định trong 12% dân số trưởng thành ở Mỹ. Một năm sau khi được chẩn đoán, 25% bệnh nhân sẽ tử vong, 30% phải cắt cụt chi, và chỉ 45% còn lại sống mà còn giữ được 2 chi. Năm năm sau đó, hơn 60% bệnh nhân sẽ tử vong do thiếu máu cục bộ cấp tính chi. Thống kê tại Viện Tim mạch Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh nhân BĐMCD điều trị nội trú tại Viện tăng từ 1,7% (2003) lên tới 2,5% (2006) và 3,4% (2007). Đến nay, hầu hết các liệu pháp điều trị cho bệnh đều dựa trên nguyên tắc phá bỏ huyết khối bằng các thuốc, bằng sóng siêu âm hoặc bằng phương pháp can thiệp nội mạch nhằm tái thiết lập dòng máu. Và khi phương pháp can thiệp nội mạch không có hiệu quả, phương pháp phẫu thuật bắc cầu động mạch sẽ được thực hiện. Tuy nhiên, khi tất cả các phương pháp truyền thống đều thất bại, bệnh nhân có thể phải đối mặt với nguy cơ cắt cụt chi hoặc tử vong. Liệu pháp tế bào gốc đang trở thành phương pháp điều trị đầy hứa hẹn cho việc tái tạo mạch máu mới. Các nghiên cứu gần đây cho thấy tế bào gốc trung mô tuỷ xương (BM-MSC) có thể cảm ứng tạo mạch máu mới trên mô hình chuột thiếu máu chi cấp tính cũng như trên người trưởng thành. Ngoài BM-MSC, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ (AD-MSC) có đặc tính tương tự. AD-MSC có thể biệt hoá thành các tế bào nội mô hoặc tế bào có nguồn gốc trung mô khác như mô cơ. Ghép AD-MSC cũng đã được nhiều báo cáo cho thấy tính hiệu quả của chúng trong việc tái tạo mô tổn thương và giúp tái tạo mạch máu mới. Mặc dù một số nghiên cứu cho thấy việc cấy ghép AD-MSC và BMMSC đều cho hiệu quả trong điều trị bệnh thiếu máu chi cấp tính trên mô hình chuột, đến nay vẫn còn ít thông tin và bằng chứng khoa học so sánh 1 hiệu quả điều trị giữa hai loại tế bào này và cơ chế hoạt động của tế bào trong việc giảm thiểu tổn thương mô. Tại Việt Nam, các nghiên cứu phân lập tế bào gốc và điều trị thực nghiệm trên mô hình động vật bệnh lý sử dụng tế bào gốc đã và đang được tiến hành. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào thực hiện đối với bệnh lý thiếu máu chi cấp tính. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu điều trị bệnh thiếu máu chi cấp tính trên chuột nhắt trắng bằng ghép đồng loài tế bào gốc trung mô” nhằm thử nghiệm điều trị bệnh bằng liệu pháp tế bào gốc với nguồn tế bào gốc trung mô từ tuỷ xương và từ mô mỡ. Đề tài được thực hiện với các mục tiêu như sau: Mục tiêu tổng quát: Đánh giá hiệu quả điều trị thực nghiệm bệnh thiếu máu chi cấp tính trên mô hình chuột sử dụng BM-MSC và AD-MSC đồng loài. Mục tiêu cụ thể 1. Phân lập được tế bào gốc trung mô từ tuỷ xương và mô mỡ - đánh giá một số đặc tính an toàn của 2 loại tế bào trên 2. Xây dựng và chuẩn hoá thành công mô hình chuột thiếu máu chi cấp tính 3. Đánh giá và so sánh hiệu quả điều trị của AD-MSC và BM-MSC trên chuột thiếu máu chi cấp tính 4. Phân tích và đánh giá được vai trò của tế bào ghép trên chuột thiếu máu chi cấp tính Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu can thiệp đối chứng ngẫu nhiên - Nghiên cứu này sử dụng chuột nhắt trắng chuột thiếu máu chi cấp tính do cắt và cắt mạch máu đùi - Nguồn tế bào cho điều trị: tế bào ghép đồng loài được sử dụng là ADMSC và BM-MSC 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bệnh tắc nghẽn mạch máu chi Tắc nghẽn mạch máu chi thuộc nhóm bệnh lý động mạch ngoại biên (BĐMNB). BĐMNB có thể xảy ra tại bất cứ mạch máu nào trong cơ thể, trong đó đại đa số xảy ra ở chi dưới. Thiếu máu cục bộ chi cấp tính là kết quả của sự tiến triển dày lên của thành động mạch do sự tích tụ của các mảng bám. Sự tích tụ mảng bám này còn được gọi là xơ vưa động mạch, làm hẹp và gây tắc dòng máu. Bệnh làm giảm đáng kể lưu lượng máu tới các chi như tay, chân, bàn chân, cuối cùng tiến triển tới mức đau nặng ngay cả khi nghỉ ngơi và thậm chí gây loét da, loét hoặc hoại tử chân và bàn chân. Thiếu máu cục bộ cấp tính chi được xác định trong 12% dân số trưởng thành ở Mỹ. Một năm sau khi được chẩn đoán, 25% bệnh nhân sẽ tử vong, 30% phải cắt cụt chi, và chỉ 45% còn lại sống mà còn giữ được 2 chi. Năm năm sau đó, hơn 60% bệnh nhân sẽ tử vong do thiếu máu cục bộ cấp tính chi. Tại Việt Nam, cùng với các bệnh động mạch do xơ vữa như nhồi máu cơ tim, đột quỵ… tỷ lệ bệnh nhân nhập viện vì BĐMCD cũng ngày một gia tăng. Thống kê tại Viện Tim mạch Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh nhân BĐMCD điều trị nội trú tại Viện tăng từ 1,7% (2003) lên tới 2,5% (2006) và 3,4% (2007). Theo báo cáo từ tác giả Đoàn Quốc Hưng và cs, trong thời gian từ 3/1999 đến 5/2005, nghiên cứu trên 113 bệnh nhân tắc nghẽn mạch máu chi dưới mạn tính do xơ vữa động mạch được điều trị phẫu thuật cho thấy tỷ lệ tử vong chung sau 5 năm là 15,1%. Các nghiên cứu gần đây cho thấy tế bào gốc trung mô tuỷ xương (BM-MSC) có thể cảm ứng tạo mạch máu mới trên mô hình chuột thiếu máu chi cấp tính cũng như trên người trưởng thành. Ngoài BM-MSC, tế bào gốc trung mô có nguồn gốc từ mô mỡ (AD-MSC) có đặc tính tương tự với tế bào BM-MSC. AD-MSC có thể biệt hoá thành các tế bào nội mô 3 hoặc các tế bào có nguồn gốc trung mô khác như mô cơ. Ghép AD-MSC đã được nhiều báo cáo cho thấy tính hiệu quả của chúng trong việc tái tạo mô tổn thương và giúp tái tạo mạch máu mới. Tế bào gốc trung mô MSC là một trong những nguồn TBG được nghiên cứu từ lâu và sở hữu nhiều đặc tính ưu việt. Uỷ ban MSC của Hiệp hội quốc tế về liệu pháp tế bào (International Society of Cellular Therapy-ISCT) đã đề xuất một bộ tiêu chuẩn tối thiểu để xác định đặc tính miễn dịch của MSC người cho các các nhà khoa học nghiên cứu cơ bản phòng thí nghiệm lẫn các nhà nghiên cứu tiền lâm sàng vào năm 2006 và được cập nhật mới năm 2013. Đầu tiên, MSC phải có tính bám dính khi được duy trì trong điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn sử dụng bình nuôi cấy mô. Thứ hai, tế bào phải biểu hiện dương tính với các phân tử protein bề mặt (marker) CD105, CD73, CD90 và không biểu hiện marker CD45, CD34, CD14 hoặc CD11b, CD79a hoặc CD19 và HLA-DR. Thứ ba, các tế bào phải có khả năng biệt hoá thành nguyên bào tạo xương, tế bào mỡ và nguyên bào sụn dưới điều kiện nuôi cấy biệt hoá in vitro tiêu chuẩn. Cơ chế sửa chữa tổn thương của tế bào gốc trung mô MSC tham gia tích cực vào việc sửa chữa và tái tạo mô. Đầu tiên MSC được phân phối vào vùng tổn thương hoặc mô bệnh có thể tiết cytokine và nhân tố tăng trưởng để kích thích tái tạo theo hướng cận tiết. MSC có thể điều chỉnh ổ tế bào gốc trong cơ thể chủ bằng cách kích thích sự huy động tế bào nội sinh tới vùng tổn thương và định hướng biệt hoá theo dòng tế bào cần thiết. Một cách có liên quan, MSC có thể cung cấp chất chống oxy hoá, dọn dẹp các gốc tự do và các protein sốc nhiệt/chaperone ở vùng thiếu máu. Kết quả là các chất độc hại phóng thích vào môi trường có thể được loại bỏ, do đó thúc đẩy sự phục hồi của các tế bào còn sống sót. MSC được cấy ghép có thể cung cấp ty thể mới cho tế bào hư hại, do đó phục hồi lại quá trình thoái hoá yếm khí. Thứ hai, MSC 4 có thể biệt hóa trực tiếp thành các tế bào có chức năng, thay thế cho tế bào đã hư hại. Tế bào gốc trong tái tạo mạch máu mới Một đặc tính sinh học quan trọng của TBG là tác động cận tiết trong quá trình tân tạo mạch. Đồng thời, TBG cũng tham gia biệt hoá trự tiếp thành các tế bào thành phần của mạch máu như tế bào nội mô, tế bào cơ trơn thành mạch... Sự tạo mạch máu mới giúp cung cấp oxy và chất dinh dưỡng là thiết yếu cho sự sống sót và tăng trưởng của các mô trong cơ thể. Sự tân tạo được hình thành theo 2 cơ chế: sự tạo mạch máu mới hoàn toàn (vasculorgenesis) và sự tạo mạch bằng cách phân nhánh và kéo dài từ các mạch tồn tại sẵn có (angiogenesis) Tế bào gốc trung mô trong việc sửa chữa và tái tạo mô cơ MSC có thể biệt hoá thành các sợi cơ vân và tham gia vào phục hồi ổ tế bào vệ tinh cả in vitro và in vivo. Do đó, MSC cũng được xem là một ứng viên cho điều trị các bệnh về cơ. Trong một số nghiên cứu, MSC khi cấy ghép vào chuột đột biến thiếu gen dystrophin hoặc bệnh nhân teo cơ Duchenne đã cho thấy dấu hiệu cải thiện đáng kể chức năng cơ. Goudenege và cs (2009) cũng đã chứng minh rằng biểu hiện của MyoD ảnh hưởng bởi AD-MSC người. Kết quả của thí nghiệm của ông cho thấy tiềm năng tạo tế bào cơ của AD-MSC người tăng cả ở in vitro và in vivo. CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu • Chuột nhắt trắng dòng Swiss trên 3 tháng tuổi được sử dụng cho thí nghiệm. • Tế bào gốc trung mô được thu nhận từ mô mỡ (AD-MSC) và tuỷ xương (BM-MSC) của chuột đồng loại. • Loại bệnh nghiên cứu: bệnh thiếu máu chi cấp tính do bị thắt và cắt mạch máu 5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm Phương pháp nghiên cứu: • Phương pháp thu nhận và nuôi cấy tế bào ứng viên tế bào gốc trung mô từ mô mỡ và tuỷ xương • Phương pháp đánh giá một số đặc tính an toàn của tế bào: tính vô khuẩn của tế bào, khả năng tạo khối u của tế bào và khả năng gây chết của tế bào trên động vật • Phương pháp tạo mô hình chuột thiếu máu chi cấp tính với các kĩ thuật đánh giá sự lưu thông mạch máu chi, SPO2, sự phù nề chi, khả năng vận động, sự biến đổi cấu trúc mô bằng nhuộm mô học, sự hình thành mạch máu mới • Phương pháp ghép tế bào gốc trên chuột tắc nghẽn mạch máu chi • Phương pháp chuyển gen phát huỳnh quang vào tế bào gốc • Phương pháp đánh giá sự tồn tại của tế bào dựa trên tế bào đánh dấu huỳnh quang và các kĩ thuật chụp hình dưới kính hiển vi huỳnh quang và kĩ thuật phân tích dòng chảy (flow cytometry) 6 • Phương pháp đánh giá sự thay đổi của các gen liên quan đến khả năng tạo mạch máu mới của tế bào ghép bằng kĩ thuật realtime RT-PCR • Phương pháp xử lý số liệu: các số liệu được sử lý bằng phần mềm xử lý thống kê prism 6.0, Tukey's multiple comparisons test với độ tin cậy trên 95% CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 1. Kết quả phân lập và định danh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ và tuỷ xương 1.1. Hình thái và khả năng tăng sinh của tế bào gốc ứng viên 1.1.1. Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ Hình 1. Hình dạng tế bào AD-MSC ứng viên nuôi cấy in vitro Phân đoạn tế bào SVF bám trải sau khi nuôi cấy hai ngày, tế bào có dạng hình thoi, thuôn dài về hai đầu, hình que hoặc dạng đa giác (Hình 1A). Sau năm ngày nuôi cấy, mật độ tế bào bao phủ khoảng 70-80% bề mặt đĩa nuôi. Tế bào có dạng hình thoi, thuôn dài về hai đầu và hình que chiếm đa số (Hình 1B). Qua các lần cấy chuyền thứ ba (Hình 1C), thứ năm (Hình 1D), thứ mười (Hình 1E), hình dạng tế bào trở nên đồng nhất hơn với hình dạng chủ yếu thuôn dài ở hai đầu. Hình dạng này giống với các tế bào nguyên bào sợi (Hình 1F). 1.1.2. Tế bào gốc trung mô từ tuỷ xương 7 Đối với tế bào đơn nhân thu nhận từ tuỷ xương chuột, tế bào bám dính sau 24 giờ nuôi cấy và tăng sinh sau 48 giờ (Hình 2A). Tế bào bao phủ 70-80% bề mặt đĩa nuôi sau 5-6 ngày (Hình 2B). Tế bào có dạng hình thoi, thuộn dài về hai đầu, ít tế bào phân nhánh hơn so với tế bào thu nhận từ mô mỡ. Hình 2. Hình dạng tế bào BM-MSC ứng viên nuôi cấy in vitro Sau 3 lần cấy chuyền, hình dạng tế bào đồng nhất hơn với dạng hình thoi chiếm đa số (Hình 2C). Ở lần cấy chuyền thứ 5 đến 10, hình dạng tế bào đồng nhất (Hình 2D,E), tế bào tăng sinh với tốc độ ổn định, sau mỗi 2 -3 ngày, mật độ tế bào bao phủ 70-80% bề mặt đĩa nuôi (Hình 2). 1.2. Khả năng biệt hoá thành tế bào mỡ, xương và sụn Sau khi nuôi trong môi trường cảm ứng biệt hoá tạo mỡ, xương và sụn, tế bào AD-MSC và BM-MSC lần lượt bắt màu với thuốc nhuộm oil red O, alizarin red S và safranin O cho thấy đã có sự hình thành và tích tụ các giọt lipid, tích tụ ion canxi và sự hình thành proteoglycan trong tế bào. Như vậy, AD-MSC và BM-MSC có khả năng biệt hoá thành tế bào mỡ, xương và sụn (Hình 3). 8 Hình 3. Khả năng biệt hoá thành tế bào mỡ, xương, sụn của BM-MSC và AD-MSC in vitro 1.3. Sự biểu hiện các dấu ấn protein bề mặt tế bào Hình 4. Sự biểu hiên kiểu hình miễn dịch của AD-MSC và BM-MSC Ở lần cấy chuyền thứ 3 và thứ 4, AD-MSC và BM-MSC biểu hiện kiểu hình miễn dịch không đồng nhất. Từ lần cấy chuyền thứ 5 và 10, tế bào đồng nhất về kiểu hình miễn dịch với trên 99% quần thể tế bào dương tính với CD44, CD90, CD106 và và dưới 5% âm tính với CD14, CD34, CD45, CD105 (Hình 4). 1.4. Thời gian nhân đôi của tế bào Ở lần cấy chuyền thứ 5 đến lần 10, thời gian nhân đôi của tế bào AD-MSC là 46,64 ± 2,3 h giờ và tế bào BM-MSC là 59,03 ± 2,9 h 2. Kết quả đánh một số đặc tính an toàn của tế bào ghép 2.1. Độ vô khuẩn của tế bào 9 Sau 14 ngày, màu sắc và trạng thái môi trường nuôi AD-MSC và BM-MSC tương đồng với mẫu đối chứng âm, dung dịch trong suốt cho thấy mẫu tế bào không bị nhiễm vi khuẩn (Hình 5A) và vi nấm (Hình 5B). Điều này khác với ống đối chứng dương, vi nấm và vi khuẩn phát triển mạnh dẫn đến màu môi trường đục. Hình 5. Độ vô khuẩn của tế bào AD-MSC và BM-MSC 2.2. Khả năng gây khối u và gây chết của tế bào trên động vật Sau 7 ngày, khối u hiện diện rõ ở tất cả các vị trí ghép tế bào ung thư vú 4T1 (3 nồng độ 105, 106 và 107 tế bào). Sau 14 ngày (Hình 6), khối u tạo dạng cầu và xuất hiện các vùng da bị hoại tử tại vị trí khối u phát triển. Sau 28 ngày, diện tích vùng hoại tử trên da chuột tăng. Kích thước khối u tăng nhanh và 100% chuột được ghép 4T1 đều tử vong. Đồng thời, với liều tế bào 4T1 ghép càng cao, sự phát triển của khối u càng nhanh. Trong khi đó, tại vị trí ghép AD-MSC (Hình 6A) và BM-MSC (Hình 6B), với tất cả các liều ghép, vào tất cả các thời điểm đánh giá đều không có sự xuất hiện của bất cứ khối u nào. 10 Hình 6. Khả năng gây khối u của tế bào trên động vật Để đánh giá tác động riêng lẻ của tế bào AD-MSC và BM-MSC lên sự sống sót của chuột, chúng tôi tiến hành ghép chỉ AD-MSC hoặc BMMSC lên chuột tại 2 vị trí cơ đùi và vú. Kết quả cho thấy, 100% chuột được ghép AD-MSC (n=15) hoặc BM-MSC (n=15) không có sự hình thành khối u và tất cả các con chuột được ghép tế bào sống khoẻ mạnh sau 6 tháng ghép tế bào. 3. Kết quả xây dựng mô hình chuột thiếu máu chi cấp tính 3.1. Khả năng lưu thông máu sau tổn thương Một đến hai phút ngay sau khi tiêm trypan blue, ở cả 2 lô chuột dưới 6 tháng tuổi và chuột trên 6 tháng tuổi, chi không cắt mạch bắt màu xanh của thuốc nhuộm. Trong khi đó, chi cắt mạch không bắt màu (Hình 7A). Hiên tượng này xảy ra tương tự cho đến ngày thứ 6 sau khi cắt mạch (Hình 7B). Điều này chứng tỏ lượng máu lưu thông đến phía sau vùng bị gây tắc nghẽn mạch đã bị gián đoạn. Điều này cho thấy việc gây tắc nghẽn mạch máu chi đã thành công trên 100% chuột thí nghiệm ở cả 2 lô. Hình 7. Khả năng lưu thông máu sau tổn thương Sau 6 ngày, những chuột còn giữ được đến bàn chân ở cả hai lô, sự bắt màu thuốc nhuộm quan sát được ở chi bị cắt mạch và chi bình thường (Hình 7C). Tuy nhiên, ở chi bị cắt mạch, sự bắt màu xanh hiện diện ở ít vị trí hơn so với chi bình thường. Điều này cho thấy, mặc dù sự tổn thương sau khi gây tắc nghẽn mạch bị hạn chế, nhưng sự lưu thông mạch máu kém hơn so với chi bình thường. 11 3.2. Độ phù nề chi sau tổn thương Sau 3 ngày gây thiếu máu, chi chuột có hiện tượng phù nề (Hình 8A). Khi đánh giá mức độ phù nề bằng phương pháp đánh giá tỉ lệ khối lượng mô ướt/mô khô ở những chuột này cho thấy, ở lô chuột bình thường là 3,45 ± 0,09 (lần). Trong khi đó, tỷ lệ này ở lô chuột dưới 6 tháng tuổi và ở lô chuột trên 6 tháng tuổi có khác biệt đáng kể so với lô bình thường (p< 0,05), lần lượt là 4,30 ± 0,09 (lần) và 4,59 ± 0,18 (lần) (Hình 8B). Tuy nhiên, không có sự khác biệt về mức độ phù của chi bị gây tắc nghẽn mạch máu ở chuột dưới 6 tháng tuổi so với chuột trên 6 tháng tuổi. Mặt khác, sau 7 ngày, độ phù nề chi ở tất cả các con chuột tắc nghẽn mạch máu không khác biệt so với các con chuột bình thường. Điều này cho thấy, sự phù nề của chi chuột giảm đáng kể sau 1 tuần sau khi bị tắc nghẽn cấp tính mạch máu chi. Hình 8. Sự phù nề chi sau khi gây tắc nghẽn mạch máu 3.4. Khả năng cử động của chi Ở cả 2 lô chuột, khả năng cử động dưới nước của chi cắt mạch có sự tương đồng nhau (Biểu đồ 1). Chuột bị tổn thương cấp độ I, khả năng đạp nước ở chuột dưới 6 tuổi (35 ± 1 lần) và chuột trên 6 tháng tuổi (36 ± 1 lần) không khác nhau và không khác biệt so với khả năng hoạt động của chuột bình thường (36 ± 1 lần). Ở cấp độ tổn thương II và III, tần số đạp nước của chi không có sự khác biệt giữa 2 nhóm tuổi, dao động từ 23 ± 1 lần đến 26± 1 lần. Tuy nhiên, so với cấp độ tổn thương I và so với chuột 12 bình thường, hoạt động đạp nước khi chuột tổn thương cấp độ II và III có khác biệt đáng kể (p<0,05). Biểu đồ 1. Khả năng cử động dưới nước của chuột 3.5. Sự tổn thương trong cấu trúc mô và khả năng phục hồi tổn thương mạch máu Hình 9. Sự tổn thương về cấu trúc mô và khả năng phục hồi tổn thương mạch máu ở chi thiếu máu cấp tính Ở mô cơ chuột bình thường (Hình 9A, D), tế bào cơ được sắp xếp trật tự, cấu trúc mô khít, nhân tế bào (mũi tên màu vàng) nằm ở ngoại vị tế bào, ngay dưới màng bào tương (mũi tên màu trắng) của tế bào cơ. Trong khi đó, sau khi cắt mạch 3 ngày, ở cả 2 lô chuột thí nghiệm, cấu trúc mô cơ biến dạng, vị trí của nhân tế bào thay đổi, nhân tập trung thành từng cụm với mật độ lớn, bào tương bị thoái hoá (Hình 9B, E). Ở chuột trên 6 tháng tuổi, sự hình thành các ổ viêm được quan sát trong các bó cơ (mũi tên màu xanh lá cây, Hình 9B). Trong khi đó, ở chuột dưới 6 tháng tuổi, sự xuất hiện mạch máu với mật độ dày hơn được quan sát (mũi tên màu xanh da 13 trời, hình 9E). Mật độ mạch máu tại lô chuột tiếp tục hiện diện khi nhuộm H&E mô cơ vào ngày thứ 28 (Hình 9F) mà không quan sát thấy ở chuột trên 6 tháng tuổi. 3.3. Mức độ tổn thương chi Sau ba giờ cắt mạch máu, chuột ở hai lô thí nghiệm diễn tiến tổn thương tăng dần theo thời gian (Hình 10A,B). Đến ngày 7 sau khi cắt mạch máu chi, ở lô chuột dưới 6 tháng tuổi (n=30), 70% chuột có dấu hiệu hoại tử chi với 20% tổn thương cấp độ I, 10% cấp độ II, 10% cấp độ III và cấp độ IV chiếm 30%. Trong khi đó, ở lô chuột trên 6 tháng tuổi (n=30), 100% chuột có dấu hiệu tổn thương ở các cấp độ khác khau. Tỷ lệ chuột tổn thương ở cấp độ III và IV chiếm 90% số chuột thí nghiệm, trong đó 50% chuột tổn thương ở cấp độ III; 40% chuột tổn thương ở cấp độ IV; chỉ 10% chuột tổn thương ở cấp độ I và không có con chuột nào tự phục hồi hoàn toàn chi. Hình 10. Sự hoại tử về hình thái chi sau khi gây tắc nghẽn mạch máu 4. Tế bào gốc có hiệu quả tích cực trong điều trị chuột tắc nghẽn mạch máu chi 4.1. Sự phù nề chi sau ghép tế bào Đánh giá sự phù nề chi ở ngày thứ ba cho thấy tỷ lệ khối lượng mô ướt/khô ở lô thiếu máu chi là 4,55 ± 0,11 (lần), và lô PBS là 4,59 ± 0,08 (lần) khác biệt đáng kể so với lô AD-MSC 3,66 ± 0,68 (lần); lô BM-MSC 14 là 3,90± 0,58 (lần) (p<0,05) và so với lô bình thường (3,37 ± 0,03 lần). Mặc dù vậy, độ phù nề của lô được ghép tế bào cao hơn đáng kể so với lô bình thường. Trong khi đó, không có sự khác biệt về độ phù nề giữa lô được ghép AD-MSC và BM-MSC. 4.2. Sự phục hồi cấu trúc mô Ở chuột bình thường, mỗi tế bào được sắp xếp có trật tự. Nhân tế bào (mũi tên màu vàng, hình 11) nằm sát màng bào tương với một hay nhiều nhân. Bào tương (mũi tên màu vàng, hình 11) bắt màu hồng đồng đều, nhân bắt màu đen tím. Trong khi đó, ngày thứ 3 sau cắt mạch máu, sự hoại tử mô xuất hiện tất cả các lô. Bào tương biến dạng hoặc thoái hoá, cấu trúc mô trở nên lỏng lẻo, nhân tế bào tập trung với mật độ cao thành từng cụm, tế bào chất phân mảnh. Đây là dấu hiệu cho thấy sự hoại tử chi đang diễn ra. Hình 11. Kết quả nhuộm H&E sau 3 ngày ghép tế bào Tuy nhiên, bên cạnh sự tổn thương tế bào, sự xuất hiện của mạch máu với mật độ dày hơn cũng được quan sát ở các vùng tổn thương ở chuột được ghép AD-MSC và BM-MSC (mũi tên màu xanh, Hình 11). Cấu trúc mạch máu với nhiều kích cỡ đan xen trong các vùng mô tổn thương. Điều này cho thấy, cơ thể đã có có những cơ chế kích hoạt quá trình ngăn ngừa và sửa chữa tổn thương bằng hoạt động kích thích tạo mạch máu nhằm 15 phục hồi lại nguồn cung cấp oxy và chất dinh dưỡng, bù đắp hoặc thay thế các mạch máu đã tổn thương. Sau 28 ngày, những chuột không bị tổn thương ở cấp độ IV đều cho thấy cấu trúc mô học tương đối tương đồng với chuột bình thường. Tuy nhiên, chuột được ghép tế bào có sự hiện diện của nhiều mạch máu hơn (mũi tên màu xanh, Hình 12) so với lô đối chứng (lô TMC và lô PBS). Kết quả trên cũng cho thấy việc ghép tế bào cho tác động kích thích sự tạo mạch máu mới tốt hơn so với chuột không ghép tế bào. Đồng thời, sự tạo mạch máu mới ở chuột được ghép AD-MSC tốt hơn so với chuột được ghép BM-MSC. Hình 12. Kết quả nhuộm H&E sau 28 ngày ghép tế bào. 4.3. Sự hình thành mạch máu mới Hình 13. Sự hình thành mạch máu mới của chi tắc nghẽn mạch máu Ở những con chuột tổn thương ở cấp 0, I và II, tại vị trí bắp chân xuất hiện nhiều mạch máu hơn (Hình 13). Sự hình thành mạch máu mới quan sát rõ vào giai đoạn 7 ngày sau ghép tế bào. Các mạch máu mới có 16 đường kính nhỏ, ngắn và được hình thành từ vị trí dưới hoặc xung quanh vùng bị cắt mạcTrong khi đó, tại vùng quanh vị trí mạch bị cắt, ở lô ADMSC và BM-MSC, giữa hai đầu nối hình thành một mạch máu mới với kích thước nhỏ hơn mạch máu trước khi cắt mạch nhưng lớn hơn so với mạch máu ở lô TMC và PBS. 4.4. Sự phục hồi lưu thông mạch máu Ở chuột bình thường, sau 62,44 ± 4,33 giây (n=3; lặp lại 3 lần) tiêm trypan blue vào tĩnh mạch đuôi, ở vùng đệm và đầu móng chi đều bắt màu xanh (Hình 14A) cho thấy máu đã lưu thông được đến toàn bộ chi sau. Trong khi đó, ở lô TMC, trong 6 ngày đầu, phần đệm chi không bắt màu xanh thuốc nhuộm so với chi đối diện không bị gây tắc nghẽn mạch (Hình 14B). Sau 14 ngày, lưu thông máu diễn tiến tốt hơn (Hình 14C) và sự lưu thông máu trở lại mức bình thường sau 28 ngày ghép tế bào (Hình 14D) thể hiện ở thời gian và độ bắt màu xanh thuốc của nhuộm đồng đều ở cả 2 chi tại vùng đệm. Tại thời điểm 28 ngày, thời gian thuốc nhuộm bắt màu xanh tại chi được ghép AD-MSC là 122,4 ± 6,77 giây (n=3; lặp lại 3 lần), có sự khác biệt đáng kể so với chuột được ghép BM-MSC là 130,9 ± 7,5 (n=3; lặp lại 3 lần) giây (p<0,05). Điều này cho thấy sự lưu thông máu ở chuột được ghép AD-MSC tốt hơn so với chuột được ghép BM-MSC. Tuy nhiên, sự lưu thông mạch ở chuột được ghép tế bào kém hơn so với chuột bình thường (p<0,05). Hình 14. Sự lưu thông máu tại chi tắc nghẽn sau ghép tế bào 17 4.5. Sự phục hồi độ bão hoà oxy trong máu Biểu đồ 2. Biểu đồ so sánh thay đổi SpO2 trong máu. Ngay sau khi cắt mạch, chỉ số SpO2 có sự giảm đáng kể (P<0,05). Ở tình trạng bình thường, giá trị SpO2 của chi chuột là 98,75% ± 0,07% (n=40). Trong khi đó, ngay sau khi cắt mạch, chỉ số này giảm xuống còn 88,90% ± 0,56% (n=40) (Biểu đồ 2A). Điều này cho thấy, việc cắt mạch máu đã làm giảm nghiêm trọng độ bão hoà oxy trong máu. Từ ngày thứ 9 sau ghép, ở lô AD-MSC và BM-MSC, sự phục hồi độ độ bão hoà oxy đạt trên 95%, lần lượt là 96,25% ± 1,71% và 96,59%±2,21% (n=10). Trong khi đó lô TMC và lô PBS, giá trị này đạt được từ ngày thứ 12. Sau 28 ngày, SpO2 ở cả chuột ghép tế bào và chuột không điều trị có sự phục hồi, đạt trên 98%. Giá trị này tương đương với giá trị SpO2 trước khi chuột được thí nghiệm (Biểu đồ 2 B). 4.6. Sự phục hồi hình thái chi chuột sau khi ghép tế bào Hình 15. Sự phục hồi hình thái chi chuột sau ghép tế bào 18