Tài liệu Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng nhân sinh khối nấm isaria tenuipes để ứng dụng phòng trừ sâu khoang spodopptera litura (fab.) hại cây trồng

0 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH TRẦN VĂN CẢNH NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG NHÂN SINH KHỐI NẤM Isaria tenuipes ĐỂ ỨNG DỤNG PHÒNG TRỪ SÂU KHOANG Spodopptera litura (Fab.) HẠI CÂY TRỒNG CHUYÊN NGÀNH: TRỒNG TRỌT Mã số: 60.62.1 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. TRẦN NGỌC LÂN 1 VINH - 2012 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, các số liệu được thu thập qua các thí nghiệm do bản thân tiến hành và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan các thí nghiệm để thu thập số liệu trong luận văn đã được chính bản thân tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ Phòng thí nghiệm Công nghệ Nấm ký sinh côn trùng, Khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Vinh, với sự đồng ý và hướng dẫn của PGS.TS. Trần Ngọc Lân là giáo viên hướng dẫn, các đồng nghiệp và các kĩ thuật viên phụ trách phòng thí nghiệm. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Vinh, tháng 10 năm 2012 Tác giả Trần Văn Cảnh 3 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Chuyên ngành Trồng trọt, tôi đã luôn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phía thầy cô, đồng nghiệp, người thân, bạn bè, các nhà khoa học. Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới PGS. TS. Trần Ngọc Lân, người đã dẫn dắt, định hướng cho tôi từ những bước đầu làm nghiên cứu khoa học, rất tận tâm và nhiệt tình hướng dẫn tôi suốt thời gian làm đề tài cũng như trong quá trình công tác. Thầy luôn động viên, khuyến khích và mang đến cho tôi niềm say mê nghiên cứu khoa học. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Nguyễn Tài Toàn, TS. Nguyễn Thị Thanh, ThS. Nguyễn Thị Thúy tổ bộ môn Bảo vệ thực vật, cùng các kĩ thuật viên phòng thí nghiệm đã hướng dẫn, giúp đỡ về chuyên môn và tạo điều kiện về cơ sở vật chất cho tôi trong quá trình làm việc và thực hiện đề tài; cùng các em sinh viên đã rất nhiệt tình hỗ trở tôi trong nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm cùng tập thể cán bộ trong Khoa Nông Lâm Ngư, Ban lãnh đạo Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện cho tôi trong công tác, học tập và nghiên cứu đề tài. Xin chân thành cảm ơn các nhà khoa học, đề tài KH & CN: Đề tài Nghị định thư giữa Trường Đại học Vinh (Việt Nam) và BIOTEC (Thái Lan): “Hợp tác nghiên cứu xác định một số loài nấm ký sinh trên côn trùng và tuyển chọn một số loài nấm đặc hữu có hoạt chất sinh học làm dược liệu”, Mã số: 04/2009/HĐ-NĐT, đã hỗ trợ kinh phí và phương pháp nghiên cứu cho tôi để thực hiện đề tài. Và tôi xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt tới người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ, hỗ trở tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Vinh, tháng 10 năm 2012 Tác giả Trần Văn Cảnh 4 MỤC LỤC TT 1. 2. 3. 4. 5. 1.1. 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3. 1.1.3.1. 1.1.3.2. 1.1.4. 1.1.4.1. 1.1.4.2. 1.1.4.3. 1.1.5. 1.2. Nội dung Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt viii Danh mục bảng ix Danh mục hình ảnh, đồ thị xi MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết của việc nghiên cứu đề tài 1 Mục đích nghiên cứu 2 Nội dung nghiên cứu 3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3 Yêu cầu và phạm vi nghiên cứu 3 Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 Cơ sở khoa học 4 Khái niệm nấm ký sinh côn trùng 4 Cơ chế tác động của nấm lên cơ thể côn trùng 4 Nhân nuôi sinh khối vi nấm 7 Dinh dưỡng của vi sinh vật 7 Nhân nuôi sinh khối nấm trên môi trường rắn 8 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của Isaria tenuipes 10 Đặc điểm phân loại và phân bố của Isaria tenuipes 10 Đặc điểm hình thái của Isaria tenuipes 11 Đặc điểm cấu trúc của Isaria tenuipes 12 Đặc điểm sinh học, sinh thái của sâu khoang 14 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trên thế giới và Việt 19 Nam 1.2.1. Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trên thế giới 1.2.1.1. Nghiên cứu về công nghệ lên men nấm ký sinh côn trùng và 19 19 nấm I. tenuipes 1.2.1.2. Tình hình nghiên cứu sử dụng nấm I. tenuipes để kiểm soát sâu hại 1.2.1.3. Tình hình nghiên cứu biện pháp phòng trừ sâu khoang trên thế giới 1.2.1.4. Tình hình nghiên cứu lựa chọn nguồn dinh dưỡng làm tăng 19 23 25 1.2.2. sinh khối và độc lực của nấm ký sinh côn trùng Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam 26 5 1.2.2.1. Nghiên cứu về công nghệ lên men nấm ký sinh côn trùng 1.2.2.2. Nghiên cứu biện pháp phòng trừ sâu khoang 1.2.2.3. Nghiên cứu sử dụng nấm ký sinh côn trùng phòng trừ sâu 26 28 30 khoang 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.4.1. 2.4.2. 2.4.3. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Quy trình nghiên cứu Đối tượng và vật liệu nghiên cứu Thời gian và địa điểm nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Phương pháp phân lập, nuôi cấy nấm Isaria tenuipes Phương pháp bảo quản nấm Isaria tenuipes ở dạng slopes Phương pháp đánh giá sự sinh trưởng và phát triển của nấm trên 32 32 33 33 33 33 34 35 các loại môi trường (môi trường thạch, môi trường lỏng, môi trường rắn) Phương pháp nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của I. 35 tenuipes trên môi trường thạch (môi trường nhân giống cấp 1) 2.4.3.2. Phương pháp nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của 38 nấm trên môi trường lỏng (mô trường nhân giống cấp 2) 2.4.3.3. Phương pháp nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển trên môi 39 2.4.4. trường rắn Phương pháp đánh giá hiệu lực chế phẩm nấm I. tenuipes 42 2.4.5. phòng trừ sâu non sâu khoang trong phòng thí nghiệm Phương pháp hồi quy tuyến tính xác định tốc độ tăng trưởng 43 2.4.6. của khuẩn lạc và tốc độ phát sinh bào tử trên môi trường Phương pháp phân tích probit xác định LC50 và LT50 44 Phương pháp xác định nồng độ bào tử Phương pháp xử lý số liệu Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Nghiên cứu lựa chọn chủng nấm và tối ưu điều kiện nhân giống cấp Ảnh hưởng của các loại môi trường thạch đến sự sinh trưởng và 45 47 48 48 48 phát triển của của I. tenuipes VN2012 và VN2013 3.1.1.1. Ảnh hưởng của các môi trường thạch đến khả năng mọc mầm 49 của bào tử của I. tenuipes VN2012 và VN2013 3.1.1.2. Ảnh hưởng của các loại môi trường thạch đến khả năng tăng trưởng 50 2.4.3.1. 2.4.7. 2.4.8. 3.1. 3.1.1. 6 đường kính khuẩn lạc của I.tenuipes VN2012 và VN2013 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của 52 hai chủng nấm I. tenuipes VN2012 và VN2013 3.1.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự nảy mầm của bào tử hai 53 chủng nấm I. tenuipes VN2012 và VN2013 3.1.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tăng trưởng đường kính 54 3.2. khuẩn lạc hai chủng nấm I. tenuipes VN2012 và VN2013 Nghiên cứu lựa chọn môi trường và phương pháp nhân giống 58 3.2.1. cấp 2 trên môi trường lỏng cho I. tenuipes VN2012 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến quá trình sinh trưởng 58 và phát triển của I. tenuipes VN2012 3.2.1.1. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng đến khả năng tạo khối 58 lượng I. tenuipes VN2012 trên môi trường lỏng 3.2.1.2. Khả năng sinh bào tử của I. tenuipes VN2012 trên các môi 60 trường lỏng Ảnh hưởng của thời gian nuôi đến khả năng sinh trưởng của 61 I. tenuipes VN2012 trên bề mặt môi trường lỏng 3.2.2.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi đến khả năng tạo khối lượng 61 của I. tenuipes VN2012 trên bề mặt môi trường lỏng 3.2.2.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi đến khả năng sinh bào tử của 62 I. tenuipes VN2012 trên bề mặt môi trường lỏng Nghiên cứu khả năng sinh trưởng của I. tenuipes VN2012 64 trên môi trường lỏng lắc 3.2.3.1. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh bào tử của I. 64 tenuipes VN2012 trong môi trường lỏng lắc 3.2.3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi đến khả năng sinh bào tử nấm 65 3.3. I. tenuipes VN2012 trong môi trường lỏng lắc Nghiên cứu lựa chọn môi trường rắn và thành phần bổ sung 66 3.3.1. cho nấm I. tenuipes VN2012 có hiệu lực cao trên sâu khoang Ảnh hưởng của các môi trường hạt đến khả năng sinh trưởng 66 và phát triển của I. tenuipes VN2012 3.3.1.1. Ảnh hưởng của các loại môi trường hạt đến khả năng phát 66 3.1.2. 3.2.2. 3.2.3. 7 triển sợi nấm của I. tenuipes VN2012 3.3.1.2. Ảnh hưởng của các loại môi trường hạt đến khả năng sinh 66 bào tử của I. tenuipes VN2012 3.3.2. Ảnh hưởng của các loại bột tằm bổ sung trong môi trường rắn 69 đến khả năng sinh trưởng và độc lực của nấm I. tenuipes VN2012 3.3.2.1. Ảnh hưởng của các loại bột tằm bổ sung đến khả năng sinh 69 trưởng và phát triển của I. tenuipes VN2012 3.3.2.2. Hiệu lực của nấm I. tenuipes VN2012 thu từ môi trường rắn 70 có bổ sung hai loại bột tằm trên sâu khoang Xác định tỷ lệ bổ sung và thời điểm thu hồi sinh khối chế phẩm 72 nấm I. tenuipes VN2012 trên môi trường rắn đã lựa chọn 3.3.3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ bột ấu trùng tằm đến khả năng phát triển 72 sợi nấm trên môi trường rắn của I. tenuipes VN2012 3.3.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ bột ấu trùng tằm bổ sung đến sự sinh 72 bào tử trên môi trường rắn của I. tenuipes VN2012 Thu sấy tạo chế phẩm và đánh giá hiệu lực của chế phẩm I. 74 tenuipes VN2012 trên sâu khoang 3.3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy chế phẩm đến khối 74 lượng và nồng độ bào tử của nấm I. tenuipes VN2012 3.3.4.2. Hiệu lực của chế phẩm nấm I. tenuipes VN2012 trên sâu 76 3.3.3. 3.3.4. 3.4. khoang Tổng hợp quy trình nhân sinh khối nấm I. tenuipes VN2012 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC BÀI BÁO TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC HÌNH 78 80 80 81 82 83 94 8 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT Chữ viết tắt BTTN Bt CT C. CV% ĐTHT EPF EPF I. VN2012 VN2013 LSD MT SD TB TN VQG NSP NSC Nội dung Bảo tồn thiên nhiên Bào tử Công thức Cordyceps Độ biến thiên của mẫu Đông trùng - Hạ thảo Entomopathogenic fungi Entomology Pathogenic Fungi Isaria I. tenuipes VN2012 I. tenuipes VN2013 Phương sai mẫu Môi trường Độ lệch chuẩn Trung bình Thí nghiệm Vườn Quốc Gia Ngày sau phun Ngày sau cấy DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Bảng 1.1. Bảng 3.1. Tên bảng Trang Các kiểu hình của Isaria tenuipes 11 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến thời gian nảy 49 9 Bảng 3.2. Bảng 3.3. mầm (GTx) của của I.tenuipes VN2012 và VN2013 Tốc độ tăng trưởng của hệ sợi nấm trên các môi trường Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian nảy mầm (GT x) 50 53 Bảng 3.5. của hai chủng nấm I.tenuipes VN2012 và VN2013 Tốc độ tăng trưởng khuẩn lạc của hai chủng nấm theo 56 Bảng 3.6. thời gian Khả năng phát triển sợi nấm trên bề mặt các môi 58 Bảng 3.7. trường lỏng của I. tenuipes VN2012 Khả năng tạo sinh khối nấm I. tenuipes VN2012 trên 59 Bảng 3.8. các môi trường lỏng Khả năng sinh bào tử I. tenuipes VN2012 trên các loại 60 Bảng 3.9. môi trường lỏng Khả năng tạo sinh khối nấm theo thời gian của I. 61 tenuipes VN2012 Bảng 3.10. Khả năng phát sinh bào tử theo thời gian của I. 63 tenuipes VN2012 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh bào tử và 64 kích thước hạt nấm Bảng 3.12. Nồng độ bào tử theo thời gian nuôi trên môi trường 65 lỏng lắc của I. tenuipes VN2012 Bảng 3.13. Khả năng sinh bào tử trên các loại môi trường hạt của 67 I.tenuipes VN2012 Bảng 3.14. Khả năng sinh bào tử của I. tenuipes VN2012 trên 69 môi trường rắn với các loại bột bổ sung khác nhau Bảng 3.15. Hiệu lực của nấm I. tenuipes VN2012 từ môi trường 70 rắn có bổ sung hai loại bột tằm khác nhau trên sâu khoang Bảng 3.16. Thời gian gây chết 50% và 70% số sâu khoang của 71 I.tenuipes VN2012 từ môi trường rắn có bổ sung các loại bột khác nhau Bảng 3.17. Khả năng phát sinh bào tử của I. tenuipes VN2012 trên môi trường rắn với các hàm lượng bột ấu trùng 73 10 tằm khác nhau Bảng 3.18. Khối lượng và nồng độ bào tử của I. tenuipes VN2012 75 thu được trên môi trường rắn sau khi sấy ở các mức nhiệt độ và thời gian khác nhau Bảng 3.19. Hiệu lực của chế phẩm I. tenuipes VN2012 trên sâu 76 khoang ở các mức nồng độ khác nhau DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình Hình 1.1. Nội dung Chu trình xâm nhiễm chung của nấm ký sinh côn Trang 6 Hình 1.2. trùng Mẫu vật, cấu trúc sinh bào tử và PDA của I. tenuipes 13 a-d. nấm trên vật chủ, e-g. cấu trúc sinh bào tử, h-i. Hình 3.1. bào tử đính, j-m. khuẩn lạc trên môi trường PDA Sự tăng trưởng đường kính khuẩn lạc của I. tenuipes 51 Hình 3.2. VN2012 Sự tăng trưởng đường kính khuẩn lạc của I. tenuipes 51 Hình 3.3. VN2013 Khuẩn lạc của I.tenuipes VN2012 trên các môi 52 Hình 3.4. trường thạch sau 5 ngày nuôi Đặc điểm khuẩn lạc của I.tenuipes VN2013 trên các 52 Hình 3.5. môi trường thạch sau 5 ngày nuôi Tăng trưởng khuẩn lạc I. tenuipes VN2012 trên 5 54 11 Hình 3.6. mức nhiệt độ Tăng trưởng khuẩn lạc I. tenuipes VN2013 trên 5 55 Hình 3.7. mức nhiệt độ Khuẩn lạc I. tenuipes VN2012 ở 5mức nhiệt độ sau 57 Hình 3.8. 14 ngày Khuẩn lạc I. tenuipes VN2013 ở 5mức nhiệt độ sau 57 Hình 3.9. 14 ngày Sinh khối nấm I. tenuipes VN2012 trên các loại môi 59 Hình 3.10. Hình 3.11. trường lỏng Sự phát triển trên bề mặt của I. tenuipes VN2012 Sự tăng và giảm giữa khối lượng và dung tích môi 59 62 Hình 3.12. Hình 3.13. trường trên môi trường lỏng của I. tenuipes VN2012 Nhân giống lỏng I. tenuipes VN2012 trên máy lắc Sự phát triển ăn sâu vào môi trường của nấm I. 65 66 Hình 3.14 Hình 3.15. tenuipes Nhân nuôi sinh khối nấm I. tenuipes Khả năng phát sinh bào tử của nấm I. tenuipes trên các 66 68 Hình 3.16. môi trường hạt ngũ cốc Khả năng sinh trưởng của nấm I. tenuipes trên các 68 Hình 3.17. môi trường hạt ngũ cốc sau 30 ngày nuôi Sự phát triển của I. tenuipes VN2012 trên môi trường 69 Hình 3.18. gạo lứt có bổ sung bột tằm Khả năng phát triển sợi nấm trên môi trường gạo tẻ 72 có bổ sung tỷ lệ bột nhộng tằm khác nhau của I. Hình 3.19. tenuipes VN2012 Sự phát sinh bào tử trên môi trường rắn của I. 73 tenuipes VN2012 với các mức hàm lượng bột nhộng Hình 3.20. tằm khác nhau Hiệu lực của chế phẩm I. tenuipes VN2012 trên sâu khoang tuổi 3 trong điều kiện phòng thí nghiệm 77 12 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nông nghiệp là ngành tạo ra sản phẩm thiết yếu nhất cho con người. Nhưng một trở ngại quan trọng nhất đối với sản xuất nông nghiệp là dịch hại. Hàng năm dịch hại có thể làm mất 20 - 30% năng suất, khi bị nặng thì có thể làm giảm năng suất từ 40 - 50%, thậm chí mất trắng (FAO, 2000). Trong đó, Sâu khoang (Spodoptera litura Fab.) là một trong những đối tượng dịch hại nguy hiểm. Trên đồng ruộng, sâu khoang là loài sâu đa thực gây hại nghiêm trọng trên rất nhiều đối tượng cây trồng với 290 loại cây trồng thuộc 99 họ thực vật, nhất là các loại rau, lạc, đậu, cây thực phẩm, cây công nghiệp, cây lương thực; và đã phát triển thành dịch hại ở nhiều vùng. Việc phòng trừ hiệu quả loại sâu hại này sẽ mang lại lợi ích nhiều mặt cho người sản xuất. Đồng thời mang lại cho chúng ta khả năng bảo vệ được nhiều loài nông sản chỉ qua một cách phòng trừ. Hiện nay, vấn đề phòng trừ sâu khoang bằng thuốc hóa học đang là thách thức đối với người sản xuất. Vì vậy, xu hướng đang được ưu tiên, quan tâm và ứng dụng rộng rãi là bảo vệ, duy trì và lợi dụng các loài thiên địch, đồng thời nghiên cứu các biện pháp để nhân sinh khối và đưa chúng ra phòng trừ ngoài đồng ruộng. Một trong những nguyên lý cơ bản nhất của biện pháp là “Sử dụng tối đa các nhân tố gây chết tự nhiên của dịch hại”. Nấm ký sinh côn trùng có nhiều tiềm năng trong phòng trừ sinh học. Cho đến nay, ở nước ta mới chỉ có một số dẫn liệu nghiên cứu sử dụng 4 loài 13 nấm ký sinh côn trùng trong việc phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng như: Paecilomyces sp., Nomurae rileyi, Beauveria spp., Metarhizium spp. phòng trừ sâu hại (Phạm Thị Thuỳ và nnk, 2005[19]; Trần Văn Hai, 2006[23]), nghiên cứu sử dụng nấm Metarhizium anisopliae phòng trừ bọ cánh cứng hại dừa ở các tỉnh phía Nam (Nguyễn Thị Lộc và nnk, 2002)[10], kết quả nghiên cứu tại Bộ môn Công Nghệ vi sinh (Đại học Vinh) về Beauveria, Metarhizium của Lê Như Trang (2008)[30]. Những nghiên cứu trên cho thấy tiềm năng của ứng dụng nấm ký sinh côn trùng trong kiểm soát sâu hại, tuy nhiên việc tìm kiếm loài mới có tiềm năng hơn là cần thiết. Nấm Isaria tenuipes (trước đây là Paecilomyces tenuipes hay Paecilomyces japonica) trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng thương mại để kiểm soát sâu khoang, sâu tơ, rệp vừng và rệp phấn trắng hại rau. Nhưng những nghiên cứu về môi trường dinh dưỡng để làm tăng hiệu lực và sinh khối của chủng nấm này là rất ít. Qua nghiên cứu ở Vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An cho thấy sự đa dạng cao của nấm Isaria tenuipes trên nhiều vật chủ, là tiềm năng lớn cho ứng dụng trong phòng trừ sinh học và thực phẩm chức năng (Trần Ngọc Lân và nnk, 2008)[26]. Cũng như các nước trên thế giới ở Việt Nam chưa có một công trình nghiên cứu nào về môi trường dinh dưỡng nhân nuôi và ứng dụng loại nấm này để kiểm soát sâu hại, đặc biệt là sâu non sâu khoang. Vì vậy, để đóng góp những dẫn liệu làm cơ sở cho biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) và (IPM-B) ứng dụng nấm ký sinh côn trùng phòng trừ sâu hại chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng nhân sinh khối nấm Isaria tenuipes để ứng dụng phòng trừ sâu khoang Spodoptera litura (Fab.) hại cây trồng”. 14 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu lựa chọn môi trường dinh dưỡng tối ưu cho quá trình nhân sinh khối chủng nấm Isaria tenuipes để ứng dụng phòng trừ sâu khoang Spodoptera litura (Fab.) hại cây trồng. 3. Nội dung nghiên cứu (i) Nghiên cứu lựa chọn chủng nấm và môi trường nhân giống cấp 1 trên cơ sở đánh giá ảnh hưởng của thành phần môi trường và nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hai chủng nấm Isaria tenuipes VN2012 và VN2013. (ii) Nghiên cứu lựa chọn môi trường nhân giống cấp hai và xác định thời điểm thu giống thích hợp nhất. (iii) Nghiên cứu lựa chọn môi trường rắn với sự bổ sung loại bột tằm (bột nhộng tằm, bột ấu trùng tằm) để có hiệu lực diệt sâu khoang lớn nhất. (iv) Đánh giá hiệu lực phòng trừ của chế phẩm nấm Isaria tenuipes đối với sâu khoang Spodoptera litura (Fab.) hại cây trồng trong điều kiện phòng thí nghiệm. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn * Cung cấp các dẫn liệu khoa học về môi trường dinh dưỡng của nấm Isaria tenuipes; góp phần nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam. * Xác định tiềm năng của loài mới trong biện pháp phòng trừ sinh học sâu khoang hại cây trồng bằng nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam. 5. Yêu cầu và phạm vi nghiên cứu 15 * Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng nhân sinh khối nấm theo định hướng ứng dụng, bước đầu đánh giá khả năng kiểm soát sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm. * Mẫu vật nấm được thu thập ở VQG Pù Mát, phân lập, nhân nuôi tại Phòng thí nghiệm Công nghệ nấm ký sinh côn trùng, Khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Vinh Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cơ sở khoa học 1.1.1. Khái niệm nấm ký sinh côn trùng Khái niệm “Nấm ký sinh côn trùng - Entomopathogenic fungi (EPF)” hay “nấm côn trùng - Insect fungi” được các nhà khoa học sử dụng như là một thuật ngữ đồng nghĩa, để chỉ về nhóm các loài nấm ký sinh gây bệnh cho côn trùng. Nấm ký sinh côn trùng là thuật ngữ chỉ nhóm sinh thái (những loài nấm ký sinh trên nhóm vật chủ là côn trùng Hexapoda/Insecta) mà không phải là đơn vị taxon phân loại. Nấm ký sinh côn trùng được phân chia thành 4 nhóm chính: (1) Ký sinh trong, tức là nấm ký sinh trong các nội quan, xoang cơ thể của côn trùng; (2) Ký sinh ngoài, tức là nấm phát triển trên lớp cuticun vỏ cơ thể côn trùng và gây nên bệnh hại cho côn trùng vật chủ; (3) Nấm mọc trên cơ thể côn trùng, tức là những nấm đã được trực tiếp hoặc gián tiếp chứng minh chúng ký sinh trên côn trùng; (4) Cộng sinh, có nghĩa là cả nấm và côn trùng cùng mang lại những lợi ích cho nhau trong mối quan hệ cùng chung sống (Samson et al., 1988) [45]. 16 1.1.2. Cơ chế tác động của nấm lên cơ thể côn trùng Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua con đường hô hấp, tiêu hóa hoặc qua cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn là qua lớp vỏ cuticun, tức là phải có sự tiếp xúc của bào tử nấm vào bề mặt cơ thể vật chủ. Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, khi đủ điều kiện ẩm độ bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp cuticun. Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính:  Giai đoạn xâm nhập Giai đoạn xâm nhập được tính từ khi bào tử nấm mọc mầm cho đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng. Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh mầm bệnh, giải phóng các enzyme ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, cenlulase. Các enzyme tạo ra nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và trong các chủng của một loài nấm. Hai enzyme quan trọng nhất là protease và chitinase tham gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein), liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng (Luangsaard et al., 2006 [52]).  Giai đoạn phát triển nấm trong cơ thể côn trùng đến khi côn trùng chết Đây là giai đoạn sống ký sinh của nấm. Trong xoang cơ thể côn trùng nấm tiếp tục phát triển, hình thành rất nhiều sợi nấm, chúng phân tán khắp xoang cơ thể theo dịch máu, phá hủy các tế bào máu và làm giảm tốc độ lưu thông máu. Toàn bộ các bộ phận nội quan bị xâm nhập. Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp, hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạp 17 và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài, kết quả là vật chủ mất khả năng kiểm soát hoạt động sống và dẫn đến chết (Phạm Văn Lầm, 2000) [15].  Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết Đây là giai đoạn sống hoại sinh của nấm ký sinh. Xác côn trùng chết là nguồn dinh dưỡng có giá trị cho các vi sinh vật. Thông thường, các bộ phận bên trong cơ thể côn trùng sẽ bị phân hủy bởi vi khuẩn hoại sinh. Trên bề mặt ngoài của cơ thể côn trùng, các nấm hoại sinh như Aspergillus spp., Penicillium spp. và Fusarium spp. định cư ở lớp biểu bì và cạnh tranh với vi khuẩn ở bên trong cơ thể côn trùng chết. Do nấm côn trùng có khả năng sản sinh ra các chất có hoạt tính như thuốc kháng sinh ức chế hoạt động của vi khuẩn và nấm hoại sinh khác nên chúng có thể cạnh tranh với các sinh vật này để tồn tại và phát triển, làm cho xác vật chủ không bị phân hủy. Sau khi nấm côn trùng đã sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bên trong cơ thể côn trùng, nó chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử. Ở giai đoạn nấm đâm xuyên, mọc thành sợi ra bên ngoài nó sử dụng toàn bộ tác động cơ học, sau đó các bào tử được hình thành trên lớp sợi nấm ở bề mặt cơ thể vật chủ. Nhiều côn trùng bị bao bọc toàn bộ bên ngoài bởi hệ sợi nấm và bào tử, vì vậy mà rất khó xác định loài côn trùng vật chủ (Luangsa-ard et al., 2006) [52]. 18 Hình 1.1. Chu trình xâm nhiễm chung của nấm ký sinh côn trùng Những cá thể sâu hại bị nhiễm nấm thường có các vệt chấm đen xuất hiện trên bề mặt, có thể tại nơi bào tử nấm bám vào và mọc mầm xâm nhiễm vào bên trong cơ thể vật chủ. Nơi xâm nhập của nấm Beauveria basiana thường có vệt chấm đen hình dạng bất định. Khi bị bệnh do nấm, sâu hại ngừng hoạt động khoảng 2 - 3 ngày trước thời điểm phát triển hoàn toàn của nấm ở trong cơ thể vật chủ. Nếu bị bệnh do nấm Beauvera thì sâu hại sẽ ngừng hoạt động khoảng 7 ngày trước khi chết. Cơ thể côn trùng bị chết do nấm côn trùng không bao giờ bị nát, mà thường vẫn giữ nguyên hình dạng như khi còn sống. Toàn bộ bên trong cơ thể sâu chết bệnh chứa đầy sợi nấm. Sau đó, các sợi nấm này mọc ra ngoài qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể sâu chết bệnh. Đây là đặc điểm rất đặc trưng để phân biệt sâu chết bệnh do nấm côn trùng với các bệnh khác (Phạm Văn Lầm, 2000) [15]. 1.1.3. Nhân nuôi sinh khối vi nấm 1.1.3.1. Dinh dưỡng của vi sinh vật Vi sinh vật sản xuất rất nhiều enzym, hầu hết là thực hiện trong chỉ một lượng nhỏ và được tham gia vào quá trình di động. Enzyme ngoại bào thường có khả năng tiêu hóa vật liệu không hòa tan chất dinh dưỡng như cellulose, protein và tinh bột và các sản phẩm tiêu hóa được vận chuyển vào trong tế bào, nơi chúng được sử dụng như là chất dinh dưỡng cho sự tăng trưởng. Dinh dưỡng của vi sinh vật được khái quát bởi ba yếu tố chính là nguồn dinh dưỡng Cacbon, nguồn dinh dưỡng Nitơ và nguồn dinh dưỡng khoáng. Bởi thành phần hoá học của tế bào vi sinh vật quyết định nhu cầu dinh dưỡng của chúng mà thành phần hoá học của các chất dinh dưỡng được cấu tạo từ các nguyên tố C, H, O, N, các nguyên tố khoáng đa và vi lượng. 19  Nguồn thức ăn cacbon của vi sinh vật Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ các nguồn thức ăn khác nhau phụ thuộc vào hai yếu tố: một là thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn này, hai là đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật. Thường sử dụng đường làm nguồn cacbon khi nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng. Các hợp chất hữu cơ chứa cả C và N (pepton, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch, nước chiết giá đậu...) có thể sử dụng vừa làm nguồn C vừa làm nguồn N đối với vi sinh vật.  Nguồn thức ăn nitơ của vi sinh vật Nguồn nitơ dự trữ nhiều nhất trong tự nhiên chính là nguồn khí nitơ tự do (N2) trong khí quyển. Vi sinh vật còn có khả năng đồng hoá rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là pepton loại chế phẩm thuỷ phân không triệt để của một nguồn protein nào đấy. Nhu cầu về axit amin của các loại vi sinh vật khác nhau là rất khác nhau.  Nguồn thức ăn khoáng của vi sinh vật Khi tạo các môi trường tổng hợp (dùng nguyên liệu là hoá chất) bắt buộc phải bổ sung đủ các nguyên tố khoáng cần thiết. Nồng độ cần thiết của từng nguyên tố vi lượng trong môi trường thường chỉ vào khoảng 10 -6 - 10-8 M. Nhu cầu khoáng của vi sinh vật cũng không giống nhau đối với từng loài, từng giai đoạn phát triển. 1.1.3.2. Nhân nuôi sinh khối nấm trên môi trường rắn Nhân nuôi sinh khối trên môi trường rắn hay lên men trạng thái rắn (Solid state fermentation – SSF) đã được định nghĩa là quá trình lên men xẩy ra khi không có mặt hoặc vắng mặt của lượng nước tự do. SSF là quá trình