Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giáo dục - Đào tạo Cao đẳng - Đại học Nghiên cứu khả năng phát triển của chủng vi khuẩn edwardsiella ictaluri bị đột b...

Tài liệu Nghiên cứu khả năng phát triển của chủng vi khuẩn edwardsiella ictaluri bị đột biến gen pura ở các điều kiện bảo quản khác nhau

.PDF
74
690
146

Mô tả:

B ộ GIÁO DỤC VÀ DÀO TẠO TRU ÔNG DẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ CHI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSĨELLA ICTALURĨ BỊ ĐỘT BIẾN GEN PURA Ỏ CÁC DIỀU KIỆN BẢO QUẢN KHÁC NHAU LUẬN VĂN THẠC s ĩ K h á n h H ò a , n ă m 2014 NGUYỄN THỊ CHI NGHIÊN CỨU KHẢ NẰNG PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSĨELLA ĨCTALVRĨ BỊ ĐỘT BIẾN GEN PURA Ỏ CÁC DIỀU KIỆN BẢO QUẢN KHÁC NHAU C hu yên ngành: N uôi trồn g th u ỷ sản M ã số: 6 0 62 0 3 01 LUẬN VĂN THẠC s ĩ N G Ư Ờ I H Ư Ớ N G D Ấ N K H O A HỌC: 1 . T S . V Õ V Ă N NHA 2 . T S . L Ê M IN H H O À N G CHÚ TỊCH HỘI ĐỒNC; KHOA SAU ĐẠI HỌC Khánh Hòa, năm 2014 L Ò I C A M ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liộu v à kct quà đã nêu trong luận văn này là công trình nghiên cứu cùa lôi cùng vói sự cho phép sử dụng chung số liệu cùa nhóm lác giá Ihực hiện dề lài Ihuộc chương trình Công nghệ sinh học cấp Nhà nước do Viện Nghiên cứu Nuôi trông Thúy sàn III chủ trì, những số liệu này là trung thực, chua được ai công bô trong bàt kỳ công trình nào khác. Tác gia L Ò I CÂ M ƠN Luận văn này dã dược Ihực hiện với sự giúp dỡ cùa nhóm nghiên cứu dẻ lài Công nghệ sinh học cấp Nhà nước: "Nghiên cửu tạo dòng vi khuân EdwardsìeUa ictaluri nhược độc dùng làm văc xin phòng bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon hypopluhaìmus) bằng kỹ thuật gây đột bicn gcn” do Viện Nghicn cứu Nuôi trồng Thùy sân ITT chù trì, tôi xin chân thành câm ơn đcn sự giúp đỡ quí báu đó. Tôi xin bày tó lòng biết ơn sâu sắc đến sự chi dẫn nhiệt tình, chu đáo của giáo viên hướng dẫn TS Võ Văn Nha và TS Lê M inh Hoàng dã giúp lôi ừong suối quá trình xây dụng dề cương, triển khai Ihực hiện các nội dung và hoàn ihiện bàn luận vãn Tôi xin chân thành cám ơn sụ giúp đỡ và tạo điêu kiện thuận lợi của các bạn đồng nghiệp thuộc Phòng nghicn cứu Bệnh T húy sàn và dự báo, Trung tâm quốc gia quan trắc cánh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thùy sán khu vực miền Trung-Viộn Nghicn cứu Nuôi trồng Thùy sàn III đc tôi hoàn thành bàn luận văn này. Tôi xin chân ihành cãm ơn dến Khoa Nuôi irồng Thuý sãn, Khoa sau Đại học, Trường Đại học Nha Trang, cùng quý ihầy cô dã lận lình giãng dạv lôi ưong suối ihời gian qua. Cuôi cùng tôi xin cảm ơn đên gia đình đã động viên và giúp đ& tôi hoàn thành luận văn này. Tác giá MỤC LỤC I lar.ii p.1.1 I'..I I <í| ( \ M O \ MI <• I : c D A N H MI. r K Y Mil o u V II I I \ T DANH M Ụ C CÁC B Ả N G ........................................................................................ DANH M Ụ C CÁC HÌNH v £, Đ Ổ T H Ị ................................................................ MỞ ĐÂU ...................................................................................................................... Chưong 1 - TỎNG Q U A N ....................................................................................... 1.1 Những nghiên cứu vê chúng vi khuân E. ictaluri bị đột biên gen cho mục đích tạo vaccine phòng bệnh do E. ictalurí ờ cá da tron trên Thè giới và ờ V iệt Nam 1.1.1 Trên Thế g iớ i................................................................................................ 3 1.1.2 T ại Việt N a m ...................................................................................................... 6 1.2 Những nghiên cứu về dặc diém sinh học. khã năng gây bệnh (rên cá tra cùa vi khuẩn E. ictaiuri phân lập irên cá Ira Việt N am và cá nheo (calíish) Hoa Kỳ.................................................................................................. 1.2.1 Đặc điêm hình thái, sinh lý và sinh vật hóa học vi khuấn E. ictahtri .......... 6 6 1.2.2 Những nghicn cứu vc khà năng gây bộnh trên cá tra nuôi cũa vi khuẳn E. icialuri ................................................................................................................ 8 1.2.3 Những nghiên cứu về kliã năng kháng kháng sình cùa chủng vi khuẩn E. ictaluri ................................................................................................................ 11 1.3 K há năng phát (liễn cùa chúng E. ictalurí bị dột biển gen và chúng E. ictalurí chưa bị đột biến gen (chủng “hoang dại’’) trên một số môi trường 12 nuôi cấy khác n h a u ............................................................................. 1.4 Một số phương pháp báo quán chúng vi khuần E. iclalurí hiện nay trên The giới và Việt N a m ....................................................................................... 14 1.4.1 Phương pháp báo quăn Ihạch nghiêng............................................................. 14 1.4.2 Phương pháp báo quân dưới lớp dầu kh o á n g ................................................ 14 1.4.3 Phương pháp lạnh s â u ........................................................................................ 14 1.4.4 Phương pháp đông k h ô ...................................................................................... 15 Chương 2 - VẬT UTỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ...................... 16 2 . :)Õ| imrriii VÌI ph.tir. 'I iiLh.cn »'.'lu l(> 2 2 \ A| ..iu r.iihiér. ».IU lít > I ha. ;■!. i: \.I ’ I Him Ik iụ-li.<-ii I UII ■ 3 : 1)1 ¿12-111 -ÌỊỈỈMC-I a m IS 2.4 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu ciìa đề tài luận v ă n ................................ 18 2.5. Phương pháp nghiên c ứ u ................................................................................. 19 2.5. ỉ Phương pháp quan sál hình dạng, màu sắc khuẩn lạc; do kích thước cùa vỉ khuẩn; nghiên cứu dặc diềm sinh lý, sinh hóa chùng vi khuấn Edvmrdsiella ictaluri bị đột biến gen p u rA .................................................. 19 2.5.2. Phương pháp kiêm tra tính kháng kháng sinh cùa chúng vi khuân Edyvardsiella icialuri bị đột bicn gcn purA ..................................................... 19 2.5.3. Phương pháp kháo sát khà năng phát triển cừa chừng E. icialuri bị đột biến gcn purA ớ các điều kiộn bào quàn khác n h a u ....................................... 22 2.6. Phương pháp phân lích, xừ lý số h ậ u ......................................................... 23 Chương 3 - KÉT QUẢ NCiHTÊN c ử u ................................................................ 24 3.1 Xác dinh lính kháng kháng sinh của chúng vi khuẩn E. ìctalurí bị dột biến gen p u rA ..................................................................................................... 24 3.1.1 Kết quả kháo sát đường cong sinh trướng phát triên của chủng vi khuân E. ictaluri bị đột biên gen purA trên môi trường BHI có kháng sinh kanam ycine................................................................................................. 24 3.1.2 Kct quà tính kháng kháng sinh cũa chúng vi khuần E. ictahưi bị đột bicn gcn purA với một số loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglỵcosid .... 25 3.2 K Ìl quà kháo sál khá năng phái irién cùa chủng vi khuấn E. ictalurí bị dộl biển gen purA ở các diều kiện báo q u á n .......................................... 26 3.2.1 Kêt quả tìm hiếu một số đặc điỄm sinh học cúa chùng vi khuấn Edvmrdsiella icialỉirì bị đột biên gen p u rA ................................................... 3.2.2 Kêt quà kháo sát kích thước cùa chúng vi khuân Edvardsielìa ìctaluri bị 26 đột biến gen purA theo thời gian và điêu kiện báo quàn khác n h a u ........... 3.2.3 32 Kct quá nghicn cứu khá năng phát triền cũa chủng vi khuẩn Edwardsie.Ua kialurì bị đột biến gcn purA ở các điều kiện bào quân khác n h au....................... 33 K. I I I AN \ A Kll N M. l l l 43 K. I l.t \ \ 43 klA N l.lll .. IAI I III l' 1‘IU. I IIIAM k ll A O D A NH M Ụ C K Ý H IỆ U , C H Ữ V IÊ T TẲT API 20E: Hệ thống định danh vi khuân họ Enterobacteriaceae và vi khuân Gi hình quc BHTA: Brain Heart Infusion Agar - Môi trường thạch BHT BHIB: Brain H eart Infusion Broth - Môi iriròng lóng BH1 CFU: Colony Forming Unit - Đ ơn vị khuẩn lạc Cs: Cộng sự DMM: Defined Minimal Medium - Môi trường nuôi cấy DMM EIM: Edwardsiella Ictaluri Medium - Môi trường nuôi cầy EIM ESC: Enteric Septicemia o f Fish - Bệnh ESC KIA: Klcglcr Tron Agar - Môi trường thạch KIA LB: Luria Berlami - M ôi trường LB LDC: Lysine decarboxylase MAC: Mac Conkey Agar - Môi trường thạch Mac Conkey NN&PTNT: Nông nghiệp và phát triển nông thôn OD: Optical Density (mật độ quang) ODC: Ornithine decarboxylase O/E: Oxydation/Ecrmcntation ONPG: p- Galaclosidase TSA: Trvptone Soya Agar - Môi triròng không chọn lọc TSA D ANH M Ụ C CÁ C BẢNG Ráng 3.1 Kếl quá vòng kháng kháng sinh của vi khuẩn E. ictaturi dộl biển gen purA và vi khuấn E. ictaluri chua bị đột biến với kháng sinh thuộc nhóm am inoglycosid................................................................................... 25 B ảng 3.2 Đặc điêm khuân lạc, hình dạng và kích thước chúng vi khuắn E. ictaluri bị đột biến gcn purA và chúng chua đột biến gcn purA .......... 27 Báng 3.3 Dặc điềm sinh lý, sinh hóa của vi khuần E. ictaluri bị đột bicn gcn purA, E. ìctalurì chưa dộl biến gen p u rA ................................................. 29 Báng 3.4 Kích thirớc chùng vi khuẩn E. ictalurì bị dột biến gen purA (E. ictalurí PAV1) và E. ictalurí chưa đột biến gen purA (E. ìctaliiri W T) 32 Ráng 3.5 Kèt quà khảo sát sự phát triên cùa chủng bị đột biến gen purA à các điêu kiện bảo quàn khác nhau bang thạch nghiên g .................................. 41 D ANH M Ụ C CÁ C H ÌN H VẺ, Đ Ô T H Ị Con dường tổng hợp adenylosuecinaie synlheiase lừ gen pítrA .............. 4 Sơ đô khôi nội dung nghiên cửu cùa đê t à i ................................................ 18 Sơ đô xác định đường cong sinh trưởng, phát triên cùa chủng E. ìctalurì đột biến gen purA trong môi trường BHIB có bô sung kananiycinc và không bô sung kanam ycinc................................................ 20 Sơ đồ thực hiện kháng sinh đồ vi k h u ẩn..................................................... Đô thị kèt quá khảo sát đường cong sinh trưởng (theo giá trị OD) vi khuần E. iclalurí đột biến gcn purA trên môi trường nuôi cay BHTB có bô sung kanamycinc và không bồ sung kanam ỵcinc................................. 24 Kháng sinh dồ cùa vi khuẩn E. ictaluri chưa dộl biến gen bi dộl biển gen purA (A) và vi khuẩn E. ictaluri dột biến gen purA ( B ) .................... 26 Khuân lạc vi khuân E. ictaluri đột biên gen pur .A (A. B ) ......................... 28 Vi khuân E. ictaỉuri chưa đột biến gen bị đột biến gen purA (A) và vi khuấn E. ictalurí đột biến gen purA (B ) ...................................................... 28 Sinh trướng quần thc vi khuẩn E. icialurì đột biến gcn pitrA trên môi trường DMM có bồ sung adcninc v à không bồ sung adcninc OD - mật dộ q u a n g ......................................................................................................... 31 Kếl quã kháo sál dưòng cong sinh Irưỡng (theo giá liị OD) vi ldiuẩu E. ictaluri chưa bị đột biên gen bị đột biên gen puìA và E. ictalurí đột biến gen purA trên môi trường nuôi cây BH1B......................................... 34 Kết quà kháo sát sô lượng te bào vi khuắn E. ictalurí chưa bị đột biên gcn và E. iaaluri đột biến gcn purA bão quán bang thạch nghiêng ờ 4°c theo thời g ia n .......................................................................................... 35 K ếl quã khảo sál giá liị OD vi khuấn E. ictaluri chưa bị dộl biến gen và E. ictaluri dột biến gen purA báo quãn bằng ihạeli nghiêng ờ 4 “C (heo thời g ia n ........................................................................................................... 35 Kèt quà khào sát số lư ợng tế bào vi khuấn E. ictaluri chưa bị đột biên gen và E. ictaluri đột biên gen purA bảo quàn bang thạch nghiêng có phù dầu khoáng ờ 48c theo thời gian............................................................ Kct quá khào sát giá trị OD vi khuẩn E. icialurí chưa bị đột biến gcn và E. ìctalurì dộl biển gen purA bão quán bắng Ihạch nghiêng có phù dầu 37 khoáng ữ 4 °c theo thời gian........................................................................... 37 H ình 3.11 Kct quá khào sát số lượng tế hào vi khuẩn E. ictaluri đột biến gcn purA và E. ictaluri chua bị đột biến gcn theo thời gian bằng lạnh sâu -30°c .. 39 H ình 3.12 K ết quả kháo sát sát giá liị OD vi khuấn E. ìctalurí dột biến gen purA và E. ictaluri chưa bị dột biến gen theo thòi gian bẳng lạnh sâu -30"C .. 39 H ình 3.13 Kèt quá kháo sát giá trị OD vi khuân E. ictaìuri đột biến gen purA bào quán ữ các điểu kiện khác nhau theo thời g ia n ........................................... 40 H ình 3.14 Kct quá kháo sát số lượng tế bào vi khuần E. ictaluri đột biến gcn purA bào quàn â các đicu kiộn khác nhau theo thời g ia n ................................... 41 MỎ ĐÀU Trên the giới, các nghiên cứu đã phát hiện ra ráng vi khuân EdwardsieUa ictaìuri là tác nhân gây bệnh quan trọng trên cá nheo (catfish) ờ Mỹ, cá trê trắng (ciarías bairachus) ớ Thái Tan và trên một số loài cá da trơn khác ỡ Indonesia, Trung Ọuoc. ờ Việt Nam, các nghicn cứu cùa Crumlish (Dại học Stirling-Anh); Công ty Bayer Việt Nam; Công ly Pharma Nauv và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 11 kết họp với NAVETCO dã cùng di dến kết luận lại hội Ihảo ờ Tp.Hồ Chí Minh tháng 9/2007: “ Mặc dù có thê phát hiện nhiêu tác nhân vi khuân trên cá tra bệnh nhưng chỉ có duy nhất vi khuân EdwardsieUa ictaluri là tác nhân thực sự gây bệnh gan thận 111Ù trên cá tra ”. Ngày 11/8/2009 hội thào bàn về tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra do Bộ NN&PTNT tồ chức tại thành phố Hồ Chí M inh cũng đã đi đcn kết luận ràng: Vi khuần E. icialuri là một tác nhân thực sự gây bệnh gan thận mủ tren cá tra nuôi tại Việt Nam. Bệnh nhiễm khuẩn gây ra bởi tdwardsiella 1Ctillan dã là m tồn thất lớn cho nghề nuôi cá da (rơn ở Mỹ hàng năm lừ 20 - 30 Iriệu USD [47], Ỡ Việl Nam, Edwardsietla ictaluri gây bệnh gan thận mú trên cá tra nuôi ờ đong bang sông Cửu Long với tý lệ chết tir 10 - 90%, gây thiệt hại đáng kế cho người nuôi c á tra hàng năm [ I()]. Vi khuấn E. ictaluri trên cá tra đã kháng với một sô loại thuôc kháng sinh nlur oxytctracylin, oxolinic acid, sulphonamid [31; Bactrimc, colistin, amoxicilin, tctracyclin, doxycyclin [81, [191. Hơn nữa, các sân phẩm thúy sân sau đó thường không dược ưa chuộng do sự lích lũv Ihuốc, hoá chấl trong thịl cá. Do vậy. việc phòng bệnh gan Ihận mù cá tra bằng vaccine là vấn dề dược dặt ra cho công nghiệp nuôi cá Nghiên cứu vê E. ictaỉurí cho thây vi khuân này có đặc tính sinh miễn dịch rất mạnh, có sự tương quan giữa kháng thè sinh ra và khả nàng báo hộ chông lại sự cám nhiễm của vi khuan Edwardsiella iclaluri [481, [491, [51], Do đó, hiện nay các nghicn cứu đang hướng đến loại bỏ gen aroA hoặc purA hoặc cá 2 cùa chùng vi khuần E. ictaluri hay m ội số gen liềm năng khác nhằm làm giám dộc lự c của vi khuẩn E. ictaluri, dùng làm vaccine kích thích sinh miễn dịch dịch thê và kích Ihích hoạt hóa sinh miễn dịch trung gian tè bào . Năm 2010. chương trình công nghệ sinh học cấp Nhà nước do Viện Nghiên cứu Nuôi trông Thủy sản III chú trì đã nghiên cứu tạo được 3 dòng vi khuắn E. ictaluii nhược độc làm nguycn liệu sán xuất vaccinc phòng bộnh gan thận mù cá tra bằng kỹ thuật đột biến gcn. T uy nhiên, cho đến nay việc lưu giũ, báo quàn chùng E. icialuri bị dột biến gen purA chưa có tài liệu nào dể cập dền. có chăng chỉ nhằm phục vụ (rực liếp cho những nghiên cứu về khả năng sừ dụng chúng làm vaceine phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra. Trước thực tế trên, cùng với việc hoàn thành khóa học, được sự đông ý của Trường Đại học Nha Trang. Viện trướng Viện Nuôi trống Thúy sàn. thây giáo hướng dẫn, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu kha năng phái triển cua chúng vi khuẩn Edwardsìeỉỉa iclaluri đội biến gen purA ờ các điểu kiện bào quàn khác nhau ” •í* Mục tiêu nghiên cứu ciía dề tài luận văn: + Xác dịnh dược khá năng phái triển của chùng vi khuẩn Edwardsìeíla ictaluri bị dộl biển gen purA trong môi trường có chứa kliáng sinh dồng (hòi xác dinh dược khá náng phát triến cùa chùng vi khuân Edward.ùella ictaluri bị đột biên gen purA ờ các điêu kiện bảo quàn khác nhau. Từ đó có được điêu kiện bào quán phù hợp. •> Nội dung nghicn cứu của đề tài luận văn: + Xác định tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictalurí bị dột biển gen purA. + Kháo sát khả năng ph ái triển cùa chúng vi khuẩn Edivardsìella ìctaluri bị dộl biến gen purA ờ các diều kiện bào quán. ❖ Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận ván: - Vê khoa học: Kêt quả cùa luận đê tài luận văn đã xác định được khá nàng phát trièn của chùng vi khuẩn Edwardsieỉla icialurí bị đột biến gcn purA trong các điều kiện bào quàn từ đó làm tiền đề cho nhũng nghicn cứu tìcp theo vc việc lưu giữ chúng vi khuẩn - v ề Ihực tiễn: Đề lài luận văn góp phẩn nâng cao hiểu biếl cho chính học viên về lĩnh vực vi sinh vật dộl biến gen. Đồng thòi cũng chi ra dược diều kiện lưu giữ chủng vi khuân Edivardsiella ictaluri bị đột bièn gen purA. làm cơ sớ ban đâu đế lưu giữ nguyên liệu phục vụ cho việc sàn xuàt vaccine nhược độc phòng bệnh gan thận mù cá C huông 1 TỒNG QUAN 1.1 Những nghiên cứu về chiing lỉ. ictaluri bị đột biến gen cho mục đích tạo vaccine phòng bệnh do E. ictaluri ỏ' cá tra trcn The giói và Việt Nam. ỉ . 1.1. Trên T hể giới Năm 1996. Cooper và các cộng sự đã tạo thành công chùng E. ìcialurí đột biến gen ch hằng cách sìt dụng mini-transposon lai giữa TnlO và Tn903, chùng đột biến dược lạo ra bị m ất hoại lính enzyme chondroilinase [23J. Khi sừ dụng chùng E. ictaluri dộl biến gen ch liêm cho cá da iron ở nồng dộ 10s cíu/cá dế kiểm Ira dộc lực. tác giả nhận thấy, sau 2 tuân theo dõi, cá không có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của bệnh nhiễm trùng do E. ictaluri gây ra. Sau đó tác già tiếp tục tiêm E. ictalurí hoang dại (gây bệnh) cho cá, cá cùng không có dấu hiệu bệnh nhicni trùng đặc trưng trong khi cá đối chứng clura được tiêm chủng đột biến gcn ch từ trước bị chết toàn bộ [23]. Năm 1997, Lawrence và cộng sự lần đầu ticn đã tạo thành công chững E. ictaluri dộl biến gen purÁ. mấi khá năng lồng họp adenine, dùng là m nguvên liệu sán xuất vaccine nhược dộc |3 4 |. Đoạn gen pnrA, mã hóa cho enzyme lổng họp adenine, được căt bó trình tự nucleotide ở giũ a và thay vào đó là gen kháng kháng sinh kanamycin; gen purA đột biến được dòng hóa vào plasmid pGP704. sau đó , plasmid sàn phầm (pFI17) được biến nạp vào E. colì SM10 'kpìr. Chúng E. ìctaluri bị đột biến gcn purA (LSU-F.2) được tạo ra khi cho E. coli SM10 Ằpir mang pFJ17 tiếp hợp với chừng E. iciahưi hoang dại. Đoạn gen purA, mã hóa cho enzyme lồng họp adenine, bị gâv dột biến mấl doạn 598 bp và ihav bằng gen kháng kanamvcìn. Khi loại bò gen purA, gen mã hóa cho enzyme adenylosuccinate synthase là enzyme đâu tiên xúc tác cho quá trình tòng hợp AMP- tham gia vào quá trình tòng hợp purin ribonucleotide (US Patent 6010705). D o vậy, ncu đột biến gen purA thì enzyme adenylosuccinate synthase không được tạo thành và quá trình chuyền hóa inosinc monophosphate (IMP) thành adenylosuccinate sc không xày ra, dẫn đcn ATP không được hì nh thành đc cung cấp năng lượng cho quá Irình chu vén hóa lừ XMP thành GMP), tạo ra GTP lliam gia quá Irình lổng họp DNA và RN A (Hìnli 1.1). T ừ dó làm ánh hướng ừược liếp dển khã năng sinh ưướng vi khuân E. ictaluri. gây ánh hưởng gián tiếp đên độc lực cùa chúng vi khuân này [ I]. UnHauiumt -> «IT -> ADP-► ATÍ Hình 1.1 Con dường lỗng hợp adenvlosuecinale synlhelase lừ gen pítrA Chùng vi khuẩn khuấn E. ìctaluri bị dộl biến gen purA (LSU-E2) không gây chết cho cá nheo M ỹ khi tiên hành gây bệnh thực nghiệm bang phương pháp cho ăn hay ngâm nhưng gây chết khoáng 50% khi sứ dụng plurong pháp tiêm với liều khoáng 107- 10s cfu/cá. D iều này có thc do các gcn qui định độc tính cùa chủng LSU-E2 vần nguycn vẹn [341. Thune và cộng sự (1997) |48J lạo thành công chủng E. Ictaluri kliuvếl dưỡng adenine bẳng phương pháp dộl biến gen purA dựa trên nguyên lắc cùa hiện lượng lái lồ họp lương dồng cùa các Irình lự AND. Chúng E. Ictaluri bị dộl biển gen purA (LSU-E2) tạo ra được đem thù nghiệm độc lực cho thày, cá thí nghiệm tiêm chùng LSU-E2 ờ nồng độ 105 và 10° cfu/cá cho ti lệ cá chết tích lũy là 0%, trong khi đó với nồng độ tiêm tương tự đối với chững E. icíaluri hoang dại ti lộ tương ứng là 96,7% và 100% . Với phương pháp tiêm, chừng đột biến có liều gây chết LD50 là 5,1 X 107 cfu/cá so với chùng hoang dại (<130 cíu/cá). nghĩa là LD50 của chùng hoang dại Ihấp hơn 51ogio so với chúng dộl biến. N goài ra. khi thứ nghiệm dộc lực bẳng phương pháp ngâm (nồng độ 106, 107 cfu/m l) v à cho ăn (nồng độ 107, 10s cfu/cá) với chúng LSUE2, tỳ' lộ cá chết tích lũy là 0% sau th í ngiộm; trong khi đó với chùng E. ictalurì hoang dại khi cá dược ngâm (nồng dộ 107cfu/m l) hoặc cho ăn (nồng dộ 109 efu/eá) (hì tỷ lệ cá chết lirong ứng là 63,3% và 54,8%. Cá dược ngâm với E. ictaluri hoang dại sau khi ngâm với chùng LSU-H2 có tỳ lệ chết lích lũv trung bình 11.1% trong khi dó ở lô dối chúng tị' lệ này là 33,3%. Gen mục tiêu phô biến nhất đuợc quan tâm là íĩraA, mã hóa enzyme 5 cnolpyruvoylshikimatc-3-phosphatc synthase. Các trình hr gcn aroA cùa một sô tác nhân gây bộnh gram (-) đ ã được công bố, v à đột biến gcn aroA đã chúng minh là có hiệu quá trong írng dụng vaccine. N hóm lác già Thune, dại học bang Louisiana dã lạo thành công chủng E. ìctalurì dột biến gen aroA bằng phương pháp tiếp họp vói chùng E. ictalurí hoang dại vào năm 1999 |4 9 |. Trong cùng nghiên cứu, chùng E. ictaluri dột biến được thử nghiệm vaccine bằng các phương pháp ngâm ở các nồng độ 1o7 cfu/ml và M r cfu/m l. Sau 4 tuần, cá được ngâm tăng cưtmg với chủng đột biến một lần nữa với cùng nồng độ lần đầu (107 cfu/ml v à 10s cfu/m l). Bốn tuần sau, cá tiếp tục đuợc ngâm với chùng E. icialuri hoang dại với nồng độ 107 cfu/ml. Cá chết được ghi nhận trong mỗi 24 giờ sau khi ngâm cho dến khi không còn cá chết ừong 3 ngày. Kết quà thu dược như sau: Tỷ lệ sống của cá dạt 54,1 - 63,8% khi dược ngâm m ột lần và 77,3 - 94,4% khi dược ngâm lăng cưởng vói chùng dột biến. N hóm nghiên cứu dã dưa ra kêt luận lân ngâm thứ 2 giúp táng đáng ke khá nàng báo vệ cùa vaccine [49J. Nghiên cứu gần đây cùa Javier Santander và cộng sụ (2011) khi thục hiện loại bò gcn c.rp cùa chùng E. ictalurì cho thấy, chững bị loại bỏ gcn crp giâm sự phát triển, mất khá năng sử dụng maltose, và thiếu khá năng tạo tiêm mao [321. Chùng E. icialurì hoang dại gây chết 50% Cit ớ nồng dộ liêm 10s efu/cá và 100% ở nồng dộ 107, 10R cíu/cá; trong khi dó chúng E. ictalurì dột biển gen crp không gây chết cá ớ nồng dộ liêm 107 efu/cá và nhó hơn 20% ờ 20% ớ 10s cíu/cá. K há năng báo hộ cùa E. ictaluri bị loại bò gen crp trong nghiên cứu này đạt 100% sau 30 ngày th í nghiệm công cường độc với chúng E. ictaluri hoang dại cho cá đã được kích thích miễn dịch với E. ictahtri đột biến gcn crp [321. Như vậy, trên thế giới đã có nhiều công trình nghicn cứu vè chùng E. icíalurí bị dột biển gen cho mục dích tạo vaccine sống nhược dộc phòng bệnh do E. ictalurí gây ra trên cá da ươn. Những sán phẩm vaccine tạo ra ớ dạng này có khà năng kích thích 6 sinh kháng thê và kích hoạt miễn dịch trung gian tc bào, vi khuẳn bị làm ycu độc lực không có khà năng hoàn độc do không tái tạo lại đoạn gcn gây bộnh hay gcn khuyết dưỡng dã bị loại bó. I. 1.2. Tại Việt Nam Nhiều nghiên eíru trong nước lạo vi khuấn E. ìctaluri bấl hoạt bang nhiều phưong pháp khác nhau đè dung làm nguyên liệu sán xuàt vaccine. Nguyễn Hữu Thịnh và cộng sự (2009) thứ nghiệm vaccine bât hoạt vi khuân E. ictaluri báng phương pháp ngâm kết hợp cho ăn 2 làn, kct quá cho tỳ lộ bào hộ đạt .“52% [47]. Tuy nhicn, kê tù khi sù dụng vaccine phòng bệnh cho vật nuôi thùy sàn năm 1987 [381. dến nay vẫn có Í1 những sàn phẩm vaccine sống dược tạo ra dáp ứng nhu cầu cùa thị inrờng. Việc ứng dụng công nghệ sinh học tạo các vi sinh vật dột biển dung là m nguyên liệu sán xuất vaccine (rong lĩnh vực (hủy sàn Việl N am hiện nay chỉ có ớ giai đoạn bắt đâu. Trong đẽ án phát triên và úng dụng công nghệ xinh học trong lĩnh vực thúy sán cúa chính phủ Việt Nam, nãm 2010 đã trièn khai thực hiện đê tài câp N hà ntrớc ' ‘Nghicn cứu tạo dòng vi khuan Edwardsiella ictaluri nhược độc dung làm vaccine phòng bệnh gan thận mù cá tra ( Pangasianodon hypopìuhaỉmus) bằng kỹ thuật gây dột biến gen” do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sán i l l chù trì. Nhóm nghiên cứu phối họp vói Trung lâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí M inh dã lạo thành công 03 chùng vi khuấn: E. ictalurì bị dột biến gen purA, E. ictaluri bị dột biển gen aroA và E. ìctaluri bị đột biên gen ch [11]. Các chủng vi khuân đột biến này đã được xác định là ôn đjnh vê mặt kiêu gen và kiêu hình so với chủng vi khuân gốc ban đâu n n , r i 2i. Như vậy, có the thấy ràng vi ộc nghiên cứu chùng E. ictaluri bị đột bicn gcn cho mục dịch lạo vaccine sống nhược dộc phòng bệnh gan thận mù cá ư a ớ Việt Nam chi m ói dược bắl dẩu lừ năm 2010 khi chính phù khởi dộng chương (rình ứng dụng công nghệ sinh học ưong lĩnh vực thùy sãn. Cho dến nay, chưa có công trình và sàn phấm nào trong nước công b ố về vaccine nhược độc phòng bệnh gan thận 111Ù cá tra do E. ictaluri gây ra. 1.2 N hũng nghicn cún về đặc điểm sinh học, khâ năng gây bệnh trên cá tra của vi khuân E . ictalurì phân lập trên cá tra Việt Nam và cá nheo (catfish) Hoa KỶ. 1.2.1 Đặc diêm hình thái, sin h lý và sin h vật hóa học vi kh u â n E. ictaluri Trong hộ thống phân loại cùa Bcrgcy, vi khuần EdwardStella icialuri thuộc giống Edwardsie.Ua, họ Enierobacieriaceae, bộ Enierobacteriales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria. Giong Edwardsieüa có các dặc diêm là: vi khuấn dạng hình que thẳng, nhó, kích thước 1pm X 2-3 pm. gram âm, cỏ khà năng di dộng bằng vành lông rung (perilrichous flagella) ờ nhiệt dộ 25 động ờ 37 c, không di c. yếm khi' tùy tiện. Loài vi khuân Edwardsiella ictaluri là một trong những loài khó nuôi cay trên môi trường nhân tạo nhầt trong số các loài thuộc giông Edwardsiella. Chúng sinh trường yêm khí tùy tiện và phát triên chậm trên môi trường thạch BHT (Brain Heart Tnfusion), sau 48 giờ nuôi cấy ớ 28 c , vi khuấn tạo nên khuấn lạc hình tròn, bóng có kích thước khoáng 2 mm, màu trắng, không có nhân, rìa có dạng không đồng nhất [3], T24], [42]. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là vi khuần hình que, gram âm, phẩn lớ n ờ dạng don, dôi và mộl số dạng chuỗi, kích thước khoảng 0,75 X 2,5 p m ở 26"c [28|, chuỗi vi khuẩn kéo dài 5-7 p m khi ớ 37 c |39J hoặc có thế biển thiên 1,2-15 gm [54]. Vi khuân có khả nãng chuyên động bang tiêm mao, di động yếu ở 25-30°C nhưng không di động ở nhiệt độ cao hơn [40]. Vi khuân Edwardsiella ìctaluri có khả nàng phát triên tôt ở khoáng nhiệt độ tòi ưu 22 - 28“c [41], pH thích hợp cho vi khuẩn phát triền là 7,0 - 7,5 v à phát triền tốt nhất trong môi trường có nồng độ muối là 0,5%, nhưng không chịu được độ muối cao hon 1,5% [39|, [40J. E. ictaluri (hường dược phân lập lừ môi Irưòng nuôi, (ừ nội quan hoặc m ô não cá bị bệnh. Trong môi trường nước, vi khuẩn E. ictaluri có thể tồn lại khoáng 9 ngày [41], còn trong môi trường bùn. đáy ao vi khuân E. ictaluri có khà nàng tồn tại trong vòng 1 tháng [26] đến 95 ngày khi ở nhiệt độ lạnh [30]. [41]. Vi khuân E. ictaluri có khả năng sứ dụng D-glucose và một số đường khác kèt quà sinh ra a xít và thường sinh hoi. Oxidase âm tính, catalase dương tính, Vogcsproskaucr và simmon citrate âm tính, I.DC dương tính, ODC dương tính, khừ Nitrate thành Nitrite. Vi khuẩn cho phàn ímg deslrose, dulcilol. fructose, galactose, maltose, mannose và saliem dương tính. Ngoài ra, E. ìctaluri cũng cho kếl quã dương tính vói lysine, ornithine,glucose, mannitol và mellibiose 129], [33], Vi khuân này là nguyên nhân gây bệnh ớ cá da trơn (cattish) và một số động vặt khác, hiếm khi là là tác nhân gây bệnh cơ hội cho người. 8 1.2.2 N h ữ n g nghiên c ứ u về kh ả năng gây bệnh trên cá tra n u ô i của vi kh u ẩ n E. ictaluri Vi khuấn E. ictalurí lần dầu liên dược xấc dính là lác nhân gâv bệnh gan (hận mù Irên cá Ira ỡ dồng bằng sông Cứu Long bời Crumlish và cs (2002) |24J. Các kểl quả nghiên cứu cùa T ừ Thanh Dung (2004) |3J, Trần Thị Minh Tâm (2003) [14J, Nguyễn Hữu Thịnh và cộng sụ (2007) [16], Lý Thị Thanh Loan (2007) [9] trên cá tra bị bệnh gan thận mủ cho thay một phức hợp gôm nhiêu tác nhân gây bệnh gôm: Edwardsiella icialuri, E. tarda. Aeromonas sp., Pseudomonas. Hafnia alvei, Plesiomonas shigelloides. Vibrio, Klebsiella. Bacillus. Entercoccus, Enterobacter, Closiridinium spp... Tuy nhiên, có hai nghiên cứu dáng chú ý nhất dó là: K ết luận của dề lài “Nghiên cứu bệnh dốm trắng Irên cá Ira nuôi công nghiệp’' cùa Trần T hị M inh T âm (2003) 114] dã phòng doán lác nhân gây bệnh dốm (rang lức bệnh gan Ihận mủ Irên cá ừa là do vi khuân Haßlia alvei và Plesiomonas shigelloides dựa trên tần suât băt gặp cao nhất (73,1% cho Hafiiia alvei và 31.9% cho Plesiotnotias shigelloides), kèt quà cảm nhiễm đc thừ độc lực và phàn úng vi ngưng kết với kháng nguyên toàn phần. Tuy nhicn, thông tin gần đây lại cho thay, sau khi kiềm chúng lại bằng kỹ thuật PCR thì vi khuẩn Hafnia alvei chính là vi khuấn E. ictalurí 114]. Nghiên cứu Ihứ 2 dó là sàn phấm họp lác cùa iriròng Đại Học Stirling (Anh) vói Trường Đ ại học c ẩ n Thơ kểl luận: lác nhân gâv bệnh gan (hận mil Irễn cá Ira là do vi khuẩn Edwardsiella ictalun |2 4 |. Sau dỏ, Viện nghiên cứu nuôi trống thúy sàn 11 phôi hợp với Công ty thuôc thú y trung ương 11 (NAVETCO) tiến hành điều tra thu mẫu cá tra bệnh tại các vùng địa lý khác nhau ờ các 0 dịch và xác định chính vi khuẩn Edwardsiella icialurì là tác nhân gây bệnh gan thận mù nhờ vào kết quà phân lập định danh vi khuân, kicm tra sinh hóa v à kiềm chứng bằng kỹ Ihuậl PC R ]14| Cho dến nay, các nghiên círu về lác nhân gâv bệnh gan Ihân mù irên cá Ira nuôi ờ dồng bằng sông Cừu Long Việl Nam như: Crumlish (Đại học Slừling-Anh) [24|; nghiên cứu cúa nhóm Công ty Bayer Việt Nam; nghiên cứu cùa nhóm công ty Pharma Na uy; nghiên cửu cúa Viện Nghiên cửu Nuôi trông T húy sàn II kêt hợp với NAVETCO; nghicn cứu cùa Dặng Thị H oàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương (Dại học Cần Thơ) năm 2009 [13]; nghiên cứu cũa Dồng Thanh Hà v à Dỗ Thị Hòa (Dại học N ha Trang) năm 2009 [6| dã cùng di dển kếl luận mói nliấl lại tại hội ihão bàn về lác nhân gâv bệnh gan lliận mủ ừên cá Ira do Bộ NN&PTNT lỗ chức lại Tp. H ồ Chí 9 Minh vào ngày 11/8/2009: Vi khuẩn E. icialuri là một tác nhân thực sự gây bệnh gan thận m ù trcn cá tra nuôi tại Việt Nam [111. Thcm vào đó, nhóm nghiên cứu của Crumlish (Đại học Slirling-Anh) khẳng dính rằng chủng vi khuẩn E.ictalurí ờ Hoa Kỳ và chủng vi khuẩn E. ictaluri ở Việt N am có mộl số sai khác dáng kễ |24J. Cá tra bệnh gan thận mủ do vi khuân £. ictaluri có thế có hoặc không xuât hiện dáu hiệu bất thường ô bên ngoài. D a số thề hiện dấu hiệu xuất huyết nhẹ ờ các gốc vây, xung quanh miệng và vùng bụng, hoặc kèm theo dấu hiệu trang mang (mang nhợt nhạt, liếl nhiều nhớt). Giãi phẫu nội lạng cho Ihấy 100% cá bệnh dều (ồn lại cùa các dổm Irắng có dường kinh 0,5-3.Omm ớ các lỗ chức nội lạng nlnr gan. (hận, lá lách. Các dốm trăng thường xuất hiện trước tiên ờ thận, làm thận sung to gấp 2-3 lân bình thường và mềm nhũn, khi bệnh nặng mcri có thê quan sát thấy ờ tỳ tạng và gan. các đốm trang ờ gan thường thưa và nhỏ hơn ở thận [6J. Bệnh do vi khuẩn E. iclaluri gây ra trên cá tra ớ đồng bang sông Cữu T.ong xuất hiện hàng năm và theo mùa vụ, thuờng vào tháng 8 -11 trong đó đinh cao nhắt vào Iháng 9 [10J. Vi khuấn E. ictalurì gây bệnh cho cá ưa ở mọi lứa tuồi, ihường gặp nhấl và gây chểl nhiều nliấl ở cá ưa dưới 3 tháng luỗi |10J. Việc phòng và ư ị bệnh do vi khuân E. ictaìuri cho cá tra hiện nay ờ Việt Nam vẫn hoàn toàn dựa vào kháng sinh và hóa chất. Phần lớ n khi có bệnh xảy ra trên cá tra, người nuôi sứ dụng nhiễu loại kháng sinh kêt hợp nham điêu tộ có hiệu quà cho tàt cá các bệnh nhiễm khuân nói chung. Việc sủ dụng thuốc nhu vậy dẫn đen tình trạng kháng thuốc cùa vi khuần ngày một gia tăng, đồng thời gây ánh hường lớn đến chất luợng thực phẩm v à gây ô nhiễm môi ưuòng |10J. Do vậy, phòng bệnh gan ihận mù cá ư a bắng vaccine là vấn dề dược dặl ra cho công nghiệp nuôi cá ưa hiện nay. Những nghiên cứu về cơ ché xâm nhập của vi khuân E. ictalurí vào trong dạ dày cùa cá cho thày: E. ictaluri xâm nhập vào l(’yp biếu mô, sau đó được thực bào bói các đại thục bào ngoại vi nam dưới l(’rp biêu mô [21J, [37J. [50J. Tuy nhiên, lại không phát hiện thấy các tồn thuơng ờ vùng te bào biếu mô nen người ta cho rằng E. icialurì xuycn qua lóp tế bào biểu mô nen nhờ vào các hệ thống vận chuyền bình thường cũa lế bào. Lập luận này cũng dược củng cố bới quan sál của Thune (1993) rằng Ihòi gian cho sự xâm nhập nhanh chống của E. ictaluri qua lóp lế bào biểu mô nền khổng dủ dễ tòng hợp các protein chức nãng cho quá trình xâm nhập này [50]. Nhìn chung, vi
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan