Tài liệu Nghiên cứu phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc xác định một số phụ gia thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------------------------- NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC XÁC ĐỊNH MỘT SỐ PHỤ GIA THỰC PHẨM Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 62440118 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2016 Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Thị Ngọc Mai TS. Nguyễn Thị Ánh Hường Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ............................................................................. Họp tại................................................................................................... vào hồi.......giờ, ngày.......tháng.......năm 2016. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm thông tin - thư viện Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Vấn đề an toàn thực phẩm ở nước ta đã trở nên đáng báo động hơn bao giờ hết khi một loạt các vụ việc về thực phẩm bẩn bị phanh phui trong thời gian vừa qua. Các vụ vi phạm liên quan đến an toàn thực phẩm diễn ra khắp mọi nơi, ở các công ty chế biến thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, từ chợ cóc đến siêu thị uy tín, từ nhà hàng sang trọng đến bếp ăn tập thể trong khu công nghiệp, trường học, quán cơm bình dân,… Ngộ độc thực phẩm và các bệnh do thực phẩm gây ra không chỉ gây ảnh hưởng trực tiếp tới sức khoẻ, cuộc sống của mỗi người, mà còn gây thiệt hại lớn về kinh tế, là gánh nặng chi phí cho chăm sóc sức khoẻ. Một trong số các vấn đề liên quan đến an toàn thực phẩm đang được quan tâm hiện nay là sử dụng trái phép và tồn dư các chất cấm (như chất tạo nạc), kháng sinh trong chăn nuôi, sử dụng không đúng liều lượng và quy cách các chất phụ gia thực phẩm (chất tạo ngọt, chất điều chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm…), sử dụng các chất cấm trong chế biến, bảo quản thực phẩm và trong chăn nuôi. Do đó, việc nghiên cứu phát triển các quy trình và phương pháp phân tích cho các nhóm chất này là rất cần thiết. Việc phân tích các chỉ tiêu thực phẩm ở VN hiện nay vẫn là vấn đề mới, chưa có đầy đủ các qui trình phân tích tiêu chuẩn theo TCVN. Thông thường, việc kiểm nghiệm thực phẩm được thực hiện chủ yếu bằng các phương pháp sắc ký (như: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí khối phổ (GC MS), sắc ký ion (IC),..). Tuy nhiên, các thiết bị phân tích này có chi phí đầu tư lớn và thường chỉ được trang bị tại Viện kiểm nghiệm tuyến Trung ương (Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia) và một số trung tâm kiểm nghiệm tuyến tỉnh. Trong khi đó, nhu cầu phân tích, kiểm nghiệm các chỉ tiêu liên quan đến an toàn thực phẩm là rất lớn và nhiều khi cần thực hiện ngay tại các địa phương để đáp ứng nhiệm vụ kiểm tra ngăn ngừa và xử lý kịp thời các vụ việc. Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE - C4D) gần đây được biết đến là một công cụ hữu hiệu trong phân tích thực phẩm với các ưu điểm nổi trội như thiết bị nhỏ gọn, hoạt động đơn giản, lượng mẫu và các dung môi hóa chất ít, chi phí đầu tư và vận hành thấp, có thể chế tạo và linh kiện thay thế sẵn có tại Việt Nam, từ đó cho chi phí phân tích mẫu thấp hơn so với các phương pháp phân tích hiện đại khác như HPLC, GC - MS. Phương pháp CE - C4D cho thấy triển vọng trở thành một công cụ đắc lực trong sàng lọc, kiểm nghiệm an toàn thực phẩm, nhất là tại các phòng thí nghiệm vừa và nhỏ ở tuyến địa phương, các chợ và siêu thị, các địa điểm kinh doanh, bếp ăn tập thể hay nhóm hộ tiêu dùng. 1 Với đề tài: “Nghiên cứu phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc xác định một số phụ gia thực phẩm”, bản luận án tập trung vào các mục tiêu nghiên cứu phát triển ứng dụng của phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết nối tụ điện (CE - C4D) nhằm xác định một số chất phụ gia và kích thích sinh học trong thực phẩm bao gồm phân tích đồng thời bốn chất điều chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm (acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric), phân tách đồng thời bốn chất tạo ngọt (acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin) và xác định đồng thời ba chất thuộc nhóm β - agonist (sabutamol, ractopamin, metoprolol), trong đó có abutamol thường được thêm trái phép vào thức ăn chăn nuôi để tăng tỷ lệ thịt nạc của vật nuôi (còn hay được gọi là chất tạo nạc). 2. Nội dung nghiên cứu 1. Tổng quan tài liệu về phương pháp điện di mao quản, về một số phụ gia thực phẩm, các phương pháp xác định phụ gia thực phẩm và ứng dụng của phương pháp điện di mao quản trong việc phân tích một số phụ gia thực phẩm 2. Nghiên cứu khảo sát phương pháp CE - C4D nhằm xác định một số phụ gia thực phẩm: điều kiện tối ưu để xác định đồng thời bốn acid hữu cơ (acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric), bốn chất tạo ngọt (acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin) và ba chất tạo nạc lựa chọn thuộc nhóm các β - agonist (sabutamol, ractopamin, metoprolol). 3. Nghiên cứu phương pháp chiết pha rắn làm sạch và làm giàu salbutamol trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn nhằm xác định bằng phương pháp CE - C4D. 4. Nghiên cứu áp dụng các điều kiện tối ưu đã khảo sát được để phân tích một số phụ gia thực phẩm trong các mẫu thực tế, đặc biệt là chất tạo nạc salbutamol trong qui trình khép kín từ thức ăn chăn nuôi, nước tiểu lợn và thịt lợn. 5. Đánh giá độ tin cậy và triển vọng của phương pháp CE - C4D trong việc phân tích một số chỉ tiêu liên quan đến an toàn thực phẩm, so sánh, đối chứng kết quả phân tích mẫu thực tế với kết quả phân tích bằng các phương pháp phân tích tiêu chuẩn như: HPLC, GC-MS. 3. Điểm mới, những đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn của luận án  Về mặt khoa học Phương pháp điện di mao quản với detector UV đã được ứng dụng nhiều trong phân tích thực phẩm nhưng lần đầu tiên ở Việt Nam, luận án đã nghiên cứu ứng dụng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE- C4D) xây dựng quy trình xác định đồng thời một số chất phụ gia (chất điều chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm và chất tạo ngọt) và kích thích sinh học (nhóm β - agonist - chất tạo nạc) trong thực phẩm. Tổng quan nghiên cứu cho thấy, trên thế giới mới chỉ có ba nghiên cứu sử dụng 2 phương pháp CE- C4D phân tích các nhóm chất này (trong đó có hai nghiên cứu xác định nhóm chất tạo ngọt và một nghiên cứu xác định salbutamol trong dược phẩm). Vì vậy có thể nói luận án đã tiên phong trong việc sử dụng phương pháp CE- C4D trong lĩnh vực phân tích thực phẩm, đóng góp thê một phương pháp kiểm nghiệm thực phẩm, từ đó hi vọng sẽ góp phần vào việc quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm ở Việt Nam.  Về mặt thực tiễn Phương pháp CE - C4D với các ưu điểm về hệ thiết bị mở ra khả năng áp dụng phân tích nhiều đối tượng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là với lĩnh vực an toàn thực phẩm, có ý nghĩa thực tế lớn, thích ứng với hoàn cảnh, điều kiện kinh tế, xã hội ở nước ta. Các quy trình phân tích xây dựng trong luận án đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp, có độ chính xác cao, rất phù hợp để áp dụng phân tích các chất điều chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm và chất tạo ngọt trong các mẫu thực phẩm, giúp kiểm soát sử dụng đúng hàm lượng và quy cách các phụ gia này trong thực phẩm. Đặc biệt là với salbutamol, một chất tạo nạc được sử dụng trái phép nhiều trong chăn nuôi ở nước ta, quy trình phân tích trong luận án đã được áp dụng để phân tích salbutamol trong mẫu thức ăn chăn nuôi, mẫu nước tiểu lợn và mẫu thịt lợn, có thể giúp các nhà quản lý kiểm tra, giám sát và kịp thời ngăn chặn xử lý việc sử dụng chất cấm này trong chăn nuôi. 4. Bố cục của luận án Luận án gồm năm phần chính là: mở đầu, chương 1: tổng quan, chương 2: nội dung và phương pháp nghiên cứu, chương 3: kết quả và thảo luận, kết luận. Trong mỗi phần có các hình ảnh và bảng biểu minh họa tương ứng, phù hợp. Ngoài ra luận án còn gồm đầy đủ các phần: mục lục, danh mục các ký hiệu và chữ cái viết tắt, danh mục bảng, danh mục hình, danh mục các công trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án, tài liệu tham khảo tiếng Việt, tiếng Anh và các phụ lục liên quan. 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. Một số chất phụ gia và kích thích sinh học trong sản xuất thực phẩm 1.1.1. Khái quát chung về một số nhóm phụ gia thực phẩm Các chất phụ gia được thêm vào thực phẩm để bảo quản hay cải thiện hương vị và hình thức của thực phẩm. Trong số các phụ gia thực phẩm thì acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric với vai trò điều chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm và acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin với vai trò chất tạo ngọt được sử dụng rất phổ biến. Thực phẩm có hàm lượng phụ gia vượt quá giới hạn cho phép sẽ gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Do đó, Bộ Y Tế đã ban hành QCVN 4 - 8.2010, QCVN 4 11.2010, QCVN 4 - 12.2010 quy định các yêu cầu kỹ thuật và quản lý về chất lượng, vệ sinh an toàn đối với các chất ngọt tổng hợp, các chất điều chỉnh độ acid và chất bảo quản được sử dụng với mục đích làm phụ gia thực phẩm. 1.1.2. Các chất kích thích sinh học β-agonist Salbutamol, metoprolol, ractopamin (Sal, Met và Rac) là ba trong số các chất β-agonist vừa được ứng dụng trong dược phẩm vừa được thêm trái phép vào thức ăn chăn nuôi, dẫn đến tồn dư ở thịt động vật, gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Đặc biệt là Sal được dùng phổ biến trong y học để điều trị các bệnh về đường hô hấp nhưng cũng được sử dụng lén lút nhiều trong chăn nuôi làm giảm tỷ lệ mỡ, tăng tỷ lệ nạc ở gia súc, gia cầm. Tại Việt Nam, bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã cấm sử dụng Sal trong chăn nuôi. 1.2. Các phƣơng pháp xác định chất phụ gia và kích thích sinh học trong thực phẩm và mẫu sinh học 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Hiện nay các phương pháp được sử dụng để xác định các chất phụ gia và kích thích sinh học trong thực phẩm bao gồm phương pháp sắc ký (HPLC, GC, IC), phương pháp điện hóa, phương pháp UV- Vis, phương pháp sinh học và phương pháp điện di mao quản. Trong đó các phương pháp sắc ký được dùng phổ biến nhất, đối với chất phụ gia có hàm lượng tương đối cao trong thực phẩm hay sử dụng cùng các detector có độ nhạy trung bình như UV, PDA, ELSD… (LOD cỡ ppm), còn đối với cácchất kích thích sinh học có hàm lượng thấp thì sử dụng các detector có độ nhạy cao như MS, ESI/MS, MS/MS… (LOD cỡ ppb). Trong khoảng 10 năm trở lại đây, phương pháp điện di (CE, CZE, ITP, MECC) với các detector UV, DAD, điện hóa và đặc biệt gần đây là detector độ dẫn C4D đang nhanh chóng phát triển thành một phương pháp có độ nhạy (cỡ ppm) phù hợp để xác định các phụ gia thực phẩm. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Giới hạn cho phép của các phụ gia thực phẩm (chất điều chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm và chất tạo ngọt) khá cao vì vậy các Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm (QCVN 4.2010 - BYT) và TCVN quy định phương pháp chuẩn độ để định lượng các chất này trong thực phẩm. Đến nay 4 mới chỉ có TCVN 8471:2010 dùng phương pháp HPLC để xác định đồng thời aspartam, saccharin, acesulfam - kali trong thực phẩm. Đặc biệt với các chất tạo nạc, hiện nay vẫn chưa có tiêu chuẩn và quy chuẩn để xác định. Vì vậy mục tiêu đặt ra của luận án là nghiên cứu xây dựng phương pháp CE-C4D có độ nhạy phù hợp với giới hạn cho phép của các phụ gia thực phẩm và có thể áp dụng được để phân tích các chất tạo nạc trong mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn một cách đơn giản, tiện lợi, áp dụng được ở các phòng thí nghiệm nhỏ tuyến địa phương. 1.3. Phƣơng pháp điện di mao quản 1.3.1. Giới thiệu chung về phương pháp điện di mao quản Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phần tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất điện ly có chất đệm pH dưới tác dụng một điện trường (E) nhất định được sinh ra do thế V. Hiện nay, CE được phân loại theo các cơ chế tách như sau: Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis - CZE), điện di mao quản điểm đẳng điện (Isoelectric focusing - IFF), điện di mao quản đẳng tốc độ (Isotachophoresis - ITP), điện di mao quản Gel (Capillary Gel Electrophoresis - CGE) và sắc ký điện di mao quản điện động học kiểu micelle (Micellar electrophoresis capillary chromatography - MECC). 1.3.2. Nguyên tắc và cấu tạo của một hệ điện di mao quản cơ bản Phương pháp điện di mao quản hiện đại sử dụng điện trường sinh ra bởi một nguồn thế cao (hàng chục kV) áp vào mao quản (có đường kính trong 10 - 150 µm) tại đầu bơm mẫu, làm cho các chất tích điện (trong nền dung dịch điện ly, có đệm pH thích hợp) di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo của một hệ thiết bị CE 1.3.3. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản Độ điện di (µ) là hằng số đặc trưng cho hạt tích điện trong một điều kiện điện di xác định: µ = q/(6...r.) (1.4) 5 Từ công thức (1.4) có thể thấy, độ điện di tỷ lệ thuận với điện tích của hạt mang điện (q) và tỷ lệ nghịch với độ nhớt của dung dịch đệm điện di (), bán kính hyddrat của hạt mang điện (r). Nghĩa là, trong một điện trường E nhất định, chất nào có điện tích lớn và kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh; với các chất mang điện có cùng điện tích, chất nào có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn; với các chất mang điện có cùng bán kính, chất nào có điện tích lớn sẽ di chuyển nhanh hơn 1.3.4. Dòng điện di thẩm thấu và phương pháp thay đổi dòng điện di thẩm thấu phân cực ngược anion chất phân tích Dòng chảy của khối chất lỏng trong mao quản được gọi là dòng điện di thẩm thấu (EOF). Trong mao quản Silica và khoảng pH điện di 4 ÷ 9, dòng EOF thường hướng theo phương từ Anot (cực dương) về Catot (cực âm). Ở điều kiện đó, các anion có tốc độ điện di riêng nhỏ hơn tốc độ của dòng EOF sẽ được dòng EOF mang theo về phía cực âm. Nếu tăng tốc độ dòng EOF sẽ làm các anion đó bị cuốn theo, di chuyển cùng dòng EOF về phía cực âm nên cần phân cực ngược (áp thế ở đầu bơm mẫu) để phân tách các anion này. 1.3.5. Các detector thông dụng trong phương pháp điện di mao quản Tùy thuộc vào mục đích phát hiện hay định lượng, cũng như tùy thuộc vào tính chất hóa học, hóa lý, vật lý của các chất phân tích có thể sử dụng các detector tương ứng như: Detector quang học, detector khối phổ, detector điện hóa, detector độ dẫn… Trong đó detector độ dẫn không tiếp xúc (C4D) có ưu điểm là đáp ứng với tất cả các hợp phần mang điện, có thể chế tạo thu nhỏ và đặc biệt có thể tự chế tạo ở Việt Nam. C4D đã được ứng dụng trong khoảng 10 năm trở lại đây, trở thành detector phổ biến trong điện di mao quản. 1.3.6. Ứng dụng của phương pháp điện di mao quản CE -C4D Trong những năm gần đây, phương pháp điện di mao quản CE -C4D đã được phát triển rất nhanh và ứng dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong môi trường, sinh học, dược phẩm, thực phẩm… để định lượng các anion, cation cơ bản, phụ gia thực phẩm, kháng sinh, thuốc kích dục, thuốc gây mê, ma túy tổng hợp… CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu Mục tiêu của luận án là nghiên cứu phát triển ứng dụng của phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết nối tụ điện (CE - C4D) nhằm xác định một số chất phụ gia và kích thích sinh học trong mẫu thực phẩm và mẫu sinh học. Để đạt được mục tiêu nghiên cứu đề ra, các nội dung chính được thực hiện gồm: Khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định đồng thời bốn acid hữu cơ (acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric), bốn chất tạo ngọt (acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin)và ba chất tạo nạc lựa 6 chọn thuộc nhóm các β - agonist (sabutamol, ractopamin, metoprolol). Nghiên cứu phương pháp chiết pha rắn làm sạch và làm giàu salbutamol trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn nhằm xác định bằng phương pháp CE - C4D. Áp dụng các điều kiện tối ưu thu được để phân tích các mẫu thực tế, đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp CE - C4D Nghiên cứu được thực hiện trên hệ thiết bị điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE -C4D). Một hệ thiết bị CE cơ bản bao gồm các bộ phận: Mao quản tách, dung dịch đệm điện di, nguồn điện thế cao, detector (cảm biến) độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C4D) và bộ phận điều khiển. 2.2.2. Phương pháp khảo sát các điều kiện tối ưu Việc khảo sát các điều kiện tách đồng thời các chất phân tích được thực hiện trên thiết bị điện di CE-C4D với cột mao quản có chiều dài 60 cm, đường kính trong 50 µm. Bơm mẫu bằng phương pháp thuỷ động lực học kiểu xi phông. Các điều kiện này được giữ nguyên trong tất cả các thí nghiệm. Ngoài ra cũng khảo sát một số điều kiệnkhác bao gồm: Dung dịch đệm điện di, thế điện di, chiều cao và thời gian bơm mẫu theo phương pháp đơn biến. 2.2.3. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu thực phẩm Các mẫu thực phẩm được lấy ngẫu nhiên trên địa bàn Hà Nội. Các mẫu ở dạng lỏng chỉ cần lọc qua màng lọc 0,45 µm, pha loãng với tỷ lệ phù hợp. Các mẫu ở dạng rắn được đồng nhất mẫu, thêm nước cất đề ion, rung siêu âm trong khoảng thời gian hợp lý sau đó lọc qua màng lọc. 2.2.4. Phương pháp lấy mẫu và xử lý, làm giàu mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn Mẫu nước tiểu lợn, mẫu thịt lợn được lấy từ con lợn nuôi thí nghiệm, được xử lý sơ bộ rồi cho qua cột chiết pha rắn (SPE). Các cột chiết pha rắn khảo sát gồm cột C18, cột SCX 3 ml, cột SCX 6 ml và cột MCX 6 ml. Các bước chiết pha rắn gồm: Hoạt hóa cột chiết, nạp mẫu vào cột chiết, rửa loại tạp chất và rửa giải chọn lọc chất phân tích. 2.2.5. Phương pháp đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích Độ tin cậy của phương pháp CE - C4D trong phân tích một số phụ gia thực phẩm được đánh giá qua các thông số: giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại, hiệu suất thu hồi. 2.3. Thiết bị và hóa chất Thiết bị CE là hệ thiết bị tự chế, bán tự động được thiết kế và chế tạo tại Việt Nam bởi Công ty 3Sanalysis (http://www.3sanalysis.vn/) trên cơ sở hợp tác với Bộ môn Hóa Phân tích (Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN) và nhóm nghiên cứu của GS. Peter Hauser (khoa Hóa, trường đại học Basel, Thụy Sỹ). Thiết bị có nguồn thế cao lên đến 25 kV, sử dụng cảm biến độ dẫn không tiếp xúc (C4D). 7 Hình 2.2. Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4D triển khai tại Việt Nam (1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển cao thế, 3: Cảm biến độ dẫn không tiếp xúc, 4: Ống dẫn dung dịch đệm, 5: Núm điều chỉnh , 6: Bộ phận điều khiển, 7: Bình khí nén) Tất cả các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích và được pha chế bằng nước deion. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định đồng thời acidformic, acid acetic, acid propionic, acid butyric bằng phƣơng pháp CE-C4D Quá trình điện di của của các ion chất phân tích trong mao quản là tổng hợp của dòng chuyển động của các ion này dưới tác động của điện trường và dòng EOF. Thông thường, các cation sẽ di chuyển cùng chiều với dòng EOF và các anion di chuyển ngược chiều. Tùy thuộc vào các đặc tính của chất phân tích như điện tích, cấu trúc không gian, kích thước phân tử, độ linh động điện di, … chúng ta sẽ sử dụng kĩ thuật phân cực phù hợp để vừa có thể tách được chất phân tích vừa lợi dụng (hoặc hạn chế) được ảnh hưởng của dòng EOF. Nhóm các acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric có pKa lần lượt là 3,75, 4,75, 4,88, 4,82. Trong khoảng pH điện di từ 5÷ 9, các acid trên tồn tại dưới dạng anion, có độ linh động điện di cao, tốc độ điện di lớn... Tuy chuyển động của các anion là ngược chiều với dòng EOF, nhưng tại các giá trị pH thấp, tốc độ dòng EOF là nhỏ không đáng kể so với tốc độ điện di của anion nên ít gây cản trở. Vì vậy để xác định các acid này, ta có thể sử dụng kĩ thuật phân cực thường tức là áp thế âm vào mao quản tại đầu bơm mẫu. Anion có độ linh động điện di lớn sẽ di chuyển nhanh hơn và ngược lại, do đó các anion sẽ được tách ra khỏi nhau theo thứ tự lần lượt là HCOO-, CH3COO-, C2H5COO-, C3H7COO-. 3.1.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu Để tối ưu hóa quá trình tách điện di, các yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến hiệu quả tách như dung dịch đệm điện di, pH, thế tách,.. sẽ được khảo sát và biện luận. 8 a) Khảo sát dung dịch đệm điện di Trong phương pháp CE-C4D, dung dịch đệm điện di có vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng đến tốc độ điện di của chất phân tích. Trong dung dịch đệm điện di, ba yếu tố gồm: pH, thành phần và nồng độ của dung dịch đệm điện di đóng vai trò quan trọng nhất. Với mao quản silica, vùng giá trị pH điện di thường dùng và có thể thay đổi trong khoảng từ 2 - 10, tùy thuộc vào mỗi loại mẫu phân tích. Thành phần của dung dịch đệm gồm các ion có độ điện di nhỏ, tức là phải có điện tích nhỏ nhưng kích thước tương đối lớn, ngoài ra các chất đệm phải tan tốt trong nước, bền vững trong mao quản và trong quá trình điện di. Sau thành phần, pH của hệ đệm điện di, nồng độ đệm được lựa chọn thích hợp để có dung lượng đệm đủ lớn và khống chế hệ đệm không đổi trong suốt quá trình điện di. Các hệ đệm điện di phân tích đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric cần có pH xung quanh khoảng 5 đến 6 để đảm bảo các chất phân tích ở dạng anion và dòng EOF không quá lớn. Tỉ lệ nồng độ đệm tương ứng với pH được khảo sát là: His 30 mM/Mes 50 mM (pH = 5,6), His 30 mM/Mes 40 mM (pH = 5,8), và His 50 mM/Mes 40 mM (pH = 6,3). Kết quả cho thấy, hệ đệm His 30 mM/Mes 40 mM (pH = 5,8) cho diện tích pic của các chất phân tích lớn nhất và đường nền tốt nhất. Do đó, dung dịch đệm điện di His 30 mM/Mes 40 mM (pH =5,8) được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo. b) Khảo sát ảnh hưởng của thế tách Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có một nguồn thế tách cao V, tạo ra lực điện trường E và dòng điện I trong mao quản, là một yếu tố quan trọng quyết định kết quả điện di các chất phân tích. Việc khảo sát thế được thực hiện ở các giá trị thế -15 kV, -18 kV và -20 kV cho thấy khi tăng thế thời gian di chuyển của các chất phân tích giảm. Để đảm bảo độ phân giải khi phân tích mẫu thực và thời gian phân tích phù hợp, thế -18 kV là thế phù hợp cho phép phân tích. c) Khảo sát ảnh hưởng của chiều cao và thời gian bơm mẫu Trong phương pháp bơm mẫu thủy động lực học kiểu xi phông, lượng mẫu bơm vào tỷ lệ thuận với chiều cao bơm mẫu và thời gian bơm mẫu. Trong quá trình nạp mẫu vào mao quản, lượng mẫu bơm vào phải đủ lớn để đảm bảo độ nhạy và khả năng tách tốt. Chiều cao bơm mẫu càng lớn thì sự chênh lệch về chiều cao của hai đầu ống mao quản càng lớn dẫn tới lượng mẫu bơm vào mao quản càng nhiều. Tương tự chiều cao bơm mẫu, nếu thời gian bơm mẫu càng lớn thì lượng mẫu bơm vào mao quản càng nhiều. Tuy nhiên nếu lượng mẫu được bơm vào mao quản quá lớn sẽ dẫn đến sự phân tán mẫu lớn làm giảm khả năng tách chất. Các chiều cao bơm mẫu được lựa chọn khảo sát gồm: 10 cm, 15 cm và 20 cm; các thời gian bơm mẫu được khảo sát là 10 s, 20 s, 25 s. Kết quả thu được thể hiện ở hình 3.3, 3.4: 9 formic acetic formic propionic butyric acetic propionic butyric 20 mV 20 mV 25s 20cm 20s 15cm 10cm 10s 0 100 200 300 Thêi gian di chuyÓn (s) 400 0 Hình 3.3. Ảnh hưởng của chiều cao bơm mẫu đến sự phân tách acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric 100 200 300 Thêi gian di chuyÓn (s) 400 Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu tới sự phân tách acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric Kết quả cho thấy, tại thời điểm bơm mẫu 20 s và chiều cao bơm mẫu 15 cm, thời gian di chuyển của các chất là nhỏ nhất, tín hiệu đo ổn định, nhiễu nền ít đồng thời đảm bảo được độ nhạy cao mà vẫn có sự tách tốt giữa các chất phân tích và thậm chí là giữa các chất phân tích và các chất có thể có trong mẫu thực. Vì vậy, chiều cao bơm mẫu 15 cm và thời gian 20 s được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo. Từ các kết quả khảo sát thu được, các điều kiện tối ưu nhằm xác định đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric bằng phương pháp CE-C4D được tóm tắt ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Điều kiện tối ưu xác định đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric Các yếu tố Điều kiện Detector Mao quản CE-C4D Mao quản silica, tổng chiều dài 60cm, chiều dài hiệu dụng là 50 cm, đường kính trong là 50 µm Phương pháp bơm mẫu Thủy động lực học kiểu xi phông:15 cm Thời gian bơm mẫu 20 s Dung dịch đệm điện di His-Mes (30 mM/40 mM), pH = 5,8 Thế tách - 18 kV 3.1.2. Xây dựng đường chuẩn cho các chất phân tích và đánh giá phương pháp Các phương trình đường chuẩn xác định acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric được nêu trong bảng 3.6. 10 Bảng 3.6. Phương trình đường chuẩn của acid Formic, acid Acetic, acid Propionic và acid Butyric Phƣơng trình đƣờng chuẩn y = (10,16538±6,5321)+(61,7982±1,16188)x y = (-0,52484±2,98169)+(31,4926±0,67235)x y = (-5,07988±6,11372)+(61,63352±1,09553)x y = (6,70525±5,2828)+(57,9034±0,99063)x Tên chất Acid formic Acid acetic Acid propionic Acid butyric R2 0,99912 0,99909 0,99921 0,99927 P <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 LOD của acid formic, acid acetic, acid propionic và acid butyric lần lượt là 0,05; 0,12; 0,17 và 0,18 ppm. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) từ 1,5 % đến 2,7 %, hiệu suất thu hồi từ 89,6 ÷ 104,0 %. Như vậy phương pháp có độ chụm và độ đúng tương đối tốt, đáp ứng yêu cầu của hiệp hội các nhà Hóa học Phân tích (AOAC). 3.1.3. Phân tích đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric trong mẫu thực phẩm Tiến hành phân tích bảy mẫu thực tế được mua ngẫu nhiên tại các cửa hàng/siêu thị ở Hà Nội. Kết quả phân tích không phát hiện acid butyric trong tất cả các mẫu phân tích, nhưng phát hiện đồng thời 2 hoặc 3 acid còn lại trong hầu hết các mẫu. Sáu trong tổng số bảy mẫu phân tích đã được phân tích đối chứng bằng phương pháp tiêu chuẩn (HPLC). Bảng 3.9. Kết quả phân tích đối chứng acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric trong thực phẩm bằng phương pháp tiêu chuẩn HPLC acid Formic Mẫu Cam ép (mg/l) Nước C2 (mg/l) Rượu nho Pháp (mg/l) Rượu Soliera Tempranillo (mg/l) Cà phê Viet (mg/kg) Cà phê G7 (mg/kg) Rượu vang Thăng Long (mg/l) acid Acetic acid Propionic CE-C D HPLC ER % CE-C D HPLC ER % CE-C D HPLC ER % ND ND - 6130±53 6570±45 -6,7 249±8 261±9 -4,6 ND ND - 1990±17 2390±17 -16,7 448±11 473±12 -5,3 ND ND - 83,9±3,9 90.8±4.5 -7,6 471±12 450±11 +4,7 ND ND - 1080±9 1100±8 1,8 851±8 875±9 -2,7 7550±66 7710 ± 57 -2,1 1260±10 1320±10 -4,5 4050±36 4120±31 -1,7 7440±65 8590 ± 61 -13,4 2320±20 2110±15 +10,0 9490±84 9920±74 -4,3 270±9 - - 935±8 - - 41,5±2,8 - - 4 4 4 ND: Không phát hiện được với LOD của acid formic, acid acetic, acid propionic và acid butyric lần lượt là 0,05; 0,12; 0,17 và 0,18 ppm. -: Không phân tích Kết quả phân tích đối chứng được thể hiện trong bảng 3.9 cho sự sai khác giữa hai phương pháp đa số đều dưới 15 %. Từ đó, có thể kết luận kết quả phân tích đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic và acid butyric bằng phương pháp CE-C4D là đáng tin cậy. 11 3.2. Xác định đồng thời chất tạo ngọt acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin trong thực phẩm bằng phƣơng pháp CE-C4D Các chất tạo ngọt:acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin (Ace - K, Asp, Cyc, Sac) có pKa lần lượt là 2,0; 3,2; 1,7; 1,6. Trong dung dịch có pH = 8 ÷ 10 các chất này tồn tại chủ yếu dưới dạng anion, có kích thước cồng kềnh, điện tích nhỏ, có độ linh động điện di thấp dẫn đến tốc độ điện di riêng nhỏ. Ở khoảng pH cao, dòng EOF lại có tốc độ lớn, có khả năng cuốn theo các anion chất tạo ngọt trong khối liên kết tương tác bền vững với các phần tử mang điện dương về phía cực âm. Để lợi dụng ảnh hưởng này của dòng EOF, các chất tạo ngọt thường được phân tích theo kiểu phân cực ngược. 3.2.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu a) Khảo sát dung dịch đệm điện di Bốn hệ đệm điện di khảo sát bao gồm: Arg/Mes, Arg/CAPS, Tris/His và Tris/Ches. Các giá trị pH được thay đổi từ 8,5 đến 9,7 bằng cách thay đổi tỷ lệ giữa các thành phần đệm. Trên điện di đồ, pic của các chất xuất hiện theo thứ tự: pic của dòng EOF, Asp, Cyc, Sac, Ace - K. Khi pH tăng, thời gian phân tích và độ phân giải của bốn chất tạo ngọt cũng đồng thời giảm. Cả bốn hệ đệm khảo sát đều cho tín hiệu chất phân tích đẹp, hiệu quả tách tốt, đường nền ổn định và thời gian phân tích hợp lý nhất tại pH = 9,2. Để có thể lựa chọn được hệ đệm tốt nhất, các điện di đồ ở pH = 9,2 của bốn hệ đệm được so sánh trong hình 3.12. Hình 3.12. So sánh khả năng phân tách Ace - K, Asp, Cyc, Sac của các đệm điện di Tris/Ches, Tris/His, Arg/Mes, Arg/CAPS ở pH = 9,2 Hình 3.12 cho thấy, tại pH = 9,2, hai hệ đệm điện di Tris/His và Tris/Ches đều cho độ phân giải tốt, đường nền ổn định và thời gian phân tích hợp lý. Hệ đệm Tris/Ches cho pic sắc nét hơn tuy nhiên hệ đệm Tris/His lại cho khả năng phân tách tốt hơn nhiều. Hệ đệm Tris/His (100 mM/10 mM), 12 pH = 9,2 được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo để đảm bảo độ phân giải của các chất phân tích. b) Khảo sát ảnh hưởng của thế tách Các chất tạo ngọt được phân tích theo kiểu phân cực ngược (áp điện thế dương). Bốn giá trị thế + 10 kV, + 15 kV, + 17 kV, + 20 kV được lựa chọn khảo sát. Kết quả cho thấy khi áp thế càng cao, thời gian phân tích và độ phân giải càng giảm. Thế + 15 kV cho thời gian phân tích ngắn (gần 8 phút), đường nền ổn định và độ phân giải tương đối tốt được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. c) Khảo sát thời gian bơm mẫu Thời gian bơm mẫu được khảo sát với các giá trị 10 s, 15 s, 20 s, 30 s.Thời gian bơm mẫu 10 s và 15 s đều cho độ phân giải tốt nhưng với thời gian 15 s, tín hiệu chất phân tích cao hơn và thời gian phân tích ngắn hơn. Để đảm bảo độ phân giải và độ nhạy của phương pháp, thời gian bơm mẫu tối ưu được lựa chọn là 15 s. Từ các kết quả thu được, điều kiện tối ưu để phân tích đồng thời bốn chất tạo ngọt Ace - K, Asp, Cyc, Sac bằng phương pháp CE - C4D được trình bày tóm tắt trong bảng 3.12. Bảng 3.12. Điều kiện tối ưu để phân tích hỗn hợp chất tạo ngọt Ace-K, Asp, Cyc, Sac bằng phương pháp CE-C4D Điều kiện Các yếu tố Detector CE-C4D Mao quản Mao quản silica, tổng chiều dài 60 cm, chiều dài hiệu dụng 50 cm, đường kính trong 75 µm Phương pháp bơm mẫu Thủy động lực học kiểu xiphông (chiều cao 10 cm) Thời gian bơm mẫu 15 s Dung dịch đệm điện di Tris/His (100 mM/10 mM), pH = 9,2 Thế tách +15 kV 3.2.2. Đường chuẩn phân tích và đánh giá phương pháp nghiên cứu Đường chuẩn của bốn chất tạo ngọt Asp, Cyc, Sac, Ace - K được thiết lập trong khoảng nồng độ 2,5-180 ppm. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.13. Bảng 3.13. Phương trình đường chuẩn của Ace-K, Asp, Cyc, Sac Tên chất Phƣơng trình đƣờng chuẩn (y = a + bx) R2 P Ace - K y = (1,94236 ± 5,21557) + (6,6173 ± 0,08186)x 0,99946 < 0,0001 Asp y = (-1,81667 ± 0,67261) + (0,43397 ± 0,00598)x 0,99934 < 0,0001 Cyc Sac y = (5,0723 ± 3,59551) + (3,33964 ± 0,05321)x y = (7,6561 ± 4,50568) + (4,62568 ± 0,06668)x 0,99924 0,99938 < 0,0001 < 0,0001 13 LOD của Ace-K, Asp, Cyc, Sac lần lượt là: 0,7 ppm; 5,0 ppm; 1,0 ppm; 1,0 ppm. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của Asp, Cyc, Sac và Ace-K nhỏ, dao động từ 0,9 % đến 2,0 %, hiệu suất thu hồi của Asp, Cyc, Sac và Ace-K khá cao, từ 95,7 ÷ 99,3 %. Như vậy phương pháp là phù hợp để phân tích các chất tạo ngọt trong mẫu thực phẩm. 3.2.3. Phân tích chất tạo ngọt acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin trong thực phẩm Áp dụng quy trình tối ưu đã khảo sát ở trên để phân tích bốn chất tạo ngọt: Ace - K, Asp, Cyc, Sac trong 16 mẫu gồm mẫu nước giải khát và 2 mẫu thạch. Kết quả ở hình 3.19 cho thấy đã phát hiện một hoặc đồng thời 2 chất tạo ngọt (Asp và Ace - K) trong số bốn chất tạo ngọt phân tích. Riêng mẫu chè đỗ đen phát hiện Sac với hàm lượng là 111 ppm. Hình 3.19: Kết quả phân tích chất tạo ngọt trong mẫu nước giải khát bằng phương pháp CE - C4D Kết quả phân tích bằng phương pháp CE-C4D được so sánh đối chứng với phương pháp tiêu chuẩn (HPLC) hình 3.19 cho thấy kết quả giữa hai phương pháp khá phù hợp (sai số dưới 15%) chứng tỏ phương pháp phân tích là chính xác và đáng tin cậy. 3.3. Khảo sát các điều kiện tối ƣu phân tích β-agonist salbutamol, metoprolol và ractopamintrong mẫu thức ăn chăn nuôi, nƣớc tiểu lợn và mẫu thịt lợn bằng phƣơng pháp CE-C4D Salbutamol, metoprolol và ractopamin là ba chất thuộc nhóm β agonist, có cấu trúc tương tự với các dẫn xuất amin, đều có pKa> 9. Tại pH nhỏ hơn pKa, các β - agonist này tồn tại dưới dạng cation, di chuyển cùng chiều với dòng EOF, thuận lợi để tách được bằng CE-C4D theo phương pháp phân cực bình thường (tức là áp thế dương vào mao quản đầu bơm mẫu) 3.3.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu 3.3.1.1. Khảo sát dung dịch đệm điện di a. Khảo sát dung dịch đệm điện di Ở pH thấp điện tích của các cationβ-agonist lớn, tuy nhiên dòng EOF lại nhỏ, còn ở pH cao dòng EOF lớn nhưng điện tích của các cation này lại nhỏ, chính vì vậy khoảng pH trung gian (khoảng pH từ 4,9 đến 5,5) đảm bảo được 14 điện tích của cation và dòng EOF phù hợp sẽ cho khả năng phân tách bằng phương pháp điện di mao quản của các β-agonist (salbutamol, metoprolol, ractopamin) là tốt nhất. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH với bốn giá trị pH 4,5; 4,9; 5,5 và 6,0 cho thấy ở giá trị pH = 4,9 các chất được tách tốt nhất, pic gọn nhất đồng thời cho tín hiệu đường nền ổn định và thời gian phân tích hợp lý. Do đó, pH = 4,9 được lựa chọn cho các bước khảo sát tiếp theo. Thành phần dung dịch đệm khảo sát là Arg (pK = 2,18; 9,09; 12,50) và His (pK = 1,78; 5,97; 9,97) kết hợp với các acid phosphoric (Phos), ascorbic (Asc) hoặc acetic (Ace). Kết quả khảo sát thành phần dung dịch đệm được thể hiện trong hình 3.24 cho thấy hệ đệm Arg/Ace cho kết quả độ phân giải giữa các pic tốt nhất và tín hiệu của các pic cao nhất nên sẽ được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo. 50mV Arg/Phos His/Ace Arg/Asc Arg/Ace Sal 0 100 200 300 400 500 Met Rac 600 Hình 3.24. Ảnh hưởng của thành phần hệ đệm đến sự phân tách của Sal, Met, Rac Các nồng độ 10 mM, 15 mM, 20 mM của hệ đệm Arg/Ace được khảo sát để tìm ra nồng độ đệm tối ưu. Kết quả khảo sát ở nồng độ đệm 10 mM cho thấy tại giá trị nồng độ này hình dáng các pic khá cân đối và sắc nét, các chất được tách tương đối tốt và thời gian phân tích hợp lý. Do đó, đệm Arg/Ace có nồng độ 10 mM được lựa chọn là dung dịch đệm tối ưu. b) Khảo sát ảnh hưởng của thế tách Tại pH = 4,9, Sal, Met và Rac đều mang điện dương. Các điện thế được lựa chọn khảo sát là: 10 kV, 15 kV, 18 kV và 20 kV. 15 20mV 20kV 18kV 15kV 10kV Sal Met Rac 200 400 600 800 1000 Thêi gian di chuyÓn (s) Hình 3.27. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của thế tách đến thời gian di chuyển và sự phân tách các pic Kết quả ở hình 3.27 cho thấy, thế tách 18 kV cho hiệu quả tách tốt, thời gian phân tích phù hợp nên được chọn cho các khảo sát tiếp theo. c) Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu Thời gian bơm mẫu được khảo sát ở 10 s, 20 s, 30 s và 50 s. Kết quả cho thấy, khi tăng thời gian bơm mẫu, thời gian di chuyển của các chất hầu như không thay đổi hoặc thay đổi rất ít nhưng diện tích pic tăng tương ứng khi tăng thời gian bơm mẫu từ 10 s đến 50 s. Thời gian bơm mẫu 20 s được lựa chọn để đảm bảo độ nhạy và khả năng tách là tốt nhất đối với cả mẫu chuẩn và mẫu thực là mẫu thức ăn chăn nuôi. Điều kiện tối ưu cho phân tích hỗn hợp Sal, Met và Rac bằng phương pháp CE-C4D được tổng hợp trong bảng 3.21. Bảng 3.21. Điều kiện tối ưu cho phân tích hỗn hợp Sal, Met, Rac bằng phương pháp CE-C4D Các yếu tố Detector Mao quản Phương pháp bơm mẫu Thời gian bơm mẫu Dung dịch đệm điện di Thế tách Điều kiện CE-C4D Mao quản silica, tổng chiều dài 60 cm, chiều dài hiệu dụng 53 cm, đường kính trong 50 µm Thủy động lực học kiểu xiphông: 10cm 20 s Arg/Ace (10 mM) pH=4,9 18 kV 3.3.2. Đường chuẩn phân tích và đánh giá phương pháp phân tích 3.3.2.1. Đƣờng chuẩn phân tích Các dung dịch để dựng đường chuẩn có nồng độ biến thiên trong khoảng 2,5- 250,0 ppm. Kết quả khảo sát và tính toán được trình bày trong bảng 3.22 16 Bảng 3.22. Phương trình đường chuẩn của Sal, Met và Rac Tên chất Phƣơng trình đƣờng chuẩn (y=a+bx) R2 P Sal y = (-0,28196±0,68338)+(0,97536±0,01028)x 0,99967 <0,0001 Met y = (0,38201 ±0,63116)+(0,78866±0,00947)x 0,99957 <0,0001 Rac y= (-0,6955±0,38796)+(0,93506±0,00582)x 0,99988 <0,0001 LOD của Sal là 0,5 ppm, của Met và Rac là 0,7 ppm. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) < 3 %, hiệu suất thu hồi của Sal, Met và Rac khá cao, từ 99,0 ÷ 99,5%, cho thấy phương pháp lặp lại, độ đúng cao. Quy trình phân tích này sẽ được áp dụng để phân tích các mẫu thực tế là mẫu thức ăn chăn nuôi. 3.3.3. Xác định đồng thời salbutamol, metoprolol và ractopamin trong mẫu thức ăn chăn nuôi Trước khi xác định Sal và Rac trong mẫu thức ăn chăn nuôi, các cation có thể gây ảnh hưởng đến phép phân tích đã được khảo sát sơ bộ và khẳng định được các cation nếu có trong mẫu thức ăn chăn nuôi cũng không ảnh hưởng đến việc xác định các chất phân tích. Mẫu thức ăn chăn nuôi được cung cấp bởi Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia. Đây là mẫu lưu, đã phân tích cho kết quả có hàm lượng chất tạo nạc. Điện di đồ thể hiện trong hình 3.33. cations 20mV 1 Rac 2 Rac 3 Sal 0 100 200 300 400 500 600 Thêi gian di chuyÓn (s) Hình 3.33. Điện di đồ xác định Sal, Met, Rac trong một số mẫu thức ăn chăn nuôi. Các đường số 1, 2, 3 tương ứng với các mẫu TACN 1, 2, 3 Từ kết quả ở hình 3.33 cho thấy không có Met trong cả ba mẫu thức ăn chăn nuôi nhưng có Rac và Sal trong hai mẫu. Các mẫu này được gửi phân tích đối chứng bằng phương pháp HPLC cho sai số giữa hai phương pháp dao động dưới 15 % chứng tỏ hàm lượng Sal và Rac thu được theo hai phương pháp khá phù hợp ở hàm lượng cỡ ppm. 17 Bảng 3.26. Kết quả phân tích Sal và Rac trong mẫu thức ăn chăn nuôi (TACN) Tên mẫu Hàm lƣợng chất phân tích (bằng CE - C4D) TACN 1 - có Rac TACN 2 - có Rac TACN 3 - có Sal ND 36,21 ± 0,15 (ppm) 297,13 ±0,92 (ppm) Hàm lƣợng chất phân tích (bằng HPLC-MS) 31,53 (ppm) 281,03 (ppm) Sai số giữa phƣơng pháp (%) 12,92 5,42 ND: Không định lượng được với LOQ của Rac là 2,3 ppm -: Không phân tích Đối tượng nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi là các mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn của lợn đã được nuôi bằng thức ăn chăn nuôi có chứa chất tạo nạc, cụ thể là salbutamol. Tuy nhiên các đối tượng mẫu này có đặc điểm là thành phần nền phức tạp và có hàm lượng Sal thấp hơn LOD, LOQ của phương pháp CE-C4D, do vậy trước khi phân tích bằng phương pháp điện di cần tiến hành tách và làm giàu Sal từ nền mẫu bằng phương pháp chiết tách phù hợp. 3.3.4. Nghiên cứu phương pháp chiết pha rắn (SPE) salbutamol trong mẫu nước tiểu lợn Kĩ thuật chiết pha rắn (SPE) được chọn làm kĩ thuật làm sạch, làm giàu salbutamol trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn. Các yếu tố ảnh hưởng quyết định đến hiệu suất chiết và hiệu quả làm sạch như cột chiết, dung dịch chiết, dung môi rửa giải, dung môi rửa tạp,.. sẽ được khảo sát để lựa chọn điều kiện tối ưu. a) Khảo sát lựa chọn cột chiết Salbutamol có cấu trúc tương tự như các catecholamin, ở khoảng pH chiết nhỏ hơn pKa Sal tồn tại ở dạng cation phân cực mạnh nên theo lý thuyết các cột SPE theo cơ chế trao đổi cation sẽ có hiệu lực tốt để chiết Sal. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các cột chiết khảo sát bao gồm cột C18 3 ml, cột SCX 3 ml và cột CX 6 ml tới hiệu suất thu hồi của quá trình chiết được thể hiện ở hình 3.35. Hình 3.35. Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của từng loại cột chiết 18