Tài liệu Nghiên cứu phân đoạn lignocellulose bã mía bằng axit formic thu nhận cellulose sử dụng làm nguyên liệu sản xuất bioethanol

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGÔ DUY SẠ NGHIÊN CỨU PHÂN ĐOẠN LIGNOCELLULOSE BÃ MÍA BẰNG AXIT FORMIC THU NHẬN CELLULOSE SỬ DỤNG LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT BIOETHANOL LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGÔ DUY SẠ NGHIÊN CỨU PHÂN ĐOẠN LIGNOCELLULOSE BÃ MÍA BẰNG AXIT FORMIC THU NHẬN CELLULOSE SỬ DỤNG LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT BIOETHANOL Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Tô Kim Anh 2. TS. Phạm Tuấn Anh Hà Nội – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là kết quả nghiên cứu của tôi trong thời gian làm nghiên cứu sinh. Các kết quả này là hoàn toàn trung thực và chƣa đƣợc tác giả khác công bố. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Ngô Duy Sạ LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Tô Kim Anh, TS. Phạm Tuấn Anh- Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội đã hƣớng dẫn tận tình và giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy, các cô giảng viên Bộ môn Hóa Sinh – Vi sinh và Sinh học phân tử và các thầy, cô giảng viên, các cán bộ nghiên cứu Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã truyền thụ kiến thức, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Lê Quang Diễn, TS. Nguyễn Thị Minh Phƣơng Bộ môn Công nghệ Xenluloza và Giấy–Viện Kỹ thuật Hoá học Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội đã hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong thực hiện một phần nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Cao đẳng Cộng đồng Hà Tây cùng gia đình, bạn bè, đồng nghiệp và các bạn cùng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đã động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến một ngƣời “bạn” đã đồng hành cùng tôi, luôn có mặt và giúp tôi vƣợt qua hết khó khăn để hoàn thành luận án ngày hôm nay. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Nghiên cứu sinh Ngô Duy Sạ MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................................... IV DANH MỤC BẢNG ................................................................................................................... V DANH MỤC HÌNH ................................................................................................................... VI MỞ ĐẦU ..................................................................................................................................... 1 1. ĐẶT VẤN ĐỀ.......................................................................................................................................... 1 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU ........................................................................................... 1 3. MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN ................................................................................................................ 2 4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................................................................................. 2 5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN .......................................................................................... 2 6. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ..................................................................................................... 3 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 4 1.1. CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TỪ LIGNOCELLULOSE ........................................................... 4 1.2. NGUYÊN LIỆU LIGNOCELLULOSE BÃ MÍA ..................................................................... 6 1.2.1. Thành phần, cấu trúc của lignocellulose và bã mía .......................................................... 6 1.2.2. Bã mía và vấn đề sử dụng bã mía ................................................................................... 12 1.3. TIỀN XỬ LÝ LIGNOCELLULOSE TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL........................... 13 1.3.1. Ảnh hƣởng của cấu trúc lignocellulose tới khả năng thủy phân cellulose bằng enzyme14 1.3.2. Các biện pháp tiền xử lý lignocellulose.......................................................................... 16 1.3.3.Lựa chọn kỹ thuật phân đoạn lignocellulose bằng axit formic........................................ 27 1.4. ENZYME THỦY PHÂN CELLULOSE ........................................................................................ 28 1.4.1. Các enzyme thủy phân cellulose .................................................................................... 29 1.4.2. Hoạt động của hệ enzyme cellulase ................................................................................ 30 1.5. THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ETHANOL TỪ CELLULOSE ................................................... 33 1.5.1. Thủy phân lignocellulose và lên men dịch thủy phân .................................................... 33 1.5.4. Các phƣơng pháp thủy phân và lên men sử dụng trong sản xuất ethanol từ lignocellulose ............................................................................................................................ 36 1.5.2. Sự ức chế quá trình thủy phân cellulose bằng cellulase ................................................. 39 1.5.3. Các chất ức chế hoạt động của nấm men ........................................................................ 41 1.5.5. Nấm men Saccharomyces cerevisiae ............................................................................. 44 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 46 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU .................................................................. 46 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................................................... 47 I 2.2.1. Phƣơng pháp phân tích ................................................................................................... 47 2.2.2. Thiết kế thí nghiệm ......................................................................................................... 52 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................................. 60 3.1. PHÂN ĐOẠN CELLULOSE BÃ MÍA BẰNG AXIT FORMIC ................................................ 60 3.1.1. Thành phần bã mía nghiên cứu....................................................................................... 60 3.1.2. Ảnh hƣởng của các điều kiện phân đoạn đến hàm lƣợng glucan bã sau phân đoạn và tỷ lệ lignin loại bỏ ......................................................................................................................... 61 3.1.3. Nghiên cứu tác động đồng thời của các điều kiện phân đoạn cellulose bã mía bằng axit formic theo phƣơng pháp formiline .......................................................................................... 66 3.1.4. Một số tính chất của cellulose bã mía phân đoạn formiline .......................................... 71 3.1.5. Mối liên hệ của hàm lƣợng lignin, chỉ số kết tinh cellulose tới khả năng thủy phân cellulose bã mía phân đoạn ....................................................................................................... 75 3.1.6. Chế độ phân đoạn bã mía bằng axit formic .................................................................... 76 3.1.7. Ảnh hƣởng của rửa kiềm tới chất lƣợng cellulose bã phân đoạn bằng axit formic ........ 80 3.1.8. Phân đoạn cellulose bã mía bằng axit formic ở nồng độ bã rắn cao .............................. 86 3.1.9. Các thành phần dịch phân đoạn cellulose bã mía bằng axit formic ............................... 89 3.2. THỦY PHÂN CELLULOSE BÃ MÍA PHÂN ĐOẠN BẰNG AXIT FORMIC ...................... 92 3.2.1. Một số đặc điểm của chế phẩm enzyme NS 22192 ........................................................ 92 3.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân cellulose bã mía phân đoạn 94 3.2.3. Ảnh hƣởng của nồng độ bã rắn tới thủy phân cellulose bã mía phân đoạn bằng enzyme .................................................................................................................................................. 95 3.2.4. Động học quá trình thủy phân cellulose bã mía phân đoạn ............................................ 97 3.2.5. Ảnh hƣởng ức chế của nồng độ glucose trong dịch thủy phân....................................... 99 3.2.6. Thủy phân cellulose bã mía phân đoạn ở nồng độ bã rắn cao (20%) ........................... 101 3.3. LÊN MEN ETHANOL TỪ BÃ MÍA PHÂN ĐOẠN FORMILINE ......................................... 105 3.3.1. Khả năng lên men dịch thủy phân cellulose bã mía phân đoạn .................................... 105 3.3.2. Thủy phân và lên men gián đoạn (SHF) 20% bã mía phân đoạn ................................. 107 3.3.3. Thủy phân và lên men đồng thời bã mía phân đoạn formiline ..................................... 109 3.3.4. So sánh hiệu quả SSF và SHF ...................................................................................... 114 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 118 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN .................................. 128 PHẦN PHỤ LỤC....................................................................................................................... 1 PHỤ LỤC 1. ẢNH CHỤP MẪU BÃ MÍA, DỊCH TXL TRONG QUÁ TRÌNH ĐỂ NGUỘI ......... 1 II 1.1. Ảnh chụp các mẫu bã mía.................................................................................................... 1 1.2. Ảnh chụp dịch TXL trong quá trình để nguội ..................................................................... 3 PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ CELLULOSE BÃ MÍA, ẢNH SEM CẤU TRÚC CÁC MẪU BÃ MÍA ........................................................................................ 3 2.1. Ảnh FESEM cấu trúc mẫu bã mía ....................................................................................... 3 2.2. Kết quả phân tích chỉ số kết tinh: ........................................................................................ 5 1.3. Kết quả phân tích mức formyl hóa cellulose ....................................................................... 7 PHỤ LỤC 3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ANOVA BỞI PHẦN MỀM DESIGN EXPERT CHO CÁC MÔ HÌNH TÁC ĐỘNG ĐỒNG THỜI CỦA ĐIỀU KIỆN PHÂN ĐOẠN ....................................... 11 3.1. Kết quả phân tích ANOVA cho mô hình hàm lƣợng glucan ............................................ 11 3.2. Kết quả phân tích ANOVA cho mô hình hàm lƣợng lignin còn lại .................................. 13 3.1. Kết quả phân tích ANOVA cho mô hình hiệu suất thủy phân cellulose bã phân đoạn ..... 14 3.4. Các phƣơng án phân đoạn đề xuất bở phần mềm Design Expert theo mục tiêu hàm lƣợng glucan bã 90% .......................................................................................................................... 16 PHỤ LỤC 4. CÁC ĐƢỜNG CHUẨN SỬ DỤNG CHO PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG CÁC CHẤT .......................................................................................................................................................... 19 4.1. Đƣờng chuẩn phân tích hàm lƣợng đƣờng khử theo phƣơng pháp DNS .......................... 20 4.2. Đƣờng chuẩn phân tích hàm lƣợng glucose bằng D glucose GOD-POD kit .................... 20 4.3. Đƣờng chuẩn phân tích hàm lƣợng gluocse, hàm lƣợng ethanol bằng HPLC .................. 21 PHỤ LỤC 5. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CÁC MẪU BÃ MÍA ................................ 21 5.1. Kết quả phân tích HPLC thành phần bã mía ..................................................................... 21 5.2. Kết quả phân tích hàm lƣợng cellulose tại Viện Công nghiệp giấy và xenluylô .............. 26 PHỤ LỤC 6. ẢNH CHỤP MẪU THỦY PHÂN, LÊN MEN.............................................................. 27 6.1. Ảnh chụp hiển vi sợi cellulose trong quá trình thủy phân ................................................. 27 6.2. Ảnh chụp các mẫu thí nghiệm thủy phân .......................................................................... 27 PHỤ LỤC 7. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG ETHANOL .................................................. 29 7.1. Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng ethanol ........................................................................ 29 7.2. Kết quả phân tích hàm lƣợng ethanol ................................................................................ 30 III DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ/thuật ngữ viết tắt Ý nghĩa của từ/thuật ngữ viết tắt AFEX Nổ hơi trong ammonia - Ammonia fiber explosion CBD Miền gắn với cellulose của enzyme - Cellulose binding domain CBH Enzyme thủy phân liên kết (1-4)-β-D glucosid từ đầu mạch cellulose - Cellobiohydrolase CMC Carboxymethyl cellulose CrI Chỉ số kết tinh cellulose- Cellulose crystallinity index DNS Axit dinitrosalicylic DP Mức độ polyme hóa- Degree of polymeization EDTA Axit ethylene diamine tetraacetic FESEM Kính hiển vi điện tử quét trƣờng phát xạ - Field-emission scanning electronic microscope FPU Hoạt tính enzyme thủy phân giấy lọc- Filter paper units HL Hàm lƣợng HMF 5-hydroxy-2-methyl furfural NREL OD SHF SSF TAPPI Phòng thí nghiệm năng lƣợng tái tạo quốc gia Mỹ - National renewable energy laboratory Mật độ quang- Optical density Thủy phân và lên men riêng rẽ - Separate hydrolysis and fermentation Thủy phân và lên men đồng thời - Simultaneous saccharification and fermentation Hiệp hội kỹ thuật Công nghiệp Giấy và Bột giấy (Mỹ) Technical association of the pulp and paper industry TXL Tiền xử lý UI Đơn vị hoạt tính enzyme quốc tế- International unit XRD Nhiễu xạ tia X- X ray diffraction IV DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose từ các nguồn khác nhau ................................................. 7 Bảng 1.2. Các phương pháp phân đoạn lignocellulose bằng dung môi .................................. 23 Bảng 1.3. Tính chất và đặc tính thủy phân của các cellululase ............................................... 32 Bảng 1.4. Các chất ức chế, nồng độ được phát hiện và nồng độ ức chế đối với S.cerevisiae . 43 Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác động đồng thời của các điều kiện phân đoạn bã mía bằng axit formic sử dụng phần mềm Design Expert ......................................................... 53 Bảng 3.1. Bố trí các điều kiện thí nghiệm và kết quả hàm lượng glucan, hàm lượng lignin và hiệu suất thủy phân bã thu được sau phân đoạn formiline ...................................................... 67 Bảng 3.2. Các mô hình phụ thuộc của hàm lượng glucan, hàm lượng lignin và hiệu suất thủy phân cellulose bã sau phân đoạn vào nhiệt độ, nồng độ formic và thời gian phân đoạn xây dựng bởi phần mềm Design expert ........................................................................................... 69 Bảng 3.3. Chỉ số kết tinh cellulose bã mía phân đoạn bằng axit formic ở các chế độ khác nhau .......................................................................................................................................... 71 Bảng 3.4. Kết quả phân tích hàm lượng formic dịch thủy phân bằng axit H2SO4 các mẫu bã mía phân đoạn formiline với chế độ rửa kiềm khác nhau ........................................................ 73 Bảng 3.5. Một số phương án phân đoạn theo mục tiêu 90% glucan được đưa ra bởi phần mềm Design Expert ........................................................................................................................................ 77 Bảng 3.6. Hàm lượng lignin tối đa trong dịch phân đoạn ở các nồng độ bã rắn khác nhau (tính theo hàm lượng lignin trong bã) ...................................................................................... 87 Bảng 3.7. Tỉ lệ thu hồi lignin dịch phân đoạn bằng kết tủa ..................................................... 90 Bảng 3.8. So sánh một số quá trình SSF ở nồng độ bã rắn cao sử dụng cơ chất lignocellulose khác nhau, phương pháp TXL khác nhau ............................................................................... 112 V DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Một số sản phẩm chuyển hóa có giá trị từ cellulose và đường ................................. 4 Hình 1.2. Sơ đồ công nghệ sản xuất bioethanol từ sinh khối lignocellulose ............................. 5 Hình 1.3. Cấu trúc lignocellulose .............................................................................................. 6 Hình 1.4. Công thức hóa học của cellulose ............................................................................... 8 Hình 1.5. Mô tả cấu trúc của cellulose trong tế bào thực vật ................................................... 8 Hình 1.6. Cấu trúc chung của lignin ....................................................................................... 10 Hình 1.7. Cấu trúc của hemicellulose ...................................................................................... 11 Hình 1.8. Biến đổi cấu trúc một số loại nguyên liệu lignocellulose trước và sau nổ hơi ........ 18 Hình 1.9. Mô tả cấu trúc lignocellulose đã TXL với axit bằng siêu máy tính ......................... 20 Hình 1.10. Sơ đồ phân đoạn lignocellulose bằng dung môi .................................................... 21 Hình 1.11. Sơ đồ phân đoạn bằng dung môi formicodeliTM được giới thiệu bởi Chempolis . 26 Hình 1.12. Mô tả tác động phối hợp thủy phân cellulose của hệ cellulase với sự có mặt của LMPO ...................................................................................................................................... 31 Hình 1.13. Hoạt động thủy phân của cellobiohydrolase ......................................................... 32 Hình 1.14. Thiết kế thiết bị thủy phân sử dụng cho quá trình thủy phân lignocellulose ở nồng độ bã rắn cao ............................................................................................................................ 35 Hình 1.15. Yêu cầu năng lượng cho chưng cất để thu sản phẩm có hàm lượng ethanol 94% 36 Hình 1.16. Sơ đồ hình thành các chất ức chế lên men từ lignocellulose ................................. 43 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu và bố trí các thí nghiệm của luận án........................................... 52 Hình 3.1. Kết quả phân tích thành phần bã mía nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu ................................................................................................ 60Error! Bookmark not defined. Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng phân đoạn cellulose bã mía bằng axit formic .................................................................................................................................................. 61 Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng phân đoạn cellulose bã mía bằng axit formic .................................................................................................................................................. 62 Hình 3.4. Ảnh hưởng của kích thước bã tới khả năng phân đoạn cellulose bã mía bằng axit formic ........................................................................................................................................ 63 Hình 3.5. Ảnh hưởng của khuấy trộn tới khả năng phân đoạn cellulose bã mía bằng axit formic ........................................................................................................................................ 64 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ formic tới khả năng phân đoạn cellulose bã mía ............. 65 Hình 3.7. Khả năng hòa tan lignin bã mía trong axit formic ở các nồng độ formic khác nhau .................................................................................................................................................. 66 Hình 3.8. Đồ thị bề mặt 3D biểu diễn ảnh hưởng của các điều kiện phân đoạn tới hiệu quả phân đoạn ................................................................................................................................. 70 Hình 3.9. Mối liên hệ giữa chỉ số kết tinh cellulose, hàm lượng lignin bã mía phân đoạn formiline với nhiệt độ phân đoạn ............................................................................................. 72 Hình 3.10. Ảnh chụp FESEM sợi cellulose trước và sau phân đoạn ...................................... 74 Hình 3.11. Tương quan giữa hàm lượng lignin- chỉ số kết tinh và khả năng thủy phân bã mía phân đoạn. .................................................................................................................................................. 75 VI Hình 3.12. Đồ thị bề mặt 2D biểu diễn mối liên hệ giữa điều kiện phân đoạn với kết quả phân đoạn .......................................................................................................................................... 77 Hình 3.13. Khả năng thủy phân cellulose bã mía bởi NS 22192 ............................................. 79 Hình 3.14. Ảnh hưởng của thời gian rửa kiềm đến hàm lượng lignin còn lại và khả năng thủy phân bã mía sau xử lý ............................................................................................................... 81 Hình 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ quá trình rửa kiềm đến hàm lượng lignin còn lại và khả năng thủy phân bã mía sau xử lý .............................................................................................. 82 Hình 3.16. Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn/lỏng quá trình rửa kiềm đến khả năng loại bỏ lignin bã sau phân đoạn........................................................................................................................... 83 Hình 3.17. Ảnh hưởng của chế độ tách dịch đến hàm lượng lignin trong bã sau phân đoạn và lượng NaOH cần dùng cho rửa kiềm ....................................................................................... 84 Hình 3.18. Hàm lượng lignin, hàm lượng glucan bã phân đoạn ở các nồng độ bã rắn khác nhau .......................................................................................................................................... 87 Hình 3.19. Tỉ lệ thu hồi bã và glucan bã mía phân đoạn formiline ......................................... 88 Hình 3.20. Thành phần chất tan dịch phân đoạn 15% bã mía bằng axit formic..................... 90 Hình 3.21. Hình ảnh lignin kết tủa trong dịch phân đoạn bã mía bằng axit formic khi để nguội ......................................................................................................................................... 91 Hình 3.22. So sánh khả năng thủy phân của NS221912 và Cellic Ctec2 ................................ 92 Hình 3.23. Độ ổn định hoạt tính enzyme ở điều kiện thủy phân. ............................................. 93 Hình 3.24. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới hiệu suất thủy phân cellulose bã mía phân đoạn .......................................................................................................................................... 94 Hình 3.25. Ảnh hưởng của nồng độ bã rắn tới thủy phân ....................................................... 95 Hình 3.26. Ảnh mẫu thủy phân cellulose bã mía với các nồng độ bã rắn khác nhau ............. 96 Hình 3.27. Động học quá trình thủy phân cellulose bã mía bằng axit formic......................... 98 Hình 3.28 . Ảnh hưởng của hàm lượng glucose dịch thủy phân đến tốc độ thủy phân và hiệu suất thủy phân cellulose bã mía phân đoạn ........................................................................... 100 Hình 3.29. Kết quả thủy phân 96h ở nồng độ bã rắn 20%. sử dụng các phương pháp batch, fed batch ................................................................................................................................. 101 Hình 3.30. Diễn biến hiệu suất thủy phân, hàm lượng glucose với quá trình thủy phân 20% bã rắn...................................................................................................................................... 104 Hình 3.31. Diễn biến quá trình lên men dịch thủy phân bã mía phân đoạn formiline. ......... 105 Hình 3.32. Kết quả lên men SHF 20% bã mía phân đoạn formiline. .................................... 108 Hình 3.33. Hiệu suất thủy phân và diễn biến tăng hiệu suất thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau ........................................................................................................................................ 110 Hình 3.34. Mức độ hóa lỏng bã trong 24 giờ đầu quá trình thủy phân ................................ 111 Hình 3.35. Kết quả lên men SSF 20% bã rắn ở 37°C và 30°C............................................... 111 Hình 3.36. Diễn biến hàm lượng glucose trong quá trình SSF ở 30°C................................. 113 Hình 3.37. So sánh quá trình SSF và SHF sử dụng 20% bã rắn ........................................... 115 - VII MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Lignocellulose là sinh khối phong phú nhất và có khả năng tái tạo nhanh. Nhiều loại lignocellulose có chứa hàm lƣợng cellulose cao (30-50%) [149] là nguồn nguyên liệu tốt cho sản xuất cellulose và thủy phân thành dịch đƣờng cho lên men sản xuất nhiều sản phẩm có giá trị. Trong đó sản xuất bioethanol từ lignocellulose là một hƣớng có tiềm năng đáp ứng nguồn nhiên liệu thay thế cho nhiên liệu hóa thạch [127, 144]. Do đặc điểm về cấu trúc, lignocellulose cần qua một công đoạn tiền xử lý để có thể thủy phân thành dịch đƣờng cho lên men. Tiền xử lý có vai trò phá vỡ cấu trúc lignin hoặc hòa tan lignin, hòa tan hemicellulose và phá vỡ cấu trúc tinh thể của cellulose giúp tăng cƣờng khả năng tiếp xúc của các enzyme cellulase với cellulose trong bƣớc thủy phân [14, 46, 57]. Các thành phần của lignocellose có thể đƣợc sử dụng riêng rẽ cho sản phẩm có giá trị. Hơn nữa, sự có mặt của lignin, hemicellulose và sản phẩm phân hủy của chúng có thể gây ức chế sự thủy phân và quá trình lên men sau này [17, 86, 153]. Phân đoạn là biện pháp tiền xử lý (TXL) cho phép tách lignocellulose thành những thành phần riêng, nhờ vậy có thể sử dụng hiệu quả các thành phần này. Cellulose thu đƣợc có hàm lƣợng cao [153, 160] có thể đƣợc sử dụng cho nhiều mục đích nhƣ sản xuất giấy, tơ sợi, cellulose vi tinh thể [94, 125] hay thủy phân thành dịch đƣờng cho lên men bao gồm lên men sản xuất ethanol. Bã mía là một nguồn sinh khối tiềm năng. Ở Việt Nam, lƣợng bã mía, phụ phẩm từ sản suất đƣờng mía, ƣớc đạt 6-7 triệu tấn/năm, tập trung ở các nhà máy, là yếu tố thuận lợi lớn cho sử dụng nguồn sinh khối này. Với hàm lƣợng cellulose cao 40-45% [93, 111], bã mía là nguyên liệu thích hợp cho sản xuất cellulose hay thủy phân thành dịch đƣờng cho lên men. Việc sử dụng bã mía để sản xuất cellulose hay dịch đƣờng cho lên men nói chung và sản xuất ethanol nói riêng còn là giải pháp giúp giải quyết triệt để vấn đề phát sinh chất thải từ bã mía ở các nhà máy và là giải pháp toàn diện thân thiện với môi trƣờng. Góp phần giải quyết vấn đề này, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu phân đoạn lignocellulose bã mía bằng axit formic thu nhận cellulose sử dụng làm nguyên liệu sản xuất bioethanol”. 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Đối tƣợng nghiên cứu : Bã mía, cellulose thu nhận từ bã mía bằng kỹ thuật phân đoạn. - Phạm vi nghiên cứu: Kỹ thuật phân đoạn cellulose bã mía bằng axit formic; thủy phân cellulose bã mía phân đoạn thu đƣợc, nghiên cứu lên men ethanol từ cellulose bã mía. 1 3. MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN - Xây dựng đƣợc quy trình phân đoạn cellulose bã mía bằng axit formic, thu nhận cellulose sạch (có hàm lƣợng cao) làm nguyên liệu cho sản xuất bioethanol. - Nghiên cứu thủy phân và lên men cellulose bã mía phân đoạn nhằm đạt nồng độ cồn trong dịch lên men cao. 4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu phân đoạn bã mía bằng axit formic + Khảo sát các điều kiện của quá trình phân đoạn bã mía bằng axit formic + Nghiên cứu tác động đồng thời của các điều kiện phân đoạn bã mía bằng axit formic + Một số đặc tính vật lý của cellulose bã mía phân đoạn và khả năng thủy phân của cellulose bã mía thu đƣợc - Nghiên cứu thủy phân cellulose bã mía phân đoạn bằng enzyme + Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme, nồng độ bã rắn tới hiệu suất thủy phân + Ảnh hƣởng ức chế sự thủy phân cellulose bằng enzyme bởi glucose + Động học quá trình thủy phân cellulose bã mía phân đoạn thu đƣợc + Thủy phân bã mía phân đoạn ở nồng độ bã rắn 20% - Nghiên cứu lên men ethanol từ cellulose bã mía phân đoạn + Lên men dịch thủy phân cellulose bã mía phân đoạn + Nghiên cứu phƣơng án nâng cao nồng độ ethanol trong dịch lên men và hiệu suất thu hồi ethanol từ cellulose bã mía phân đoạn. 5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN - Ý nghĩa khoa học: + Các kết quả của luận án bổ sung thêm kiến thức về quá trình phân đoạn cellulose từ nguyên liệu lignocellulose bằng axit formic. Luận án cung cấp cơ sở khoa học cho lựa chọn kỹ thuật phân đoạn bã mía bằng axit formic + Cung cấp cơ sở khoa học cho lựa chọn kỹ thuật thủy phân và lên men ethanol từ cellulose bã mía phân đoạn bằng axit formic đạt hiệu suất thu hồi ethanol cao. - Ý nghĩa thực tiễn: + Kết quả nghiên cứu cho phép phát triển công nghệ sản xuất cellulose từ bã mía ứng dụng cho phát triển vật liệu cellulose và làm nguyên liệu sản xuất các sản phẩm sinh học, nâng cao giá trị của phụ phẩm bã mía. 2 + Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho phát triển công nghệ sản xuất bioethanol từ bã mía tại Việt nam. 6. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Đánh giá tác động đồng thời của các điều kiện phân đoạn và xây dựng mô hình ảnh hƣởng của các điều kiện phân đoạn đến hiệu quả phân đoạn cellulose bã mía bằng axit formic, đánh giá ảnh hƣởng của các điều kiện rửa kiềm đến hàm lƣợng lignin, hiệu suất thủy phân cellulose bã mía phân đoạn. - Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam sử dụng axit formic để phân đoạn bã mía thu cellulose. Quá trình phân đoạn bã mía theo chế độ lựa chọn cho phép thu cellulose có độ sạch 90,02±1,47%, đƣợc thủy phân với hiệu suất 90,04±0,53% glucan; dịch thủy phân đƣợc lên men dễ dàng, hiệu suất lên men đạt 90,34±1,19%. - Cellulose bã mía phân đoạn đƣợc chuyển hóa thành ethanol đạt hiệu suất thu hồi 81,66 ±1,88%, nồng độ ethanol trong dịch lên men SSF đạt 82,46±3,42 g/L (>10% v/v), tiếp cận yêu cầu của công nghiệp sản xuất ethanol. 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TỪ LIGNOCELLULOSE Công nghệ sinh khối là một lĩnh vực rộng liên quan đến chế biến hay chuyển hóa sinh khối thành các sản phẩm khác nhau. Trong công nghệ sinh khối ở thời điểm hiện tại, lignocellulose là nguyên liệu đƣợc quan tâm nhất. Lignocellulose là là thành phần chính cấu trúc lên thành tế bào thực vật. Sản lƣợng lignocellulose hàng năm trên toàn thế giới đƣợc ƣớc tính vào khoảng 1 x 1011 triệu tấn [115]. Công nghệ sinh khối từ lignocellulose và các sản phẩm có thể đƣợc mô tả nhƣ Hình 1.1. Sinh khối (lignocellulose) Tiền xử lý Lignin (Phenol-polymer) Hemicellulose (pentose, hexose) Cellulose (Glucose-polymer) Vật liệu cellulose, giấy, cell-vi tinh thể… Thủy phân Chất kết dính, keo dán, sợi các bon Vanillin, Quinone, Guaiacol… Chất đốt Xylitol Glucose HMF, Axit levulinic Lên men Fufural Nhựa fufural, Nylon… Ethanol Chất làm mềm, dung môi Axit hữu cơ Glycerin… Hóa polyme chất, Hình 1.1. Một số sản phẩm chuyển hóa có giá trị từ cellulose và đường [39, 94] Trong công nghệ sinh khối lignocellulose, cellulose và sản phẩm thủy phân của nó là đƣờng đƣợc chuyển hóa thành nhiều sản phẩm khác nhau [39]. Có nhiều phƣơng pháp tiền xử lý (TXL) có thể đƣợc áp dụng để TXL lignocellulose, cho phép tách riêng các thành phần cellulose, hemicellulose và lignin ở mức độ khác nhau. Phƣơng pháp phân đoạn lignocellulose bằng dung môi là biện pháp TXL cho phép tách lignocellulose các thành phần cellulose, hemicellulose, lignin. Cellulose thu đƣợc có hàm lƣợng cao hay độ tinh sạch cao có thể đƣợc sử dụng làm bột giấy, sản xuất các vật liệu cellulose, sản xuất tơ sợi v.v. [94, 125] hoặc để 4 thủy phân tạo đƣờng cho lên men sản xuất nhiều sản phẩm nhƣ sản xuất sinh khối nấm men, glycerin, các axit hữu cơ, ethanol v.v.. Tƣơng tự với cellulose, hemicellulose hay các đƣờng 5 cacbon thu đƣợc có thể đƣợc sử dụng cho lên men tạo thành nhiều sản phẩm khác nhau [69]. Phần lignin thu đƣợc có thể đƣợc sử dụng để điều chế các chất hóa học nhƣ các quinol, vanilline v.v.. Phần lignin ở dạng polyme có thể đƣợc ứng dụng trong việc tạo độ cứng, chống thấm nƣớc cho các sản phẩm giấy, gỗ công nghiệp; làm chất kết dính, keo dán, sợi cacbon v.v.. [13]. Lignocellulose Tiền xử lý (phân đoạn) (Hemicellulose) Pentose Phụ phẩm chăn nuôi Ethanol Cellulose Thủy phân Lên men ethanol Chƣng cất Lên men ethanol Lignin Hình 1.2. Sơ đồ công nghệ sản xuất bioethanol từ sinh khối lignocellulose Bioethanol thế hệ 2 hay bioethanol từ lignocellulose là một sản phẩm tiềm năng của công nghệ sinh khối lignocellulose. Với sản lƣợng lớn của lignocellulose, bioethanol từ nguồn sinh khối này có khả năng đáp ứng nhu cầu ethanol nhiên liệu để thay thế cho nhiên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt. Quá trình sản xuất bioethanol từ lignocellulose có thể mô tả nhƣ ở Hình 1.2. Các sản phẩm đƣờng pentose thu đƣợc từ quá trình TXL và thủy phân bởi enzyme có thể đƣợc lên men thành ethanol. Tuy nhiên để thực hiện điều này đòi hỏi phải phối hợp các chủng vi sinh vật có khả năng lên men đƣờng pentose với nấm men Saccharomyces cerevisiae hoặc sử dụng các chủng biến đổi gen. Hiện tại, khả năng lên men các đƣờng C5 đạt đƣợc thấp, mặt khác các đƣờng C5 nhƣ xylose có thể đƣợc tách riêng cho các ứng dụng hấp dẫn nhƣ sản xuất xylitol v.v. [51, 72]. Vì vậy sẽ tốt hơn nếu đƣờng pentose đƣợc tách ra để sử dụng cho các mục đích riêng. Các công đoạn chính sản xuất ethanol từ lignocellulose gồm TXL lignocellulose, thủy phân cellulose và lên men tạo ethanol. Trong đó TXL đƣợc coi là bƣớc có vai trò quyết định, có tác động lớn đến tất cả các bƣớc tiếp theo của toàn bộ quá trình nhƣ hiệu quả thủy phân, khả năng lên men v.v. [14, 32, 139]. Trong khuôn khổ luận án này, chúng tôi tập trung theo 5 hƣớng thu cellulose sau đó thủy phân thành dịch đƣờng và sử dụng cho lên men ethanol. Biện pháp TXL đƣợc nghiên cứu nhằm mục đích tạo thành nguồn nguyên liệu cellulose có hàm lƣợng cao, có thể đƣợc ứng dụng cho nhiều mục đích. Đồng thời các sản phẩm phụ lignin, hemicellulose có thể đƣợc phân riêng. 1.2. NGUYÊN LIỆU LIGNOCELLULOSE BÃ MÍA Lignocellulose đƣợc sử dụng trong công nghệ sinh khối có thể từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ gỗ, rơm rạ, bã mía v.v. Mặc dù là nguồn nguyên liệu sẵn có và rẻ tiền, tuy nhiên việc thu gom và tập trung nguyên liệu làm gia tăng đáng kể chi phí của sản xuất. Theo số liệu của FAO năm 2015, mía đƣợc trồng ở hơn 90 quốc gia trên thế giới với diện tích khoảng 23 triệu hecta, sản lƣợng mía ƣớc đạt 1,83 tỷ tấn (nguồn: fenix.fao.org). Với hàm lƣợng bã khoảng 3033%, sản lƣợng bã mía hàng năm thải ra từ sản xuất đƣờng mía khoảng 54-60 triệu tấn. Ở Việt Nam, theo số liệu của Tổng cục Thống kê, tổng diện tích trồng mía cả nƣớc vụ 2012/13 đạt khoảng 309,3 ngàn hecta, sản lƣợng mía đạt hơn 20 triệu tấn. Nhƣ vậy, mỗi năm cả nƣớc thải ra 6-7 triệu tấn bã mía. Bã mía không chỉ là nguồn sinh khối có số lƣợng lớn mà ƣu thế nổi bật của nguồn sinh khối này là tập trung ở các nhà máy đƣờng giúp tiết kiệm chi phí cho việc thu gom nguyên liệu. 1.2.1. Thành phần, cấu trúc của lignocellulose và bã mía Hình 1.3. Cấu trúc lignocellulose [23] 6 Về thành phần và cấu trúc, bã mía cũng giống nhƣ các sinh khối lignocellulose khác. Thành phần, cấu trúc của lignocellulose có vai trò quan trọng quyết định đến khả năng đƣợc sử dụng của loại sinh khối này. Các thành phần chủ yếu của lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin nằm xen kẽ và tƣơng tác lẫn nhau tạo thành một cấu trúc vững chắc (Hình 1.3) [66, 83] làm cho vật liệu này khó đƣợc sử dụng, đồng thời làm giảm giá trị sử dụng của mỗi thành phần. Các thành phần này đƣợc mô tả với lignin, hemicellulose tồn tại ở dạng vô định hình; cellulose tồn tại ở dạng cấu trúc tinh thể. Lignin bao bọc bên ngoài, liên kết với hemicellulose và cả cellulose, hemicellulose nằm xen kẽ với cellulose [33]. Các loại lignocellulose khác nhau, thành phần cellulose, hemicellulose và lignin có sự khác biệt (Bảng 1.1). Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose từ các nguồn khác nhau [149] Nguồn lignocellulose Cellulose(%) Hemicellulose(%) Lignin(%) Thân gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 Thân gỗ mềm 45-50 25-35 25-35 Vỏ lạc 25-30 25-30 30-40 Lõi ngô 45 35 15 Vỏ trấu 32.1 24 18 Vỏ trấu lúa mì 30 50 15 Giấy 85-99 0 0-15 Lá cây 15-20 80-85 0 Bông 80-95 5-20 0 Các loại cỏ 25-40 25-50 10-30 Xác cây mía 54.87 16.52 23.33 Bã mía 42 25 20 1.2.1.1. Cellulose Cellulose là thành phần có giá trị nhất trong lignocellulose hiện nay, có công thức cấu tạo (C6H10O5)n, là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau tạo thành chuỗi 4-O-(β-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.4). Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp đƣợc khoảng 5 x 1010 tấn cellulose. Hàm lƣợng cellulose có thể chiếm 15 - 90% trong các lignocellulose khác nhau nhƣ lá cây, bông [71]; trong bã mía cellulose khoảng 34,4–55% [75, 106]. 7 Về cấu trúc, các mạch cellulose đƣợc liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình. Trong hầu hết các trƣờng hợp, cellulose đƣợc bao bọc bởi hemicellulose và lignin [33], điều này làm cho cellulose tự nhiên nằm trong cấu trúc của lignocellulose khó đƣợc tiếp cận và thủy phân bởi enzyme. Hình 1.4. Công thức hóa học của cellulose (nguồn: wikimedia) Hình 1.5. Mô tả cấu trúc của cellulose trong tế bào thực vật (nguồn: bio1151.nicerweb.com) Các nghiên cứu cho thấy phân tử cellulose không phân nhánh và có mạch phân tử khá dài, từ 3000 đến 10.000 đơn vị glucose, khi đƣợc thuỷ phân hoàn toàn thì thu đƣợc glucose. Các phân tử cellulose kết hợp nhau tạo thành micel là bó sợi có chiều dày 50-100Å. Các micel lại tạo thành bó microfibril với đƣờng kính khoảng 250Å, các microfibril tập hợp thành fibril có đƣờng kính 2000Å có thể quan sát đƣợc bằng kính hiển vi thƣờng (Hình 1.5). Các sợi cellulose chính là các fibril, gồm các phân tử cellulose liên kết với nhau bằng rất nhiều liên kết hydro, tạo cấu trúc dạng sợi bền chắc. Trong cấu trúc sợi của cellulose, có những đoạn (segment) mà liên kết giữa các phân tử cellulose yếu hơn đƣợc gọi là vùng vô định hình. Vùng này dễ bị tác động của các tác nhân hóa học, sinh học; khi vùng này bị phân cắt, vùng tinh thể của sợi cellulose đƣợc tách ra để điều chế cellulose vi tinh thể có nhiều ứng dụng trong y học, công nghiệp và thực phẩm [71]. Ở vùng các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, tạo thành cấu trúc tinh thể. Vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng nhƣ hóa chất. 8 Chỉ số kết tinh của cellulose (CrI ) thƣờng từ 30 đến 80%, tùy theo phần trăm cellulose tồn tại ở dạng tinh thể. Cellulose bã mía có CrI khoảng 48,0% và phụ thuộc lớn vào hàm lƣợng hemicellulose có mặt. Sau quá trình TXL, chỉ số kết tinh có thể tăng lên hoặc giảm đi phụ thuộc vào hàm lƣợng hemicellulose còn lại và phƣơng pháp TXL. Nghiên cứu của Roberta, sau quá trình TXL với SO2 và CO2, chỉ số kết tinh cellulose bã mía thu đƣợc là 65,5% và 56,4% tƣơng ứng với lƣợng hemicellulose loại bỏ là 68,3% và 40,5% [110]. Trong quá trình TXL, việc mở cấu trúc tinh thể của cellulose đồng nghĩa với việc làm đứt gãy các liên kết hydro, giải phóng các gốc hydroxyl tự do, làm lỏng lẻo mối liên kết giữa các sợi cellulose giúp cho sự xâm nhập và thủy phân cellulose bởi các cellulase dễ dàng hơn. Dung dịch kiềm ở nồng độ khác nhau và ở nhiệt độ khác nhau có khả năng hòa tan cellulose với mức polyme hóa khác nhau [33]. Dù vậy trong cấu trúc của lignocellulose, cellulose tồn tại ở dạng các fibril hay các sợi và không có khả năng hòa tan. Tuy nhiên trong quá trình TXL cấu trúc tinh thể của cellulose giảm đi, mạch cellulose có thể bị thủy phân hay cắt ngắn. Khi đó một phần cellulose có thể đƣợc hòa tan làm giảm hiệu suất thu hồi bột cellulose. Cellulose bị thủy phân bởi axit. Trong axit đậm đặc (H2SO4 72%) quá trình thủy phân có thể xảy ra ở nhiệt độ thƣờng (30°C). Trong axit loãng, quá trình thủy phân cellulose diễn ra chậm vì vậy thƣờng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ cao 140-180°C. Thủy phân gỗ có thể đƣợc thực hiện ở nồng độ H2SO4 0,5% ở nhiệt độ 180°C [1]. Ở nồng độ H2SO4 4%, nhiệt độ 121°C trong thời gian 60 phút, chỉ các mạch cellulose ngắn đƣợc thủy phân thành đƣờng [124]. Ở nồng độ axit sulphuric 10%, nhiệt độ 100°C, trong thời gian 40 phút, cellulose thủy phân và hòa tan khoảng 15% [28]. Tính chất này cho thấy trong quá trình TXL bằng axit một phần cellulose có thể bị thủy phân hay hòa tan, đặc biệt là khi tiến hành ở nhiệt độ cao trong thời gian dài. 1.2.1.2. Lignin Lignin là một trong các polyme hữu cơ phổ biến trên trái đất. Lignin là một phức chất, tồn tại chủ yếu ở giữa các tế bào và trong thành tế bào thực vật. Lignin có cấu trúc không gian 3 chiều phức tạp, vô định hình, chiếm 17% đến 33% thành phần của lignocellulose [43]; khoảng 27-32% ở cây thân gỗ và khoảng 14-25% trong cây thân thảo [33]. Trong bã mía lignin chiếm khoảng 18–24% [75, 106]. Lignin có liên kết chặt chẽ với các carbohydrate giúp thực vật cứng chắc và giòn. Thực vật càng già, lƣợng lignin tích tụ càng lớn. Lignin đƣợc cấu thành từ các đơn vị phenylpropene. Các đơn vị điển hình cấu trúc lên lignin là: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; phydroxylphenyl (H), trans-p-courmary alcohol (Hình 1.6). 9