Tài liệu Nghiên cứu quy trình công nghệ trích ly β glucan từ nấm linh chi, ứng dụng cho chế biến trà túi lọc

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ TRÍCH LY βGLUCAN TỪ NẤM LINH CHI, ỨNG DỤNG CHO CHẾ BIẾN TRÀ TÚI LỌC Lớp : CNTP K41 Khóa : 41 Ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Người hướng dẫn : 1. ThS. NGUYỄN ĐỨC TIẾN Bộ môn Nghiên cứu Phụ phẩm và Môi trường Nông nghiệp - Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch 2. ThS. Trần Thị Lý Bộ môn Công nghệ thực phẩm - Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên 1 THÁI NGUYÊN LỜI CẢM ƠN Có được kết quả nghiên cứu này, tôi xin trình bày lòng biết ơn sâu sắc đến: ThS. Nguyễn Đức Tiến - Trưởng Bộ môn Nghiên cứu Phụ phẩm và Môi trường nông nghiệp thuộc Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ, động viên, khuyến khích tôi rất tận tình và chu đáo trong những lúc khó khăn, truyền cho tôi kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp này. ThS. Trần Thị Lý và các thầy cô giáo khác trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm Khoa Công nghê sinh học và Công nghệ thực phẩm - trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ, hỗ trợ về phương tiện nghiên cứu, kiến thức và có những góp ý sâu sắc trong thời gian tôi thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình và những người thân đã luôn ở bên động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài này. Tôi cũng xin cảm ơn bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi, chia sẻ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài tốt nghiệp. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu trên. Thái Nguyên , ngày Sinh viên 2 tháng năm 2013 MỤC LỤC Phần I MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ “Sống khoẻ - không bệnh tật” là niềm ước ao của con người ở bất cứ thời đại nào. Tuy nhiên, sức khỏe của mỗi người còn tùy thuộc vào nhiều yếu tố như di truyền, môi trường sống, dinh dưỡng và phòng bệnh. Trong đó dinh dưỡng để phòng ngừa bệnh tật đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe. Vì thế con người ngày càng quan tâm hơn tới những thực phẩm không chỉ giàu dinh dưỡng mà còn có tác dụng như thuốc để tăng cường thể lực, phòng, điều trị bệnh tật và kéo dài tuổi thọ. Đó là những thực phẩm có thành phần dinh dưỡng đặc hiệu đối với cơ thể, có tác dụng tăng cường đề kháng và giúp cơ thể phòng bệnh. Ngày nay, xu hướng sư dụng các thảo dược thiên nhiên để trị bê ̣nh đa trở nên phổ biến, viê ̣c tìm kiếm những khả năng trị bê ̣nh từ các loại thảo dược đa được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới như:i Trung Quốc, Nhâ ̣t Bản, Đài Loan, Thái Lan, Malaysia…i Trong đó nấm Linh Chi là đối tượng nghiên cứu của nhiều quốc gia. Đă ̣c biê ̣t là các nước Châu Á, vì nó có tiềm năng về nguôn dược liê ̣u. Tác dụng kỳ diệu của nấm Linh Chi đa được chứng minh bằng các công trình nghiên cứu khoa học hiện đại. Trong nấm Linh Chi có rất nhiều các hoạt chất sinh học quý như:i Triterpenoid, Lonosterol, Ganoderans A, B, C, Lingzhi-8, Adenosine …ivà các nguyên tố vô cơ. Đặc biệt hơn các nhà khoa học đa nghiên cứu và chiết xuất được β- glucan - một hoạt chất sinh học thuộc nhóm polysaccharide có trong nấm Linh Chi. β- glucan được nghiên cứu là có khả năng kích thích các tế bào của hệ miễn dịch, giảm cholesterol và có tác dụng làm giảm đáng kể các triệu chứng nhiễm trùng đường hô hấp như:i nghẹt mũi, sổ mũi, đau họng, ho.... Ngoài ra, nó còn có tác dụng là kích hoạt và làm tăng số lượng của các tế bào miễn dịch của cơ thể là macrophage và tế bào sát thủ tự nhiên để chúng nhận biết, tiêu diệt tế bào ung thư và cảnh báo cho cơ thể biết.. 3 Tại thị trường Viê ̣t Nam, hiện nay nhu cầu sư dụng nấm Linh Chi làm thuốc chữa bê ̣nh và đặc biệt là chế phẩm β- glucan trong loại nấm này ngày càng tăng cao. Tuy nhiên, trên thị trường, các sản phẩm từ Linh Chi hầu hết đều nhập ngoại từ Trung Quốc, Hàn Quốc có giá thành cao, một số còn chưa đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm. Mặt khác, tại Việt Nam, với khí hâ ̣u nhiê ̣t đới gió mùa, nguôn nguyên liệu cellulose dôi dào, lực lượng lao đô ̣ng đông đảo. Điều này tạo điều kiện rất thuâ ̣n lợi cho ngành sản xuất nấm phát triển. Tuy nhiên nấm Linh Chi sản xuất ra chủ yếu chỉ bán dưới dạng nguyên liệu thô, giá trị kinh tế còn thấp, các cơ sở chế biến nấm Linh Chi còn hạn chế. Vì vậy, việc nghiên cứu trích ly hoạt chất sinh học β- glucan và tạo sản phẩm trà từ nấm Linh Chi đạt tiêu chuẩn chất lượng có thể mang đến nhiều lợi ích to lớn. Được sự đông ý của Bộ môn Nghiên cứu Phụ phẩm và Môi trường nông nghiệp Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch và bộ môn Công nghệ thực phẩm - Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Tôi tiến hành đề tài:i “Nghiên cứu quy trình công nghệ trích ly β- Glucan từ nấm linh chi, ứng dụng cho chế biến trà túi lọc ”. 4 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ trích ly β- Glucan từ nấm Linh Chi và ứng dụng cho chế biến trà túi lọc. 1.2.2. Yêu cầu - Xác định ảnh hưởng của các điều kiện xư lý nguyên liệu đến hiệu quả trích ly βglucan . - Xác định các thông số của quá trình trích ly β- glucan từ nấm linh chi. - Xác định được phương pháp lọc, cô dịch trích ly và thu nhận chế phẩm β- glucan trích ly. - Xác định được công thức phối chế để tạo ra sản phẩm trà túi lọc từ nấm Linh Chi. - Đề xuất được quy trình sản xuất chế phẩm β- glucan và xây dựng được quy trình sản xuất sản phẩm trà túi lọc có thành phần β- glucan từ nấm Linh Chi 5 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Nấm Linh Chi 2.1.1. Nguôn gôc và phân loai nấm Linh Chi * Nguồn gốc Linh Chi viết theo kiểu phiên âm Trung Hoa là Lingzhi, có tên tiếng Nhật là Reishi, tên khoa học là Ganoderma lucidum, là loại nấm thuộc họ đa khổng (polyporaceae), thường mọc trên những thân cây mục. Người ta còn gọi Linh Chi là Linh Chi thảo, nhiều tác giả đa cho rằng đây là một loại cây cỏ nhưng thực ra Linh Chi là một loại nấm. Năm 1971, hai nhà bác học người Nhật là Yukio Naoi và Zenzabuno Kasai, giáo sư của phân khoa nông nghiệp, trường Đại học Kyoto mới thành công trong việc gây giống và người ta mới sản xuất được loại nấm này một cách quy mô. Từ đó Linh Chi được trông và sư dụng trong việc bào chế chứ không chỉ là huyền thoại [5,7,14]. * Phân loại Nấm Linh Chi có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rai hiện nay [2,3]. Ngành:i Eumycota Ngành phụ:i Basidiamyctina Lớp:i Hymenomycetes Lớp phụ:i Hymenomycetidae Bộ:i Aphyllophorales Họ:i Ganodermataceae Họ phụ:i Ganodermoidae Chi:i Amauroderma Linh Chi (Ganoderma) là loại nấm gỗ mọc hoang trong thiên nhiên, có hàng trăm các loài khác nhau, trong đó có 2 nhóm lớn là:i Cổ Linh Chi và Linh Chi [3,4]. 6 Cổ Linh Chi (Ganoderma applanatum (Pers Past), là các loài nấm gỗ không cuống (hoặc cuống rất ngắn) có nhiều tầng (mỗi năm thụ tầng lại phát triển thêm một lớp mới chông lên). Mũ nấm hình quạt, màu từ nâu xám đến đen sẫm, mặt trên sù sì thô ráp. Nấm rất cứng (cứng như gỗ lim nên còn gọi là nấm lim). Linh Chi rất phong phú về chủng loại, ước tính trên toàn thế giới có 200 loài Linh Chi. Riêng Trung Quốc có 84 loài, trong đó có 12 loài được dùng làm thuốc như Xích Linh Chi, Tư Linh Chi, Hắc Linh Chi [10, 8]. Theo sách bản thảo cương mục của Lý Thời Trần (1959) thì đại danh y của Trung Quốc đa phân loại Linh Chi theo màu sắc thành 6 loại:i - Thanh chi hay Long chi:i màu xanh, vị chua, tính bình, không độc. - Hông chi, Xích chi hay Đơn chi:i màu đỏ vị đắng, tính bình, không độc. - Hoàng chi hay Kim chi:i màu vàng, vị ngot, tính bình, không độc. - Bạch chi hay Ngọc chi:i màu trắng, vị cay, tính bình, không độc. - Hắc chi hay Huyền chi:i màu đen, vị mặn, tính bình, không độc. - Tư chi hay Mộc chi:i màu tím, vị ngọt, tính ôn, không độc. 2.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bô Nấm Linh Chi là một trong những loại nấm phá gỗ, nó thường ký sinh trên các cây gỗ lâu năm, đặc biệt trên các cây thuộc bộ Đậu (Fabales). Ngoài ra còn gặp chúng trên các cây Lim, Phượng Vĩ, So Đũa và một số loài cây chết, mục hoặc cả trên cây sống như Xoài, Mít, Mang Cầu…i Nấm thường có ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong tự nhiên, nấm thường chỉ có ở nơi rừng rậm, ít ánh sáng và có độ ẩm cao [6]. Linh Chi có cấu tạo 2 phần:i phần cuống và mũ nấm. Cuống nấm biến dị rất lớn, từ rất ngắn (0,5cm), rất mảnh (0,2cm) cho đến dài cỡ hàng 5-10 cm hoặc rất dài 20-25cm. Cuống có thể đính ở bên hoặc đính gần tâm do quá trình lên tán mà thành. Mũ nấm dạng thận - gần tròn, đôi khi xoè hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng. Trên mặt mũ có vân gợn đông tâm và có tia ranh phóng xạ, màu vàng nâu, vàng cam, đỏ cam, đỏ nâu, nâu tím hoặc nâu đen, nhẵn bóng như láng vecni. Kích thước tán biến động từ 2 – 30cm, dày 0,8 – 2,5cm. Thịt nấm dày từ 0,4 – 1,8cm, màu vàng kem, nâu nhạt hoặc trắng. Nấm mềm, dai khi tươi và trở nên chắc cứng và nhẹ khi khô, hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận cùng của sợi 7 phình hình chuỳ, màng rất dày đan khít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mũ và bao quanh cuống [8]. 2.1.3. Thành phần các hoat chất sinh học trong nấm Linh Chi Các nghiên cứu về thành phần hoá học của nấm Linh Chi đầu tiên được tiến hành vào đầu thế kỷ XX, khi các nhà khoa học nghiên cứu đến lớp vỏ láng của nấm và đa phát hiện các chất như:i esgosterol, các enzyme phenoloxidase và peroxidase. Theo phân tích của G. Bing Lin thì thành phần hoá học của Ganoderma lucidum gôm các chất:i nước(12 - 13%), cellulose (54 - 56%), lignin (13 - 14%), monosaccharide (4,5 - 5%), lipid (1,9 - 2,0%), protein (0,08 - 0,12%), sterol (0,14 - 0,16%), các nguyên tố vô cơ như:i Ag, Br, Ca, Fe, K, Na, Mg, Mn, Zn, Bi…i Hai nguyên tố quan trọng nhất là Selenium và Germanium. Hiện nay người ta đa tìm được các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi. Theo nhiều tài liệu các hoạt chất được thể hiện dưới các nhóm chính sau [9]. Hình 2.1. Công thức phân tử các hoạt chất sinh học của nấm Linh Chi a. Nhóm có bản chất proteine Nhóm này nổi bật với Lingzhi - 8 do các nhà khoa học Nhật Bản tìm ra được chứng minh là một tác nhân hỗ trợ chống dị ứng phổ rộng và điều hoà miễn dịch rất hữu hiệu. Đông thời, duy trì tạo kháng thể hỗ trợ chống các kháng nguyên viêm gan B [20]. b. Nhóm nucleoside Nhóm này đặc trưng bởi dẫn xuất của adenosine với tác dụng hỗ trợ thư gian cơ, giảm đau và ức chế sự dính kết tiểu cầu. c. Nhóm alcaloide Nhóm alcaloide còn ít được khảo cứu. Tuy nhiên nó có tác dụng trợ tim là rõ ràng. d. Nhóm Steroide 8 Nhóm Steroide khá phong phú ở các nấm Linh Chi với tác dụng chủ đạo là ức chế sinh tổng hợp cholesterol bởi các lacton A, B và các sterol. e. Các hợp chất Lanostanoide có cấu trúc kiểu Triterpen Các hợp chất Lanostanoide có cấu trúc kiểu triterpen được phát hiện ngày một nhiều, năm 1986, Arisawa, M.và cộng sự đa xác định cấu trúc:i - Ganodermenonol:i 26 - hydroxy - 5 alpha - lanosta - 7,9 (11).24 - trien - one - Ganodermadiol:i 5 alpha - lanosta - 7,9 (11).24 - trien - 3 beta.26 - diol - Ganodermatriol:i 5 alpha - lanosta - 7,9 (11).24 - trien - 3 beta.26,27 - triol. Trong các nhóm Ganodermic acid, Wang và cộng sự đa chứng minh được hiệu lực ức chế kết tụ cầu ở người và xác định cấu trúc phân tư của Ganodermic acid S:i Lanosta 7,9 (11).24 - trien - 3 beta, 15 alpha - diacetoxy - 26 - oic acid. Kết quả gắn đông vị phóng xạ P- 32 chỉ ra rằng Ganodermic acid hoạt hoá sự thuỷ phân P1P2 (đó là phosphatidylinositol 4,5 - biphosphate). f. Nhóm các ester với axít béo không no linoleic Nhóm các ester với axít béo không no linoleic được ghi nhận vào năm 1991 có hoạt tính chống ung thư. Đó là 2 ergosterol mới:i - Steryl ester1:i Ergosta - 7.22 - dien - 3beta - yl – linoleate - Steryl ester 2:i 5 alpha. 8 alpha - epidioxyergosta - 6.22 - dien - 3 beta - yl - linoleate. Đông thời các tác giả còn tìm ra 1 lanostanoid và 1 steroid mới cũng có tác dụng ức chế các tế bào ung thư [9, 10]. g. Nhóm Polysaccharide Có trên 200 loại polyssaccharide được trích ly và thu nhâ ̣n từ nấm linh Chi . Theo Hee và cộng sự năm 1992, đa khảo cứu các BN3B - gôm 4 polysaccharide có hoạt tính làm tăng miễn dịch. Trong đó BN3B1 được xác định là glucan (chỉ chứa glucose) và BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kết glycosid [14]. h. Các phức hợp Polysaccharide-proteine Đặc biệt các phức hợp Polysaccharide-proteine có hoạt tính hỗ trợ chống khối u và tăng miễn dịch đa được chỉ ra từ lâu. Gần đây tác dụng tăng sinh tổng hợp IL-2 (Interleukine-2) và hoạt tính DNA polymerase ở chuột già tuổi bởi polysaccharit đa soi sáng thêm khả năng trẻ hoá, tăng tuổi thọ bởi các nấm Linh Chi [26]. 9 Hàng loạt các nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước của các tác giả Nhật Bản và Trung Quốc chứng tỏ hiệu lực chống khối u rất rõ rệt, thậm chí tan khối u với tỷ lệ 3/4 với các loài G.applantum và G. Lucidum [8]. Những tổng kết xác đáng về vai trò sinh dược học của các nhóm hoạt chất này được R. Chang giới thiệu tại Hội thảo Bắc Kinh năm 1991 với các báo cáo thực nghiệm của các tác giả Đài Loan, Trung Quốc và Hoa Kỳ. i. Nhóm triterpennoid Đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh là nhóm saponine - triterpennoids các axít ganoderic. Những năm 1984-1987, lần đầu tiên Nishitiba và cộng sự đa chứng minh ganoderic acid C là chất mới trong tự nhiên. Sau đó Morigiwa (1986) tìm ra thêm ganoderic acid B. Năm 2001, Masao Hattori đa trích ly thêm được 10 triterpennoid mới bao gôm lucidumol A và B, các ganoderic A, B, E, F, H, K, Y và R. Đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh là nhóm saponine - triterpennoids - các axít ganoderic Bảng 2.1. Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi và công dụng[9] Hoat chất Nhóm Hoat tính dược lý Cyclooctasulfur Adenosine và dẫn xuất Nucleotid Lingzhi-8 *** Ganodosteron Lanosporeric axít A Lonosterol Compounds I, II, III, IV, V Ganoderans A, B, C Beta-D- glucan BN-3B:i1, 2, 3, 4 D-6 Ganoderic axít R, S Ganoderic axít B, D, F, H, K, Y Ganoderic axíts Ganodermadiol Ganodermic axít Mf Protein Alcaloide Steroid Steroid Steroid Steroid Polysaccharide Polysaccharide Polysaccharide Polysaccharide Triterpenoid Triterpenoid Triterpenoid Triterpenoid Triterpenoid Ức chế giải phóng histamine Ức chế kết dính tiểu cầu, thư gian cơ, giảm đau Chống dị ứng phổ rộng, điều hoà miễn dịch. Trợ tim Giảm độc gan Ức chế sinh tổng hợp cholesterol Ức chế sinh tổng hợp cholesterol Ức chế sinh tổng hợp cholesterol Hạ đường huyết Chống ung thư, tăng tính miễn dịch Tăng tính miễn dịch Tăng sinh tổng hợp protein Ức chế giải phóng histamine Giảm huyết áp Ức chế sinh tổng hợp cholesterol Giảm huyết áp Ức chế sinh tổng hợp cholesterol Ganodermic axít T.O Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol Lucidone A Triterpenoid Tăng cường chức năng gan 10 Lucidenol Ganosporelacton A Ganosporelacton B Oleic axít Triterpenoid Triterpenoid Triterpenoid Triterpenoid Tăng cường chức năng gan Chống khối u Chống khối u Ức chế giải phóng histamine 2.2. Giới thiệu về β- Glucan 2.2.1. Định nghĩa β- glucan là một polysaccarit của D- glucose với các liên kết glicozit., có trọng lượng phân tư khoảng 321000- 1560000 Da. Các phân tư β- glucan khác nhau ở khối lượng phân tư, tính hòa tan, độ nhớt và cấu hình trong không gian. Nhiều nghiên cứu đa chỉ ra rằng β-glucan với liên kết (1,3/1,6) có hoạt tính sinh học cao hơn β-glucan với liên kết (1,4/1,6). Sự khác nhau giữa các mối liên kết và cấu trúc hóa học β-glucan sẽ ảnh hưởng đến tính hòa tan, hoạt động và hoạt tính sinh học của chúng. β-glucan càng phân nhánh mạnh hoạt tính sinh học càng cao [21]. Hình 2.2. Công thức cấu tạo β- Glucan β-glucan thường có trong tế bào thực vật, hạt ngũ cốc, nấm men, nấm và vi khuẩn [18]. Theo Ko và Lin (2004), ước tính β- Glucan có trong các loại thưc phẩm là:i rau, củ, trái cây và nấm . Trong nấm đó nấm mộc nhĩ trắng cho hàm lượng β- Glucan cao nhất là 2,5% trọng lượng khô. Nấm mỡ trung bình có khoảng 42mg/100g nấm khô, nấm hương là 22mg/100g nấm khô. Đậu nành có chứa 0,8% β-1,3- Glucan so với trọng lượng khô, trong cần tây, củ cải, cà rốt cũng chứa gần 20% β-1,3-D- Glucan trong thành phần cacbonhydrat tổng số. 11 Ngoài ra, theo các nghiên cứu của viện thực phẩm Nhật Bản thì trong 100g nấm linh chi khô có khoảng 52,8 mg β- glucan. 2.2.2 Cơ chế tác động của β- glucan β- glucan kết hợp với các thụ thể bên ngoài màng của đại thực bào và những tế bào bạch cầu khác (bao gôm cả những tế bào thực bào tự nhiên và những tế bào tạo độc tố của cơ thể). Với sự kết hợp đặc hiệu giữa các thụ thể trên bề mặt đại thực bào với tác nhân lạ, β- glucan có tác dụng phát hiện sự xâm nhập hoặc bám vào cơ thể của các nhân tố bất lợi và cảnh báo cho cơ thể biết [23]. β- glucan kết hợp rất đặc hiệu với các bạch cầu và gây ra phản ứng chuỗi dẫn đến việc làm gia tăng hoạt tính miễn dịch:i - Sản xuất ra những tế bào bạch cầu từ tủy xương bao gôm:i đại thực bào, bạch cầu trung tính và hông cầu. - Huy động các tế bào bạch cầu máu có khả năng nhận diện “ kẻ thù ” và di chuyển đến nơi có tác nhân lạ. - Hoạt tính thực bào của bạch cầu tiêu diệt các tế bào bên ngoài xâm nhập vào. - Sản xuất ra các tác nhân kháng vi sinh vật tăng cường sự đặc hiệu của hệ thống miễn dịch. 2.2.3. Tác dụng sinh học của β- Glucan * Tác dụng chống ung thư Tác dụng tích cực của β- Glucan lên các tế bào ưng thư là khá đa dạng, một trong những tác dụng đó là kích hoạt và làm tăng số lượng của các tế bào miễn dịch của cơ thể là macrophage và tế bào sát thủ tự nhiên NK Cell. Macrophage là hàng rào miễn dịch đầu tiên bảo vệ và chống lại bất cứ yếu tố ngoại lai nào xâm nhập vào cơ thể, kể cả các tế bào ung thư. NK Cell là một tế bào miễn dịch đặc hiệu có chức năng nhận biết và tiêu diệt tế bào ung thư. Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khác còn cho thấy được hiệu quả tích cực của βGlucan trong việc điều trị các khối u nhọt ác tính, HIV, sự biến chủng của các vết thương [23]. Nghiên cứu của đại học thành phố Osaka Nhật Bản đa khẳng định β- Glucan được chiết xuất từ nấm linh chi có cấu trúc mạch chính là β- 1,3- Glucan có tác dụng mạnh mẽ lên khối u sarcoma 180 ở rắn. 12 Theo nghiên cứu của Viện ung thư quốc gia của Mỹ tiến hành trên nhóm bệnh nhân được dùng β- Glucan thì kết luận kích cỡ khối u giảm rõ rệt sau một thời gian ngắn sư dụng so với nhóm đối chứng. Cũng theo Viện nghiên cứu bức xạ Armed force Mỹ cho thấy β- Glucan có tác dụng làm tăng khả năng tạo tế bào máu và nhanh chóng khôi phục tế bào máu sau khi xạ trị, kết quả cho thấy β- Glucan bảo vệ mạnh mẽ các bệnh nhân hóa trị và có tác dụng chống oxy hóa. * Tăng khả năng kích thích hệ miễn dịch β- glucan có khả năng tăng hệ miễn dịch chống lại mần bệnh rất hiệu quả. Theo Patchen, β- glucan có khả năng tăng cường mạnh mẽ quá trình sản xuất đại thực bào và tăng tính kháng đặc hiệu của vật chủ đối với vi khuẩn, các loại nấm và bệnh nhiễm kí sinh trùng. β- glucan kết hợp đặc hiệu với các thụ thể bên ngoài màng của đại thực bào và những tế bào bạch cầu khác ( bao gôm cả những tế bào thực bào tự nhiên và những tế bào tạo độc tố của cơ thể) để phát hiện sự xâm nhập hoặc bám vào cơ thể của các nhân tố bất lợi và cảnh báo cơ thể biết. β- glucan có thể gia sức đề kháng của chuột với bệnh bạch cầu lymphocytis do sự lây nhiễm từ Staphytococcusaureus và β- glucan có ảnh hưởng trên tất cả các loại động vật có vú, chim. Đặc biệt, miễn dịch gia tăng trên một số loài cá. Vetvickav và cộng sự đa chứng minh khi cho chuô ̣t uống β- glucan với liều lượng 2-20mg/ kg thể trọng thì có khả năng chống bê ̣nh than của chúng là tốt nhất. Theo viện nghiên cứu Tulane University và Havrvad Medical School đa chứng minh β- 1,3/1,6 Glucan có hiệu quả kích hoạt và bảo về hệ miễn dịch. Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khác còn cho thấy β- glucan tăng cường tính đặc hiệu của các loại thuốc kháng sinh và kháng virut [23]. Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu, người ta đa kết luâ ̣n rằng β- glucan đại diê ̣n cho mô ̣t loại kích thích miễn dịch mà loại kích thích miễn dịch này hoạt đô ̣ng thông qua sự phát triển từng bước mô ̣t giống như sự tiến triển có tính bảo tôn của hê ̣ thống đáp ứng miễn dịch bẩm sinh chống lại tác nhân gây bê ̣nh. Tuy nhiên các nghiên cứu cũng cho rằng tác dụng của β- glucan còn tuỳ thuô ̣c vào nguôn gốc, cách tách chiết, nông đô ̣ và 13 cách đưa vào cơ thể (vào đường miê ̣ng, màng bụng, dưới da, tĩnh mạch) sẽ cho kết quả khác nhau ngay cả trên cùng mô ̣t đối tượng thí nghiê ̣m. * Tác dụng giảm đường huyết và cholesterol. Đây là kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc Đại học Toron, β- glucan làm giảm chỉ số glycemia trong khi vẫn duy trì vị ngon. Điều này giúp bình thường lượng đường trong máu và giữ cho chúng không tăng sau khi ăn. Nghiên cứu của trường đại học Minnesota của Mỹ và Manitoba, Winninpeg, Canada trên 75 bệnh nhân có chosleterol trong máu cao. Kết quả cho thấy nhóm dùng dung dịch chiết β- Glucan giảm đáng kể nông độ chosleterol so với nhóm đối chứng. Điều này có ý nghĩa rất lớn cho các bệnh nhân bị mỡ máu, chống lại các nguy cơ tim mạch. Năm 1994 các nhà khoa học của trường đại học Mitahora Nhật Bản đa nghiên cứu trên những con chuột bị mắc bệnh tiểu đường bằng cách cho chúng uống β- Glucan từ nấm. Họ phát hiện β- Glucan giúp hạ đường huyết ở cả hai loài chuột bình thường và bị tiểu đường. Đặc biệt, theo báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ, TS. Phạm Viê ̣t Cường đa chỉ ra β-glucan có thể chữa khỏi cho những người bị suy yếu chức năng miễn dịch, nhạy cảm với dị ứng, bệnh nhiễm trùng, làm chậm quá trình lao hóa…iHợp chất kim loại nặng độc hại như là thủy ngân có thể sinh ra các gốc tự do gây hư hại các mô, cơ quan làm cho chức năng các mô này bị suy yếu. Vì vậy, βglucan có thể giúp hạn chế ảnh hưởng các kim loại nặng đối với cơ thể. Cơ chế giải độc của cơ thể, đặc biệt là ở gan, cần một số lượng lớn các chất kháng độc tố và glucan có thể làm được điều này. 2.2.4. Ứng dụng của glucan * Ứng dụng của glucan trong thực phẩm:i β- Glucan trong tự nhiên rất sạch, có khả năng giữ nước cao, không tạo gel, không bị phân hủy bởi enzyme tiêu hóa ở người. Vì vậy chúng thích hợp như một nguôn xơ thực phẩm. β- glucan được sư dụng làm phụ gia thực phẩm để tăng sự tiêu hóa và chữa rối loạn tiêu hóa [12]. Hiện nay, β- glucan thường được bổ sung vào một số sản phẩm dành cho trẻ em như:i sữa, thức ăn dặm, Siro Martians, kem , đô uống trái cây…i * Ứng dụng của β- glucan trong y dược: 14 Nhiều nghiên cứu đa cho thấy β- glucan có tác động lên hệ miễn dịch thông qua cơ chế kích thích đại thực bào hoặc tạo ra các chất trung gian hoạt hóa oxy và các nhân tố khác giết chết vật thể lạ. Vì vậy, β- glucan được sư dụng trong việc hỗ trợ điều trị ung thư. Đối với bệnh nhân ung thư phải điều trị bằng hóa chất hoặc chiếu xạ, glucan có khả năng tăng nhanh sự phục hôi máu kích thích sự phục hôi tủy xương và ngăn cản biến chứng nhiễm bệnh trong quá trình điều trị. Bên cạnh đó, β- glucan còn có hiệu quả kháng khối u, giảm kích cỡ khối u [13,15]. * Ứng dụng của β- glucan trong mỹ phẩm: β-1,3- glucan còn có khả năng cảm ứng hoạt tính của tế bào Langerhans - là một tế bào chuyển hóa nằm trên da hoạt động tương tự như đại thực bào. β-1,3- glucan làm se lỗ chân lông, giảm số lượng, độ sâu, độ dài của nếp nhăn, cảm ứng tổng hợp collagen và elastin, giảm số lượng và kích cỡ tổn thương trên da và sự khô da. Vì thế, β-1,3- glucan có thể được thêm vào kem bôi da, thuốc mỡ, kem cạo râu…inhững sản phẩm tiếp xúc trực tiếp với da [13]. * Ứng dụng của β- glucan trong nuôi trồng thủy sản: Có một số nghiên cứu sư dụng β- glucan như một chất kích thích hệ thống miễn dịch tiềm năng trong chăn nuôi thủy sản [13]. Chang cheng - Fang và cộng sự (2000) đa nghiên cứu hiệu quả của β-1,3- glucan lên sự sống xót của tôm sú lớn (Penaeus monodon). Khi bổ sung β-1,3- glucan (2g/kg trọng lượng) cho tôm trong vòng 40 ngày thì lượng tôm sống xót trong lô có bổ sung β-1,3glucan cao hơn hẳn so với lô đối chứng [13]. Kết quả thí nghiệm của Rostad Gunnar và cộng sự (1995) cho thấy khi thêm β- glucan vào thức ăn hàng ngày cho cá hôi Atlantic(Salmo salar) với hàm lượng 1g/kg thức ăn trong 12 tuần trước khi nhiễm nguôn bệnh thì lượng cá sống sót tăng lên rất nhiều [14]. 2.2.5 Mô ̣t số sản phâm chứa beta glucan trên thị trương Nhờ vào những tác dụng to lớn mà β- glucan mang lại cho cơ thể mà hiê ̣n nay có rất nhiều các sản phẩm có bổ sung thành phần β- glucan với mục đích hỗ trợ điều trị ung thư, giảm kích cỡ khối u, ngăn ngừa khối u diễn tiến ác tính. Đông thời tăng cường hê ̣ miễn dịch tự nhiên, giảm cholesterol, mỡ máu,... 15 Hình 2.3:i Thực phẩm chức Hình 2.4:i Thực phẩm chức năng có thành phần β- glucan năng có thành phần βở dạng viên nén glucan ở dạng túi lọc Hình 2.5:i Thực phẩm chức năng có thành phần βglucan ở dạng siro 2.2. Trích ly và thu nhận β- glucan của nấm Linh Chi 2.2.1. Cơ sở khoa học duy trì và trích ly β-Gucan trong nấm Linh Chi Theo các nghiên cứu thì β- glucan trong nấm Linh Chi thuô ̣c nhóm polysaccharide - là nhóm chất hữu cơ phổ biến và có khối lượng lớn nhất trong nấm Linh Chi. Chúng là các glucid với phân tư rất lớn gôm nhiều đơn vị monosaccharide liên kết với nhau tạo nên. Polysaccharide có thể không tan như cellulose nhưng có những loại có độ trương nở và hoà tan tốt trong nước nóng và nước lạnh như tinh bột, guaran gum, lenantin, ergothioneine…i). Cenllulose chiếm một lượng khá lớn và có độ nhớt vừa phải nên các chất trong nấm Linh Chi dễ hòa tan khi được trích ly bằng nước, enzyme và ngâm trong côn…i mà không bị mất hoạt tính của các chất sinh học. Ngoài ra, các hợp chất này rất bền đối với nhiệt. Chính vì vậy, dịch chiết Linh Chi rất thuận lợi trong việc chế biến các sản phẩm đô uống dạng cao nấm Linh Chi, trà hòa tan, trà túi lọc Linh Chi và và bổ sung vào thực phẩm dinh dưỡng, tạo dược phẩm ... 2.2.2. Phương pháp trích ly β- glucan trong nấm Linh Chi Hiện nay có hai phương pháp trích ly chính là:i Phương pháp trích ly lỏng – lỏng và phương pháp trích ly lỏng – rắn. Trích ly rắn - lỏng là quá trình tách một hoặc một số chất tan trong chất rắn bằng một chất lỏng khác – gọi là dung môi. Vì mục đích của đề tài là trích ly hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi cụ thể là β- glucan nên chúng tôi sẽ 16 trình bày về phương pháp trích ly rắn – lỏng. Đối với phương pháp này phải có các yêu cầu sau:i Yêu cầu đối với dung môi:i Dung môi phải có tính hoà tan chọn lọc, không độc, không ăn mòn thiết bị, rẻ và dễ tìm. Cơ chế hoà tan:i Dung môi thấm qua các mao quản vào các tế bào dược liệu, thời gian thấm phụ thuộc vào đường kính, chiều dài mao quản, bản chất dung môi... Quá trình hoà tan phụ thuộc vào bản chất hoá học của các chất tan và dung môi. Các chất có nhiều nhóm phân cực (-OH -COOH) dễ tan trong dung môi phân cực (nước, côn, propyl...). Các chất có nhiều nhóm không phân cực (chất béo, CH 3- C2H5- và đông đẳng) dễ tan trong dung môi không phân cực. - Dựa vào phương pháp và số bậc trích ly có hai loại là trích ly một bậc và nhiều bậc. Với phương pháp trích ly một bậc thì toàn bộ quá trình trích ly được thực hiện trong thiết bị trích ly, nguyên liệu và dung môi chỉ tiếp xúc một lần. Phương pháp trích ly nhiều bậc được tiến hành trong một số thiết bị trích ly. Ở thiết bị cuối cùng dung dịch đậm đặc đi vào nôi chưng. Hơi dung môi từ thiết bị chưng đi vào thiết bị ngưng tụ rôi vào thùng chứa rôi vào thiết bị thứ nhất. Quá trình tiếp tục cho đến khi đạt được độ trích ly cần thiết của nôi thứ nhất. Sau đó tháo hết dung môi và ba ra khỏi thiết bị thứ nhất rôi cho vật liệu mới vào, lúc này thiết bị thứ nhất thành thiết bị cuối và thiết bị thứ hai giờ thành thiết bị thứ nhất. Quá trình cứ tiếp tục như vậy, hệ thống làm việc liên tục [11]. - Phương pháp ngâm:i Chuẩn bị nguyên liệu đổ vào bình có kích thước nhất định. Đổ dung môi vào nguyên liệu ngâm qua đem để chiết hoạt chất. Dịch chiết thu được đem cô đuổi dung môi thu hoạt chất. - Phương pháp ngấm kiệt:i Cho dược liệu vào bình ngâm nhỏ giọt. Đặt giấy lọc dưới đáy bình kim loại có đục lỗ. Cho từ từ nguyên liệu đa được làm ẩm vào bình, san đều, nén nhẹ. Cho tới 2/3 thể tích bình rôi đặt giấy lọc và các bi thuỷ tinh hoặc tấm sứ, thép không gỉ lên bề mặt nguyên liệu. Đổ dung môi vào bình và ngâm lạnh, mở ống khoá thoát dịch chiết và đổ dung môi lên khối nguyên liệu, khi có vài giọt dịch chảy ra thì đóng lại. Đổ dung môi cách mặt nguyên liệu 3 – 4cm, ngâm lạnh 2 – 4h. 17 - Phương pháp trích ly bằng thiết bị Soxhlet:i Chuẩn bị nguyên liệu, bọc giấy, bịt 2 đầu rôi đặt vào trụ chiết. Dùng dung môi chiết trong thời gian nhất định. Sau khi thực hiện các chu trình chiết lấy dịch chiết ra đem cô chân không thu được hoạt chất thô. 2.2.3. Ứng dụng sóng siêu âm trong trích ly các hoạt chất sinh học của nấm Linh Chi Ngoài ra, việc sư dụng sóng siêu âm để phá vỡ vách bào tư cũng được ứng dụng khá rộng rai. Nguyên lý tác động của sóng siêu âm Hiệu quả trích ly các hợp chất hòa tan tăng lên nhờ sự tạo thành các bọt khí trong dung môi khi sóng truyền qua. Dưới tác dụng của sóng, các bọt khí bị kéo nén, sự tăng áp suất và nhiệt độ làm các bọt khí nổ vỡ, tạo lên hiện tượng “sốc sóng”. Khi sự nổ vỡ của các bọt khí ở gần bề mặt pha rắn, xảy ra mất đối xứng sinh ra các tia dung môi có tốc độ cao vào thành tế bào, do đó làm tăng sự xâm nhập của dung môi vào tế bào và làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha rắn và lỏng. Điều này làm tăng sự chuyển khối và phá vỡ cấu trúc tế bào. Sự nổ vỡ của các bọt khí làm tăng sự thoát của các chất nội bào vào dung dịch [24]. Theo nghiên cứu để nâng cao hiệu suất trích ly polysaccharide trong nấm Linh Chi thì có thể sư dụng sóng siêu âm có tần số 8 kHz trong nước ở 95 0C trong 3h với tỷ lệ nguyên liệu / dung môi là 1:i12. Trong điều kiện này hiệu suất trích ly polysaccharide có thể tăng lên 42% đến 75% [28]. Cũng trong một nghiên cứu khác của Huang Sheng Quan và cộng sự (2010) đa tiến hành xư lý nguyên liệu với sóng siêu âm với công suất 50W trong 701s với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1:i11,6 cho hiệu suất trích ly tăng 115,56% so với trích ly bằng nước nóng [26]. Ngoài ra, khi các nhà khoa học tiến hành xư lý sóng siêu âm trong 20 phút ở nhiệt độ 80 C bằng dung môi nước trong 2h cũng làm tăng đáng kể hiệu suất trích ly nấm Linh Chi . 0 2.4. Tình hình sản xuất và nghiên cứu Linh Chi trong và ngoài 2.4.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Linh Chi trên thế giới * Tình hình sản xuất Trung Quốc được coi là cái nôi phát hiện nấm Linh Chi. Ngay từ đầu thế kỷ 17 (1621), nấm Linh Chi đa được biết đến, nuôi trông và sư dụng như nguôn dược liệu quý. Nó hay gặp ở nơi có khí hậu lạnh như Tứ Xuyên, Phúc Kiến, Quảng Đông... Quốc gia 18 này cũng được thừa nhận là trung tâm lớn nhất thế giới về nuôi trông và sản xuất nấm Linh Chi. Hàng năm, trên thế giới sản xuất 4300 tấn nấm Linh Chi, riêng Trung Quốc chiếm 3000 tấn, còn lại là Hàn Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Thái Lan, Mỹ, Malaysia, Việt Nam, Indonesia và Srilanka. Đến nay có rất nhiều công trình nghiên cứu trên các thực nghiệm về giá trị dược liệu cao của nấm Linh Chi. Do vậy, Linh Chi đa được nuôi trông trên quy mô công nghiệp ở Mỹ. Viện nghiên cứu nấm Linh Chi quốc tế đa được thành lập ở New York [29]. * Tình hình nghiên cứu Nấm Linh Chi, từ nhiều ngàn năm nay đa được trọng dụng ở Á Đông, hiện nay Linh Chi là một trong những đề tài nghiên cứu và ứng dụng đang được quan tâm của ngành y dược Âu Mỹ. Được xếp vào nhóm thuốc bổ có khả năng giúp tăng lực, đây là một thực tế không thể chối cai, sau khi sư dụng nấm Linh Chi. Điều này không chỉ căn cứ vào cảm giác chủ quan của người dùng, mà dựa trên các tiêu chuẩn khoa học khách quan và theo kết quả của hàng trăm công trình nghiên cứu từ châu Á sang châu Âu. Trên thế giới đa có rất nhiều nghiên cứu về trích ly và ứng dụng các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi. Theo công trình nghiên cứu gần đây, thành phần chủ yếu của các loại Linh Chi có:i acid amin, protid, steroid, polysaccharide, germanium (cao hơn lượng germanium trong Nhân sâm 5 - 8 lần), acid ganodenic. Huang Sheng-Quan và cộng sự trong nghiên cứu của mình đa trích ly polysaccharide tối ưu trong điều kiện sư dụng dung môi NaOH nông độ 5,1%, ở nhiệt độ 60,10C trong thời gian 77,3 phút với tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tưong ứng là 1:i21,4. Trong điều kiện này năng suất trích ly polysaccharide từ Linh Chi là 8,30% [18]. Để tách β-glucan ra khỏi quả thể Linh Chi, Nagaoka, Hitoshi (2000) nói đến phương pháp hóa học thường sư dụng dung môi natri hydroxide (NaOH) hay kali hydroxide (KOH), hoặc natri hydro cacbonat (NaHCO3), hoặc natri cacbonat (Na2CO3) để tách chiết. Sau đó tiến hành ly tâm thu hôi và tinh chế. Phương pháp hóa học thích hợp với các mẫu phân tích chứa lớn hơn 20% glucan tổng số. Theo nghiên cứu của Mỹ các phương pháp này đạt hiệu suất thu hôi 50 - 80% [27]. Bên cạnh đó họ còn nhắc đến phương pháp enzym, sư dụng enzym β-1,3glucanase để tách chiết β-glucan sau đó tiến hành tinh chế. Phương pháp enzym thích hợp với các mẫu phân tích có chứa hàm lượng β-glucan thấp. Phương pháp này đạt hiệu suất 19 thu hôi hơn 80%, thời gian tách chiết ngắn nhưng yêu cầu về thiết bị hiện đại, chi phí cao [22]. Từ đầu những năm 1970, một số viện nghiên cứu ở Nhật Bản đa thư tách chiết βglucan từ nấm nói chung và nó trở thành hướng nghiên cứu chính ở Nhật Bản. Trong 50 năm qua, rất nhiều nhà khoa học và viện nghiên cứu đa góp phần to lớn vào việc định loại. tách chiết, định lượng, định tính các thành phần khác nhau của β-1,3- Glucan. Những nghiên cứu về β-glucan chỉ ra rằng hợp chất này kích thích các tế bào khác nhau trong hê ̣ miễn dịch trở thành những “ kẻ giết ” năng nổ hơn. Trong 10 năm qua các nhà khoa học và các bác sỹ trong nhiều lĩnh vực đa chú ý hơn trong viê ̣c sư dụng β-glucan để giải quyết nhiều vấn đề như bê ̣nh nhân bị dị ứng với thuốc, nhiễm nấm và ung thư. 2.3.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Linh Chi tại Việt Nam * Tình hình sản xuất Từ thập niên 90, nấm Linh Chi mới thực sự nuôi trông nhiều ở Việt Nam. Ngoài ra, còn thấy 15 loài nấm Linh Chi mọc hoang dại ở rừng Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Lâm Đông, Đông Nai, Bình Phước, Gia Lai, Đăk Lắc. Tại hội nghị kết quả công tác chuyển giao công nghệ nuôi trông nấm ăn và nấm dược liệu, theo tài liệu đa được công bố tới nay có 32/61 tỉnh thành có cơ sở nuôi trông nấm dược liệu (tháng 12.2001). Gần đây đa có rất nhiều Viện, Trung tâm nghiên cứu về nấm Linh Chi ở cả Bắc và Nam nhằm lựa chọn những chủng có năng suất cao, phẩm chất tốt, phù hợp với khí hậu và đặc biệt có thể phổ biến đại trà cho dân ở một số nơi nuôi trông để tận dụng nguôn nguyên liệu cellulose có sẵn cùng với lực lượng nhân công đông đảo. Mặt khác, nuôi trông nấm Linh Chi để cung cấp nguôn dược liệu trong nước, bổ sung cho thực phẩm và một phần để xuất khẩu. * Tình hình nghiên cứu Gần đây trong nước cũng rất quan tâm và có khá nhiều nghiên cứu về trích ly và ứng dụng các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi . Nhóm nghiên cứu Viện Công nghệ thực phẩm của T.S Trương Thị Hòa trong nghiên cứu “Trích ly hoạt chất sinh học từ nấm Linh Chi ” đa đa xác định được phương pháp trích ly các hoạt chất sinh học sư dụng cho công nghệ sản xuất rượu bổ. Phương pháp trích ly bằng côn với tỷ lệ dung môi / nguyên liệu là 1/10 đạt hiệu suất cao (8,8%) khi chiết lần 1 bằng côn 960, lần 2 bằng côn 700, lần 3 bằng côn 450. Ngoài ra còn sư dụng enzyme Novozyme 342 (hỗn hợp của enzyme cellulase và hemicellulase) đạt hiệu 20