Tài liệu Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của nấm đông trùng hạ thảo cordyceps militaris

1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -------- NGUYỄN THỊ HẬU NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI SỰ SINH TRƢỞNG CỦA NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, Tháng 12 - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Nấm đông trùng hạ thảo là tên chung chỉ một nhóm các loài nấm ký sinh trên sâu non, sâu trƣởng thành hoặc nhộng của một số loại côn trùng. Nấm đƣợc đặt tên đông trùng hạ thảo dựa vào quá trình phát sinh, phát triển và vòng đời của chúng. Sâu non, nhộng, sâu trƣởng thành của một số loài côn trùng nằm dƣới đất hoặc ở trên mặt đất bị nấm ký sinh. Các loài nấm này sử dụng các chất hữu cơ trong cơ thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng bị chết. Mùa đông, nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh ở dạng hệ sợi. Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, nấm chuyển sang giai đoạn sinh sản hữu tính, hình thành thể quả. Nhƣ vậy, mùa đông nấm ký sinh trên sâu, tồn tại ở giai đoạn hệ sợi, mùa hạ mọc thành cây nấm nên có tên là đông trùng hạ thảo. Một số loài đáng chú ý là Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris. Chi nấm Cordyceps đã đƣợc thu mẫu và định loại trên 400 loài khác nhau và theo hệ thống phân loại truyền thống, các loài này đƣợc xếp vào họ Clavicipitaceae [33]. Đông trùng hạ thảo không chỉ đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu, mà còn đƣợc cả xã hội quan tâm đến, vì nấm là loại dƣợc liệu quý, rất tốt cho sức khoẻ con ngƣời, phù hợp với mọi lứa tuổi, từ trẻ con, phụ nữ mang thai, thanh thiếu niên, cho đến ngƣời già. Theo các tài liệu ghi chép về đông dƣợc cổ, đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bồi bổ hết sức quý giá, có tác dụng tích cực với các bệnh nhƣ rối loạn tình dục, thận hƣ, liệt dƣơng, di tinh, đau lƣng, mỏi gối, ho hen, và có tác dụng tốt đối với trẻ em còi xƣơng chậm lớn. Một số nghiên cứu hiện đại gần đây đã chỉ ra rằng nấm đông trùng hạ thảo có tác dụng làm tăng cƣờng công năng của tuyến thƣợng thận, cải thiện đƣợc chức năng thận, nâng cao năng lực miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thƣ và chất phóng xạ. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về đông trùng hạ thảo nhìn chung chƣa nhiều. Phần lớn những gì mà các nhà nghiên cứu Việt Nam có đƣợc về nguồn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3 dƣợc liệu quý hiếm này đều chỉ dừng lại ở việc phát hiện các chủng của đông trùng hạ thảo sẵn có trong tự nhiên. Một số ít tiến hành những nghiên cứu sâu hơn về đặc tính sinh lý của đông trùng hạ thảo cũng chỉ dừng lại ở mức độ thử nghiệm. Nhìn chung các nghiên cứu về đông trùng hạ thảo ở Việt Nam còn gặp nhiều khó khăn. Từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực tiễn nói trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng của nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: - Xác định đƣợc sự ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng, nhiệt độ, độ ẩm không khí, pH môi trƣờng đến sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống. - Xác định đƣợc sự ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng và phƣơng thức cấy giống đến sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn ƣơm sợi. - Xác định đƣợc sự ảnh hƣởng của nhiệt độ, độ ẩm không khí và cƣờng độ chiếu sáng đến sự hình thành phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris. 3. Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng, nhiệt độ, độ ẩm không khí, pH môi trƣờng đến sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống. - Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng và phƣơng thức cấy giống đến sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn ƣơm sợi. - Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của nhiệt độ, độ ẩm không khí và cƣờng độ chiếu sáng đến sự hình thành phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 4 Kết quả nghiên cứu sự ảnh hƣởng của một số yếu tố cơ bản tới sự sinh trƣởng của hệ sợi, sự hình thành, phát triển của quả thể nấm Cordyceps militaris sẽ là căn cứ khoa học cho việc hoàn thiện và đƣa quy trình sản xuất quả thể nấm đông trùng hạ thảo vào thực tế phục vụ đời sống con ngƣời. Ngoài ra kết quả của đề tài cũng cung cấp thông tin khoa học cho các nhà khoa học nghiên cứu chuyên sâu loài nấm quý hiếm Cordyceps militaris. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 5 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cƣơng về nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu về Cordyceps Nấm đông trùng hạ thảo đƣợc xem là rất quý, hiếm. Những câu truyện mang tính thần thoại và truyền thuyết liên quan đến loài nấm này đƣợc lƣu truyền trong nhiều thiên niên kỷ. Hiện nay, các ghi nhận về thời gian phát hiện đầu tiên loài nấm này chƣa đƣợc thống nhất. Theo Das (2009) thì nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps đƣợc biết đến từ những năm 2000 trƣớc công nguyên [15]. Nhƣng theo Holliday và cộng sự (cs) (2004) tổng hợp từ nhiều nguồn tài liệu ghi nhận đầu tiên về nấm đông trùng hạ thảo đƣợc thực hiện tại Trung Quốc vào năm 620 sau công nguyên, vào triều đại nhà Đƣờng (618-907 sau công nguyên). Sự ghi nhận này đã làm rõ bản chất sinh học từ những câu truyện huyền thoại và truyền thuyết về đông trùng hạ thảo. Đông trùng hạ thảo là một sinh vật tồn tại hàng năm đƣợc chuyển một cách thần bí từ động vật sang thực vật vào mùa hè và sau đó lại từ thực vật chuyển sang động vật vào mùa đông. Tiếp sau đó có nhiều công trình đƣợc xuất bản với nội dung về loài nấm đông trùng hạ thảo này của các học giả xứ Tây Tạng từ thế kỷ 15 đến thế kỷ 18, trong đó có công trình đầu tiên đƣợc cho là có cơ sở khoa học tin cậy nhất mô tả về nấm đông trùng hạ thảo của Wu-Yiluo năm 1757, trong cuốn sách Dược điển, dƣới triều đại Thanh. Theo sau các học giả xứ Tây Tạng, việc phát hiện ra giá trị của đông trùng hạ thảo thuộc về những ngƣời chăn bò trên núi Hymalaya ở Tây Tạng cũ và Nepal, họ thấy rằng những chú bò gặm cỏ ăn phải cây nấm đông trùng hạ thảo vào mùa xuân đã trở nên cuồng nhiệt, bò đực luôn tìm và theo sát bò cái [18]. 1.1.2. Phân loại học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 6 Chi nấm Cordyceps đã đƣợc thu mẫu và định loại trên 400 loài khác nhau. Theo hệ thống phân loại truyền thống, chi Cordyceps thuộc giới Nấm, ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae [33]. Hình 1.1. Hình ảnh đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (www.jscr.jp) Phân loại nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris: Giới : Fungi Ngành : Ascomycota Phân ngành : Ascomycotina Lớp : Sordariomycetes Bộ : Hypocreales Họ : Clavicipataceae Chi : Cordyceps Loài : Cordyceps militaris 1.1.3. Đặc điểm và phân bố của Cordyceps Nấm đông trùng hạ thảo là tên chung chỉ một nhóm các loài nấm ký sinh trên sâu non hoặc sâu trƣởng thành của một số loại côn trùng. Nấm đƣợc đặt tên đông trùng hạ thảo dựa vào quá trình phát sinh, phát triển và vòng đời của chúng. Sâu non, nhộng, sâu trƣởng thành của một số loài côn trùng nằm dƣới đất hoặc ở trên mặt đất bị nấm ký sinh. Các loài nấm này sử dụng các chất hữu cơ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 7 trong cơ thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng bị chết. Mùa đông, nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh ở dạng hệ sợi. Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, nấm chuyển sang giai đoạn sinh sản hữu tính, hình thành thể quả [7]. Nấm đông trùng hạ thảo thƣờng phát hiện vào mùa hè ở một số cao nguyên có độ cao từ 3500 m đến 5000 m so với mặt biển; đó là các vùng Tây Tạng, Tứ Xuyên, Cam Túc, Vân Nam... Đây chính là nguồn đông trùng hạ thảo tự nhiên [11]. Ngoài ra còn phát hiện tại các vùng núi cao thuộc Ấn Độ, Nepal, Bhutan. Hiện nay, khoảng hơn 400 loài đã đƣợc tìm thấy, trong đó có khoảng 90 loài đƣợc phát hiện ở Trung Quốc [44]. Tại Việt Nam, đông trùng hạ thảo cũng đã đƣợc phát hiện tại nhiều địa điểm khác nhau. Năm 2009, Phạm Quang Thu và cs đã phát hiện 3 chủng là Cordyceps nutans Pat. tại khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang [3], Cordyceps gunni Berk. tại vƣờn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc [4], Cordyceps militaris Link. tại vƣờn quốc gia Hoàng Liên tỉnh Lào Cai [5]. Năm 2009, Đái Duy Ban và cộng sự cũng công bố phát hiện mới của mình về loài đông trùng hạ thảo lần đầu tiên đƣợc tìm thấy ở Việt Nam đó là loài đông trùng hạ thảo có tên là Isaria cerambycidae. Loài Đông trùng hạ thảo này đƣợc tìm thấy trên ấu trùng xén tóc [1]. Năm 2010, Phạm Thị Thùy Viện phát hiện đƣợc 2 giống là Cordyceps nutans ở Vƣờn quốc gia Cúc Phƣơng (Ninh Bình) và Cordyceps militaris ở Vũ Quang (Hà Tĩnh) [8]. 1.2. Các hoạt chất chính trong nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps 1.2.1. Cordycepin Cordycepin có cấu trúc 3’-deoxyadenosin là một purin alkaloid có dạng của nucleosid adenosin bị mất một oxy ở vị trí 3’ phần đƣờng ribose. Cordycepin đƣợc phân lập lần đầu vào năm 1950 từ Cordyceps militaris. Bằng phân tích phổ NMR (nuclear magnetic resonance) và IR (infrared), cordycepin đƣợc xem nhƣ là một hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc ly trích từ quả thể và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 8 sợi nấm. Cordycepin có công thức C10H13N5O3 và có phân tử lƣợng 251, điểm nóng chảy tại 230-2310C, độ hấp thu cực đại tại 259 nm. Có thể hoà tan trong dung dịch đệm muối, methanol hay ethanol, nhƣng không hoà tan trong benzen, ether hay chloroform, do vậy nhiều nghiên cứu đã sử dụng dung dịch muối khử trùng và đệm phosphat làm dung môi [44]. Vì cordycepin có cấu trúc tƣơng tự adenosin nên RNA polymerase không thể phân biệt. Khi tham gia tổng hợp nên phân tử RNA, cordycepin ngăn chặn quá trình kéo dài thêm các RNA và tạo ra các phân tử RNA kết thúc sớm. Do đó, cordycepin đƣợc xem nhƣ chất kháng ung thƣ hiệu quả [20]. Năm 2003, Sun và cs đã chứng minh hàm lƣợng cordycepin với hoạt tính kháng khối u ở Cordyceps kyushuensis cao hơn Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris, ở Cordyceps nuôi cấy cao hơn tự nhiên, và trong sợi nấm cao hơn ấu trùng chủ [32]. Tác giả cũng khẳng định rằng đây là hợp chất có tiềm năng dƣợc học cao. Năm 2007, Noriko Yoshikawa và cs chứng minh cordycepin có hoạt tính kháng ung thƣ hiệu quả thông qua việc ức chế quá trình methyl hóa acidnucleic và polyadenin hóa [40]. Đồng dạng của cordycepin là 2’,5’- oligoadenin có tác dụng kháng virus thông qua việc ức chế reverse transcriptase. Tác giả cũng chứng minh rằng tiền chất của cordycepin là adenosin cũng có hoạt tính kháng ung thƣ. 1.2.2. Acid cordyceptic Acid cordyceptic, một isomer của acid quinic, đƣợc nghiên cứu đầu tiên ở Cordyceps sinensis năm 1957. Cấu trúc tinh thể của acid cordyceptic đƣợc xác định là D-mannitol. Mannitol là hợp chất sinh học chính có nhiều hoạt tính quan trọng nhƣ kháng gốc tự do, lợi tiểu, trị ho. Chất này tồn tại trong tự nhiên chủ yếu ở rễ, thân và lá cây; đƣợc tìm thấy nhiều trong nấm ăn, cà rốt và rêu. Hàm lƣợng acid cordyceptic trong Cordyceps khoảng 7-29%. Mannitol có cấu tạo gồm một alcohol và một đƣờng, hoặc một polyol; tƣơng tự nhƣ xylitol hay sorbitol. Tuy nhiên, mannitol có xu hƣớng loại bỏ ion hydrogen trong nƣớc làm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 9 dung dịch trở nên acid. Công thức hóa học của mannitol là C6H14O6, trọng lƣợng phân tử 182, nhiệt độ nóng chảy 1660C, tỷ trọng 1,489 (200C) và nhiệt độ sôi 290-2950C (467 kPa). Mannitol có nhiều đặc tính quan trọng đã đƣợc sử dụng trong y học và thực phẩm, hàm lƣợng mannitol có trong quả thể nấm Cordyceps vào khoảng 29-85 mg/g, sợi nấm có hàm lƣợng acid cordyceptic cao hơn so với trong quả thể [44]. 1.2.3. Polysaccharid Cordyceps chứa một lƣợng lớn polysaccharid, khoảng 3-8% khối lƣợng, đây là một trong những hợp chất sinh học chính. Từ năm 1977, nhiều nghiên cứu khoa học tại Trung Quốc và Nhật Bản đã chứng minh đƣợc những ích lợi từ polysaccharid trong việc kháng ung thƣ, kháng oxy hóa, kháng viêm cũng nhƣ tác động điều hòa miễn dịch. Các hợp chất polysaccharid ở Cordyceps là một galactomannan nhiều nhánh. Các hợp chất này bao gồm D-mannose và D-galactose với tỷ lệ 3:5, thƣờng chứa một tỷ lệ nhỏ protein. Nó là một cấu trúc phân nhánh gồm các liên kết (1-6) và (1-2) liên kết các gốc α-D-mannopyranosyl ở mạch chính, có các liên kết đa dạng giữa các monosaccharid kế cận tạo thành các cấu trúc xoắn và vòng nhỏ. Tuy nhiên, một mannoglucan với trọng lƣợng phân tử xấp xỉ 7700 g/mol đƣợc phân tách gần đây chỉ chứa các đơn vị mannose và glactose với tỷ lệ 1:9. Các phân tích cho thấy nó có một khung sƣờn α-D-glucan với các liên kết (1-4) và (1-3); và các mạch nhánh của α-D-(1-6)-mannopyranose (Manp) đƣợc gắn vào khung sƣờn qua vị trí O-6 của gốc α-(1-3)-glucopyranosyl (Glcp). Nghiên cứu này cũng cho thấy dƣợc tính của polysaccharid là từ các đặc tính của nó nhƣ trọng lƣợng phân tử, ví dụ nhƣ các polyglucan có trọng lƣợng phân tử lớn hơn (10-1000 kDa) có xu hƣớng tan trong nƣớc tốt hơn và vì thế có hoạt tính kháng khối u hiệu quả hơn. Tuy nhiên, hoạt tính kháng ung thƣ là do sự tăng cƣờng miễn dịch cho cơ thể hơn là hiệu ứng gây chết tế bào trực tiếp [34]. 1.2.4. Ergosterol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 10 Ergosterol là tiền chất quan trọng cho vitamin D. Hàm lƣợng ergosterol ở Cordyceps militaris nuôi cấy rất cao, chỉ đứng sau Cordyceps sinensis tự nhiên phân lập ở Tây Tạng. Các ergosterol và các chất đồng dạng của nó có hoạt tính kháng virus, điều hoà tim mạch, điều trị bệnh thận do giảm immunoglobin A [44]. 1.2.5. Nucleotid Nucleotid là chất có nhiều trong Cordyceps, có tác dụng kháng khối u, phóng thích các tín hiệu dẫn truyền thần kinh, chống co giật… Trong đó, hàm lƣợng guanosin thƣờng cao nhất. Hàm lƣợng nucleotid trong Cordyceps nuôi cấy cao hơn hẳn Cordyceps tự nhiên, điều này có thể liên quan đến hoạt động biến dƣỡng nhanh trong quá trình nuôi cấy. Hàm lƣợng các nucleotid trong tự nhiên thấp có thể do sự thoái biến các nucleotid trong quá trình ủ đông [42]. Khí hậu ấm và ẩm ƣớt là điều kiện làm tăng nucleotid trong Cordyceps. Năm 2003, Sun và cs nghiên cứu thấy có ít nhất 8 loại nucleosid hoặc nitrogen base có trong Cordyceps kyushuensis [32]. Năm 2010, Xie Jian Wei và cs đã tách và xác định đƣợc các loại thymin, adenosin, adenin và cordycepin có trong Cordyceps sinensis, nghiên cứu cho thấy hàm lƣợng các nucleotid khác nhau tùy theo vị trí phân lập [38]. 1.2.6. Protein và acid amin Hàm lƣợng protein trong Cordyceps vào khoảng 29,1 – 33% bao gồm 18 acid amin: acid aspartic, threonin, serin, glutamat, prolin, glycin, valin, methionin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin, histidin, cystin, cystein và tryptophan. Các acid amin có hàm lƣợng cao nhất là glutamat, arginin và acid aspartic và có dƣợc tính cao nhất là arginin, glutamat, tryptophan và tyrosin. Năm 2011, Zheng và cs đã nghiên cứu họ protein trong Cordyceps militaris [43]. Kết quả cho thấy bộ gen Cordyceps militaris chứa 61 họ protease nhƣng hầu hết là serin protease và metallopeptidase, 12 gen mã hóa trypsin, 167 gen mã hóa protein kinase, 105 gen mã hóa glycosid hydrolase. Hơn nữa, Cordyceps Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 11 militaris sở hữu hầu hết các gen cần thiết cho hoạt động biến dƣỡng adenin và adenosin, ngoại trừ việc thiếu ribonucleotid triphosphat reductase và deoxyadenosin kinase. 1.3. Nghiên cứu tác dụng của nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới, các nghiên cứu về tác dụng của Cordyceps rất đƣợc các nhà khoa học quan tâm. Rất nhiều nghiên cứu đã đƣợc công bố chứng minh Cordyceps có hoạt tính kháng oxy rất cao, kháng ung thu, kháng một số virus, vi khuẩn và nấm. Hoạt tính kháng oxy hóa của nấm Cordyceps là một trong những vấn đề đƣợc nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Hui Mei Yu và cs (2006) đã so sánh về hiệu quả bảo vệ giữa Cordyceps militaris nuôi cấy và Cordyceps sinensis tự nhiên chống lại quá trình oxy hóa. Kết quả nghiên cứu cho thấy ở Cordyceps militaris, khả năng ức chế sự oxy hóa ở liposom thì cao hơn nhƣng ở protein thì thấp hơn Cordyceps sinensis, hàm lƣợng polyphenolic và các hoạt chất sinh học nhƣ cordycepin và adenosin thì cao hơn Cordyceps sinensis. Tiếp tục nghiên cứu trên polysaccharid và polyphenol, kết quả cho thấy mặc dù polyphenol có hoạt tính kháng oxy hóa nhƣng hiệu quả bảo vệ thì không thể chỉ đƣợc tạo ra bởi chúng vì hàm lƣợng quá thấp. Hơn nữa, hàm lƣợng polyphenol ở Cordyceps militaris cao hơn Cordyceps sinenis nhƣng hiệu quả bảo vệ tránh khỏi sự oxy hóa protein và LDL ở Cordyceps militaris lại thấp hơn, chứng tỏ các hợp chất polyphenol không phải là hợp chất duy nhất gây ra khả năng kháng oxy hóa ở Cordyceps. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của polysaccharid lấy từ 2 chủng trên bằng phƣơng pháp TEAC, kết quả cho thấy các polysaccharid này có hoạt tính, nên có thể kết luận hoạt tính kháng oxy hóa ở 2 chủng trên một phần có từ polysaccharid [41]. Lý giải cho hoạt tính kháng oxy hóa của polysaccharid, Leung và cs (2009) nghiên cứu cho tháy sự tồn tại các nhóm hydroxyl trong polysaccharid ly trích từ Cordyceps có liên quan đến việc nhận electron để khử Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 12 điện tử tạo thành dạng ổn định hơn hoặc phản ứng với các gốc tự do để kết thúc phản ứng chuỗi điện tử tự do [30]. Zhang và cs (2010) cho rằng các chất khử có trong Cordyceps biểu hiện hoạt tính kháng oxy hóa bằng cách bẻ gãy phản ứng chuỗi điện tử tự do bằng cách nhƣờng hydrogen [42]. Jung Nam Choi và cs (2010) đã sử dụng phƣơng pháp kết hợp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) và sắc ký khí khối phổ (GC-MS) để xác định các thành phần trong hạt đậu nành nảy mầm có và không có Cordyceps militaris. Kết quả cho thấy trong canh trƣờng đậu nành có nuôi Cordyceps militaris chứa một lƣợng lớn chất dinh dƣỡng và có hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn hẳn canh trƣờng đậu nành nảy mầm không chứa Cordyceps militaris [14]. Liu và cs (2010) chứng minh dịch chiết từ Cordyceps sinensis có khả năng làm giảm hiện tƣợng thiếu máu não cục bộ thông qua hoạt tính kháng oxy hóa [25]. Jiang và cs (2011) chứng minh rằng adenosin và 6,7,2',4',5'pentamethoxyflavon ly trích từ Cordyceps militaris có khả năng ức chế HIV-1 protease [21]. Xiao và cs (2011) đã nghiên cứu tiềm năng kháng oxy hóa trên các phân đoạn polysaccharid từ Cordyceps jiangxiensis, còn đƣợc gọi là “Cao Mu Wang”. Kết quả cho thấy Cordyceps jiangxiensis biểu hiện hoạt tính bắt các gốc tự do DPPH, hydroxyl, superoxid, năng lực khử và tạo phức với các ion Fe 2+. Tác giả khẳng định rằng các phân đoạn polysaccharid của Cordyceps jiangxiensis đều có hoạt tính kháng oxy hóa cao, trong đó, các phân đoạn có trọng lƣợng phân tử khác nhau biểu hiện hoạt tính kháng oxy hóa khác nhau, chứng tỏ trọng lƣợng phân tử có ảnh hƣởng rõ rệt đến hoạt tính sinh học của polysaccharid [37]. Cũng nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa trên các phân đoạn polysaccharid, Wu Fengyao và cs (2011) đã chỉ ra tỷ lệ monosaccharid trong phân đoạn polysaccharid tinh sạch từ Cordyceps militaris nuôi cấy gồm mannose : glucose : galactose với tỷ lệ là 1,35:8,34:1,00. Phân đoạn này cũng cho hoạt tính kháng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 13 oxy hóa cao, điều này có thể liên quan đến khả năng chuyển electron hoặc nhƣờng hydrogen [36]. Tác dụng kháng ung thƣ, chống rối loạn, kháng virus, vi khuẩn và nấm của Cordyceps cũng đƣợc đề cập tới rất nhiều trong các công bố của các nhà khoa học trên thế giới. Nan J.X. và cs (2001) chứng minh đông trùng hạ thảo chữa trị bệnh rối loạn chức năng gan rất có hiệu quả [28]. Tác dụng chống ung thƣ đƣợc đề cập đến trong nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả ở nhiều quốc gia trên thế giới. Dịch chiết từ thể quả có tác dụng chống ung thƣ, hiệu quả đối với hai loại tế bào màng trong tĩnh mạch rốn là HT1080 và B16-F10 do có khả năng chống lại sự tạo thành các mạch máu mới bằng cách giảm sự biểu hiện của bFGF, một trong những nhân tố kích thích quá trình này. Do có vai trò kìm hãm quá trình tạo thành các mạch máu mà có thể ngăn chặn đƣợc quá trình di căn và sự phát triển của tế bào ung thƣ [39]. Dịch chiết bằng nƣớc ấm có tác dụng kìm hãm sự phát triển của dòng tế bào ung thƣ máu ở ngƣời bằng cách gây ra hiện tƣợng tự chết của các tế bào thông qua sự hoạt hóa enzym caspase-3 [24]. Thí nghiệm của Kim G.Y. và cs (2006) cũng cho kết quả tƣơng tự với khả năng điều trị ung thƣ máu của dịch chiết từ nấm [22]. Các hoạt chất ergosterol peroxide và acetoxyscirpenediol tách chiết từ nấm Paecilomyces tenuipes nuôi cấy nhân tạo có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời nhƣ tế bào khối u dạ dày, tế bào ung thƣ gan, tế bào ung thƣ ruột kết-ruột thẳng. Hoạt tính của acetoxyscirpenediol mạnh hơn cisplatin là hoạt chất đang đƣợc dùng điều trị cho các bệnh nhân ung thƣ hiện nay là 4 đến 6,6 lần [31]. 1.3.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam So với thế giới, các nghiên cứu về tác dụng của của nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps ở Việt Nam chƣa đƣợc công bố nhiều. Phần lớn những gì mà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 14 các nhà nghiên cứu Việt Nam có đƣợc về nguồn dƣợc liệu quý hiếm này đều chỉ dừng lại ở việc phát hiện các chủng của đông trùng hạ thảo sẵn có trong tự nhiên. Một trong số ít các nghiên cứu về tác dụng của nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps ở Việt Nam là nghiên cứu của Đái Duy Ban và cs. Theo nghiên cứu của tác giả Đái Duy Ban và cs thì đông trùng hạ thảo là một loại dƣợc liệu quý hiếm, có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh virus, ung thƣ, HIV/AIDS, đái tháo đƣờng và suy giảm tình dục [1]. Nguyễn Mậu Tuấn và cs đã tiến hành nghiên cứu hiệu quả của dịch chiết nấm đông trùng hạ thảo tằm dâu Paecilomyces tenuipes đến khả năng bơi của chuột. Kết quả cho thấy chuột uống dịch nấm đông trùng hạ thảo chiết trong nƣớc, chiết trong cồn và đối chứng (đƣợc uống nƣớc vô trùng) đều sống khỏe mạnh trong 4 tuần thí nghiệm và tất cả chuột đều biểu hiện bình thƣờng về hình thái, tập tính trong ăn uống và các hoạt động khác trong cả 2 lần thí nghiệm dù liều dùng cho chuột/ngày là rất cao so với thể trọng của chuột. Điều này cho thấy với liều uống hằng ngày tƣơng đƣơng khoảng 890 mg nấm đông trùng hạ thảo tằm dâu Paecilomyces tenuipes/kg thể trọng là an toàn đối với chuột bạch. Kết quả so sánh sức sống của chuột sau 4 tuần thí nghiệm hoàn toàn không có sự khác biệt, tất cả chuột đều sống 100% và không có bất kì biểu hiện bất thƣờng nào về tập tính, màu sắc của mắt và lông. Điều này cho thấy nấm không gây độc tính cấp và an toàn cho chuột. Kết quả về khả năng bơi của chuột khi cho uống dịch chiết của đông trùng hạ thảo tằm dâu Paecilomyces tenuipes , tỉ lệ tăng lần lƣợt là 163,7 và 172,7% [10]. Trần Minh Trang và cs đã tiến hành nghiên cứu tách chiết exopolysaccharide từ dịch nuôi cấy nấm Cordyceps sinensis, kết quả nhóm tác giả đã chỉ ra exopolysaccharide có tiềm năng kích thích sự tăng sinh PBMC. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 15 Nghiên cứu này tạo cơ sở và tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về tác dụng miễn dịch ở mức in vitro [9]. Đoàn Minh Quân và cs đã tiến hành nghiên cứu tách chiết ergosterol và thử nghiệm hoạt tính kháng phân bào của cao ether dầu hỏa từ sinh khối nấm Cordyceps spp. tại Việt Nam, kết quả cho thấy ergosterol dạng tinh thể và dạng cao PE có khả năng ức chế sự phân bào trên dòng tế bào ung thƣ vú MCF-7 [2]. 1.4. Sơ lƣợc tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps ở Việt Nam và trên thế giới 1.4.1. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps trên thế giới Các nghiên cứu trên thế giới đã hoàn toàn chứng minh đƣợc công dụng vƣợt trội của nấm đông trùng hạ thảo là một nguồn dƣợc liệu quý. Vì vậy, việc nuôi trồng loài nấm quý hiếm này đã đƣợc các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu từ quy mô phòng thí nghiệm thu sinh khối sợi nấm, tới quy mô lớn hơn thu quả thể nấm. Mao X.L. (2000) đã mô tả đặc điểm hình thái, công dụng và ảnh minh họa cho 13 loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố ở Trung Quốc [26]. Sung Jae Mo (2000) đã mô tả đặc điểm hình thái và hình ảnh của 25 loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố ở Hàn Quốc [27]. Nuôi trồng quả thể nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris đƣợc tiến hành ở nhiều nƣớc trên thế giới: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Mỹ... Tại Trung Quốc có các trang trại lớn chuyên nuôi trồng loài nấm này ở các tỉnh: Thƣợng Hải, Quảng Châu, Chiết Giang, An Huy, Giang Tô... Chỉ tính một trang trại nuôi trồng loài nấm này tại Kaiping, Quảng Châu, sản lƣợng một năm thu đƣợc 100000 kg sản phẩm. Sản phẩm nấm đông trùng hạ thảo từ nuôi trồng nhân tạo đã có mặt ở nhiều nƣớc trên thế giới kể cả các nƣớc phƣơng Tây và mang lại lợi nhuận cao cho các doanh nghiệp và ngƣời nuôi trồng nấm [7]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 16 Tại Thái Lan, Patcharaporn Wongsa (2005) đã nghiên cứu phân lập và sự sinh trƣởng của hệ sợi, hình thành bào tử chồi của nấm Cordyceps unilateralis ký sinh kiến. Môi trƣờng PDA (Potato Dextrose Agar), PYEG (Peptone Yeast Extract Glucose), CSA (Carrot extract Sucrose Agar) và môi trƣờng MEA (Malt Extract Agar) đƣợc dùng để phân lập và nuôi cấy hệ sợi [35]. Jae Sung Kim và cs (2006), tại Hàn Quốc, đã sử dụng nhộng tằm để nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps militaris. Nhộng tằm đƣợc đựng trong các lọ nuôi cấy, khử trùng ở 121oC trong thời gian 90 phút, để nguội, cấy giống nấm, 20 ngày sợi nấm ăn kín toàn bộ giá thể, trong điều kiện nhiệt độ 20-25oC, cƣờng độ ánh sáng 500-700 lux đã hình thành mầm thể quả [22]. Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi cũng đƣợc các tác giả tiến hành trên môi trƣờng dinh dƣỡng lỏng với thành phần nhƣ sau: 40 g/lít đƣờng glucose, 10 g/lít cao nấm men, 0,5 g/lít KH2PO4, 0,5 g/lít K2HPO4.3H2O, và 0,5 g/lít MgSO4.7H2O. Duck-Hyun Cho và cs (2003), tại Hàn Quốc, đã tiến hành nghiên cứu sự sinh trƣởng của hệ sợi của 3 chủng ký hiệu là CHO-7208; CHO-7845; CHO7846 của loài Cordyceps militaris trên môi trƣờng dinh dƣỡng và quá trình hình thành thể quả nấm Cordyceps militaris với giá thể là sâu non loài Allomyrina dichotoma Linnaeus. Kết quả cho thấy sự sinh trƣởng của hệ sợi của các chủng khác nhau là khác nhau trong nuôi cấy thuần khiết. Chỉ có 2 chủng CHO-7208 và CHO-7846 hình thành thể quả khi sử dụng sâu non Allomyrina dichotoma Linnaeus làm giá thể. Chiều dài của thể quả đạt 51-56 mm sau 27 ngày nuôi cấy [13]. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps ở Việt Nam Các nghiên cứu về nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps ở Việt Nam chƣa nhiều và chƣa có hệ thống. Một số ít các nghiên cứu đƣợc tiến hành nhƣng cũng chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu về sự sinh trƣởng của hệ sợi hoặc nghiên cứu tạo quả thể ở mức độ thử nghiệm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 17 Phạm Quang Thu và cs (2011) đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết các chủng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:Fr) Link. Đặc điểm sinh học của nấm Cordyceps militaris bao gồm đặc điểm sinh trƣởng, loại môi trƣờng dinh dƣỡng, pH của môi trƣờng, nhiệt độ và ẩm độ không khí tối ƣu cho sự phát triển của nấm đã đƣợc nghiên cứu. Kết quả chỉ ra rằng 8 chủng nấm Cordyceps militaris gồm 4 chủng thu thập ở Việt Nam, 3 chủng sƣu tầm từ Nhật và 1 chủng ở Trung Quốc, tất cả đều sinh trƣởng bình thƣờng trên môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo, trong đó 4 chủng sinh trƣởng nhanh bao gồm chủng HL2, chủng CM, chủng F1010 và chủng F1080 với tốc độ lần lƣợt là 104,66; 122,02; 107,64; 105,08 μm/giờ, 4/8 chủng nấm sinh trƣởng chậm là chủng HL22, chủng HL34, chủng HL35 và chủng F1012 với tốc độ sinh trƣởng đạt 69,95; 71,92; 79,37 và 80,36 μm/giờ. Các đặc điểm nuôi cấy cho sự phát triển tối ƣu của hệ sợi đƣợc xác định là môi trƣờng dinh dƣỡng là PDA có bổ sung thêm 10% nhộng tằm, nhiệt độ không khí thích hợp nhất là từ 20 – 25oC, một số chủng nhƣ HL2 và chủng F1012 cho sinh trƣởng nhanh ở cả nhiệt độ thấp 15oC. Độ ẩm trong không khí trong khoảng 80 - 85%, và môi trƣờng pH là axit từ 4,5 - 6,5 [6]. Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã tiến hành thu mẫu đông trùng hạ thảo tại một số vƣờn quốc gia và khu bảo tồn thiên nhiên. Giám định mẫu đƣợc dựa trên các khóa phân loại, chuyên khảo về Cordyceps. Tổng số 24 loài nấm đông trùng hạ thảo đƣợc giám định. Các loài nấm đƣợc xác định là: Aschersonia badia Patouillard, Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill., Beauveria brongniartii (Saccardo) Petch, Cordyceps annullata Kobayasi & Shimizu, Cordyceps cardinalis G.H. Sung & Spatafora, Cordyceps crinalis Ellis ex Lloyd, Cordyceps formicarum Kobayasi, Cordyceps formosana Kobayasi & Shimizu, Cordyceps gunnii Berk, Cordyceps militaris (L.:Fr.) Link., Cordyceps myrmecophilla Cesati, Cordyceps nutans Pat., Cordyceps oxycephala Penz. & Sacc., Cordyceps pseudomilitaris Hywel-Jones & Sivichai, Cordyceps Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 18 sphecocephala (Klotzsch ex Berk.) Berk. & M.A. Curtis, Cordyceps stylophora Berk. & Br., Cordyceps takaomontana Yakush. & Kumaz, Cordyceps tuberculata (Lebert) Maire, Isaria cateniannulatus (Z.Q. Liang) Samson & Hywel-Jones, Isaria farinosa (Holmsk.) Fr., Isaria japonica Yasuda, Isaria takamizusanensis Kobayasi, Isaria ternuipes Peck và Metarrhizium anisopliae (Metch.) Sorokin. Nguồn gen các loài nấm này đang đƣợc lƣu trữ tại Trung tâm Nghiên cứu bảo vệ rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam. Trên cơ sở nguồn gen thu thập đƣợc và sƣu tập từ Trung Quốc và Nhật Bản, Trung tâm Nghiên cứu bảo vệ rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm đông trùng hạ thảo trên giá thể nhân tạo đối với một số loại nhƣ đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes) và đông trùng hạ thảo bọ xít (Cordyceps nutans) [7]. A B Hình 1.2. Đông trùng hạ thảo nuôi cấy tại Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam [7] (A: Cordyceps nutans; B: Isaria tenuipes) Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông Lâm nghiệp Lâm Đồng thuộc Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên từ năm 2006 bao gồm thu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 19 thập nguồn nấm tự nhiên, phân lập, định danh và nuôi cấy thử trên vật chủ côn trùng để sản xuất nấm. Đến nay đã xây dựng đƣợc các quy trình công nghệ để sản xuất nấm đông trùng hạ thảo tằm dâu (hay đông trùng hạ thảo hoa tuyết), Paecilomyces tenuipes (Cordyceps takaomontana) trên tằm dâu và nhộng tằm dâu Bombyx mori [11]. Hình 1.3. Đông trùng hạ thảo nuôi cấy tại Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông Lâm nghiệp Lâm Đồng [11] (A: Hình thái nhộng từ lúc mới chết đến khi hình thành hệ sợi nấm trên mình; B C: Hệ sợi mọc giữa các đốt ở mặt lƣng và mặt bụng nhộng; D: Thể quả bắt đầu hình thành; E: Thể quả phát triển hoàn toàn) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 20 Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Chủng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris TS06 thuộc bộ chủng của Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ Sinh học (CBRTT) Công ty Cổ phần Ứng dụng Khoa học Kỹ thuật Việt Nam. 2.2. Địa điểm nghiên cứu Phòng thí nghiệm vi sinh - Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ Sinh học (CBRTT) - Công ty Cổ phần Ứng dụng Khoa học Kỹ thuật Việt Nam. 2.3. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu Hóa chất: Tất cả các hóa chất đều có độ tinh sạch cần thiết, đảm bảo các tiêu chuẩn dành cho hóa chất dùng trong phòng thí nghiệm nghiên cứu sinh học và đƣợc sử dụng đúng theo những hƣớng dẫn và khuyến cáo của nhà sản xuất. Thiết bị: - Bể ổn nhiệt Jeio Tech, Hàn Quốc - Máy đo pH Horiba, Nhật Bản - Máy ly tâm Eppendorf, Đức - Tủ cấy vi sinh Esco, Singgapo - Tủ lạnh Panasonic, Nhật Bản - Nồi hấp khử trùng Hirayama, Nhật Bản - Tủ mát Hirayama, Nhật Bản - Hệ thống tạo ẩm bằng sóng siêu âm, Nhật Bản Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/