Tài liệu Nghiên cứu sản xuất giấm từ vi sinh vật và ứng dụng phương pháp lên men liên tục (1)

i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập em đã hoàn thành đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất giấm ăn bằng vi sinh vật và ứng dụng phương pháp lên men liên tục”. Trong thời gian nghiên cứu và thực tập tại phòng thí nghiệm, em đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy, cô trong khoa để em thực hiện đề tài này. Qua đây, em bày tỏ lòng cảm ơn tới: - Quý thầy, cô, cán bộ, công nhân viên chức trường Đại Học Nha Trang đã trang bị truyền đạt kiến thức trong suốt khóa học. - Lời cảm ơn chân thành tới giáo viên hướng dẫn, cô ThS. NGUYỄN THỊ THANH HẢI đã giúp đỡ, hướng dẫn em trong suốt thời gian làm đồ án. - Giáo viên hướng dẫn thực hành thí nghiệm phòng công nghệ thực phẩm, và phòng thực hành hóa- vi sinh đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình làm các thí nghiệm. - Gia đình đã tại điều kiện cho em trong suốt thời gian học và cảm ơn tất cả bạn bè luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ trong suốt thời gian qua. Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha trang, tháng 6 năm 2011 Sinh viên Võ Thị Thu Hoài ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN.........................................................................................................i MỤC LỤC..............................................................................................................ii DANH MỤC CÁC HÌNH......................................................................................v DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................vii CÁC KÍ HIỆU .....................................................................................................vii LỜI MỞ ĐẦU........................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN ......................................................................................2 1.1. Tổng quan về giấm........................................................................................2 1.1.1 Khái niệm ....................................................................................................2 1.1.2. Phân loại .....................................................................................................2 1.1.3. Các phương pháp sản xuất acid acetic .........................................................2 1.1.4. Tình hình sản xuất giấm ở Việt Nam và các nước trên thế giới....................4 1.2. Tổng quan về quá trình lên men ....................................................................5 1.2.1. Khái quát chung .........................................................................................5 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ...............................................6 1.3. Tổng quan quá trình lên men giấm ................................................................8 1.3.1. Bản chất của quá trình.................................................................................8 1.3.2. Cơ chế tạo axit axetic trong tế bào vi khuẩn ................................................9 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men giấm: .................................... 10 1.3.4. Các phương pháp lên men tạo axit axetic ................................................. 12 1.3.5. Phương pháp nâng cao nồng độ acid acetic trong dịch lên men ................ 15 1.3.6. Sự sinh trưởng và phát triển của VSV trong quá trình lên men .................. 17 1.3.7 Thành phần hóa học của giấm nuôi ............................................................ 19 1.3.8. Một số hư hỏng giấm và nguyên nhân....................................................... 20 1.4. Hệ VSV sử dụng trong lên men giấm .......................................................... 21 iii 1.4.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................... 21 1.4.2. Đặc điểm sinh trưởng ............................................................................... 22 1.4.3. Một số vi khuẩn thường gặp trong lên men giấm...................................... 23 1.5. Một số ứng dụng của acid acetic ................................................................. 26 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 28 2.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................. 28 2.1.1. Vi khuẩn acetobacter pasteurianum.......................................................... 28 2.1.2. Cơ chất..................................................................................................... 28 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ thí nhgiệm...................................................................... 30 2.1.4. Bao bì thủy tinh......................................................................................... 30 2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 30 2.2.1. Nội dung nghiên cứu:................................................................................ 30 2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm .................................................................. 31 2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm xác định các thông số dịch lên men............. 33 2.3.1. Bố trí thí nghiêm xác định nồng độ rượu dịch lên men. ............................. 33 2.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ đường thích hợp........................................ 33 2.3.3 Bố trí thí nghiệm xác định pH thích hợp..................................................... 34 2.4. Tiến hành nhân giống và xác định tỷ lệ bổ sung giống vi khuẩn acetobater pasteurianum vào dịch lên men.......................................................................... 35 2.4.1 Quy trình nhân giống dự kiến..................................................................... 35 2.4.2. Thuyết minh quy trình nhân giống thuần chủng ........................................ 35 2.4.3. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ bổ sung giống vào dịch lên men............... 36 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian lên men............................................... 37 2.6 . Nghiên cứu quá trình lên men giấm bằng thiết bị lên men liên tục......... 38 2.6.1. Thiết bị lên men liên tục............................................................................ 38 2.6.2. Xác định thời gian tạo màng VSV trên chất mang..................................... 39 2.6.3. Xác định thông số quá trình lên men liên tục:............................................ 40 2.7. Bố trí thí nghiệm xác định chế độ thanh trùng sản phẩm ............................. 42 2.5. Phương pháp phân tích đánh giá cảm quan, chất lượng sản phẩm................ 43 iv 2.5.1. Phương pháp đánh giá chất lượng cảm quan ............................................. 43 2.5.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu hóa học ............................................... 45 2.5.3. Phân tích các chỉ tiêu vi sinh của giấm ăn theo TCVN .............................. 45 2.5.4. Xử lý số liệu thực nghiệm, vẽ đồ thị biểu diễn quy luật biến đổi các thông số........................................................................................................................ 45 Chương 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.................................. 46 3.1. Kết quả nghiên cứu xác định thông số dịch lên men .................................... 46 3.1.1. Kết quả nghiên cứu xác định nồng độ rượu thích hợp................................ 46 3.1.2. Kết quả xác định hàm lượng đường bổ sung vào dịch lên men .................. 48 3.1.3. Kết quả thí nghiệm xác định pH dịch lên men thích hợp ........................... 50 3.2. Tiến hành nhân giống và kết quả thí nghiệm xác định tỷ lệ bổ sung giống vi khuẩn Acetobater pasteurianum vào dịch lên men ............................................. 52 3.3. Kết quả thí nghiệm xác định thời gian lên men............................................ 54 3.4. Kết quả nghiên cứu quá trình lên men giấm bằng thiết bị lên men liên tục .. 56 3.4.1. Kết quả xác định thời gian tạo màng VSV trên vật liệu chất mang ............ 56 3.5. Kết quả TN xác đinh thời gian lên men liên tục........................................... 59 3.6. Kết quả xác định chế độ thanh trùng sản phẩm............................................ 61 3.7. Quy trình sản xuất hoàn thiện...................................................................... 63 3.8. Kết quả sản xuất thực nghiệm ..................................................................... 65 3.9 Kết quả xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm giấm .............................. 66 3.9.1 Tiêu chuẩn chất lượng cảm quan ................................................................ 66 3.9.2 Tiêu chuẩn hóa học .................................................................................... 66 3.9.2 Tiêu chuẩn về vi sinh vật............................................................................ 66 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .................................................................. 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 69 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic trong tế bào vi khuẩn. .............9 Hình 1.2. Đường cong sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh ........................... 17 Hình 1.3. Đường cong sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy liên tục ..................... 19 Hình 1.4. Acetobacter pasteurianum...................................................................... 24 Hình 2.1. Công thức hóa học của đường saccarose ................................................ 29 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình dự kiến.......................................................................... 31 Hình 2.3 Sơ đồ nhân giống thuần chủng ................................................................ 35 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ bổ sung chủng VSV .................... 36 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian lên men ................................ 37 Hình 2.6. Thiết bị lên men liên tục…………………………………………………38 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí xác định thời gian tạo màng VSV trên vật liệu chất mang ... 39 Hình 2.8. Sơ đồ bố trí xác định vận tốc dòng môi trường....................................... 41 Hình 2.9. Sơ đồ bố trí TN xác định thời gian lên men ............................................ 42 Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định chế độ thanh trùng............................. 43 Hình 3.1. Hàm lượng acid, rượu dư của mẫu TN xác định nồng độ rượu thích hợp46 Hình 3.2 Điểm cảm quan các mẫu TN xác định nồng độ rượu dịch lên men .......... 47 Hình 3.3. Hàm lượng acid, rượu dư các mẫu TN xác định hàm lượng đường thích hợp sau lên men..................................................................................................... 48 Hình 3.4. Điểm cảm quan các mẫu TN xác định hàm lượng đường dịch lên men .. 49 Hình 3.5. Hàm lượng acid, nồng độ rượu dư của các mẫu TN xác định pH dịch lên men ....................................................................................................................... 50 Hình 3.6. Điểm cảm quan các mẫu TN xác định pH dịch lên men ......................... 51 Hình 3.7. Kết quả hàm lượng acid, nồng độ rượu dư các mẫu TN xác định tỷ lệ bổ sung chủng VSV.................................................................................................... 52 Hình 3.8. Kết quả điểm cảm quan các mẫu TN xác định tỷ lệ bổ sung chủng VSV 53 Hình 3.9. Hàm lượng acid, rượu dư các mẫu TN xác định thời gian lên men ......... 54 vi Hình 3.10. Điểm cảm quan các mẫu TN xác định pH dịch lên men ....................... 55 Bảng 3.17. Kết quả hàm lượng acid thu được các mẫu TN xác định thời gian tạo màng VSV............................................................................................................. 56 Hình 3.11. Hàm lượng acid, rượu dư các mẫu TN xác định vận tốc dòng môi trường .............................................................................................................................. 57 Hình 3.12. Điểm cảm quan các mẫu TN xác định pH dịch lên men ....................... 58 Hình 3.13. Hàm lượng acid, nồng độ rượu dư các mẫu TN xác định thời gian lên men liên tục........................................................................................................... 59 Hình 3.14. Điểm cảm quan các mẫu TN xác định thời gian lên men liên tục.......... 60 Hình 3.15. Điểm cảm quan xác định chế độ thanh trùng ........................................ 61 Hình 3.9. Sơ đồ quy trình sản xuất sản phẩm hoàn chỉnh ....................................... 63 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men................................. 33 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men ........ 34 Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ rượu đến quá trình lên men ............... 34 Bảng 2.4 Bảng đánh giá sản phẩm qua hệ số quan trọng........................................ 44 Bảng 2.5. Bảng cơ sở chấm điểm cảm quan các chỉ tiêu sản phẩm giấm................ 44 Bảng 3.1. Điểm cảm quan của hội đồng cảm quan của sảm phẩm.......................... 65 Bảng 3.2 Tiêu chuẩn chất lượng cảm quan sản phẩm giấm ................................... 66 Bảng 3.3. Chỉ tiêu hóa học sản phẩm giấm ............................................................ 66 CÁC KÍ HIỆU TN: thí nghiệm TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam ĐCQ: Điểm cảm quan h: giờ tb: tế bào VSV: vi sinh vật NADP: nicotinamide adennine dinucleotide NADPH2:nicotinamide adennine dinucleotide dihidro 1 LỜI MỞ ĐẦU Từ xưa, giấm đã được sử dụng như một gia vị trong ẩm thực và ngày nay giấm đã đuợc ứng dụng rộng rãi hơn trong đời sống. Nó không chỉ được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm mà còn được ứng dụng nhiều trong ngành công nghiệp nhẹ, y học và còn như một loại mỹ phẩm dành cho phái đẹp. Trong quá trình lên men, rượu, đường bị oxy hóa không hoàn toàn tạo acid acetic. Bên cạnh quá trình lên men tạo acid acetic còn có quá trình chuyển hóa các thành phần khác trong môi trường tạo nên các sản phẩm phụ như các acid hữu cơ, vitamin,…rất tốt cho sức khỏe. Các sản phẩm phụ này đã làm cho giấm lên men có vị chua thanh, dịu ngọt, mà giấm hóa học không có được. Nguyên liệu chính sản xuất giấm là rượu gạo, đường và có thể một số loại trái cây. Trong sản xuất rượu gạo, rượu có nồng độ cồn thấp (rượu bào) hầu như không có giá trị kinh tế. Để tận dụng nguyên liệu thừa này, từ lâu con người đã sử dụng nó để lên men giấm phục vụ cho những bữa ăn gia đình. Tuy nhiên quá trình sản xuất giấm vẫn còn ở quy mô nhỏ, hộ gia đình và bằng phương pháp thủ công. Vì vậy tôi đề xuất “Nghiên cứu quy trình sản xuất giấm từ vi sinh vật và ứng dụng phương pháp lên men liên tục” ở phòng thí nghiệm. Do kiến thức bản thân còn hạn chế, bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu thực tế còn gặp nhiều khó khăn, cùng với thời gian thực hiện có hạn nên nội dung không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy cô giáo và các bạn để nội dung đề tài được tốt hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! 2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về giấm [4] 1.1.1 Khái niệm: Giấm là dung dịch acetic loãng có nồng độ ≤8%. 1.1.2. Phân loại [9] Tùy theo nguyên liệu sản xuất giấm mà người ta phân giấm ra 2 loại: - Giấm gạo: Hay còn gọi là giấm cất, đó là quá trình sản xuất mà dùng lương thực, ngũ quả, đường và rượu gạo làm nguyên liệu chính nhờ quá trình lên men của vi khuẩn acetic. Loại giấm này có nhiều hương vị khác nhau, thành phần dinh dưỡng cũng phong phú nhờ quá trình thủy phân các thành phần dinh dưỡng được dùng chế biến thực phẩm và mục đích nội trợ. - Giấm pha chế: Hay còn gọi là giấm hóa học được sản xuất dựa trên nguyên liệu chính là acid acetic tinh luyện pha thêm nước mà thành, không có thêm thành phần dinh dưỡng khác. Lọai này thường dùng trong công nghiệp luyện kim hoặc sát khuẩn hoặc trong ngành công nghiệp nhẹ… 1.1.3. Các phương pháp sản xuất acid acetic [3] Acid acetic là một loại acid hữu cơ được ứng dụng rộng rãi và từ lâu. Do đó, loài người đã phát minh ra nhiều phương pháp khác nhau để sản xuất acid acetic. Những phương pháp sản xuất cid acetic bao gồm:  Phương pháp hóa gỗ.  Phương pháp hóa học.  Phương pháp sinh học.  Phương pháp kết hợp. a- Phương pháp hóa gỗ Cùng với sự phát triển của ngành khai thác và chế biến gỗ loài người cũng đã biết cách sản xuất acid acetic từ dạng nguyên liệu này. 3 Bằng cách chưng cất gỗ đã lên men, người ta thu được một hỗn hợp nhiều chất khác nhau, trong đó acid acetic với hàm lượng rất lớn. Hiện nay phương pháp này đã không còn được ứng dụng. b- Phương pháp hóa học Phương pháp này dựa trên quá trình oxy hóa axetaldehyd thành acid acetic, có xúc tác của mangan rồi sau đó chưng cất phân đoạn ở nhiệt độ 50-80oC Phản ứng oxy hóa xảy ra như sau: CH≡ CH + H2O CH3CHO +O2 CH3COOH CH2≡CH2 +O2 Hiện nay, người ta tổng hợp acid acetic từ methanol và CO bằng phản ứng carbonyl hóa. Trong quy trình này, metanol và cacbon monoxit phản ứng với nhau tạo ra acid acetic theo phương trình: CH3OH + CO → CH3COOH c- Phương pháp hỗn hợp Trước tiên, người ta tiến hành quá trình oxy hóa hydrat cacbon có mạch cacbon ngắn như propan hay butan để tạo thành acid acetal dehyt, formaldehyde methanol và acetone. Sau đó acetaldehyd được oxy hóa để tạo thành acid acetic. Rồi người ta trung hòa khối thủy phân này và tiến hành lên men để thu nhận được dung dịch chứa acid acetic. d- Phương pháp sinh học: Hiện nay, người ta sản xuất acid acetic chủ yếu bằng phương pháp lên men. So với những phương pháp khác thì phương pháp này có nhiều ưu điểm: a. Nguyên liệu để sản xuất acid acetic bằng phương pháp lên men rất dễ kiếm. Có thể sử dụng nguyên liệu chứa đường (nước ép trái cây, nước trái dừa, nước ép mía…) có thể sử dụng nguyên liệu chứa tinh bột và có thể sử dụng cồn công nghiệp. - Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa tinh bột, phải qua 3 giai đoạn chuyển hóa. 4 Giai đoạn chuyển tinh bột thành đừờng. (đường hóa) Giai đoạn chuyển đường thành cồn. (rượu hóa) Giai đoạn chuyển rượu thành acid acetic. - Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa đường thì qua 2 giai đoạn. Giai đoạn chuyển đường thành cồn. Giai đoạn chuyển cồn thành acid acetic. - Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa cồn thì chỉ cần tạo điều kiện thuận lợi để vi khuẩn acid acetic chuyển cồn thành acid acetic. b. Quá trình chuyển hóa hay quá trình lên men được thực hiện ở điều kiện rất ôn hòa, không cần ở nhiệt độ cao, áp suất cao hay máy móc, thiết bị phức tạp. Mặt khác, lên men theo phương pháp sinh học tạo ra một số sản phẩm phụ làm cho hương vị sản phẩm rất đặc trưng. 1.1.4. Tình hình sản xuất giấm ở Việt Nam và các nước trên thế giới: Công nghệ sản xuất giấm đã có từ lâu. Công nghệ sản xuất ban đầu chỉ mang tính chất thủ công. Mãi cuối thế kỷ XIX và đầu thế kỷ XX công nghệ thủ công mới được thay thế bằng công nghệ sản xuất theo quy mô công nghiệp. a. Tình hình trên thế giới [1] Các tài liệu nghiên cứu trước đây đã cho thấy giấm xuất hiện từ khoảng 5000 năm trước công nguyên , khi người Babilon đã sử dụng nước quả chà là để làm rượu vang và giấm. Họ sử dụng nó như là một loại thực phẩm và dùng để bảo quản hoặc làm tác nhân acid (để tẩy rửa). Các vết tích còn sót lại của giấm đã được tìm thấy trong các cái vại của người Ai Cập cổ xưa có niên đại từ khoảng 3000 năm trước công nguyên. Tương tự, giấm được phát hiện ở Trung Quốc từ các tài liệu cổ ghi lại là khoảng 1200 năm trước công nguyên. Ở Ai Cập cổ đại khoảng 400 năm trước công nguyên , Hippocrates, cha đẻ của ngành y học hiện đại , đã sớm biết công dụng của giấm táo kết hợp với mật ong để chữa trị bệnh cúm bao gồm cả ho và cảm lạnh. 5 Từ thời kỳ phục hưng, làm giấm là nghề đem lại lợi nhuận ở Pháp. Nước này đã sản xuất gần 150 loại giấm có mùi vị khác nhau từ việc bổ sung tiêu, cỏ ba lá, hoa hồng, mâm xôi. Sản xuất giấm cũng được phát triển ở Anh, sinh lời đến nỗi năm 1693 Nghị viện thiết lập thuế trên giấm – bia. Vào thời kỳ đầu ở Mỹ, sản xuất giấm rượu táo là nền tảng của nông nghiệp và kinh tế hộ gia đình, được đánh giá là gấp 3 lần rượu táo thô truyền thống. Ngày nay thì sản xuất giấm đã phát triển mạnh và sản xuất với quy mô công nghiệp. Hàng năm sản xuất hàng triệu lít giấm để cung cấp cho nhu cầu sử dụng của con người. Chiếm thị trường phần lớn tại Đức là dòng giấm làm từ rượu chưng cất. Đó là loại giấm công nghiệp, làm từ gỗ cặn bã. Một sản phẩm không có chút hương thơm, thêm vào đó còn được nhuộm màu, thêm chút muối hoặc có trộn lẫn chút dấm làm từ rượu nho thật để tăng thêm hương vị. b. Tình hình trong nước Quá trình sản xuất giấm ở Việt Nam vẫn ở quy mô nhỏ lẻ theo từng hộ gia đình bằng phương pháp thủ công. Sản phẩm tạo ra chỉ để mục đích sử dụng trong gia đình mà chưa có sản phẩm trên thị trường nhiều. Tùy vào mùa vụ mà người ta có thể tạo giấm từ xoài, chuối hay từ hồng xiêm…nhu cầu sử dụng ngày càng nhiều trong khi đó việc sản xuất acid hữu cơ bằng công nghệ lên men không đủ đáp ứng những nhu cầu trên. Hiện nay, đã có một số doanh nghiệp nhỏ lẻ sản xuất giấm bán ra trên thị trường nhưng chất lượng và số lượng chưa ổn định. Hoặc có một số doanh nghiệp đã dùng giấm được pha chế từ axit vô cơ để bán ra trên thị trường (doanh nghiệp giấm ăn Trung Thành số 2, Lĩnh Nam, Q.Hoàng Mai, Hà Nội). 1.2. Tổng quan về quá trình lên men 1.2.1. Khái quát chung [5] 1.2.1.1. Khái niệm chung - Sự lên men theo nghĩa rộng là quá trình trao đổi chất, qua đó các chất hữu cơ mà trước tiên là đường bị biến đổi dưới tác dụng của các enzyme của vi sinh vật. 6 Dựa vào cơ chế của quá trình lên men có thể chia ra: lên men yếm khí và lên men hiếu khí. Lên men yếm khí là quá trình phân giải bằng enzyme các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất đơn giản mà không có sự tham gia của oxy phân tử. Ví dụ lên men rượu, lên men axetonbutylic, lên men lactic… Lên men hiếu khí cũng là quá trình phân giải đường thành các hợp chất đơn giản nhưng cần phải có oxy tự do. Ví dụ lên men axetic, lên men xitric. - Trong sản xuất lên men, người ta dùng các vi sinh vật khác nhau như nấm mốc, nấm men, vi khuẩn. - Các sản phẩm thu được của các quá trình lên men cũng khác nhau và rất đa dạng. Dựa vào tính chất của các sản phẩm lên men người ta chia ra: công nghiệp lên men cổ điển và công nghiệp lên men hiện đại. - Công nghiệp lên men cổ điển là những ngành lên men qua đó người ta thu được những sản phẩm có phân tử lượng nhỏ hơn chất “khởi thủy” trong nguyên liệu. Một đặc điểm nữa là có thể thay thế bằng phương pháp hóa học. Ví dụ sản xuất rượu, sản xuất lactic, axit axetic… - Công nghệ lên men hiện đại là các sản phẩm thu được phức tạp hơn, khác xa về bản chất của các chất “khởi thủy” ban đầu trong nguyên liệu và không thể thay thế bằng phương pháp hóa học. Ví dụ như sản xuất vitamin, kháng sinh… 1.2.1.2. Bản chất của các quá trình lên men - Lên men thực chất là quá trình oxy hóa – khử sinh học (có sự tham gia của enzyme xúc tác) để thu năng lượng và các hợp chất trung gian cho tế bào vi sinh vật hoạt động. - Lên men là quá trình để thu năng lượng, qua đó hydro tách ra khỏi cơ chất được chuyển đến chất tiếp nhận cuối cùng là chất hữu cơ. Hợp chất hữu cơ được khử đi vào môi trường dinh dưỡng và tích tụ lại trong đó. Tùy thuộc vào sản phẩm cuối cùng được tích tụ chiếm ưu thế hoặc sản phẩm nào đặc trưng mà người ta phân ra lên men rượu, lên men lactic hay lên men butilic,… 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men [5] 1.2.2.1. Các cấu tử của môi trường 7 a. Nguồn gluxit Một trong những thành phần chủ yếu của quá trình lên men đó là gluxit. Nó không những là nguồn cung cấp năng lượng mà còn là nguồn cung cấp vật liệu xây dựng cần thiết để sinh tổng hợp các cấu tử cần thiết của tế bào. Trong điều kiện thí nghiệm các chất này có thể cho vào hợp chất thuần khiết đặc biệt là glucose. Trong công nghiệp thì đa dạng hơn. b. Phosphat vô cơ Phosphat có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của hệ thống sinh học. c. Nitơ Nitơ là hợp phần quan trọng protein, axit nucleic và phần lớn các hợp chất phức tạp của chất sống. Nhiều vi sinh vật có thể đồng hóa nitơ dưới dạng ion amoni, một số dưới dạng nitrat, … d. Các nguyên tố vi lượng Ngoài các nguyên tố trên, các nguyên tố vi lượng cũng rất cần thiết. Các nguyên tố vi lượng có thể hiệu quả ở nồng độ cực kỳ nhỏ.  - analin có hiệu quả khi nồng độ là 1:108. Các nguyên tố vi lượng cũng như các chất khác ở dạng vết là những yếu tố sinh trưởng thường chứa trong các nguyên liệu ban đầu khi dùng để chuẩn bị các cơ chất hay được chúng ta bổ sung vào trong quá trình lên men. e. Vitamin 1.2.2.2 Các nhân tố bên ngoài a. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Do đó người ta sử dụng nhân tố này để điều chỉnh quá trình lên men. Nhiệt độ có vai trò thực sự đến một số khía cạnh khác của quá trình sinh tổng hợp như: chất lượng sản phẩm tạo thành, vận tốc tạo thành và giải phóng sản phẩm… b. Ảnh hưởng của pH 8 Các vi sinh vật có vận tốc sinh trưởng cực đại trong một khoảng pH nhất định và có thể bị chết hoặc vô hoạt ở pH giới hạn. Các vi sinh vật khác nhau tồn tại ở những pH tối ưu khác nhau. Vì vậy cần dựa vào từng loại vi sinh vật mà điều chỉnh pH thích hợp cho loại vi sinh vật đó. c. Ảnh hưởng của hàm lượng O2 Tùy vào bản chất của quá trình lên men hiếu khí hay lên men kỵ khí mà ta cung cấp lượng oxy cho phù hợp. Có những quá trình lên men cần cung cấp oxy trong suốt quá trình lên men (lên men axetic), hay chỉ cần cung cấp oxy trong giai đoạn đầu của quá trình lên men (lên men rượu), hay không cần cung cấp oxy trong suốt quá trình lên men. d. Các yếu tố khác Tùy thuộc mỗi quá trình lên men khác nhau nên sẽ có các yếu tố ảnh hưởng khác nhau, như điều kiện để yên hay khuấy đảo khác nhau sẽ có những ảnh hưởng khác nhau tới quá trình các quá trình lên men khác nhau. 1.3. Tổng quan quá trình lên men giấm 1.3.1. Bản chất của quá trình [5] Lên men giấm là quá trình oxy hóa không hoàn toàn trong đó etanol bị oxy hóa tạo thành acid acetic trong điều kiện hiếu khí nhờ enzyme oxy hóa của vi khuẩn acetic. Đồng thời, hidro được vận chuyển nhờ sự xuất hiện của NADP tạo thành NADPH2 và được chuyển qua chuỗi hô hấp để sinh năng lượng. Tuy nhiên, cơ chất không bị oxy hóa hoàn toàn nên được gọi là quá trình oxy hóa không hòan toàn. Tất cả các hoạt động sống đều cần phải có năng lượng để thực hiện các hoạt động sống, sinh trưởng phát triển. Quá trình lên men giấm là quá trình oxy hóa không hoàn toàn sinh năng lượng và tổng hợp các hợp chất trung gian cho VSV hoạt động. Các rượu khác nhau, đường và một số axit cũng có thể bị vi khuẩn axetic oxy hóa. Chẳng hạn nó có thể oxy hóa rượu butylic thành axit butyric, rượu propylic thành axit propionic, glixerin thành dioxyaxeton… 9 1.3.2. Cơ chế tạo axit axetic trong tế bào vi khuẩn [5] Phản ứng tạo axit axetic xảy ra trong tế bào của vi khuẩn. Muốn phản ứng xảy ra thì đường, C2H5OH và O2 phải được thẩm thấu vào trong tế bào. Khi đó các enzyme oxy hóa có trong tế bào của vi khuẩn tham gia oxy hóa rượu tạo thành CH3COOH. CH3COOH được tạo thành sẽ thoát ra khỏi tế bào và tan vô hạn trong dung dịch của môi trường. Phương trình phản ứng tổng quát của sự lên men giấm: C2H5OH + O2  CH3COOH + H2O + 117 Kcal Ethanol C2H5OH CH3COOH CH3COOH Đường O2 Môi trường Tế bào Hình 1.1. Quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic trong tế bào vi khuẩn. Tùy vào nguyên liệu ban đầu mà quá trình lên men giấm mà có thể xảy ra theo sơ đồ: Tinh bột Đường hóa đường đường Rượu Rượu hóa rượu Lên men acid acetic Sau khi tạo thành rượu tiếp tục thực hiện quá trình lên men giấm, là quá trình oxy hóa tuần tự etanol → axetaldehyde → acid acetic. Đầu tiên từ ruợu etylic tạo 10 thành axetaldehyde rồi được chuyển thành hydrat của axetaldehyde và sau cùng hydrat axetaldehyde bị oxy hóa thành acid acetic CH3CH2OH + 12 O2 →CH3CHO + H2O Rượu etylic axetaldehyde CH3CHO + H2O → CH3CH(OH)2 Hydrat axetaldehyde Hai nguyên tử hydro trong phân tử hydrat – axetaldehyde đuợc hoạt hóa rồi kết hợp với oxy là chất tiếp nhận hidro: CH3CH(OH)2 + 12 O2 → CH3COOH + H2O Hydrat axetaldehyde acid acetic Quá trình lên men giấm sẽ kết thúc khi hàm lượng acid acetic đạt yêu cầu. Điều lưu ý là, trong môi trường lên men hết rượu, vi khuẩn acetic sẽ tham gia quá trình oxy hóa axit axetic thành CO2 và H2O để nhận năng lượng dùng cho quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng. CH3COOH + 2O2 CO2 + H2O Vi khuẩn khuẩn Vi Chính vì thế, sau khi lên men, bao giờ người ta cũng để lại một lượng etanol khoảng 0,3 – 0,5 % để vi khuẩn có thể sử dụng cồn mà không sử dụng acid acetic như một nguồn năng lượng. 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men giấm: 1.3.3.1. Chủng vi sinh vật Chủng VSV có ảnh hưởng rất lớn tới quá trình lên men. Hoạt lực của VSV trong quá trình lên men quyết định tới hiệu suất chuyển hóa các chất tạo ra sản phẩm. Vì vậy, để quá trình lên men giấm đạt hiệu quả cao yêu cầu chủng VSV sử dụng trong quá trình lên men đáp ứng một số yêu cầu: 1. Chủng có khả năng chuyển hóa ethylic tốt và tạo acid acetic với hiệu suất cao. 2. Chủng có khả năng chịu được độ cồn và acid cao. 11 3. Các tính chất ban đầu được giữ nguyên trong suốt quá trình lên men. 4. Các điều kiện phân lập, nuôi cấy, bảo quản giống đơn giản không tốn kém nhiều phù hợp với điều kiện Việt Nam. 1.3.3.2. Ảnh hưởng của sự thoáng khí [4] Sự chuyển hóa etanol thành axit axetic do phản ứng oxy hóa trong đó oxy khí quyển là chất tiếp nhận hydro. Do vậy, trong sản xuất sự oxy hóa rượu chỉ xảy ra trong trường hợp nếu vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với oxy không khí. Trong điều kiện yếm khí thì vi khuẩn lên men giấm sẽ sử dụng cơ chất dinh dưỡng mà không tạo thành axit axetic. Như vậy, chế độ cung cấp oxy là nhân tố điều chỉnh quá trình lên men. 1.3.3.3. Ảnh hưởng nhiệt độ Acetobacter thuộc nhóm ưa ấm, nhiệt độ thích hợp cho chúng là từ 25-32oC. Nhiệt độ thấp quá trình lên men xảy ra chậm, nhiệt độ cao ức chế hoạt động và đến mức độ nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào làm tăng sự tổn thất của vi khuẩn và hiệu suất của quá trình lên men giảm do sự bay hơi của acetic và etylic. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình sản xuất giấm 22-35oC, nhiệt độ tối ưu là 23-27oC. 1.3.3.4. Ảnh hưởng nồng độ etylic trong dịch lên men [4] Etylic được sử dụng như là cơ chất chủ yếu của quá trình lên men giấm với hàm lượng thích hợp là 5-12% thể tích. Nồng độ rượu quá cao sẽ ức chế hoạt động của hệ vi khuẩn dẫn tới làm giảm hiệu suất lên men. Khi không có etylic để làm cơ chất vi khuẩn acetic lại sử dụng acid acetic trong môi trường để tiếp tục oxy hóa tạo năng lượng cung cấp cho hoạt động của chúng, vì vậy làm cho hàm lượng acetic giảm đi. Để tránh hiện tượng oxy hoá tiếp tục acid acetic thành CO2 và H2O thì cần có 1 lượng rượu còn lại trong sản phẩm khoảng 0.3-0.5% so với yêu cầu. 12 1.3.3.5. Ảnh hưởng của nồng độ acetic và pH [4] Trong sản xuất giấm người ta thường cho vào cơ chất ban đầu 1 lượng acid acetic nhất định để axit hóa môi trường nhằm:  Ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật các loại  Đưa về pH thích hợp cho vi khuẩn hoạt động. Môi trường pH= 3 là thích hợp nhất cho vi khuẩn acetic. Khi nồng độ acetic tăng dần làm cho pH giảm sẽ hạn chế hoạt động của vi khuẩn. Nồng độ acid ban đầu khoảng 2-6%. Hàm lượng cao hạn chế sự sinh trưởng của vi khuẩn và giảm khả năng lên men. Nồng độ acid acetic 8% ức chế hoạt động của vi khuẩn rất lớn. Nồng độ 12-14% thì vi khuẩn ngừng hoạt động. 1.3.3.6. Các chất C, N, P và nguyên tố vi lượng [8] Để quá trình oxy hóa xảy ra nhanh trong dịch lên men cần bổ sung 1 số muối khoáng (NH4)2SO4, KH2PO4, CaHPO4, FeCl3… tùy theo nhu cầu cụ thể từng loài. Các chất này cung cấp năng lượng cho sự phát triển của tế bào và giữ vai trò như những khối xây dựng nên tế bào VSV. Ngoài ra trong môi trường dinh dưỡng còn được bổ sung vitamin, chất kích thích sinh trưởng như pepton, cao nấm men… 1.3.4. Các phương pháp lên men tạo axit axetic [3] Bản chất của quá trình lên men là hiếu khí,vì thế phải tạo điều kiện tối đa để vi khuẩn tiếp xúc với oxy và cơ chất. Để giải quyết tối đa vấn đề này, người ta đã đưa ra 4 phương pháp khác nhau: Phương pháp lên men chậm Phương pháp lên men nhanh Phương pháp lên men chìm Phương pháp lên men kết hợp 13 1.3.4.1. Phương pháp lên men chậm Phương pháp này được người Pháp thực hiện từ rất lâu và được coi như là phương pháp truyền thống của người Pháp. Nguyên liệu dùng để sản xuất acid acetic là nước nho. Giống vi khuẩn axetic được sử dụng cho quá trình sản xuất là Acetobacter orleaneuse. Người ta thường cho vào thùng lên men bằng gỗ có dung tích 250-300 lít bằng gỗ sồi hình tank trống 1/5 thể tích lượng acid acetic và sau đó cho vào thùng dung dịch nước ép nho sao cho toàn bộ khối lượng đạt ½ thể tích thùng lên men ( hoặc 2/3 thể tích thùng lên men). Sở dĩ người ta cho acid acetic trước để tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển, mặt khác để ngăn ngừa các vi khuẩn khác phát triển, tránh bị nhiễm. Tiến hành quá trình lên men ở nhiệt độ thường. Sau một thời gian, trên bề mặt sẽ tạo thành váng chứa nhiều vi khuẩn acetic và có sự tích lũy acid acetic trong dịch lên men. Vì thế mà quá trình oxy hóa xảy ra chậm và kéo dài rồi kết thúc sau vài tuần sau đó. Sau khi họ kiểm tra hàm lượng acit đạt tiêu chuẩn, chỉ tiêu cảm quan rồi kết thúc quá trình lên men giấm, họ lấy giấm ra, cho dịch dinh dưỡng mới vào. Nếu để lâu, chất lượng giấm bị giảm nhanh do quá trình oxy hóa giấm xảy ra tiếp tục. Giấm thu đuợc thường có hàm lượng axit 5-6%. Muốn để lâu phải đem thanh trùng Pasteur. 1.3.4.2. Phương pháp lên men nhanh Phương pháp này do người Đức thực hiện theo qui mô công nghiệp đã khắc phục được những nhược điểm của phương pháp lên men chậm của người Pháp. Thiết bị lên men là một thùng gỗ cao 2,5-6m, có đường kính 1,2 - 3m. Tỷ lệ đường kính đáy so với chiều cao khoảng ½ là thích hợp nhất. Trong thùng được chất đầy phoi bào hay lõi bắp. Phoi bào hay lõi bắp được xem như chất mang, giữ vi sinh vật trong quá trình lên men, nhờ đó mà vi sinh vật không đi theo vào sản phẩm cuối cùng. Ngoài ra, ở đáy thiết bị, người ta cho lắp một hệ thống phân phối, không khí đưa từ dưới lên. Môi trường được đưa vào từ trên xuống.