Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giáo dục - Đào tạo Cao đẳng - Đại học Nghiên cứu sự hình thành tế bào đơn cây lan hồ điệp (phalaenopsis amabilis) và ứ...

Tài liệu Nghiên cứu sự hình thành tế bào đơn cây lan hồ điệp (phalaenopsis amabilis) và ứng dụng trong nhân giống (tóm tắt)

.PDF
32
509
75

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRỊNH THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU SỰ HÌNH THÀNH TẾ BÀO ĐƠN CÂY LAN HỒ ĐIỆP (PHALAENOPSIS AMABILIS) VÀ ỨNG DỤNG TRONG NHÂN GIỐNG Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 62 42 30 05 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh năm 2016 Công trình được hoàn thành tại: ....................................................... .......................................................................................................... Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Dương Tấn Nhựt 2. PGS. TS. Võ Thị Bạch Mai Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Thị Quỳnh Phản biện 2: TS. Bùi Minh Trí Phản biện 3: PGS.TS. Lê Thị Thủy Tiên Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Đặng Văn Đông Phản biện độc lập 2: TS. Đoàn Thị Phương Thùy Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại ........ .......................................................................................................... .......................................................................................................... vào lúc giờ ngày tháng Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM - Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên năm MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 1 1.1. NUÔI CẤY MÔ SẸO ................................................................................ 1 1.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO......................................................... 1 1.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN ....................................................................... 2 1.4. NUÔI CẤY PHÔI ..................................................................................... 2 1.5. SỰ BIỂU HIỆN GENE TRONG QUÁ TRÌNH PHÁT SINH PHÔI SOMA ....................................................................................................... 3 1.6. QUÁ TRÌNH TÁI SINH ........................................................................... 4 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................... 4 2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI 2.1.1. Địa điểm tiến hành đề tài 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ....................................................................... 4 2.2.1. Vật liệu dùng trong nuôi cấy .................................................................. 4 2.2.2. Vật liệu dùng trong sinh trắc nghiệm ..................................................... 5 2.3. MÔI TRƯỜNG, ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN KẾT QUẢ......................................................................... 5 2.3.1. Môi trường thí nghiệm tạo mô sẹo, phôi, PLB, tế bào đơn, ra cây ......... 5 2.3.2. Thiết kế thí nghiệm nuôi cấy lỏng lắc .................................................... 5 2.3.3. Điều kiện nuôi cấy .................................................................................. 5 2.3.3.1. Điều kiện nuôi cấy in vitro .................................................................. 5 2.3.3.2. Điều kiện ở vườn ươm ......................................................................... 5 2.3.4. Phương pháp xác định số lượng tế bào, sinh khối (trọng lượng mô sẹo, sinh khối huyền phù, phôi, PLB và cây con) .................................. 5 2.4. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM............................................................... 6 2.4.1. Nội dung 1: Tạo nguồn mẫu ban đầu cho nuôi cấy tế bào đơn .............. 6 2.4.1.1. Qui trình tạo mẫu in vitro .................................................................... 6 2.4.1.2. Nuôi cấy lá in vitro tạo nguồn PLB ban đầu ....................................... 6 2.4.1.3. Khảo sát các môi trường nhân nhanh PLB .......................................... 6 2.4.1.4. Khảo sát các môi trường nuôi cấy để tạo mô sẹo từ PLB làm nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào ........................................... 6 2.4.2. Nội dung 2: Nuôi cấy huyền phù tế bào thu nhận tế bào đơn ................. 6 2.4.2.1. Thí nghiệm 3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng phát sinh hình thái và hình thành tế bào đơn trong huyền phù tế bào ............................................................................................... 6 2.4.2.2. Xác định môi trường thích hợp cho nuôi cấy tế bào đơn lan Hồ điệp ......................................................................................................... 6 i 2.4.2.3. Thí nghiệm 4.4. Xác định đường cong tăng trưởng của huyền phù tế bào lan Hồ điệp ........................................................................... 7 2.4.3. Nội dung 3: Nghiên cứu tái sinh tế bào đơn ........................................... 7 2.4.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể, môi trường khoáng và sucrose lên sự tái sinh ......................................................................................... 7 2.4.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các loại đường (đường đơn, đường đôi) lên sự phát sinh phôi .............................................................................. 8 2.4.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các loại dịch chiết hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên lên sự phát sinh hình thái lan Hồ điệp ...................................... 8 2.4.4. Nội dung 4: Nghiên cứu chuẩn hóa cây con in vitro .............................. 9 2.4.5. Nội dung 5: Chuyển cây nuôi cấy mô ra vườn ươm, trồng thử nghiệm, theo dõi sự sinh trưởng ............................................................. 9 2.4.6. Hình thái giải phẫu ............................................................................... 10 2.4.7. Đo cường độ hô hấp.............................................................................. 10 2.4.8. Đo hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh ............... 10 2.4.9. Thống kê và xử lý số liệu ..................................................................... 10 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 10 3.1. NỘI DUNG 1: TẠO NGUỒN MẪU BAN ĐẦU CHO NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN ...................................................................................... 10 3.1.1. Kết quả nuôi cấy phát hoa và nuôi cấy lá in vitro tạo nguồn PLB ban đầu ................................................................................................ 10 3.1.2. Xác định các môi trường nhân nhanh PLB có nguồn gốc từ mẫu cấy lá hình thành từ nuôi cấy phát hoa lan Hồ điệp ............................. 10 3.1.2.1. Thí nghiệm 1.1. Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy ...................... 10 3.2.2.2. Thí nghiệm 1.2. Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy................ 11 3.1.2.3. Thí nghiệm 1.3. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên khả năng tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy ........................................................................................ 11 3.1.3. Xác định các môi trường nuôi cấy để tạo mô sẹo từ PLB làm nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào ......................................... 12 3.1.3.1. Thí nghiệm 2.1. Ảnh hưởng của mannitol đến sự tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy............ 12 3.1.3.2. Thí nghiệm 2.2. Ảnh hưởng của adenine đến sự tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi từ lTCL-PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy...... 12 3.2. NỘI DUNG 2: NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO THU NHẬN TẾ BÀO ĐƠN ...................................................................................... 13 ii 3.2.1. Thí nghiệm 3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng phát sinh hình thái và hình thành tế bào đơn trong nuôi cấy huyền phù tế bào mô sẹo có khả năng sinh phôi sau 14 tuần nuôi cấy ........... 13 3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào tạo dòng tế bào có khả năng hình thành tế bào đơn ............................................................................................. 14 3.2.2.1. Thí nghiệm 4.1. Ảnh hưởng của BA lên khả năng hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy 3.2.2.2. Thí nghiệm 4.2. Ảnh hưởng của sucrose lên khả năng hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy ....................................................................................... 14 3.2.2.3. Thí nghiệm 4.3. Ảnh hưởng của sucrose kết hợp với sorbitol lên khả năng hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc sau 16 ngày nuôi cấy........................................................ 15 3.2.2.4. Thí nghiệm 4.4. Xác định đường cong tăng trưởng của tế bào đơn trong nuôi cấy huyền phù tế bào lan Hồ điệp................................ 15 3.3. NỘI DUNG 3: NGHIÊN CỨU TÁI SINH TẾ BÀO ĐƠN ..................... 15 3.3.1. Ảnh hưởng của giá thể, môi trường khoáng và sucrose lên sự tái sinh ....................................................................................................... 15 3.3.1.1. Thí nghiệm 5.1. Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma lan Hồ điệp từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy ........................................................................................................ 15 3.3.1.2. Thí nghiệm 5.2. Ảnh hưởng của khoáng và sucrose lên quá trình phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 8 tuần nuôi cấy ................................................................................................ 16 3.3.2. Ảnh hưởng của các loại đường (đường đơn, đường đôi) lên sự phát sinh phôi lan Hồ điệp ........................................................................... 17 3.3.2.1. Thí nghiệm 6.1. Ảnh hưởng của D-glucose lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy .................. 17 3.3.2.2. Thí nghiệm 6.2. Ảnh hưởng của D-fructose lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy .................. 17 3.2.2.3. Thí nghiệm 6.3. Ảnh hưởng của sucrose thí nghiệm (TN) lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy ................................................................................................ 17 3.2.2.4. Thí nghiệm 6.4. Ảnh hưởng của sucrose công nghiệp (CN) lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 6 tuần nuôi cấy ................................................................................................ 18 3.3.3. Ảnh hưởng của các loại dịch chiết hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên lên sự phát sinh hình thái lan Hồ điệp .................................................. 18 iii 3.3.3.1. Thí nghiệm 7.1. Ảnh hưởng của dịch chiết Cà chua lên sự phát sinh hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy ................................................................................................ 18 3.3.3.2. Thí nghiệm 7.2. Ảnh hưởng của Chuối nghiền lên sự phát sinh hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy ........................................................................................................ 18 3.3.3.3. Thí nghiệm 7.3. Ảnh hưởng của Khoai tây nghiền lên sự phát sinh hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy ................................................................................................ 19 3.4. NỘI DUNG 4: NGHIÊN CỨU CHUẨN HÓA CÂY CON IN VITRO .................................................................................................. 19 3.4.1. Thí nghiệm 8.1. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng và hàm lượng nước dừa lên khả năng sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy ............................................................... 19 3.4.2. Thí nghiệm 8.2. Ảnh hưởng của mật độ cây khi cấy chuyền lên khả năng sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 12 tuần nuôi cấy ........................................................................................ 20 3.4.3. Thí nghiệm 8.3. Ảnh hưởng của chiều cao cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn khi cấy chuyền lên sự sinh trưởng của chúng sau 12 tuần nuôi cấy ........................................................................................ 20 3.4.4. Thí nghiệm 8.4. Ảnh hưởng của tuổi cây con khi cấy chuyền lên sự sinh trưởng của chúng trong điều kiện in vitro sau 12 tuần nuôi cấy ........................................................................................................ 20 3.5. KẾT QUẢ QUAN SÁT HÌNH THÁI GIẢI PHẪU CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI, PLB VÀ RỄ ................................ 21 3.6. CHUYỂN CÂY NUÔI CẤY MÔ RA VƯỜN ƯƠM, TRỒNG THỬ NGHIỆM, THEO DÕI SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN ........ 21 3.6.1. Thí nghiệm 9.1. Ảnh hưởng của chế độ tưới nước đến khả năng sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn sau 8 tuần ở vườn ươm........................................................................................... 21 3.6.2. Thí nghiệm 9.2. Ảnh hưởng của chiều cao cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn lên khả năng sinh trưởng của chúng sau 20 tuần ở vườn ươm........................................................................................... 21 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ ................................................... 23 4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................. 23 4.2. ĐỀ NGHỊ ................................................................................................. 24 iv MỞ ĐẦU Mặc dù thị trường xuất khẩu phong lan trên thế giới có nhiều triển vọng song để có thể đáp ứng nhu cầu nội địa, tiến vào thị trường thế giới, ngành công nghiệp hoa lan của Việt Nam còn phải quan tâm rất nhiều đến vấn đề tạo giống, công nghệ sản xuất, canh tác, công nghệ sau thu hoạch, đóng gói, kiểm dịch và đầu tư mở rộng cơ sở hạ tầng. Hàng năm Việt Nam vẫn phải chi hàng tỷ đồng để nhập phong lan từ các nước láng giềng cho nhu cầu nội địa. Hiện nay, đối với việc nhân giống lan Hồ điệp (Phalaenopsis) đã có nhiều triển vọng. Tuy nhiên, hầu hết các giống lan rất dễ xảy ra biến dị vì vậy việc nuôi cấy hạt không thể tạo được cây con đồng nhất (Arditti, 1992). Do vậy, để tạo cây con đồng nhất cần phải áp dụng phương pháp nhân giống vô tính. Khó khăn lớn nhất trong nhân giống vô tính lan Hồ điệp là nguồn mẫu rất hạn chế do chúng là lan đơn thân, sử dụng chồi đỉnh để nuôi cấy như nhiều loài lan khác sẽ làm tổn thương cây mẹ (Intuwong và Sagawa, 1974). Hơn nữa, lan Hồ điệp thường tiết nhiều hợp chất phenol từ bề mặt vết cắt ra môi trường nuôi cấy, gây độc cho mẫu (Fast, 1979). Đối với lan Hồ điệp các quy trình tái sinh có tần số cao chưa xác định được (Takuhara và Mii, 2001). Trong các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật thì nuôi cấy tế bào đơn có nhiều ưu điểm vượt trội. Để tạo được dòng tế bào đơn thì trong nuôi cấy huyền phù tế bào, việc loại bỏ các cụm tế bào lớn, sau đó ly tâm sẽ giúp thu được huyền phù tế bào lý tưởng chỉ chứa các tế bào đơn. Tế bào đơn là một đối tượng nghiên cứu sinh hóa, bệnh lý tế bào, đồng thời thông qua đó có thể thu nhận tế bào trần. Do tế bào có tính toàn năng nên từ một tế bào sinh dưỡng thực vật có thể tái sinh thành một cây hoàn chỉnh, sau khi đã tạo khối tế bào dạng mô sẹo. Về mặt lý thuyết thì nuôi cấy tế bào đơn thành công cho hệ số nhân giống cao vượt trội hơn hẳn so với các kỹ thuật khác, chất lượng cây con đồng nhất. Nuôi cấy tế bào đơn còn mở ra những ứng dụng mới trong việc tạo các dòng tế bào đột biến, các dòng siêu sản xuất một sản phẩm thứ cấp nào đó và khả năng tăng tần suất đột biến di truyền ở thực vật bậc cao, giúp rút ngắn thời gian lai tạo giống. Xuất phát từ những vấn đề trên, tác giả tiến hành luận án: “Nghiên cứu sự hình thành tế bào đơn cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) và ứng dụng trong nhân giống”. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. NUÔI CẤY MÔ SẸO Trong nuôi cấy in vitro, mô sẹo là đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan. Do đó, các phần non của cơ thể thực vật (mô phân sinh ngọn, thân, rễ,…) dễ tạo mô sẹo trong điều kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác động của một auxin mạnh (như 2,4-D) được sử dụng riêng rẽ hay kết hợp với auxin khác hay với cytokinin. Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo (Taiz và Zeiger, 2006; George et al., 2008). Sự tạo mô sẹo in vitro thuộc một trong ba quá trình: sự phản phân hóa của tế bào nhu mô (xung quanh mộc hay libe, trong vỏ hay lõi), sự phân chia của tế bào tượng tầng hay sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi để tạo mô sẹo, cần chú ý đến tuổi của mô cấy, sử dụng auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin, bản chất của loại auxin và nồng độ auxin (Hopkin, 1995; Bùi Trang Việt, 2000; George et al., 2008; Suárez và Bozhkov, 2008; Grafi et al., 2011). Quá trình hình thành mô sẹo chia ra ba giai đoạn: Giai đoạn 1: giai đoạn phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này phụ thuộc vào loại mô mẫu, tình trạng sinh lý của mẫu và điều kiện nuôi cấy. Giai đoạn 2: phân chia tế bào, sau khi hình thành, các tế bào mô sẹo phân chia nhanh tạo ra nhiều tế bào mới. Giai đoạn 3: biệt hóa, các tế bào mô sẹo đi vào giai đoạn biệt hóa, xuất hiện các con đường trao đổi chất dẫn đến sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học. 1.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO Nuôi cấy huyền phù tế bào được khởi đầu bằng cách chuyển các khối mô sẹo vào môi trường B5, MS lỏng khuấy và bổ sung thêm các dịch chiết có nguồn gốc tự nhiên như nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết malt,… Các tế bào được tách ra khỏi khối mô sẹo và phân tán vào trong môi trường lỏng, nơi chúng sẽ phân chia để tạo thành các cụm tế bào nhỏ. Nuôi cấy được duy trì qua một loạt cấy chuyền dưới những điều kiện về dinh dưỡng và thoáng khí thích hợp. Việc bổ sung thêm các dịch chiết có nguồn gốc tự nhiên như nước dừa, dịch chiết nấm men, các auxin và cytokinin ở nồng độ tối ưu sẽ thúc đẩy sự phân bào cũng như tăng tốc độ tăng trưởng (Earle và Torrey, 1965; King et al., 1973). Sự phân bố của các tế bào và các cụm tế bào phụ thuộc vào thành phần của môi trường dinh dưỡng và sự thông khí của môi trường. Theo King (1980) nuôi cấy huyền phù tế bào gần với nuôi cấy tế bào đơn. Huyền phù tế bào lý tưởng có sự phân chia tế bào tích cực, sự cân bằng tốt giữa hai quá trình tạo nhóm và tách rời tế bào, có tính đồng nhất cao về hình thái và sinh hóa. Huyền phù tế bào lý tưởng là một dịch mịn, hầu như chỉ bao gồm các tế bào có khả năng sinh phôi, cô lập hay hợp lại thành từng nhóm nhỏ chứa từ vài đến vài chục tế bào có khả năng duy trì tính toàn năng và tiến hóa thành phôi soma trên môi trường tái sinh trong một điều kiện thích hợp (Bùi Trang Việt, 2000; Assani et al., 2002; George et al., 2008). Nhu cầu về ánh sáng trong quá trình tạo huyền phù tế bào thường tương tự như quá trình hình thành mô sẹo trước đó. Sự hình 1 thành và tăng trưởng của huyền phù tế bào có thể xảy ra trong điều kiện tối hoàn toàn như ở Solanum tuberosum L. (De Vries và Bokelmann, 1986); hay Daucus carota (Fujimura và Komamine, 1979)]; và cũng có thể xảy ra trong điều kiện chiếu sáng ở cây Pyrus communis [(Mehra và Jaidka, 1985), Brassica nigra (Klimaszewska và Keller, 1986) hay ở Solanum melongena (Gleddie et al., 1983). 1.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN Bản thân mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, nó chứa đựng tất cả những thông tin di truyền đặc trưng của cơ thể từ đó nó sinh ra. Cho nên mỗi tế bào có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể mới nhờ tính toàn thế. Nuôi cấy tế bào đơn là phương pháp nuôi cấy tế bào được phân lập vô trùng trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện có kiểm soát (King, 1980). Các nguyên tắc cơ bản của nuôi cấy tế bào đơn là cô lập số lượng lớn các tế bào còn sống nguyên vẹn và nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự tăng trưởng và phát triển. Tế bào đơn có thể được thu nhận từ một loạt các mô và cơ quan của thực vật cũng như từ mô sẹo và huyền phù tế bào. Theo phương pháp truyền thống các tế bào đơn cũng được thu nhận từ nuôi cấy mô sẹo và huyền phù tế bào trên hệ thống máy lắc. Các tế bào đơn được cô lập một cách cẩn thận từ huyền phù tế bào bằng kim tiêm. Nhờ sự rung lắc của máy lắc làm cho các cụm mô sẹo tạo ra các tế bào đơn và các cụm nhỏ tế bào trong môi trường. Kết quả tạo thành huyền phù tế bào. Huyền phù tế bào được lọc để loại bỏ những khối tế bào và dịch lọc sau đó được ly tâm để thu nhận các tế bào đơn. Các mô sẹo rời thường được chọn để nuôi cấy tế bào đơn. Tế bào đơn là một đối tượng nghiên cứu sinh hóa, bệnh lý tế bào, đồng thời thông qua đó có thể thu nhận tế bào trần. Do tế bào có tính toàn năng nên từ một tế bào sinh dưỡng thực vật có thể tái sinh thành một cây hoàn chỉnh, sau khi đã tạo khối tế bào dạng mô sẹo. Nuôi cấy tế bào đơn mở ra những ứng dụng mới trong việc tạo các dòng tế bào đột biến, các dòng siêu sản xuất một sản phẩm thứ cấp nào đó và khả năng tăng tần suất đột biến di truyền ở thực vật bậc cao. Mô sẹo cũng có thể được sử dụng cho nuôi cấy tế bào đơn. 1.4. NUÔI CẤY PHÔI Phôi soma (phôi vô tính, phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ) là phôi hình thành theo con đường vô tính từ các tế bào soma (tế bào sinh dưỡng 2n), theo con đường sinh phôi soma. Phôi soma phổ biến khi nuôi cấy in vitro của các mô tách rời trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh. Trong quá trình sinh phôi soma, tế bào soma đóng vai trò sinh phôi như hợp tử và sự phát triển phôi cũng trải qua các giai đoạn như trong quá trình sinh phôi hợp tử. Sự hiện diện của phôi soma là điểm kết thúc của một chuỗi các bước bao gồm sự thu nhận các tế bào có khả năng phát sinh phôi và biệt hóa tế bào (Suárez và Bozhkov, 2008). Để tạo thành phôi soma, các tế bào thực vật đã biệt hóa cần phản biệt hóa (trừ các tế bào mô phân sinh) tạo thành tế bào gốc, phát triển thông qua giai đoạn phôi đặc trưng để tạo ra tất cả các loại tế bào của cây mới. Do đó, các tế bào tiền thân của một phôi soma là một tế bào gốc có tính toàn năng. Các đặc điểm chính để phân biệt một phôi soma với một chồi bất định là khi giải phẫu hình thái cho thấy phôi có cấu tạo rời rạc, độc lập không có liên kết mạch với các mô của mô mẹ (Haccius, 1978; Rafael, 2009). Tuy nhiên, ngay cả sau khi công bố nhiều bài báo về phôi soma, các nhà nghiên 2 cứu vẫn không hiểu được làm thế nào mà một tế bào được lập trình lại để có thẩm quyền tạo thành một phôi soma (Michael et al., 2010). Quá trình phát sinh phôi soma thường được xem là con đường trung tâm của quá trình vi nhân giống thực vật và có vai trò đặc biệt quan trọng trong các nghiên cứu về phát sinh hình thái thực vật. Quá trình thu nhận phôi soma thường bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn tạo các tế bào sinh phôi (mô sẹo và dịch huyền phù tế bào) và giai đoạn tiến hóa phôi soma từ các tế bào sinh phôi. Dưới các điều kiện xác định, các tế bào mô sẹo hay huyền phù tế bào có thể cho các sơ khởi cơ quan (sinh cơ quan) hay phôi (sinh phôi soma) dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật (Ahloowalia, 1991; Bùi Trang Việt, 2005). Sự sinh phôi từ tế bào sinh dưỡng phải trải qua hai giai đoạn: Giai đoạn 1: mô nuôi cấy trong môi trường có auxin sẽ tăng sinh nhanh, các tế bào trong môi trường này sẽ phản phân hóa và mất tính hữu cực. Giai đoạn 2: mô sẹo từ giai đoạn 1 sẽ được chuyển sang môi trường có ít hoặc không có auxin, trong môi trường này tính hữu cực và sự sinh phôi được cảm ứng với trạng thái phôi từ hình cầu đến trạng thái hình tim và trạng thái hình cá đuối. Các phân tích về quá trình phát triển phôi cho thấy sự hình thành phôi của thực vật gồm hai giai đoạn chính: sự phân đoạn và sự sinh cơ quan phôi Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh phôi: các chất điều hòa sinh trưởng, nguồn carbohydrate, nguồn nitrogen, các thành phần khoáng trong môi trường nuôi cấy, tính chất đồng bộ của tế bào. Hiện nay, những nghiên cứu về đặc tính sinh lý, sinh hóa của quá trình sinh phôi trong huyền phù tế bào còn rất ít do sự tạo phôi xảy ra không đồng bộ và tần số không cao. Gần đây, người ta đã thành công trong việc tạo phôi đồng bộ từ những cụm tế bào kích thước nhỏ với tần số cao hơn trước đây. Nuôi cấy phôi soma hiện nay được xem như một kỹ thuật mang lại nhiều hiệu quả hơn trong nhân giống cây trồng mà nhân giống vô tính theo phương pháp cổ điển có nhiều hạn chế. 1.5. SỰ BIỂU HIỆN GENE TRONG QUÁ TRÌNH PHÁT SINH PHÔI SOMA Mỗi giai đoạn của sự phát triển phôi soma liên quan đến việc kích hoạt và khử hoạt tính của các gene. Quá trình phát triển một số cây trồng là kết quả của một loạt các tương tác gene, đòi hỏi sự biểu hiện của gene khởi động (Torres-Ruiz et al.,1996). Sự cô lập các gene cụ thể quyết định sự sinh phôi, các đặc tính và vai trò của chúng trong quá trình phát triển của phôi là nền tảng cho sự hiểu biết tổng quát về quá trình điều khiển sự sinh phôi ở cấp độ phân tử (Magioli et al., 2001). Các giai đoạn và cơ chế tham gia vào quá trình biến đổi của các tế bào mô sẹo thành các tế bào phôi chưa được biết rõ. Giai đoạn cảm ứng tạo mô sẹo và chuyển hóa thành phôi được gọi chung là giai đoạn tạo phôi soma sớm (Kairong et al., 1999; Sato et al., 1995; Momiyama et al., 1995). Các nghiên cứu gần đây đã cố gắng xác định những khác biệt trong sự biểu hiện gene giữa mô sẹo và mô phôi. Duncan và cộng sự (2003) đã nhận thấy rằng các mô với hàm lượng cao protein globulin-1 (Glb1) được mã hóa bởi các chuỗi polypeptid là các mô có thẩm quyền tạo phôi. Trong mô không phải là phôi, nồng độ Glb1 rất thấp. Các protein Glb1 được tổng hợp trong phôi hợp tử ngay sau khi hoa được thụ phấn. Sự biểu hiện của gene SERK đã được phát hiện 3 trong nhóm các tế bào đang trong quá trình kéo dài và không bào hóa trong suốt giai đoạn phát triển trước khi tạo phôi hình cầu. Somleva và cộng sự (2000) cũng đã xác định được gene SERK trong giai đoạn cảm ứng tạo phôi của các tế bào đơn ở loài Dactylis glomerata. Gene HBK2, một gene mới thuộc lớp I của họ gene KNOTTED1 (tương tự như gene KNOX) gene được biểu hiện ở cây Vân sam Na Uy (Picea abies L. Karst.) từ giai đoạn tăng sinh của tiền phôi cho đến giai đoạn phát triển phôi muộn (Hjortswang et al., 2002). Các gene homeobox kiểm soát chi tiết tế bào và hình thành mô hình trong thời gian phát triển của cây. Gene HBK2 chỉ biểu hiện trong các dòng tế bào có khả năng sinh phôi mà kết quả là tạo phôi soma và không được biểu hiện trong các dòng tế bào không sinh phôi. Các nghiên cứu khác liên quan đến gene KNOX cũng cho thấy sự biểu hiện của gene này thể hiện cả trong phôi hợp tử cũng như trong phôi soma ở cây Ngô (Zea mays L.) (Zhang et al., 2002). Thực tế là sự phát triển của phôi soma dễ dàng được chia thành các giai đoạn khác biệt dựa trên đặc điểm hình thái học (phôi hình cầu, phôi hình tim, phôi hình thủy lôi và phôi lá mầm) điều này dễ tiếp cận hơn so với giai đoạn phát triển phôi soma sớm. Mặc dù có sự khác biệt cả về mặt phân tử và hình thái học giữa các mô không sinh phôi và mô sinh phôi, nhưng quá trình biến đổi từ giai đoạn này đến giai đoạn tiếp theo vẫn còn ít được biết đến. Rất khó để xác định sự khác biệt trong biểu hiện gene giữa các giai đoạn khi chính các giai đoạn đó không được xác định rõ (Tammy và Zhongmin, 2004). 1.6. QUÁ TRÌNH TÁI SINH Tái sinh là quá trình các mô đã biệt hóa phản biệt hóa và chuyển thành mô non trẻ, có khả năng phân chia tế bào và bước vào chu trình tế bào mới, hình thành cơ quan (Klerk et al., 1997). Quá trình này gồm ba giai đoạn chính, chịu sự điều hòa của nhiều yếu tố khác nhau. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI 2.1.1. Địa điểm tiến hành đề tài Các thí nghiệm trong nghiên cứu của luận án được tiến hành tại: Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa Học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam – 116 Xô Viết Nghệ Tĩnh - Đà Lạt - Lâm Đồng và Bộ môn Sinh lý Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM – 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, Tp. HCM. 2.1.2. Thời gian tiến hành đề tài Các thí nghiệm trong nghiên cứu của luận án được tiến hành từ năm 2010 đến 2015. 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1. Vật liệu dùng trong nuôi cấy Vật liệu dùng trong nghiên cứu là phát hoa của các cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) trưởng thành, khỏe mạnh, không có biểu hiện bệnh, cho hoa đẹp trồng trong nhà kính. Chọn những phát hoa có nụ hoa chưa nở. Chọn các phần trên phát hoa có mang mầm ngủ, ở khoảng vị trí thứ ba từ dưới lên, hai vị trí mầm ngủ ở phần gốc thường không tạo được chồi nên loại bỏ đi, phần phía trên mang hoa cũng không sử dụng. Phần phát hoa sử dụng làm 4 nguồn mẫu cấy ban đầu thường chỉ mang từ 4 – 6 vị trí mầm ngủ (Tanaka và Sakanishi, 1978). 2.2.2. Vật liệu dùng trong sinh trắc nghiệm Mẫu cấy ở các giai đoạn nuôi cấy khác nhau (phát sinh mô sẹo từ PLB, mô sẹo tái sinh từ tế bào đơn, phôi được dùng để trích ly các chất điều hòa sinh trưởng thực vật dùng trong sinh trắc nghiệm. 2.3. MÔI TRƯỜNG, ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN KẾT QUẢ 2.3.1. Môi trường thí nghiệm tạo mô sẹo, phôi, PLB, tế bào đơn, ra cây Môi trường căn bản được sử dụng là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962). Ngoài ra, bổ sung thêm: 30 g/l sucrose (đường Biên Hòa), 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính, riêng đối với nuôi cấy huyền phù tế bào sử dụng môi trường lỏng không bổ sung agar. Tùy từng thí nghiệm mà các chất điều hòa sinh trưởng như BA (6-benzyl adenin), NAA (α-naphthalene acetic acid), 2,4-D (2,4dichlorophenoxy acetic acid),… được sử dụng riêng lẻ hay phối hợp với nhau ở các nồng độ khác nhau. Tùy từng thí nghiệm mà dịch chiết hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên được bổ sung thêm hay không bổ sung vào môi trường nuôi cấy. 2.3.2. Thiết kế thí nghiệm nuôi cấy lỏng lắc Dung dịch huyền phù tế bào được hình thành trên hệ thống máy lắc, các bình thủy tinh có thể tích 250 ml có chứa 40 ml môi trường lỏng cấy 1,3 g mô sẹo và các bình thủy tinh có thể tích 100 ml có chứa 30 ml môi trường lỏng cấy 1 g mô sẹo được đặt lên máy lắc Orbital Shaker S01 (Stuart Scientific, Anh Quốc) ở tốc độ 100 vòng/phút. Hệ thống này được đặt dưới đèn huỳnh quang (Rạng Đông, Việt Nam), với cường độ sáng từ 2.500 – 3.000 lux). 2.3.3. Điều kiện nuôi cấy 2.3.3.1. Điều kiện nuôi cấy in vitro 10 giờ/ngày - Thời gian chiếu sáng : - Cường độ ánh sáng : 2.500 – 3.000 lux - Nhiệt độ : 25 ± 2oC : 75 – 80% - Độ ẩm trung bình 2.3.3.2. Điều kiện ở vườn ươm - Thời gian chiếu sáng: ánh sáng tự nhiên - Nhiệt độ : 18 – 25oC - Độ ẩm trung bình : 80 – 85% - Che bóng râm bằng lưới đen : 70% - Cường độ ánh sáng : 5.000 – 7.000 lux 2.3.4. Phương pháp xác định số lượng tế bào, sinh khối (trọng lượng mô sẹo, sinh khối huyền phù, phôi, PLB và cây con) Mật độ tế bào được tính bằng cách đếm số lượng tế bào. Trọng lượng của mẫu cấy huyền phù được thu nhận bằng cách lọc trong phễu lọc buchner có màng lọc millipore 0,22 µm dưới áp lực của máy hút chân không để loại bỏ nước, sau đó thu sinh khối và cân trên cân phân tích (Sartorius, Đức) để xác định trọng lượng tươi. Mô sẹo, phôi, PLB và cây con sau khi lấy ra khỏi bình nuôi cấy cũng được cân trên cân phân tích (Sartorius, Đức). 5 2.4. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.4.1. Nội dung 1: Tạo nguồn mẫu ban đầu cho nuôi cấy tế bào đơn 2.4.1.1. Qui trình tạo mẫu in vitro Nuôi cấy phát hoa để tạo chồi. 2.4.1.2. Nuôi cấy lá in vitro tạo nguồn PLB ban đầu Từ các chồi thu được tiến hành nuôi cấy lá để thu nhận PLB. 2.4.1.3. Khảo sát các môi trường nhân nhanh PLB a) Thí nghiệm 1.1. Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa Các mẫu cấy PLB có nguồn gốc từ mẫu lá hình thành từ nuôi cấy phát hoa được cấy vào môi trường MS có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 20% (v/v) nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính. b) Thí nghiệm 1.2. Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa Các mẫu cấy PLB có nguồn gốc từ mẫu lá hình thành từ nuôi cấy phát hoa được cấy vào môi trường MS có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau kết hợp với 2,0 mg/l BA, 30 g/l sucrose, 20% (v/) nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt. c) Thí nghiệm 1.3. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên khả năng tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa Các mẫu cấy PLB được cấy vào môi trường ½MS và môi trường MS có bổ sung 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 20% (v/v) nước dừa, 30 g/l sucrose, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính. 2.4.1.4. Khảo sát các môi trường nuôi cấy để tạo mô sẹo từ PLB làm nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào a) Thí nghiệm 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của mannitol đến sự tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp Các lớp mỏng tế bào cắt dọc (lTCL) PLB có kích thước 0,5 x 1,5 mm được cấy vào môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l BA, 0,01 mg/l 2,4-D, 1,0 g/l cao nấm men, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2009) kết hợp với mannitol ở nồng độ khác nhau (0; 10; 20; 30; 40 mg/l). b) Thí nghiệm 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của adenine đến sự tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp Các lTCL-PLB có kích thước 0,5 x 1,5 mm được cấy vào môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l BA, 0,01 mg/l 2,4-D, 1,0 g/l cao nấm men, 20% nước dừa, 30 g/l sucrose, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính kết hợp với adenine ở nồng độ khác nhau (0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 mg/l). 2.4.2. Nội dung 2: Nuôi cấy huyền phù tế bào thu nhận tế bào đơn 2.4.2.1. Thí nghiệm 3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng phát sinh hình thái và hình thành tế bào đơn trong huyền phù tế bào Các cụm mô sẹo được cấy vào môi trường MS lỏng có bổ sung 0,1 mg/l BA, 0,01 mg/l 2,4-D, 1,0 g/l cao nấm men, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2009). 2.4.2.2. Xác định môi trường thích hợp cho nuôi cấy tế bào đơn lan Hồ điệp 6 a) Thí nghiệm 4.1. Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc Các cụm mô sẹo có khả năng sinh phôi (trọng lượng 1,00 ± 0,01 g) được cấy vào môi trường MS bổ sung BA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/l) kết hợp với 0,01 mg/l 2,4-D; 1,0 g/l cao nấm men; kết hợp thêm với môi trường nuôi cấy protoplast gồm có 27,3 g/l mannitol; 27,3 g/l sorbitol; 18 g/l glucose (Lê Văn Hoàng, 2008. b) Thí nghiệm 4.2. Khảo sát ảnh hưởng của sucrose lên khả năng hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc Song song với thí nghiệm 4.1 chúng tôi cũng tiến hành cải tiến môi trường nuôi cấy tế bào đơn bằng cách cấy các cụm mô sẹo có khả năng sinh phôi (trọng lượng 1,00 ± 0,01 g) vào môi trường MS lỏng có bổ sung sucrose (30; 40; 50; 60; 70 g/l) kết hợp với 0,01 mg/l 2,4-D; 2,0 mg/l BA; 1,0 g/l cao nấm men; 20% nước dừa. c) Thí nghiệm 4.3. Khảo sát ảnh hưởng của sucrose kết hợp với sorbitol lên khả năng hình thành tế bào đơn lan Hồ điệp trong huyền phù tế bào lỏng lắc Các cụm mô sẹo có khả năng sinh phôi (trọng lượng 1,00 ± 0,01 g) được cấy vào môi trường MS lỏng bổ sung sucrose (30; 40 g/l) kết hợp sorbitol (0; 10; 20; 30; 40 g/l) và bổ sung thêm 0,01 mg/l 2,4-D; 2,0 mg/l BA; 1,0 g/l cao nấm men; 20% nước dừa. 2.4.2.3. Thí nghiệm 4.4. Xác định đường cong tăng trưởng của huyền phù tế bào lan Hồ điệp Các cụm mô sẹo có khả năng sinh phôi (trọng lượng 1,00 ± 0,01 g) được cấy vào ba môi trường tốt nhất cho sự tăng trưởng của tế bào đơn trong huyền phù tế bào thu được từ ba thí nghiệm nuôi cấy huyền phù tế bào ở trên là: MS lỏng có bổ sung: 2,0 mg/l BA; 0,01 mg/l 2,4-D; 27,3 g/l mannitol; 27,3 g/l sorbitol; 18 g/l glucose; 1,0 g/l cao nấm men (Nghiệm thức F3); MS lỏng có bổ sung: 2,0 mg/l BA; 0,01 mg/l 2,4-D; 40 g/l sucrose; 1,0 g/l cao nấm men; 20% nước dừa (Nghiệm thức G1); MS lỏng có bổ sung: 2,0 mg/l BA; 0,01 mg/l 2,4D; 40 g/l sucrose; 10 g/l sorbitol; 1,0 g/l cao nấm men; 20% nước dừa (Nghiệm thức H6). Thí nghiệm này nhằm để khảo sát chu kỳ tăng trưởng của huyền phù tế bào, từ đó xác định pha log của quá trình tăng trưởng của tế bào đơn lan Hồ điệp nhằm xác định thời điểm thích hợp để cấy chuyền tế bào đơn và nghiên cứu tái sinh. 2.4.3. Nội dung 3: Nghiên cứu tái sinh tế bào đơn 2.4.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể, môi trường khoáng và sucrose lên sự tái sinh a) Thí nghiệm 5.1. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể lên khả năng tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma lan Hồ điệp từ tế bào đơn Huyền phù tế bào được thu nhận ở ngày nuôi cấy thứ 16 (pha log kết quả ở thí nghiệm 4.4) sau khi loại bỏ các cụm tế bào lớn chỉ chứa các cụm nhỏ tế bào (chứa vài tế bào có nguồn gốc từ tế bào đơn) được cấy với thể tích là 1 ml/bình sử dụng pipette thủy tinh vô trùng vào môi trường MS bổ sung 0,01 mg/l 2,4-D; 2 mg/l BA; 40 g/l sucrose; 10 g/l sorbitol; 20% nước dừa; 1,0 g/l 7 than hoạt tính trên các loại giá thể: agar; bông gòn; giấy lọc + agar sau đó được nuôi cấy trong điều kiện tối. b) Thí nghiệm 5.2. Khảo sát ảnh hưởng của khoáng và sucrose lên quá trình phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn Các cụm mô sẹo có khả năng sinh phôi có nguồn gốc từ tế bào đơn (kết quả thí nghiệm 5.1) được cấy vào môi trường có thành phần khoáng thay đổi [MS0 (không sử dụng môi trường khoáng), ½MS (có hàm lượng khoáng đa lượng MS giảm đi một nửa), MS] có bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 1,0 g/l cao nấm men; 20% nước dừa; 9,0 g/l agar; 1,0 g/l than hoạt tính và sucrose ở nồng độ khác nhau (30; 40; 50; 60 g/l). 2.4.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các loại đường (đường đơn, đường đôi) lên sự phát sinh phôi a) Thí nghiệm 6.1. Khảo sát ảnh hưởng của D-glucose lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn Các mẫu cấy mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn được cấy vào môi trường MS bổ sung D-glucose (10, 20, 30, và 40 g/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 2,0 mg/l BA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính. b) Thí nghiệm 6.2. Khảo sát ảnh hưởng của D-fructose lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn Các mẫu cấy mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn được cấy vào môi trường MS bổ sung D-fructose (10, 20, 30, và 40 g/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 2,0 mg/l BA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính. c) Thí nghiệm 6.3. Khảo sát ảnh hưởng của sucrose thí nghiệm (TN) lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn Các mẫu cấy mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn được cấy vào môi trường MS bổ sung sucrose TN (10, 20, 30, và 40 g/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 2,0 mg/l BA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính. d) Thí nghiệm 6.4. Khảo sát ảnh hưởng của sucrose công nghiệp (CN) lên sự phát sinh phôi từ mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn Các mẫu cấy mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn được cấy vào môi trường MS có bổ sung sucrose CN (10, 20, 30, và 40 g/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 2,0 mg/l BA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính. 2.4.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các loại dịch chiết hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên lên sự phát sinh hình thái lan Hồ điệp a) Thí nghiệm 7.1. Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết Cà chua lên sự phát sinh hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn Các cụm mô sẹo hình thành từ tế bào đơn được cấy vào môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l BA; 1,0 mg/l NAA; 30 g/l sucrose; 5% nước dừa; 9,0 g/l agar; 1,0 g/l than hoạt tính (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007) còn dịch chiết Cà chua được bổ sung với các nồng độ khác nhau (0; 10; 20; 30; 40; 50; 60 ml/l). b) Thí nghiệm 7.2. Khảo sát ảnh hưởng của Chuối nghiền lên sự phát sinh hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn Các cụm mô sẹo hình thành từ tế bào đơn được cấy vào môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l BA; 1,0 mg/l NAA; 30 g/l sucrose; 5% nước dừa; 9,0 g/l agar; 1,0 g/l than hoạt tính (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007) còn Chuối nghiền được bổ sung với các nồng độ khác nhau (0; 10; 20; 30; 40; 50; 60 ml/l). 8 c) Thí nghiệm 7.3. Khảo sát ảnh hưởng của Khoai tây lên sự phát sinh hình thái của mô sẹo có nguồn gốc từ tế bào đơn Các cụm mô sẹo hình thành từ tế bào đơn được cấy vào môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l BA; 1,0 mg/l NAA; 30 g/l sucrose; 5% nước dừa; 9,0 g/l agar; 1,0 g/l than hoạt tính (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007), còn Khoai tây được bổ sung với các nồng độ khác nhau (0; 10; 20; 30; 40; 50; 60 ml/l). 2.4.4. Nội dung 4: Nghiên cứu chuẩn hóa cây con in vitro a) Thí nghiệm 8.1. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoáng và hàm lượng nước dừa lên khả năng sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn Các cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn được cấy vào môi trường khoáng (MS và ½MS) bổ sung nước dừa (10; 15; 20%) kết hợp với 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính. b) Thí nghiệm 8.2. Khảo sát ảnh hưởng của mật độ cây khi cấy chuyền lên khả năng sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn Các cây con 3 tháng tuổi có nguồn gốc từ tế bào đơn, chiều cao cây 3 cm được cấy vào các bình có thể tích 250 ml trên môi trường ½MS có bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 15% nước dừa (v/v); 30,0 g/l sucrose; 1,0 g/l than hoạt tính; 9,0 g/l agar; pH = 5,3 với các mật độ khác nhau (1, 2, 3, 4, 5 cây/bình). c) Thí nghiệm 8.3. Khảo sát ảnh hưởng của chiều cao cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn khi cấy chuyền lên sự sinh trưởng của chúng Các cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn 3 tháng tuổi với các chiều cao khác nhau (1, 2, 3, 4 cm/cây) được cấy chuyền sang môi trường ½MS có bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 15% nước dừa (v/v); 30,0 g/l sucrose; 1,0 g/l than hoạt tính; 9,0 g/l agar; pH = 5,3. d) Thí nghiệm 8.4. Khảo sát ảnh hưởng của tuổi cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn khi cấy chuyền lên sự sinh trưởng của chúng Các cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn có độ tuổi khác nhau (2, 3, 4 tháng tuổi) được cấy vào các bình có thể tích 250 ml (kích thước cây 3 cm, cấy 3 cây trong một bình) trên môi trường ½MS có bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 15% nước dừa (v/v); 30,0 g/l sucrose; 1,0 g/l than hoạt tính; 9,0 g/l agar; pH = 5,3. 2.4.5. Nội dung 5: Chuyển cây nuôi cấy mô ra vườn ươm, trồng thử nghiệm, theo dõi sự sinh trưởng a) Thí nghiệm 9.1. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ tưới nước đến khả năng sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn ở vườn ươm Chọn các cây con sau 3 tháng nuôi cấy in vitro có kích thước 4 – 5 cm, có 2 – 3 lá và 5 – 6 rễ chuyển ra trồng ex vitro. Tiến hành 3 chế độ tưới nước: tưới 1 lần/ngày (9h sáng), tưới 2 lần/ngày (9h sáng, 15h chiều), tưới 3 lần/ngày (9h sáng, 12h trưa, 15h chiều). b)Thí nghiệm 9.2. Khảo sát ảnh hưởng của kích thước cây con có nguồn gốc từ tế bào đơn lên khả năng sinh trưởng ở giai đoạn vườn ươm Cây con sau 3 tháng nuôi cấy in vitro với các chiều cao cây khác nhau được chuyển ra trồng ex vitro trong điều kiện vườn ươm. Tiến hành theo dõi sáu kích thước (dựa vào chiều cao cây) sau của cây in vitro ở điều kiện vườn ươm: kích thước lớn: 7,23 ± 0,81 cm; cây có kích thước vừa: 5,47 ± 0,60 cm; kích 9 thước trung bình: 4,17 ± 0,43 cm; kích thước nhỏ vừa: 2,73 ± 0,51 cm; kích thước nhỏ trung bình: 1,95 ± 0,37 cm; kích thước nhỏ nhất: 1,01 ± 0,23 cm. 2.4.6. Hình thái giải phẫu Giải phẫu hình thái phôi, PLB, rễ cây con thu nhận được trên các môi trường nuôi cấy khác nhau bằng phương pháp nhuộm kép. Phôi, PLB và cây con được hình thành trong các thí nghiệm khác nhau được giải phẫu để xem xét hình thái của mô cắt dọc, cắt ngang, nhận biết các vùng mô phân sinh chồi, lông biểu bì, cấu trúc phôi hình cầu, hình trứng, phôi dạng chuyển tiếp, phôi dạng PLB, cực ngọn, cực gốc của PLB, cấu trúc rễ. 2.4.7. Đo cường độ hô hấp Cường độ hô hấp (µmol O2/g TLT/giờ) của mẫu cấy ở các giai đoạn nuôi cấy khác nhau (phát sinh mô sẹo từ PLB, mô sẹo tái sinh từ tế bào đơn, phôi, chồi) được xác định bằng máy Oxylab Hansatech bằng điện cực oxygen ở nhiệt độ 25 ± 2oC, trong điều kiện tối, kết quả là giá trị trung bình của ba lần lặp lại. 2.4.8. Đo hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh - Ly trích và phân đoạn - Sắc ký và cô lập - Thu nhận và xác định hoạt tính bằng sinh trắc nghiệm - Sinh trắc nghiệm auxin và acid abscisic - Sinh trắc nghiệm cytokinin - Sinh trắc nghiệm gibberellin 2.4.9. Thống kê và xử lý số liệu Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại (30 bình nuôi cấy/lần). Số liệu thu nhận được xử lý bằng phần mềm MicroSoft Excel® 2010 và phần mềm Statgraphic centurion XV. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê ở mức ý nghĩa 0,05. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. NỘI DUNG 1: TẠO NGUỒN MẪU BAN ĐẦU CHO NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN 3.1.1. Kết quả nuôi cấy phát hoa và nuôi cấy lá in vitro tạo nguồn PLB ban đầu Sau 8 tuần nuôi cấy các đoạn cắt phát hoa tạo chồi ở các nốt các chồi có lá dài khoảng 2 cm, các lá này được sử dụng làm nguồn mẫu cho nuôi cấy tạo PLB. Các lá được cắt đôi theo chiều dọc (cắt tại phần gân lá), sau đó cắt ngang vuông góc với gân chính, tạo khoảng 6 mảnh lá cấy vào môi trường tạo PLB, mỗi bình cấy 2 mảnh. Sau 8 tuần nuôi cấy, tại bề mặt cắt xuất hiện các PLB, các PLB này được sử dụng làm nguồn mẫu cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.1.2. Xác định các môi trường nhân nhanh PLB có nguồn gốc từ mẫu cấy lá hình thành từ nuôi cấy phát hoa lan Hồ điệp 3.1.2.1. Thí nghiệm 1.1. Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy 10 Trọng lượng Số PLB Số chồi Số cây Tỷ lệ sống sót tươi (mg/mẫu) (PLB/mẫu) (chồi/mẫu) (cây/mẫu) (%) A0 1936,1b* 106,45b 8,72a 4,72a 100a A1 772,3d 40,38c 3,99c 1,66b 64,0c A2 2296,3a 532,24a 3,86c 1,89b 100a A3 1103,3c 23,31c 5,59b 5,52a 78,59b A4 268,2e 7,38d 1,41d 0,69c 25,72d A5 – – – – – *Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. (-): Không có số liệu hoặc mẫu bị chết. NT Kết quả thí nghiệm cho thấy sự có mặt của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy cho thấy hiệu quả rõ rệt về sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào (Madhabi et al., 2014). Nhìn chung, nghiệm thức A2 tốt nhất có tỷ lệ sống sót cao nhất (100%), mẫu cấy tăng trưởng tốt, trọng lượng tươi đạt cao nhất, số PLB tạo ra nhiều nhất. 3.1.2.2. Thí nghiệm 1.2. Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 3.2. Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy Trọng lượng Số PLB Số chồi Số cây Tỷ lệ sống tươi (mg/mẫu) (PLB/mẫu) (chồi/mẫu) (cây/mẫu) sót (%) b b c a B0 1512,6 300,14 2,72 3,59 92,21b a a b b B1 2346,4 539,14 5,72 2,86 100a b b a B2 1576,0 312,28 10,86 – 90,0b B3 269,0c 16,83c 0,62d 0,41c 16,86d B4 133,1d 13,34c 0,48d 0,14c 24,31c B5 – – – – – *Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. (-): Không có số liệu hoặc mẫu bị chết. NT Trong thí nghiệm này, nghiệm thức B1 cho sự tăng trưởng hơn hẳn so với các nghiệm thức còn lại, đây là nghiệm thức tăng sinh PLB tốt nhất. Như vậy, khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy 20% nước dừa, 2,0 mg/l BA, thì NAA ở nồng độ 0,5 mg/l (B1) thích hợp nhất cho nuôi cấy tăng sinh PLB. 3.1.2.3. Thí nghiệm 1.3. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên khả năng tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên khả năng tăng sinh PLB từ các mảnh lá có nguồn gốc từ phát hoa sau 12 tuần nuôi cấy Môi Trọng lượng Số PLB Số chồi Số cây Tỷ lệ sống trường tươi (mg/mẫu) (PLB/mẫu) (chồi/mẫu) (cây/mẫu) sót (%) C0 MS 2286,9b 584,45b 4,00c 0,59b 100a C1 ½MS 2391,0a 1169,45a – – 100a *Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. (-): Không có số liệu hoặc mẫu bị chết. NT Kết quả thí nghiệm cho thấy, hàm lượng khoáng đa lượng trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tăng sinh PLB. Lan Hồ điệp vốn là loài cây yêu cầu hàm lượng khoáng thấp, cho nên môi trường nuôi cấy có hàm lượng khoáng đa lượng giảm đi một nửa C1 (½MS bổ sung 2,0 mg/l BA, 11 0,5 mg/l NAA, 20% nước dừa, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính) thích hợp nhất cho nuôi cấy tăng sinh PLB. 3.1.3. Xác định các môi trường nuôi cấy để tạo mô sẹo từ PLB làm nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào 3.1.3.1. Thí nghiệm 2.1. Ảnh hưởng của mannitol đến sự tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy Bảng 3.4. Ảnh hưởng của mannitol đến sự tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy Nồng độ Trọng lượng Trọng lương NT mannitol (g/l) tươi (mg/mẫu) khô (mg/mẫu) b D0 0 232,9 142,5c D1 10 503,8a 137,0d D2 20 283,2b 195,9a D3 30 248,4b 169,8b D4 40 201,9b 131,4d *Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. Bảng 3.5. Cường độ hô hấp của mẫu cấy khi khảo sát ảnh hưởng của mannitol đến sự tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy Cường độ hô hấp (µ µmol O2/g TLT/giờ) D0 0 4,338b D1 10 6,586a D4 40 3,705c *Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. NT Nồng độ mannitol (g/l) Bảng 3.6. Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật của mẫu cấy khi khảo sát ảnh hưởng của mannitol đến sự tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Nồng độ Tỷ lệ (mg/l/g TLT) mannitol IAA/Zeatin (g/l) IAA Zeatin GA3 ABA D0 0 0,880b 0,337b 1,015b 1,3 1,147a D1 10 1,050b 0,280c 1,0 1,055a 2,121a c c c a D4 40 0,118 0,114 0,066 1,0 1,586 *Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. NT Khi mẫu cấy mô sẹo tăng trưởng trên môi trường bổ sung 10 g/l mannitol, tương ứng với chỉ tiêu tăng trưởng trọng lượng tươi đạt cao nhất thì cường độ hô hấp của mẫu cấy cũng cao nhất (6,586 µmol O2/g TLT/giờ). Mannitol thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với vai trò tương tự như chất tạo stress áp suất thẩm thấu và trao đổi chất trong nuôi cấy mô cây gỗ (George, 1993). Trong thí nghiệm này, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy 10 g/l mannitol (nghiệm thức D1) cho khả năng tăng trưởng và hình thành mô sẹo từ mẫu cấy lát mỏng PLB cắt dọc tốt nhất tương ứng với cường độ hô hấp của mẫu cấy cao nhất, hoạt tính zeatin, GA3 cao nhất. 3.1.3.2. Thí nghiệm 2.2. Ảnh hưởng của adenine đến sự tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi từ lTCL-PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy Bảng 3.7. Ảnh hưởng của adenine đến sự tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi từ lTCL-PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy NT E0 Nồng độ adenin (mg/l) 0,0 Trọng lượng tươi (mg/mẫu) 364,7d Trọng lượng khô (mg/mẫu) 133,7e Số PLB (PLB/mẫu) 25,33a Tỷ lệ mô sẹo (%) 7,33e 12 380,0c 18,67b 16,67d E1 1,0 799,9c E2 2,0 1081,9b 574,0b 7,67d 70,67b E3 3,0 1747,8a 769,1a 6,00d 95,33a cd d bc E4 4,0 632,7 251,4 14,00 34,67c *Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. Bảng 3.8. Cường độ hô hấp của mẫu cấy khi khảo sát ảnh hưởng của adenine đến sự tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy Cường độ hô hấp (µ µmol O2/g TLT/giờ) E0 0 4,473b E3 3 5,729a E4 4 3,558c *Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. NT Nồng độ adenine (mg/l) Bảng 3.9. Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật của mẫu cấy khi khảo sát ảnh hưởng của adenine đến sự tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cắt dọc PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Nồng độ Tỷ lệ (mg/l/g TLT) adenine IAA/Zeatin (mg/l) IAA Zeatin GA3 ABA E0 0 1,283a 0,901a 1,959a 1,085b 1,4 E3 3 1,328a 0,750b 1,777 b 0,523c 1,8 E4 4 0,904b 0,259c 0,072c 1,291a 3,5 *Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. NT Kết quả nghiên cứu cho thấy adenine ở nồng độ 3 mg/l (nghiệm thức E3) thích hợp cho việc tạo mô sẹo của lan Hồ điệp. Tóm lại, việc bổ sung adenine ở nồng độ 3 mg/l (nghiệm thức E3) thích hợp cho việc tạo mô sẹo của lan Hồ điệp tương ứng với cường độ hô hấp của mẫu cấy cao nhất, hoạt tính IAA tăng cao còn hoạt tính ABA thấp nhất. 3.2. NỘI DUNG 2: NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO THU NHẬN TẾ BÀO ĐƠN 3.2.1. Thí nghiệm 3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng phát sinh hình thái và hình thành tế bào đơn trong nuôi cấy huyền phù tế bào mô sẹo có khả năng sinh phôi sau 14 tuần nuôi cấy Bảng 3.10. Khả năng tăng sinh, phát sinh phôi, PLB và hình thành tế bào đơn trong nuôi cấy huyền phù tế bào mô sẹo sau 8 tuần nuôi cấy Trọng lượng Số cụm Số lượng Tế bào đơn tươi (mg/bình) PLB PLB a a a Lỏng lắc (Lc) 10936,0 35,30 5600,59 Rất nhiều 1963,0b 9,17b 1024,41b Rất ít Lỏng tĩnh (Lt) Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng ký tự a, b, c,… thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, c,…) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05. Kiểu nuôi cấy Bảng 3.11. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên tỷ lệ sống sót của mẫu cấy Kiểu nuôi cấy Lỏng lắc Lỏng tĩnh 0 100a 100a 2 100a 100a Tỷ lệ sống sót (%) Thời gian nuôi cấy (tuần) 4 6 8 10 100a 100a 100a 80,37a b b b 90,21 80,72 67,81 20,00b 12 50,0a – 14 – – 13
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan