Tài liệu Nghiên cứu điều trị thực nghiệm thỏ bị khuyết hổng xương bằng san hô kết hợp tế bào gốc tủy xương tự thân

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HUỲNH DUY THẢO NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM THỎ BỊ KHUYẾT HỔNG XƯƠNG BẰNG SAN HÔ KẾT HỢP TẾ BÀO GỐC TỦY XƯƠNG TỰ THÂN Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh - Năm 2017 Công trình được hoàn thành tại: Phòng thí nghiệm Vật liệu Sinh học, Bộ môn Mô – Phôi – Di truyền, Trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.BS. Trần Công Toại (ghi rõ họ tên, chức danh khoa học, học vị) Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Anh Tuấn Phản biện 2: TS.BS. Trương Trí Hữu Phản biện 3: TS. Bùi Hồng Thủy Phản biện độc lập 1: TS. Bùi Hồng Thủy Phản biện độc lập 2: TS.BS. Phan Ngọc Tiến Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... vào lúc giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM - Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, nhu cầu sử dụng mô xương để ghép điều trị trong các trường hợp khuyết hổng hoặc các bệnh lý dẫn đến tổn thương xương là rất lớn. Các loại mô xương ghép tự thân, đồng loài và dị loài đã được sử dụng để đáp ứng nhu cầu ghép xương ngày càng gia tăng của người bệnh. Tuy nhiên, các loại mô xương ghép hiện tại chưa đáp ứng đủ nhu cầu của người bệnh, mặt khác, việc sử dụng các nguồn mô xương trên đều có những ưu, nhược điểm nhất định. Từ đó đặt ra nhu cầu cho các nhà nghiên cứu, các nhà lâm sàng làm thế nào để chế tạo ra một loại vật liệu có khả năng dùng để ghép thay mô xương. Do đó, đã có rất nhiều loại vật liệu ghép thay xương đã được nghiên cứu và phát triển, từ các loại vật liệu có nguồn gốc tự nhiên cho đến các loại vật liệu được tổng hợp nhân tạo. Các loại vật liệu này trước hết phải có tính tương hợp sinh học, phải có khả năng cảm ứng và kích ứng tạo xương, có độ bền cơ học để có thể đảm nhận được vai trò vật lý của mô xương và cuối cùng có thể thoái biến sinh học để chuyển hóa thành mô xương chủ. Tuy nhiên, điểm hạn chế của những loại vật liệu ghép xương hiện tại là chưa bổ sung các loại tế bào phù hợp để thúc đẩy và hỗ trợ cho quá trình tái tạo mô xương diễn ra nhanh và hiệu quả hơn. Vì vậy, những loại vật liệu dùng để ghép thay xương hiện tại đòi hỏi không những đáp ứng được các yêu cầu của vật liệu ghép thay xương truyền thống mà còn phải mang được các tế bào có khả tạo xương để thúc đẩy tiến trình lành xương nhanh và hiệu quả hơn. Một trong những loại vật liệu sinh học được sử dụng phổ biến trong ghép thay xương là là những hợp chất có canxi, một trong số đó là san hô biển. San hô có thành phần chủ yếu là canxi carbonate (98-99%), sau quá trình xử lý thì san hô chỉ chứa canxi carbonate với một ít chất khoáng đều là thành phần có chứa trong xương người, phù hợp với sự chuyển hóa và hấp thu của cơ thể nên được sử dụng làm vật liệu ghép thay xương khá phổ biến trong y học tái tạo. Ngoài ra, khung san hô còn có đặc tính phù hợp cho tế bào bám dính, tăng trưởng và phát triển trên khối san hô trong điều kiện nuôi cấy do đó có thể tạo ra được các mảnh ghép thay xương theo xu hướng kỹ nghệ mô hiện đại của thế giới. Mảnh ghép được tạo ra không chỉ đáp ứng được các tiêu chuẩn cơ bản của vật liệu ghép thay xương mà còn mang các tế bào phù hợp có khả năng tạo xương để giúp quá trình lành xương xảy ra nhanh hơn. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu: “Nghiên cứu điều trị thực nghiệm thỏ bị khuyết hổng xương bằng san hô kết hợp tế bào gốc tủy xương tự thân”. Mục đích nghiên cứu của luận án là sử dụng san hô làm khung xương để mang các tế bào gốc tự thân được thu nhận từ tủy xương để tạo ra những mảnh ghép thay xương dùng để ghép điều trị cho những trường hợp khuyết xương trên mô hình thỏ. Kết quả mà nghiên cứu này mang lại có thể tạo ra các mảnh ghép thay xương hiệu quả hơn các loại vật liệu ghép xương truyền thống, phục vụ nhu cầu ghép xương ngày càng gia tăng của người bệnh. 1 ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đây là một nghiên cứu cơ bản có triển khai ứng dụng trên mô hình động vật nhằm đánh giá tiềm năng của mảnh ghép được tạo ra từ khung san hô và tế bào gốc thu nhận từ tủy xương để tái tạo các khuyết hổng xương. - Nghiên cứu sử dụng san hô làm khung xương để mang các tế bào gốc tự thân được thu nhận từ tủy xương để tạo ra vật liệu ghép thay xương là một hướng nghiên cứu rất mới ở Việt Nam. - Vật liệu thay xương có mang các yếu tố cần thiết của kỹ nghệ mô gồm tế bào, giá thể và các yếu tố sinh học đó là tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương, khung san hô làm giá thể và các yếu tố sinh học trong môi trường nuôi cấy để tạo mảnh ghép. - Luận án này đã thiết lập được quy trình từ khâu thu nhận, tạo mảnh ghép và đánh giá mảnh ghép trong điều kiện in vitro và thực hiện đánh giá tiềm năng của mảnh ghép trong điều kiện in vivo trên phần thân xương đùi của thỏ. - Mảnh ghép được tạo ra dựa trên công nghệ vật liệu và công nghệ tế bào gốc thật sự cho thấy có hiệu quả để tái tạo các trường hợp khuyết hổng xương, giúp quá trình liền xương xảy ra nhanh hơn và chất lượng liền xương tốt hơn khi so sánh với mẫu đối chứng. - Đây thực sự là một hướng nghiên cứu rất mới và luận án đã góp phần tiệm cận với lĩnh vực kỹ nghệ mô hiện đã rất phát triển và đạt được nhiều thành tựu to lớn. BỐ CỤC LUẬN ÁN Luận án gồm 121 trang không kể phần tài liệu tham khảo, có bố cục như sau: - Đặt vấn đề: 3 trang - Chương 1: Tổng quan tài liệu: 32 trang - Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 13 trang - Chương 3: Kết quả và bàn luận: 61 trang - Chương 4: Kết luận: 2 trang - Kiến nghị: 1 trang - Tài liệu tham khảo: 18 trang - Gồm 12 bảng; 34 hình và 03 biểu đồ. 2 NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. KỸ NGHỆ MÔ Kỹ nghệ mô là một lĩnh vực đa ngành, ứng dụng các công cụ kỹ thuật kết hợp y sinh học và khoa học kỹ nghệ để sử dụng các tế bào sống hoặc thu hút các tế bào nội sinh nhằm hỗ trợ sự hình thành hoặc tái tạo mô để hồi phục, duy trì hoặc cải thiện chức năng của mô, đã được áp dụng để sửa chữa, tái tạo các tổn thương ở nhiều loại cơ quan khác nhau như mô xương, gan, tụy … và mạch máu. Riêng đối với kỹ nghệ mô xương nhằm nghiên cứu để tạo ra các loại mô xương kỹ nghệ dùng để thay thế mô xương. Một trong những lợi ích quan trọng nhất của công nghệ này là có thể sử dụng chính tế bào tự thân của người bệnh để tạo ra các mảnh ghép cho chính họ, các mảnh ghép thay thế này có thể dễ dàng vượt qua rào cản miễn dịch ghép của cơ thể. So với việc sử dụng mô ghép tự thân, mô kỹ nghệ sử dụng một lượng tế bào hiến ít hơn (vì số tế bào thu nhận được sẽ được làm tăng số lượng tế bào thông qua việc nhân khối in vitro) và làm giảm tổn thương cho người bệnh khi phải phẫu thuật thu nhận mô xương tự thân để ghép vào các khuyết hổng hoặc tổn thương xương dẫn đến mất xương. Các thành phần cơ bản để tạo ra mảnh ghép thay xương dựa trên nền tảng kỹ nghệ mô gồm có 3 yếu tố cơ bản là tế bào tạo xương, giá thể (khung xương) và các yếu tố hoạt hóa sinh học để hỗ trợ quá trình tạo xương. 1.2. NGUỒN TẾ BÀO SỬ DỤNG TRONG KỸ NGHỆ MÔ XƯƠNG Trong kỹ nghệ mô, nguồn tế bào có khả năng phát triển là một yếu tố rất quan trọng. Nguồn tế bào đầu tiên được sử dụng là tế bào từ chính người bệnh (ghép tự thân). Hiện tại, ghép mô tự thân vẫn được xem là một tiêu chuẩn vàng trong chữa trị. Mô được lấy trực tiếp từ người bệnh, nhân khối, tái cấu trúc in vitro và sau đó là ghép lại cho chính người bệnh. Các tế bào tiền thân tạo xương thường được sử dụng trong kỹ nghệ mô xương do chúng có khả năng tăng trưởng, có tiềm năng biệt hóa để tạo ra các tế bào tạo xương tương đối dễ dàng hơn so với các dòng tế bào khác. Tuy nhiên, chúng cũng cần phải được kích thích để biệt hóa thành các tế bào tạo xương, tổng hợp nên các protein ngoại bào và tạo thành khung ngoại bào của mô xương. Tủy xương là một nguồn mẫu lý tưởng để cung cấp các tế bào gốc (TBG) và tế bào tiền thân của các tế bào tạo xương, việc phân lập, nuôi cấy và biệt hóa những tế bào này sẽ được sử dụng cho kỹ nghệ mô xương trong luận án này. 1.2.1. Tế bào gốc trung mô Hiện nay, TBG được xem là nguồn tế bào vô tận. Chúng có thể được thu nhận từ phôi, bào thai và mô trưởng thành. Ngược lại với những tế bào từ cơ thể trưởng thành, TBG có khả năng tăng sinh không giới hạn nên có thể được sử dụng trong các liệu pháp điều trị. Ngoài ra, các tế bào này còn có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau của cơ thể khi cảm ứng trong điều kiện nuôi cấy thích hợp. Trong giai đoạn 3 lá phôi, lớp trung bì phôi được tạo thành giữa lớp ngoại bì và nội bì phôi. Lớp tế bào của phần trung bì có chứa các tế bào được cho là các TBG trung mô. Các TBG này là quần thể tế bào gốc đa tiềm năng còn tồn tại sau khi sinh. 1.2.2. Nguồn gốc xác định tế bào gốc trung mô Vào những năm 1970, nhóm nghiên cứu của Friedenstein nhận thấy khi nuôi cấy dịch tủy xương ở động vật, trong đĩa nuôi xuất hiện các cụm tế bào có hình thái giống nguyên bào sợi, khi đó tác giả gọi là đơn vị tạo cụm nguyên bào sợi (Fibroblastic-Colony Forming Units - CFU). Trong điều kiện in vitro, các tế bào này hiện diện thành các cụm tế bào lớn, nhân khối rất nhanh từ sự phân chia của từng tế bào đơn lẻ. Một số nhóm nghiên cứu đã chứng minh tính đa tiềm năng của những tế bào này trong điều kiện in vitro. 3 1.2.3. Nguồn thu nhận tế bào gốc trung mô TBG trung mô có thể thu nhận từ nhiều nguồn mô khác nhau của phôi thai cho đến cơ thể trưởng thành. Tuy nhiên, hiện tại các nhà nghiên cứu tập trung nhiều hơn ở các loại mô có nguồn gốc từ cơ thể trưởng thành vì các điểm nổi bật mà các mô này mang lại như dễ thu nhận, vượt qua rào cản y đức cũng như có thể dễ dàng để ghép tự thân lại cho người bệnh. Có thể thu nhận được quần thể tế bào TBG trung mô trong các mô khác nhau trong cơ thể người trưởng thành. Tuy nhiên, TBG trung mô lần đầu tiên được thu nhận ở tủy xương. 1.2.4. Phân lập và duy trì tế bào gốc trung mô TBG trung mô thường được phân lập từ tủy xương ở xương mào chậu của người. Nhiều nghiên cứu cũng đã được tiến hành để thiết lập quy trình thu nhận TBG trung mô từ tủy xương người trưởng thành và nhân khối in vitro quần thể tế bào này. Khả năng tăng trưởng và duy trì tiềm năng biệt hóa của TBG trung mô phụ thuộc vào nhiều yếu tố như là nguồn mô thu nhận, kỹ thuật nuôi cấy, hóa chất sử dụng …. Trong đó, đặc biệt là việc lựa chọn loại huyết thanh phù hợp để bổ sung vào môi trường nuôi tế bào. Ngoài ra, việc nhân khối các TBG trung mô trong thời gian dài là cần thiết để có thể sử dụng một lượng lớn các TBG trung mô trong y học tái tạo vì số lượng các TBG trung mô trong tủy xương rất thấp. 1.2.5. Đặc điểm định danh tế bào gốc trung mô Hội liệu pháp Tế bào Quốc Tế (International Society for Cellular Therapy – ISCT) đưa ra các tiêu chí để sử dụng cho việc định danh các quần thể tế bào TBG trung mô. Theo đó:  Thứ nhất, đó là các tế bào có khả bám dính vào chai nuôi khi tiến hành nuôi cấy trong điều kiện in vitro.  Thứ hai, chúng không biểu hiện các marker của các tế bào tạo máu như CD11b, CD14, CD34, CD45, Blymphocyte antigens CD19 và CD79a và HLA-DR nhưng biểu hiện được các marker như CD73, CD90 và CD105 (endoglin).  Thứ ba, chúng có khả năng biệt hóa thành các tế bào của dòng trung mô như là tế bào sụn, tế bào mỡ và tế bào xương trong điều kiện in vitro. 1.2.6. Biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành nguyên bào xương Quá trình biệt hóa của TBG trung mô thành nguyên bào xương được thể hiện qua bốn giai đoạn chính: (1) tế bào gốc trung mô, (2) tế bào tiền thân tạo xương, (3) tiền nguyên bào xương, (4) nguyên bào xương và cuối cùng là các nguyên bào xương phát triển thành các tế bào xương trưởng thành. Việc cảm ứng các TBG trung mô với môi trường tạo xương bao gồm β-glycerophosphate, ascorbic-2-phosphate, dexamethasone và huyết thanh thai bò gây ra một chuỗi các tác động phân tử bao gồm hoạt hóa các con đường truyền tín hiệu và biểu hiện các marker tạo xương bao gồm alkaline phosphatase (AP), osteopontin, osteocalcin and Cbfa1. 1.3. GIÁ THỂ Đối với kỹ nghệ mô thì giá thể được sử dụng cần phải thỏa mãn một số tiêu chí. Đầu tiên, giá thể cần phải hỗ trợ cho sự tăng trưởng của tế bào, do đó bề mặt giá thể cần phải có tính tương hợp sinh học để cho phép tế bào bám dính. Giá thể cũng cần phải có độ xốp để cung cấp chất dinh dưỡng và cho tế bào phát triển bên trong giá thể và phân bố khắp giá thể. Khi được cấy ghép, một giá thể xốp sẽ phù hợp cho sự tạo mạch một cách nhanh chóng và vật liệu cần phải được thoái biến cùng lúc với tiến trình tái tạo của mô chủ. Ngoài ra, đối với mô xương thì vật liệu cần phải có một độ bền cơ học nhất định để phù hợp với chức năng của mô cần cấy ghép. Vai trò của giá thể chính là những cấu trúc ba chiều, có thể được sử dụng để kiểm soát sự biệt hóa, tăng trưởng và di chuyển của tế bào. Giá thể cũng hoạt động như một cấu trúc hỗ trợ lực tạm thời. Ngoài ra, giá thể có thể được sử dụng như “giàn giáo” thay thế cho chức năng của chất nền ngoại bào và cần phải thỏa mãn các tiêu chí đặc hiệu cho từng loại mô. 4 1.4. CÁC YẾU TỐ HOẠT HÓA SINH HỌC Các thành phần cảm ứng tạo xương được sử dụng trong kỹ nghệ mô là các hoạt chất sử dụng cho các tế bào tiền thân và TBG. Những thành phần này bao gồm các yếu tố tăng trưởng như là yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi, yếu tố tăng trưởng insulin, yếu tố tăng trưởng từ tiểu cầu và các protein hình thái xương... Đặc biệt đối với các protein hình thái xương đã được sử dụng rất nhiều để kết hợp với giá thể hydroyapatite để gia tăng hiệu quả sửa chữa khuyết hỗng xương trên chuột khi so sánh với trường hợp chỉ sử dụng hydroyapatite. 1.5. SỬ DỤNG SAN HÔ LÀM VẬT LIỆU GHÉP THAY XƯƠNG San hô tự nhiên sau khi được xử lý loại bỏ các thành phần hữu cơ (xác polyp) thì chỉ còn chứa calci carbonate với một ít chất khoáng khác đều là thành phần có chứa trong xương người. Vì thế các thành phần này có thể được hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể người. Do đó, đây là một vật liệu phù hợp để chế tạo thành vật liệu ghép thay xương. Trong trường hợp ổ khiếm khuyết xương có hình dạng phức tạp gây ra sau chấn thương hay phẫu thuật, việc tìm một mảnh ghép có hình dạng tương tự thường gặp nhiều khó khăn. Hơn nữa, nếu mảnh ghép không được cố định chặt, để lại những khoảng trống giữa mô ghép và xương chủ thì có nguy cơ các mảnh mô vụn xung quanh lọt vào khoảng trống đó sẽ làm chậm quá trình liền xương, thậm chí gây ra thải ghép hay nhiễm trùng sau này. Tuy nhiên, san hô biển là loại vật liệu có thể tạo hình mảnh ghép theo các khuyết hỗng mô xương tương đối dễ dàng, do đó sẽ khắc phục được những khó khăn do hình dạng mô ghép gây ra để nâng cao hiệu quả của mảnh ghép cũng như quá trình phẫu thuật và giữ ổn định mảnh ghép san hô cũng không quá khó khăn khi thực hiện. Nguyên tắc xử lý, chế tạo san hô thành vật liệu ghép thay xương Chế phẩm san hô tự nhiên đã được chứng minh là ứng dụng có hiệu quả trong nhiều lĩnh vực lâm sàng như Cột sống, Chi, Sọ-Mặt, Nha; Tai-Mũi-Họng, Mắt … Về nguyên tắc quy trình xử lý san hô tự nhiên tương đối dễ thực hiện, chủ yếu bao gồm việc loại bỏ các polyp chứa phần lớn thành phần hữu cơ của san hô. Một số tác giả nghiên cứu người Pháp sử dụng sóng siêu âm để xử lý san hô Porites. Các tác giả này cũng cho rằng việc phơi nắng các mảnh san hô cũng có thể phá hủy được các polyp. Một số tác giả người Bulgari mô tả việc phá hủy polyp bằng dung dịch hypochlorite, chiết rút chất hữu cơ bằng nước khử khoáng, sấy khô ở 900C rồi sau cùng hấp cao áp ở 1300C. Ngoài ra, quy trình đưa ra phải thỏa mãn nhiều tiêu chí. Trước hết, các công đoạn xử lý san hô phải đảm bảo tiêu chí không phá hủy cấu trúc xốp tự nhiên của san hô. Các kỹ thuật áp dụng trong phạm vi khả thi của điều kiện trong nước và không làm tăng cao quá mức giá thành sản phẩm. Tiếp theo, quy trình phải loại trừ được các thành phần của vật liệu gây ra những tác động có hại trong cơ thể vật chủ, chủ yếu bao gồm các xác polyp. Chế phẩm san hô phải được khử trùng theo các tiêu chuẩn áp dụng cho vật liệu ghép. San hô thường được tiệt trùng chủ yếu bằng hơi nước hoặc tia gamma và trong một số trường hợp bằng khí ethylene oxide. Trước khi khử trùng, mẫu san hô thường được làm sạch các thành phần hữu cơ bằng cách ngâm trong dung dịch 5% sodium hypochlorite trong 30 phút sau đó làm khô bằng cách xử lý nhiệt hoặc xử lý bằng cách sử dụng sóng siêu âm. Sau cùng, chế phẩm san hô phải được đóng gói trong bao bì phù hợp và phải được xác định được các thông số vật lý và hóa học. 1.6. MÔ HÌNH ĐỘNG VẬT TRONG ĐÁNH GIÁ VẬT LIỆU GHÉP THAY XƯƠNG Thỏ là một trong những loài động vật thường được sử dụng cho nhiều nghiên cứu y học, được sử dụng trong khoảng 35% các nghiên cứu liên quan về xương khớp. Đó là do thỏ có những thuận lợi nhất định trong việc xử lý và thao tác cũng như kích thước cơ thể thuận tiện cho việc phẫu thuật và chăm sóc. Ngoài ra, cơ thể thỏ đạt đến sự trưởng thành của mô xương trong thời gian ngắn sau khi thành thục sinh dục vào khoảng 6 tháng tuổi điều này rất phù hợp để triển khai các nghiên cứu liên quan về xương khớp do không phải chờ đợi lâu để thu thập kết quả. 5 1.7. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUÁ TRÌNH LÀNH XƯƠNG Xương tồn tại trong nhiều hình dạng và kích cỡ khác nhau, hiện tại chưa có tiêu chuẩn nào được thiết lập để đánh giá quá trình lành xương. Do đó, chỉ có một số kỹ thuật chung để đánh giá quá trình lành xương phụ thuộc vào mảnh ghép và mô hình động vật sử dụng để chúng ta có thể lựa chọn. 1.7.1. Dựa trên hình ảnh X-Quang Vì có rất ít thông tin khoa học có giá trị về sự phát triển của quá trình sửa chữa xương trên cơ sở bằng chứng về hình ảnh học (trên phim X-quang), do đó đánh giá về hình ảnh trên phim X-quang của quá trình sửa chữa xương phụ thuộc phần lớn vào kinh nghiệm của người thực hiện kỹ thuật chụp phim X-quang. Tuy nhiên, một số đặc điểm đặc trưng của quá trình sửa chữa xương (gãy xương hở, mô sợi hóa mép xương, hoạt động quá mức của màng xương, sự xuất hiện của mô sẹo, mật độ mô sẹo, sự tu sửa xương, bắc cầu xương …) có thể được quan sát một cách rõ ràng trên phim X-quang và một số điểm đặc trưng này có thể định lượng được. Ngoài ra, thước đo trên phim Xquang có thể sử dụng như là công cụ khách quan để đánh giá quá trình sửa chữa xương. 1.7.2. Dựa trên hình thái mô xương Các thông số về các tiêu chí của mô xương có thể được quan sát và định lượng thông qua các tiêu bản mô học. Một vấn đề khá quan trọng phát sinh trong phân tích định lượng các mẫu mô học là làm thế nào để lấy mẫu một cách chính xác (do mẫu mô không đồng nhất) để có được một tập hợp các phép đo diện tích có ý nghĩa về mặt thống kê phản ánh những thay đổi về các đặc điểm cơ sinh học và hình ảnh học của mô xương và cần phải bảo quản mẫu để có thể thực hiện lại thí nghiệm nhiều lần. Tóm lại, sự lựa chọn một mô hình thử nghiệm trên động vật phù hợp là điều kiện tiên quyết để có được một kết quả nghiên cứu hoàn chỉnh và có thể triển khai trên lâm sàng. Đánh giá một cách đầy đủ các số liệu, các phân tích cụ thể trên các mô hình động vật trước khi thực nghiệm là một bước khởi đầu rất quan trọng. Những khía cạnh về y đức cũng phải được xem xét và các mô hình động vật dễ bị nhiễm bệnh, truyền bệnh và phẫu thuật ít gây đau đớn cho các động vật thí nghiệm nên được ưu tiên lựa chọn. Các thử nghiệm ban đầu phải được thực hiện trên một vài loài động vật nhỏ để đánh giá tính khả thi của phương pháp thử nghiệm và kết quả có tính lặp lại trước khi triển khai trên các mô hình động vật lớn hơn. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU + Tủy xương được thu nhận từ xương mào chậu của người hiến ở Khoa Chấn Thương Chỉnh Hình, Bệnh viện Chợ Rẫy và Bệnh viện Chấn thương Chỉnh hình. + Thỏ nâu (Việt Nam) + San hô (Loài Porites Lutea) được xử lý thành mảnh ghép thay xương tại Phòng thí nghiệm Vật liệu Sinh học, Bộ môn Mô – Phôi, Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch. TIÊU CHUẨN CHỌN MẪU: Mẫu tủy xương người: + Người cho mẫu có các xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV và VDRL. + Người cho mẫu đồng ý cho mẫu tủy xương để thực hiện nghiên cứu (có giấy xác nhận đi kèm đồng ý cho tiến hành nghiên cứu). + Mẫu được thu nhận trong điều kiện phòng mổ của bệnh viện. Thỏ nâu: + Được cung cấp từ các trang trại, thỏ được chọn là các thỏ đực. + Thỏ được chọn là những thỏ khỏe mạnh, trọng lượng trung bình từ 2,00 – 2,5 kg. + Tuổi của thỏ được chọn là khoảng 6 tháng tuổi. 6 Mẫu san hô: + San hô được cung cấp từ Viện Hải Dương Học Nha Trang. + Được xử lý theo quy trình vật liệu ghép tại Phòng thí nghiệm Vật liệu Sinh học, Bộ môn Mô – Phôi, Trường ĐHYK Phạm Ngọc Thạch. + Được xử lý vô trùng, đóng gói và bảo quản ở nhiệt độ phòng. 2.2. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp thực nghiệm – mô tả. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phân lập, nuôi cấy và định danh tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương người 2.3.1.1. Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương người Thu nhận khoảng 02 ml tủy xương người trong tube đã chứa sẵn 300µl heparin để chống đông. Tế bào gốc được tách bằng phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng với dung dịch Ficoll-Paque (Amersham, Germany). Đánh giá mật độ tế bào thu nhận với buồng đếm Neubauer. Mật độ tế bào đem đi nuôi nằm trong khoảng từ 105 – 106 tế bào/ml. Sau đó, tế bào phân lập được nuôi trong môi trường gồm DMEM/F12, 10% FBS, Pen-Strep. Tế bào được nuôi trong tủ ấm ở 370C, 5% CO2. Môi trường được thay mới mỗi 3 lần/ngày. 2.3.1.2. Định danh tế bào gốc trung mô từ tủy xương người. Trong nghiên cứu này, áp dụng theo tiêu chí của ISCT để định danh các tế bào gốc trung mô. Tiêu chí này đánh giá dựa vào 3 đặc tính của tế bào, đó là khả năng bám dính của tế bào vào đáy chai nuôi, khả năng biệt hóa in vitro (biệt hóa thành tế bào xương, tế bào sụn, tế bào mỡ) và khả năng biểu hiện các marker bề mặt (đặc biệt là các marker CD73, CD90, CD105). 2.3.1.3. Đánh giá tính toàn vẹn của tế bào qua nhiễm sắc thể đồ Tế bào được cấy chuyền đến lần thứ ba sẽ sử dụng để thực hiện bộ nhiễm sắc thể đồ nhằm mục đích đánh giá tính toàn vẹn của nhiễm sắc thể của TBG trung mô qua quá trình nuôi cấy in vitro. Cả hai loại tế bào là TBG trung mô và nguyên bào xương (được biệt hóa từ các TBG trung mô) sẽ được thực hiện bộ nhiễm sắc thể đồ để đánh giá . Nhiễm sắc thể được đánh giá theo tiêu chí của ISCN (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature). 2.3.2. Tạo mảnh ghép thay xương từ sự kết hợp của tế bào gốc trung mô và khung san hô Hiện tại để tạo mảnh ghép có sự kết hợp giữa giá thể và tế bào có thể sử dụng phương pháp chuyển tế bào lên giá thể một cách trực tiếp hoặc gián tiếp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chuyển tế bào lên khung san hô theo phương pháp gián tiếp để tạo mảnh ghép, dựa vào phương pháp quay ly tâm để đưa tế bào lên khung san hô. Đây là một trong những phương pháp khá phổ biến, được nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới sử dụng để tạo mảnh ghép. Sử dụng phương pháp này tế bào có thể được chuyển lên khung san hô một cách đồng đều, tế bào được phân tán đều trong khung san hô và điều này giúp cho tế bào phát triển hiệu quả để tạo mảnh ghép. 2.3.3. Ghép mảnh ghép san hô mang nguyên bào xương trong trường hợp khuyết xương ở thỏ Đối với mục tiêu này, chúng tôi cũng tiến hành lặp lại các quy trình thực hiện giống như trong trường hợp của tủy xương người. Chúng tôi sẽ thu nhận tủy xương thỏ, sau đó tiến hành nuôi cấy và định danh TBG trung mô. Tiếp theo sẽ tạo mảnh ghép bằng sự kết hợp giữa khung san hô và TBG trung mô. Mảnh ghép này sau đó sẽ được ghép vào thân xương đùi của thỏ. Đây là một giai đoạn nghiên cứu không thể bỏ qua theo các tiêu chuẩn trong nước cũng như quốc tế đối với các mảnh ghép khi tiến hành thực nghiệm trên người phải thực hiện những nghiên cứu, đánh giá hiệu quả trên mô hình động vật trước khi triển khai thực hiện trên lâm sàng cho người. 7 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU  Đây là đề tài nghiên cứu cơ bản có triển khai thực nghiệm trên động vật. Chúng tôi luôn tuân thủ các yêu cầu về đảm bảo đạo đức trong nghiên cứu.  Mặc dù trong luận án có sử dụng tủy xương người để thực hiện một số nghiên cứu nhưng những người hiến tủy xương là những đối tượng hoàn toàn tỉnh táo về nhận thức, người hiến đã được giải thích rõ ràng về mục đích hiến tủy xương để thực hiện các thí nghiên cứu chỉ dừng lại trong phòng thí nghiệm, người hiến tủy xương cũng được giải thích rõ ràng và nhận thức được những lợi ích mà nghiên cứu này mang lại cũng như những rủi ro có thể xảy. Tủy xương cũng được thu nhận trong quá trình điều trị nên cũng không cần phải thực hiện thêm những thủ thuật để thu nhận tủy xương này.  Người hiến hoàn toàn tình nguyện tham gia nghiên cứu và đồng ý ký giấy cam kết tham gia vào chương trình nghiên cứu cũng như có quyền rút khỏi nghiên cứu bất cứ lúc nào. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ ĐỊNH DANH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TỦY XƯƠNG NGƯỜI 3.1.1. Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương người Trong quá trình thực hiện, đã tiến hành thu nhận được 14 mẫu tủy xương người để tiến hành xây dựng các quy trình chuẩn để phân lập và nhân khối tế bào gốc từ tủy xương người, trong đó có 11 mẫu nam và 03 mẫu nữ. Độ tuổi trung bình của người tham gia nghiên cứu khoảng 33,50 tuổi (tuổi từ 24 - 58). Kết quả phân lập tế bào đơn nhân trung bình trong mỗi ml dịch tủy là 31,00  12,83 (× 106 ) tế bào/ml. Nồng độ tế bào có nhân biến thiên rất lớn từ 10 – 160 × 106 tế bào/ml dịch tủy xương. Mặc dù thể tích dịch tủy xương thu nhận để phân lập tế bào đơn nhân là tương đối thấp (trung bình là 2,00 ml dịch tủy xương) nhưng mật độ tế bào đơn nhân thu nhận được cũng khá cao. Mật độ tế bào đơn nhân rất có ý nghĩa trong quá trình nuôi cấy và nhân khối vì nếu thu được càng nhiều tế bào đơn nhân thì cơ hội phân lập được TBG trung mô càng cao. Kết quả nuôi cấy và nhân khối sẽ đạt kết quả tốt hơn. Hơn nữa, mật độ tế bào đơn nhân thu được cũng có liên quan mật thiết với số CFU-Fs thu được trong quá trình nuôi cấy. Số CFU-Fs trung bình là 87,00  11,30 (CFU-Fs). Kết quả đánh giá chỉ số CFU-Fs này cũng tương đối cao. 3.1.2. Kết quả nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ tủy xương người Sau 1 ngày nuôi cấy, trong chai nuôi bắt đầu xuất hiện các tế bào đơn lẻ, nằm rải rác, có dạng hình thoi, thon dài giống với hình thái nguyên bào sợi. Sau 3 ngày nuôi cấy, bắt đầu xuất hiện những cụm tế bào có đặc tính bám dính vào đáy chai nuôi. Các cụm tế bào này phát triển từ các tế bào đơn lẻ bám dính vào chai nuôi trước đó. Những tế bào này vẫn duy trì đặc điểm hình thái giống với tế bào gốc trung mô như hình thoi, thon dài, tăng trưởng và phát triển mạnh. A B C Hình 3.1. Kết quả nuôi cấy tế bào từ tủy xương người. (A). Tế bào sau 3 ngày nuôi cấy (×10). (B). Tế bào sau 5 ngày nuôi cấy (×10). (C). Tế bào sau 1 tuần nuôi cấy, tế bào từ các cụm tăng trưởng mạnh và lan tỏa đều ra xung 8 quanh, tế bào bám dính chiếm 65 - 75% diện tích chai nuôi, tại thời điểm này chúng ta có thể tiến hành cấy chuyền để nhân khối tế bào qua các chai nuôi mới (×10). Theo như quy trình mà chúng tôi đã thiết lập, thì trong vòng 7 - 14 ngày thì có thể cấy chuyền để nhân khối tế bào nhằm gia tăng số lượng tế bào đủ để thực hiện cho các nghiên cứu tiếp theo. Trong quá trình nuôi cấy và nhân khối in vitro, tiến hành xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào để theo dõi khả năng tăng trưởng cũng như xác định đỉnh tăng trưởng của tế bào, dựa vào đường cong tăng trưởng này, chúng ta có thể chủ động thiết lập quá trình nuôi cấy, nhân khối cho phù hợp. Ngoài ra, đây cũng là một thí nghiệm quan trọng, gián tiếp đánh giá sự biến đổi của tế bào có xảy ra các bất thường hay không? Vì đường cong chuẩn của một tế bào luôn luôn đi qua các chu kỳ như khởi đầu, tăng trưởng, đạt đỉnh, ổn định và suy tàn. Một dòng tế bào bình thường luôn luôn trãi qua các giai đoạn này. Nếu như đường cong tăng trưởng của tế bào cho thấy các dấu hiệu bất thường như chủ yếu là giai đoạn tăng trưởng liên tục mà không có dấu hiệu suy tàn hoặc đường cong tăng trưởng khá ngắn … điều này giúp nhà nghiên cứu có thể nhận định các bất thường xảy ra đối với dòng tế bào của mình. Đồ thị 3.1. Đường cong tăng trưởng tế bào (F3) được xây dựng theo mật độ tế bào. Như vậy, quần thể tế bào nuôi cấy cho thấy tăng trưởng theo quy luật bình thường của một đường cong tăng trưởng. Tế bào trong quá trình nuôi cấy in vitro đã trải qua các giai đoạn như khởi đầu, tăng trưởng, đạt đỉnh, ổn định và suy tàn. Với đường cong tăng trưởng này cho thấy tế bào nuôi cấy không phải là những tế bào có khả năng tăng trưởng vô hạn, cũng như chưa thấy các dấu hiệu bất thường theo quy luật phát triển của một dòng tế bào thông thường. 3.1.3. Kết quả định danh tế bào gốc trung mô Để định danh tế bào đang nuôi cấy có phải là TBG trung mô hay không? Chúng tôi sử dụng theo tiêu chí quốc tế (ISCT, 2006), theo tiêu chuẩn đánh giá này thì một tế bào gốc được xem như là TBG trung mô thì phải thỏa mãn ba tiêu chí sau: Dựa vào các tiêu chí trên, chúng tôi định danh tế bào nuôi cấy từ tủy xương người như sau: Thứ nhất, dựa vào khả năng bám dính của tế bào: Trong quá trình theo dõi nuôi cấy, chúng tôi nhận thấy các tế bào phát triển trong chai nuôi có hình thái giống với hình dạng của nguyên bào sợi. Đó là những tế bào có dạng hình thoi, thon dài hoặc bầu dục. Sau 7 ngày nuôi cấy, trong chai nuôi xuất hiện các tế bào bám dính vào bề mặt chai nuôi (Hình 3.2). 9 A B C D Hình 3.2. Hình thái tế bào trong quá trình nuôi cấy in vitro. (A). Tế bào sau 7 ngày nuôi cấy được chụp dưới kính hiển vi đảo ngược (×10), tế bào khá đồng nhất, hình dạng thon dài, bào tương phân nhánh và bám vào đáy chai nuôi. (B). Tế bào sau 7 ngày nuôi cấy (×20) được nhuộm với thuốc nhuộm Giemsa và chụp hình dưới kính hiển vi đảo ngược, kết quả quan sát cho thấy tế bào khá đồng nhất về hình dạng và kích thước. (C). Tế bào quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược tương phản pha (×10) và (D) quan sát ở vật kính (×20), cho thấy đây là các tế bào bám dính vào đáy chai nuôi cấy, hình thái đặc trưng của dòng tế bào có nguồn gốc từ phần trung mô. Dựa vào hình thái tế bào cho thấy các tế bào thu nhận từ tủy xương có hình thái thon dài, bầu dục giống với hình dạng giống với hình thái của nguyên bào sợi, có đặc điểm bám dính vào đáy chai nuôi cấy. Thứ hai, dựa vào khả năng biểu hiện marker bề mặt Khung CD panel để khảo sát marker của quần thể tế bào đang nuôi cấy gồm các marker sau: CD14, CD45, HLA-DR (nhóm các marker âm tính) và CD73, CD90, CD105 (đây được xem là nhóm các marker dương tính) (Bảng 3.7). Bảng 3.1. Khung CD Panel và kết quả phân tích Flow Cytometry. Marker Phần trăm (%) dương tính, n = 5 bề mặt Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 CD19      CD34      CD45      CD73 98,5 99,0 99,5 99,9 99,8 CD90 98,5 99,0 99,5 99,9 99,9 CD105 97,0 96,0 97,0 98,5 99,5 HLA-DR 1,8     Giá trị trung bình (%)    99,3 99,4 97,6 0,4 Ghi chú: () không biểu hiện (âm tính). Có tất cả 3 mẫu tế bào độc lập được thực hiện Flow Cytometry. Kết quả chạy Flow Cytometry cho thấy quần thể tế bào mà chúng tôi nuôi cấy không biểu hiện các phân tử marker bề mặt là CD14, CD45 và HLA-DR. Bên cạnh đó, các tế bào này lại biểu hiện rất mạnh 3 marker là CD73, CD90 và CD105 dương tính với phần trăm rất cao ( 95%). Theo tiêu chí của ISCT nếu một marker dương tính > 95% thì được xem như là marker này dương tính (Bảng 3.1). Đây được xem là 3 marker đặc hiệu dùng để xác định TBG trung mô được nhiều tác giả trên thế giới chấp nhận và sử dụng để phân lập TBG trung mô từ nhiều nguồn mô khác nhau như tủy xương, mô mỡ, máu cuống rốn … 10 Với kết quả khảo sát Flow Cytometry và theo tiêu chí của ISCT thì quần thể tế bào đang nghiên cứu thỏa mãn tiêu chí đề ra với sự biểu hiện các marker phù hợp cho dòng TBG trung mô, đặc biệt là đối với sự biểu hiện của 3 marker CD73, CD90 và CD105. Thứ ba, dựa vào khả năng biệt hóa của tế bào Mẫu tế bào sẽ tiến hành biệt hóa lần lượt thành tế bào mỡ, nguyên bào xương và nguyên bào sụn. Sau khi biệt hóa các tế bào gốc thu được từ tủy xương thành các dòng tế bào khác, các tế bào sẽ được đánh giá bằng cách sử dụng các phương pháp theo tiêu chí của ISCT là sử dụng các phương pháp nhuộm để đánh giá kết quả biệt hóa của tế bào thành tế bào mỡ, tế bào xương cũng như tế bào sụn trong điều kiện in vitro. Kết quả nghiên cứu cho thấy các tế bào này hoàn toàn có thể biệt hóa thành nguyên bào xương, tế bào sụn và tế bào mỡ trong điều kiện in vitro. Như vậy, dựa theo tiêu chí của ISCT thì chúng tôi đã thu nhận được các TBG trung mô từ tủy xương. Đó là các tế bào có đặc tính bám dính vào chai nuôi, các tế bào này cũng biểu hiện được các marker thiết yếu để định danh TBG trung mô là CD73, CD90 và CD105 với phần trăm dương tính rất cao ( 95%); cuối cùng các tế bào này có tiềm năng biệt hóa thành các dòng tế bào mỡ, xương và sụn trong điều kiện nuôi cấy in vitro dưới những điều kiện nuôi cấy và cảm ứng phù hợp. 3.1.4. Định danh nguyên bào xương Trong quá trình nguyên cứu, chúng tôi cũng đã đánh giá quá trình biệt hóa của TBG trung mô thành các nguyên bào xương trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Tùy theo từng giai đoạn biệt hóa mà TBG trung mô sẽ cảm ứng biệt hóa thành nguyên bào xương và biểu hiện các gien khác nhau. Theo đó, từ lúc TBG trung mô được cảm ứng biệt hóa sẽ tăng trưởng và biệt hóa thành các tế bào tiền thân tạo xương và phát triển thành tiền nguyên bào xương. Tại thời điểm này chúng sẽ biểu hiện gien Runx2 và Osterix. Tiếp theo giai đoạn biệt hóa và phát triển, các tiền nguyên bào xương sẽ biệt hóa thành các nguyên bào xương sớm, tại thời điểm này hoạt tính của enzyme alkaline phosphatase rất mạnh (đây được xem như là maker sớm dùng để định danh các nguyên bào xương trong quá trình nuôi cấy in vitro). B A Hình 3.3. Kết quả đánh giá sự biểu hiện của alkaline phosphatase. (A) Nhóm chứng của nghiên cứu là TBG trung mô không biệt hóa (×20). (B). Kết quả nhuộm cho thấy hoạt tính của Alkaline phosphatase biểu hiện rất mạnh, các tế bào họat động, biểu hiện enzyme Alkaline Phosphatase có màu hồng đậm trong bào tương. Sau đó, các nguyên bào xương sớm sẽ tiếp tục phát triển thành các nguyên bào xương muộn, tại thời điểm này chúng biểu hiện rất mạnh gien osteocalcin. Cuối cùng các nguyên bào xương này sẽ phát triển thành các nguyên bào xương trưởng thành, tại thời điểm này, các nguyên bào xương biểu hiện rất mạnh gien Osteopontin. 3.1.5. Đánh giá tính toàn vẹn của tế bào qua nhiễm sắc thể đồ Để có thể sử dụng một dòng tế bào nào đó trải qua quá trình nuôi cấy in vitro vào các ứng dụng lâm sàng trên người thì tế bào đó cần phải được kiểm soát và đánh giá một cách nghiêm ngặt. Một trong những phương pháp phổ biến để đánh giá tính toàn vẹn của tế bào qua nuôi cấy là đi khảo sát bộ nhiễm sắc thể đồ của tế bào, bằng kỹ thuật này có thể đánh giá một số tiêu chí quan trọng về các biến đổi có thể xảy ra về các bất thường nhiễm sắc thể về mặt số lượng cũng như cấu trúc nhiễm sắc thể, giúp cho nhà nghiên cứu có thể đánh giá được dòng tế bào mình đang nuôi cấy để đảm bảo an toàn và hiệu quả khi triển khai ứng dụng trên lâm sàng. 11 Trong quá trình nuôi cấy các TBG trung mô và nguyên bào xương, chúng tôi đã thực hiện 3 mẫu tế bào để đánh giá tính toàn vẹn của NST. TBG trung mô và nguyên bào xương sau khi được biệt hóa từ chính các TBG trung mô sẽ được chọn để đánh giá (hình 3.4). A B Hình 3.4. Khảo sát bộ nhiễm sắc thể đồ của tế bào trước và sau biệt hóa thành nguyên bào xương. (A). Nhiễm sắc thể đồ của tế bào gốc trung mô. (B). Nhiễm sắc thể đồ của nguyên bào xương. Nhìn chung, cả hai bộ NST của tế bào qua quá trình nuôi cấy chưa cho thấy bất thường về số lượng NST, cả hai bộ NST có số lượng ổn định. Từ NST đồ cho thấy, cả hai dòng tế bào (TBG trung mô và nguyên bào xương) có số lượng NST ổn định (46 NST), chưa thấy các biến đổi bất thường về cấu trúc NST. Tuy nhiên, đối với việc thực hiện NST đồ cũng có những hạn chế khi không phát hiện được các vi đột biến về mặt cấu trúc NST (<2 Mb). 3.2. TẠO MẢNH GHÉP TỪ SỰ KẾT HỢP CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ VÀ KHUNG SAN HÔ Đây là nội dung lớn thứ hai trong nghiên cứu, trong nội dung nghiên cứu này, mảnh ghép được tạo ra bằng sự kết hợp của khung san hô và TBG trung mô bằng cách chuyển các TBG trung mô từ chai nuôi lên các giá thể san hô và cảm ứng các TBG trung mô này biệt hóa thành nguyên bào xương trực tiếp trên khung san hô để tạo ra mảnh ghép thay xương, mảnh ghép này sẽ được nuôi trong môi trường cảm ứng tạo xương in vitro để tạo ra mảnh ghép hướng đến việc thay thế mô xương. Sau khi đã chuyển tế bào lên khung san hô thì mảnh ghép được nuôi trong môi trường cảm ứng tạo xương để kích thích các TBG trung mô trên mảnh ghép tăng trưởng, nhân khối và biệt hóa thành nguyên bào xương trên khung san hô. Phương pháp này cũng được rất nhiều các tác giả trên thế giới sử dụng khá phổ biến để cảm ứng biệt hóa TBG trung mô thành nguyên bào xương in vitro. 3.2.1. Đánh giá sự tăng trưởng của tế bào trên mảnh ghép Cả hai mẫu TBG trung mô và nguyên bào xương cảm ứng biệt hóa từ TBG trung mô được nuôi trên các giá thể san hô với mật độ ban đầu là 103 tế bào/cm3. Kích thước mẫu san hô (0,5×0,5×0,5 cm) được sử dụng làm giá thể để nuôi cho cả hai dòng tế bào là TBG trung mô và nguyên bào xương. Mẫu được nuôi trong khoảng thời gian 24 ngày, mẫu được thay môi trường mới mỗi 3 ngày/1 lần. Trong khoảng thời gian nghiên cứu, mỗi 2 ngày sẽ tiến hành đo mẫu 1 lần cho cả hai nhóm mẫu TBG trung mô và nguyên bào xương ở bước sóng 546 nm. 12 Đồ thị 3.2. So sánh đường cong tăng trưởng của hai dòng TBG trung mô và nguyên bào xương được nuôi trên khung san hô. Khi so sánh 2 mẫu cho thấy mật độ tế bào nguyên bào xương thấp hơn nhưng thời gian đạt đỉnh nhanh hơn. Sau khi đạt đỉnh tăng trưởng, cả hai dòng tế bào đi vào pha ổn định và suy tàn. Đối với mẫu TBG trung mô các tế bào duy trì giai đoạn ổn định lâu hơn và chưa cho thấy dấu hiệu suy giảm lượng tế bào một cách đột ngột. Điều này cũng phù hợp với tiến trình tăng trưởng và phát triển của TBG trung mô, khi bắt đầu nuôi cấy do các tế bào này có đặc tính tăng trưởng mạnh nên giá trị đo OD cao hơn tại các mốc thời gian khi so sánh với nguyên bào xương. Tóm lại, trong thí nghiệm này đánh giả khả năng tăng trưởng và phát triển của tế bào trên giá thể san hô để xem giá thể san hô có phải là một vật liệu phù hợp để mang các tế bào nuôi cấy hay không. 3.2.2. Đánh giá đặc điểm cấu trúc của mảnh ghép Kết quả đánh giá cho thấy, tế bào có khả năng bám dính tốt trên giá thể san hô (Hình 3.5A), tế bào bám dính vào các rảnh cũng như trên bề mặt san hô. Dựa vào kết quả đánh giá mô học thì tế bào không những bám dính được trên bề mặt mà còn có khả năng tăng trưởng, di chuyển và phát triển trong khối san hô. Hình 3.5A cho thấy các tế bào xâm nhập và phân bố gần như đều khắp khối san hô. Ngoài ra, mảnh ghép cũng được nhuộm hóa mô miễn dịch huỳnh quang để khảo sát khả năng sống, bám dính, tăng trưởng trên giá thể san hô (Hình 3.5B). B A Hình 3.5. Kết quả đánh giá cấu trúc mảnh ghép. (A). Kết quả nhuộm mô học (×20). (B). Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch huỳnh quang (×20) cho thấy trên bề mặt giá thể san hô có rất nhiều tế bào bám dính, lan tỏa và tăng trưởng theo các rảnh và xâm nhập vào các hốc của khối san hô. Kết quả nhuộm mô học và hóa mô miễn dịch huỳnh quang nhận thấy các nguyên bào xương di chuyển theo các rảnh, xâm nhập vào khối san hô và tăng trưởng khá tốt trên giá thể san hô. 13 3.3. XÂY DỰNG MÔ HÌNH GHÉP ĐOẠN XƯƠNG ĐÙI TRÊN THỎ BẰNG MẢNH GHÉP TỪ KHUNG SAN HÔ VÀ NGUYÊN BÀO XƯƠNG TỰ THÂN 3.3.1. Phân lập, nuôi cấy và nhân khối tế bào tủy xương thỏ Đối với các loài gặm nhắm có kích thước cơ thể nhỏ như chuột, thỏ … thì việc nuôi cấy tủy xương để phân lập TBG trung mô thường được thực hiện theo phương pháp nuôi cấy tủy xương toàn phần không qua bất kỳ giai đoạn phân lập thêm nào khác. Vì thường thể tích tủy xương của các loài động vật này quá ít hoặc rất khó để thu nhận, ngoài ra nếu sử dụng thêm các phương pháp phân lập khác có thể làm mất đi các TBG trung mô hiện diện trong mẫu tủy xương. Do đó, thường các nhóm nghiên cứu trong nước và quốc tế ưu tiên lựa chọn phương pháp nuôi trực tiếp tủy xương toàn phần. Đây cũng là một trong những phương pháp nuôi khá phổ biến và dễ thực hiện, được nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới thực hiện. Kết quả thu nhận và phân lập tế bào từ tủy xương thỏ cho thấy mật độ trung bình 49,00  5,66 × 106 tế bào/ ml. So với tế bào từ tủy xương người (44,00 × 106 tế bào/ ml) thì ở thỏ cho kết quả phân lập tốt hơn. Điều này có thể là do quy trình đã được hoàn thiện và thể tích mẫu (trung bình 2,50  0,10 ml) ở thỏ cũng nhiều hơn so với khi tiến hành phân lập trên tủy xương người (trung bình là 2,00 ml) (Bảng 3.2). Bảng 3.2. Tóm tắt một số đặc điểm của thỏ trong quá trình nghiên cứu. STT Trọng lượng (kg) Thể tích tủy (ml) Số CFU-FS 2,00 2,50 2,00 2,50 2,50 2,00 3,00 2,50 3,00 2,50  0,13 Mật độ tế bào (×106 tế bào/ml) 60,00 46,00 25,00 30,00 17,00 22,00 52,00 70,00 96,00 46,00  8,68 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Trung bình 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Trung bình Tổng 2,60 2,60 2,60 2,80 2,70 2,50 2,00 2,70 3,00 2,60  0,07 2,50 2,30 2,00 2,80 2,50 2,30 2,70 2,50 2,20 2,50  0,08 2,50 2,00 2,00 1,50 2,50 2,50 2,50 3,00 2,00 2,50  0,17 53,00 32,00 69,00 25,00 45,00 80,00 70,00 76,00 26,00 53,00  7,68 64,00 2,55  0.06 2,50  0,10 49,00  5,55 37,00 79,00 116,00 85,00 Thời gian (tháng) 6 6 6 3 3 3 1 1 1 6 6 6 3 3 3 1 1 1 Thực nghiệm Đối chứng X X X X X X X X X X X X X X X X X X 79,00  13,03 X: có thực hiện. Sau 3 ngày nuôi cấy tiến hành thay môi trường mới. Khi đó, quan sát dưới kính hiển vi thấy bắt đầu xuất hiện các tế bào bám dính, có hình dạng giống nguyên bào sợi. Các tế bào này sau đó phát triển và tạo thành các cụm tế bào bám dính (CFU-Fs). 14 B A C Hình 3.6. Kết quả nuôi cấy tế bào gốc thu nhận từ tủy xương thỏ. (A). Sau 3 ngày nuôi cấy, trong chai nuôi bắt đầu xuất hiện các tế bào bám dính, các tế bào này có hình thoi, thon dài hoặc bầu dục (đầu mũi tên màu vàng), các tế bào bám dính này bắt đầu phân chia và phát triển tạo thành các cụm (×10). (B). Sau một tuần nuôi cấy, các tế bào phân chia và phát triển mạnh, xuất hiện ngày càng nhiều các tế bào có hình dạng giống TBG trung mô khi so sánh với tế bào TBG trung mô từ tủy xương người (×10). (C). Tế bào được nhuộm Giemsa sau một tuần nuôi cấy, các tế bào có khuynh hướng tạo ra các cụm (colony) và từ đó tế bào lan tỏa và phát triển ra xung quanh. Hình thái TBG trung mô từ tủy xương thỏ khi thực hiện nuôi cấy cho thấy cũng không có khác biệt quá lớn khi so sánh với TBG trung mô từ tủy xương người. TBG trung mô từ thỏ cho thấy cũng là những tế bào có hình dạng thon dài giống với nguyên bào sợi và cũng là những tế bào bám dính vào bề mặt chai cấy. Tóm lại, khi thu nhận tủy xương thỏ để phân lập và nuôi cấy TBG, chúng tôi nhận thấy hình thái và đặc điểm tăng trưởng mạnh của quần thể các tế bào bám dính trong chai nuôi, có hình thái giống với nguyên bào sợi. Điều này có thể kết luận đó chính là các TBG trung mô từ tủy xương thỏ. Tiếp theo đánh giá khả năng tăng trưởng của tế bào thông qua đường cong tăng trưởng. Chọn một số thỏ đại điện để thực hiện nghiên cứu. Các tế bào sau khi nuôi cấy sơ cấp, tăng sinh đạt khoảng 70-80% diện tích bề mặt chai nuôi, tiến hành cấy chuyền sang chai nuôi mới. Các tế bào này sau khi nuôi đến lần cấy chuyền thứ ba sẽ được sử dụng để đánh giá sự tăng trưởng của tế bào bằng cách đếm tế bào theo ngày bằng buồng đếm Neubauer. Kết quả đếm mật độ tế bào theo thời gian mỗi ngày, mỗi ngày đếm 3 mẫu để có số liệu trung bình, số trung bình này được sử dụng để xác lập đường cong tăng trưởng. Đồ thị 3.3. Đường cong tăng trưởng của tế bào gốc từ tủy xương thỏ. 3.3.2. Cảm ứng biệt hóa tạo nguyên bào xương từ tế bào gốc tủy xương thỏ. Các TBG trung mô từ tủy xương thỏ ở lần cấy chuyền thứ ba sẽ tiến hành biệt hóa thành các nguyên bào xương. Sau khoảng thời gian nuôi cấy từ 14 – 21 ngày, các tế bào biệt hóa được xác định bằng các phương pháp như nhuộm Alirazin Red, Von kossa. 15 A B C D Hình 3.7. Kết quả định danh các nguyên bào xương được biệt hóa từ tế bào gốc trung mô tủy xương thỏ. (A). Tế bào dương tính với phương pháp nhuộm Von Kossa (×10), trong chai nuôi cấy chất nền xương bắt màu nâu đen và tạo thành các nốt xương (bắt màu nâu đen đậm). (B). Tế bào dương tính với phương pháp nhuộm Alirazin Red (×10), trong chai nuôi cấy chất nền xương bắt màu đỏ cam và tạo thành các nốt xương (bắt màu đỏ cam, sáng màu). (C). Tế bào dương tính với sự biểu hiện của enzyme AP (×10), các tế bào sau biệt hóa biểu hiện được enzyme AP, sự biểu hiện của enzyme này thể hiện thông qua bào tương tế bào bắt màu hồng đậm (×10). (D). Tế bào dương tính với phương pháp nhuộm AP (×20), ở độ phóng đại to hơn, cho chúng ta thấy rõ bào tương của các tế bào này biểu hiện rất mạnh enzyme AP bằng chứng là bào tương tế bào có màu hồng đậm và khi quan sát trong quan trường cho thấy tất cả tế bào đều biểu hiện hoạt tính của enzyme này. Từ các kết quả nhuộm khác nhau để đánh giá sự khoáng hóa của chất nền xương và sự biểu hiện của enzyme AP (marker để định danh nguyên bào xương) cho thấy các TBG trung mô thu nhận từ tủy xương thỏ đã biệt hóa được thành các nguyên bào xương trong điều kiện nghiên cứu in vitro. 3.3.3. Tạo mảnh ghép từ giá san thể san hô và tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương thỏ Các TBG trung mô ở lần cấy chuyền thứ ba, được chuyển lên giá thể san hô để tạo ra mảnh ghép mô xương. Quy trình thực hiện cũng tương tự như nghiên cứu đã thực hiện trên TBG trung mô từ tủy xương người. Sau khoảng thời gian nuôi cấy và cảm ứng biệt hóa thành các nguyên bào xương trên giá thể san hô để tạo mảnh ghép xương trong khoảng thời gian từ 14 – 21 ngày. Kết quả đánh giá khả năng bám dính, tăng trưởng và phát triển của nguyên bào xương trên khối san hô bằng phương pháp nhuộm Giemsa và H&E được cho trong Hình 3.8. A B C Hình 3.8. Kết quả đánh giá mảnh ghép bằng nhuộm Giemsa và H&E. (A). Hình chụp khối san hô nhuộm Giemsa, tế bào bắt màu tím đậm, bám dính và tăng trưởng trên bề mặt cũng như di chuyển theo các rãnh của khối 16 san hô. (B) Hình chụp khối san hô nhuộm H&E (×10). Tế bào phát triển bên trong khối san hô, nhân bắt màu tím đậm (hình mũi tên màu đỏ), tế bào phân tán rộng trong khối san hô. (C). Hình chụp khối san hô nhuộm H&E (×20). Tế bào phát triển bên trong khối san hô nhân bắt màu tím đậm (mũi tên màu đỏ). Hình chụp cho thấy tế bào di chuyển vào bên trong các hốc và tạo ra mạng lưới chất nền xương (màu xanh dương). Để chứng minh TBG trung mô thỏ cũng có thể cảm ứng biệt hóa thành nguyên bào xương trên giá thể san hô, nhuộm mảnh ghép có mang các nguyên bào xương với thuốc nhuộm để xác định sự hiện diện của enzyme AP. Kết quả nhuộm và quan sát tế bào bằng SEM được thể hiện trong hình 3.9. A B C Hình 3.9. Kết quả đánh giá sự biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành nguyên bào xương trên khung san hô. (A). Tế bào gốc tủy xương thỏ sau thời gian nuôi cấy và kích thích biệt hóa thành nguyên bào xương trên giá thể san hô biểu hiện dương tính với enzyme AP (×4). (B). Các nguyên bào xương biểu hiện enzyme AP với bào tương tế bào bắt màu hồng đậm, bám dính và phát triển theo các rảnh và hốc của khối san hô (×20). Trong hình cho thấy một nguyên bào xương với bào tương bắt màu hồng rất đậm, bào tương trãi rộng bao lấy hốc san hô. (C). Bào tương tế bào trãi rộng trên khối san hô và các nhánh bào tương tế bào phân nhánh và gắn bám rất chặt trên khối san hô được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) (×1000, 10µm). Như vậy, với các phương pháp đánh giá hiệu quả có thể xác định rằng các TBG trung mô thu nhận và nuôi cấy từ tủy xương thỏ đã phát triển, tăng trưởng rất tốt trên khung san hô. Các tế bào này hoàn toàn có thể cảm ứng biệt hóa thành các nguyên bào xương sau thời gian nuôi cấy và kích thích biệt hóa với môi trường biệt hóa phù hợp. Để đánh giá hiệu quả và tiềm năng của mảnh ghép trong việc tái tạo các khuyết hỗng ở mô xương. Mảnh ghép được tạo ra theo hướng mảnh ghép mang các nguyên bào xương tự thân từ sự kết hợp của khung xương (khung san hô) và tế bào xương (nguyên bào xương được thu từ tủy xương thỏ) cũng như các yếu tố tăng trưởng trong môi trường nuôi cấy. Nghiên cứu tiếp theo thực hiện ghép mảnh ghép vào đoạn xương đùi của thỏ để đánh giá tiềm năng của mảnh ghép trong việc sửa chữa và tái tạo mô xương. Thí nghiệm ghép trên thỏ được chia làm hai nhóm: nhóm 1 gồm có các thỏ được ghép mảnh ghép gồm khung san hô mang nguyên bào xương tự thân và nhóm 2 gồm các thỏ chỉ được ghép khung san hô không có mang tế bào xương tự thân (nhóm đối chứng). Cả hai nhóm thỏ sau khi được ghép mảnh ghép trên phần xương đùi sẽ được nuôi trong điều kiện chuồng trại, chế độ dinh dưỡng và chăm sóc như nhau. Cả hai nhóm thỏ được theo dõi trong khoảng thời gian 6 tháng, tại các mốc thời gian 1, 3 và 6 tháng các thỏ ghép sẽ được mang đi đánh giá quá trình tái tạo xương. Để đánh giá quá trình liền xương chủ yếu thực hiện đánh giá thông qua phương pháp quan sát hình ảnh học. Đầu tiên, cả hai nhóm thỏ nghiên cứu sẽ được mang đi chụp phim X-Quang để quan sát hình thái quá trình liền xương tại vị trí. Tiếp theo, sẽ thu nhận sinh thiết tại vị trí ghép để thu nhận mảnh ghép, thực hiện tiêu bản mô học (nhuộm H&E) để đánh giá hoạt động tái tạo mô xương. Tất cả các lô thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần tại các mốc thời gian 1, 3 và 6 tháng. 17 A B C D E F Hình 3.10. Quy trình phẫu thuật ghép san hô trên xương đùi thỏ. (A). Sử dụng dao mổ phẫu thuật để bọc lộ phần cơ bám xương. (B). Bọc lộ phần thân xương đùi. (C). Dùng máy cưa xương cắt bỏ một phần thân xương đùi có kích thước khoảng 0,125 cm3 bằng với khối san hô cần ghép (khối san hô có kích thước 0,5x0,5x0,5 cm). (D). Phần xương đùi đã được loại bỏ một phần thân xương bằng với kích thước khối san hô. (E). Chèn khối san hô vào vị trí phần thân xương đã loại bỏ. Tiến hành cố định bằng nẹp trong. (F). Khối san hô sau khi đã được cố định vào vị trí khuyết xương. Sau đó dùng chỉ phẫu thuật khâu phần cơ để cố định mẫu san hô ghép và khâu lại vết mổ. Sát trùng lại bằng Betadine và chích kháng sinh Gentamicine với liều 5 mg/kg thể trọng liên tục trong vòng 5 ngày 3.3.4. Đánh giá kết quả sau ghép 3.3.4.1. Mảnh ghép ở thời điểm 1 tháng Sau thời điểm ghép 1 tháng, thỏ được mang đi chụp phim X-Quang tại vị trí ghép để quan sát quá trình liền xương. Sau đó, các thỏ này cũng được thu nhận sinh thiết đoạn ghép xương để đi làm tiêu bản mô học nhằm quan sát chất lượng liền xương và cấu trúc xương được tạo thành tại vị trí ghép diễn ra như thế nào. Kết quả được cho trong Hình 3.11. 18