Tài liệu Nghiên cứu sự phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào (jatropha curcas l.) và ứng dụng trong vi nhân giống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐỖ ĐĂNG GIÁP NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH PHÔI SOMA TỪ NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO LÁ CÂY CỌC RÀO (Jatropha curcas L.) VÀ ỨNG DỤNG TRONG VI NHÂN GIỐNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP TP. HỒ CHÍ MINH – Năm 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐỖ ĐĂNG GIÁP NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH PHÔI SOMA TỪ NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO LÁ CÂY CỌC RÀO (Jatropha curcas L.) VÀ ỨNG DỤNG TRONG VI NHÂN GIỐNG Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 62 62 01 11 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. THÁI XUÂN DU TS. NGUYỄN ĐÌNH LÂM TP. HỒ CHÍ MINH – Năm 2016 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Vi c ng d ng c ng ngh sinh học nhi n li u hó thạch sản xuất nhi n li u sinh học th y th nguồn ng ngày càng cạn ki t như hi n n y là một vấn ề áng qu n tâm. Theo các tài li u nghi n c u và thực t sử d ng ở nhiều nước tr n th giới, nhi n li u sinh học chủ y u gồm: eth nol sinh học và diesel sinh học. Eth nol sinh học có th sản xuất từ nhiều nguồn nguy n li u khác nh u như sắn, mí , ng , ậu tương, mỡ cá, còn diesel sinh học có th sản xuất từ các cây cọc rào, cọ dầu, hoàng li n mộc, văn quan, bánh dầu, dừa. Vi t N m, vi c sản xuất eth nol có nh ng hạn ch nhất nh. Di n tích ất n ng nghi p hạn hẹp n n khả năng mở rộng di n tích trồng cây nguy n li u có nhiều khó khăn, các cây nguy n li u cho sản xuất eth nol sinh học ều là nh ng cây lương thực chủ y u, cây làm th c ăn chăn nu i có li n qu n n n ninh lương thực cần phải xem xét c n trọng. Hơn n , sự phát tri n mạnh củ vi c trồng cây sắn tr n ất dốc s gây r xói mòn ất (bồi lấp cử s ng, lòng hồ ập...). Cho n n, vi c nh hướng phát tri n diesel sinh học s có nhiều thuận lợi hơn. Trong số nh ng loài cây có khả năng sản xuất diesel sinh học thì cây cọc rào ược chú ý hơn cả do dễ trồng, bi n ộ sinh thái rộng, khả năng chống ch u tốt và hàm lượng dầu trong hạt khá c o. Chương trình phát tri n nhi n li u sinh học nói chung và cây cọc rào nói ri ng nhận ược sự ủng hộ mạnh m củ Nhà nước. Ngày 20 tháng 11 năm 2007, Thủ Tướng Chính Phủ r quy t phát tri n nhi n li u sinh học nh số 177/2007/QĐ ˗ TTg về vi c ph duy t “Đề án n năm 2015, tầm nhìn n năm 2025”. Ngày 19 tháng 6 năm 2008, Bộ N ng nghi p và Phát tri n N ng th n r quy t nh số 1842/QĐ˗BNN˗LN về vi c ph duy t ề án “Nghi n c u, phát tri n và sử d ng sản ph m cây cọc rào (Jatropha curcas L.) ở Vi t N m gi i oạn 2008 ˗ 2015 và tầm nhìn n 2025”. Hi n n y, cây giống cọc rào ược dùng phát tri n vùng nguy n li u chủ y u ược gieo từ hạt và cành giâm. M i phương th c sản xuất giống ều có ưu và nhược i m nhất nh. Cây giống ược gieo từ hạt có giá thành thấp nhưng b phân ly do cọc rào là cây th phấn chéo nên khó ki m soát ược năng suất. Cây giống ược sản xuất 2 từ cành giâm cũng kh ng ảm bảo tính ồng nhất về mặt di truyền. Vì vậy, xu hướng gần ây, các nhà kho học nghi n c u nhân giống theo quy trình kỹ thuật cơ bản như s u: (1) Nhân giống in vitro một số cây ầu dòng tốt ược tuy n chọn. Nguy n li u nu i cấy b n ầu có th là ỉnh sinh trưởng, chồi ngọn, chồi nách; (2) Trồng nh ng cây cấy m r ồng ruộng; (3) Chọn lọc lại và nhân giống bằng kỹ thuật nu i cấy ph i som từ nh ng cây nu i cấy m nói tr n tăng h số nhân giống và làm hạ giá thành cây giống. Phương pháp nu i cấy lớp mỏng t bào là một phương pháp mới, nghi n c u về khả năng bi t hó củ t bào. H thống t bào lớp mỏng với ặc tính mỏng có nhiều ưu i m qu n trọng tái thi t lập chương trình cho vi c tạo ph i som . Sự thuận lợi củ phương pháp nghi n c u lớp mỏng t bào là: tần số phát sinh cơ qu n c o, th i gi n cho k t quả ngắn. N u chọn ược m i trư ng dinh dưỡng và nồng ộ chất iều hò sinh trưởng thích hợp thì hầu như 100% mẫu cấy có phản ng. Phương pháp nu i cấy lớp mỏng t bào cũng là một phương pháp mới, nghi n c u về khả năng bi t hó củ t bào. Chỉ th phân tử ược phát tri n và ng d ng từ ầu thập ni n 90 củ th kỷ XX. Sự phát tri n và ng d ng củ chỉ th phân tử xác nh và sử d ng nh ng bi n ổi củ DNA là một bước phát tri n qu n trọng nhất trong lĩnh vực di truyền chọn giống thực vật. Cho n n y, nhiều loại chỉ th phân tử ược phát tri n và ư vào sử d ng. M i loại chỉ th ều có nguy n lý, kỹ thuật, phạm vi ng d ng khác nh u và phù hợp cho từng m c ích nghi n c u khác nh u. Trong số các chỉ th phân tử, RAPD ược xem là kỹ thuật tương ối ơn giản và r tiền, ược ng d ng trong nghi n c u về tính ổn nh di truyền củ cây giống nu i cấy m . Trong phạm vi nghi n c u củ luận án, kỹ thuật RAPD ược sử d ng ánh giá ki m tr tính ổn nh di truyền củ cây con cọc rào từ quy trình vi nhân giống. Từ nh ng vấn ề n u tr n, luận án: “Nghiên cứu sự phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào (Jatropha curcas L.) và ứng dụng trong vi nhân giống” ược thực hi n nhằm ư r một phương pháp mới quả số lượng lớn cây cọc rào chất lượng c o, ổn dòng. vi nhân giống hi u nh về mặt di truyền so với cây ầu 3 2. Mục tiêu - Nghi n c u sự phát sinh ph i som từ nu i cấy lớp mỏng t bào lá cây cọc rào. - Xây dựng ược quy trình vi nhân giống hi u quả từ nu i cấy ph i som . - Đánh giá m c ộ ổn ph i som nh di truyền ở cây cọc rào vi nhân giống tạo thành bởi ược cảm ng từ m sẹo nu i cấy bằng kỹ thuật lớp mỏng t bào lá làm cơ sở cho vi c sản xuất cây giống in vitro. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Luận án nghi n c u tr n ối tượng cây cọc rào giống Ấn Độ. Giống này ược nhập nội và khảo nghi m từ ề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn giống và công nghệ trồng cây dầu mè Jatropha curcas L. để sản xuất diesel sinh học góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường thành phố” ược thực hi n do B n quản lý Khu N ng nghi p C ng ngh c o thành phố Hồ Chí Minh chủ trì từ năm 2007 - 2010. Lá củ nh ng cây cọc rào trưởng thành ược thu nhận và sử d ng làm vật li u trong nghi n c u. Phạm vi nghi n c u: + Sử d ng nh ng phương pháp nu i cấy m t bào thực vật trong xây dựng quy trình vi nhân giống cây cọc rào từ ph i som , + Sử d ng nh ng c ng c hi n ại trong ánh giá m c ộ ổn nh di truyền ở cây giống từ ph i som , + Sử d ng nh ng phương pháp giải phẫu m t bào thực vật và qu n sát hình thái trong nghi n c u phát sinh hình thái. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn a. Ý nghĩa khoa học: - Đây là một hướng nghi n c u mới trong nu i cấy in vitro tại Vi t N m tr n ối tượng cây cọc rào. - Đề tài óng góp một số k t quả nghi n c u về phát sinh hình thái, di truyền chọn giống cũng như vi nhân giống cây thân g . b. Ý nghĩa thực tiễn: - Từ quy trình vi nhân giống củ luận án có th sản xuất cây giống cọc rào ổn nh về mặt di truyền, có năng suất và hàm lượng dầu c o áp ng nhu cầu củ x hội. - Một số cá nhân, cơ qu n có nhu cầu nghi n c u có th sử d ng th m khảo quy trình c ng ngh vi nhân giống cây cọc rào từ k t quả củ luận án. 4 - Một số cơ qu n nghi n c u, do nh nghi p cần ược chuy n gi o quy trình c ng ngh vi nhân giống cây cọc rào từ k t quả củ luận án. 5. Những đóng góp mới của luận án Luận án xây dựng ược quy trình vi nhân giống từ ph i som cây cọc rào th ng qu kỹ thuật nu i cấy lớp mỏng t bào lá. Quy trình ảm bảo các m c ti u có hi u suất nhân giống c o, ổn nh di truyền, chất lượng tốt. Đây là quy trình ược xây dựng ầu ti n ở Vi t N m và có một vài i m cải ti n so với nh ng k t quả nghi n c u tr n th giới. Trong luận án này, các chất iều hò sinh trưởng thực vật ngoại sinh ược th y th bằng một số cid mine và poly mine trong một số gi i oạn củ quá trình phát sinh ph i som tr n cây cọc rào. Đây có th ược xem là tính mới củ luận án so với nh ng k t quả nghi n c u trước ây. K t quả củ luận án là tiền ề trong nh ng nghi n c u chuy n gen m c ti u vào cây cọc rào. 5 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1. Tổng quan về cây cọc rào 1.1.1. Vị trí phân loại Giới (regnum) : Plantae Ngành (divisio) : Embryophyt (thực vật có ph i) Lớp (class) : Sperm topsid (thực vật có hạt) Bộ (ordo) : M lpighi les (bộ sơ ri) Họ (f mili ) : Euphorbiaceae (thầu dầu) Chi (genus) : Jatropha (dầu mè, cọc rào) Loài (species) : Jatropha curcas Linn T n ti ng Anh : Physic nut T n ti ng Vi t : Dầu mè, cọc rào, dầu l i …[6] Tên Jatropha có nguồn gốc từ ti ng Hy Lạp, ghép từ hai ch Jatros (bác sĩ) và Trophe (th c ăn) ám chỉ công d ng làm thuốc củ cây này. Curc s là t n thư ng gọi của cây cọc rào ở Malabar, Ấn Độ. Tên thông d ng ở các nước hi n nay là Jatropha. Vi t Nam, tùy theo từng phương, cây này cũng có nh ng tên gọi khác nh u như: Cọc giậu, ậu cọc rào, cọc rào, cây li, dầu mè (Võ Văn Chi, 1999; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [6], [13]. 1.1.2. Nguồn gốc và phân bố Cọc rào (Jatropha curcas L.) có l ch sử hơn 70 tri u năm, nguồn gốc từ Mexico (nơi duy nhất có hóa thạch của cây này) và Trung Mỹ, ược ngư i Bồ Đào Nh ư n ảo Cape Verde, rồi lan truyền s ng Châu Phi, Châu Á, s u ó ược trồng ở nhiều nước và dần trở thành cây bản a ở hầu khắp các nước nhi t ới, cận nhi t ới trên toàn th giới. Hi n nay, cây cọc rào ược trồng ở nhiều nước như: Ấn Độ, Indonesia, Philippine, Trung Quốc, Vi t Nam, một số ảo ở Thái Bình Dương và Úc nhằm ph c v nhu cầu năng lượng tại ch và xuất kh u (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13]. 6 Vi t Nam, cây cọc rào n y có mặt từ rất sớm (từ trước th kỷ XIV) và cho ược trồng rải rác ở nhiều n phương: Đ c Trọng, Bắc Ninh, Lạng Sơn, Ninh Thuận, Bình Thuận, Th nh Hó , Lào C i, Đồng Nai và Thành phố Hồ Chí Minh (Nguyễn C ng Tạn, 2008) [13]. 1.1.3. Đặc điểm sinh học 1.1.3.1. Đặc điểm hình thái Cọc rào là cây b i g mềm, vỏ xám nhẵn. Cây thư ng cao khoảng 3 ˗ 5 m với tán cây rộng, vòng i tr n 50 năm. Trong iều ki n chăm sóc tốt, cây có th cao từ 8 ˗ 10 m và có th sống lâu hơn. Cành non mập và mọng nước, nhựa cây có màu trắng s a hay màu vàng nhạt. Cây rậm lá, lá to bản có màu xanh hoặc xanh nhạt, hình ovan hoặc hình trái tim, có lá ch 3 n 5 thùy. Lá sắp x p xen k nhau, 3 ˗ 5 lá ối x ng nhau xoắn ốc quanh tr c (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13]. Hoa cọc rào mọc thành c m ở ngọn h y nách lá, cây thư ng ra hoa vào mùa hè khoảng tháng 4 ˗ 9 hàng năm. Ho có kích thước nhỏ, màu vàng và có mùi thơm. Ho ực mọc ở ầu các nhánh với cuống ngắn có khuỷu, hoa cái mọc ở gi a nh ng nhánh với nh ng cuống không khuỷu, ho lưỡng tính ực thư ng nhiều hơn ho cái. Ho ực có 10 nh nh ở vòng trong dính vào phần chân i khi cũng xuất hi n. Số lượng hoa ược chia thành 2 vòng riêng bi t: 5 , 5 nh ở vòng ngoài k t lại thành bó. Hoa cái thư ng r i rạc với bầu nh y hình elip có 3 noãn với ầu núm nh y ch i (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13]. Quả mọc thành chùm và có dạng n ng, kích thước (2,5 ˗ 4,0) cm. Quả chia thành 3 ngăn có ch a hạt. Hạt chín có màu en, thu n dài, kích thước (2 × 1) cm, khối lượng khoảng 5,8 g (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13]. 1.1.3.2. Đặc điểm sinh thái Cọc rào là loài cây có khả năng thích nghi c o. Khi gặp hạn hán, cây thích ng bằng cách r ng hầu h t lá làm giảm sự thoát hơi nước. Cây có th trồng trên mọi loại ất. Cây cũng có khả năng ch u ược sương mù nhẹ nhưng chỉ trong th i gian ngắn. Cây càng già khả năng ch u ựng càng tốt. Tr i lạnh cũng làm cây r ng lá. Nhi t ộ thích hợp cho cây là 18,0 ˗ 28,5°C. Điều ki n Th i gian ra quả trong vòng 6 tháng hạt nảy mầm là khí hậu nóng m. n 1 năm và có th kh i thác trong khoảng th i gian ít nhất 40 năm (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13]. 7 Nhu cầu nước của cây cọc rào rất thấp. Cây có th tồn tại ược với lượng mư trung bình năm từ 250 n 350 mm. Vào nh ng tháng mù ng, cây cọc rào r ng lá hình thành lớp che phủ b n dưới gốc cây giúp cây hạn ch sự thoát hơi nước (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13]. Hình 1.1. Hình thái cây cọc rào a1: Cây cọc rào; b2: lá, c3: hoa, d4: quả, e5: mặt cắt hạt, f6: hạt Nguồn: 1. http://shop.theplantattraction.com/Jatropha-Curcas-Tree-Bio-Diesel-Fuel-Source-Physic-Nut-5-Seeds-S-Jatropha-Curcas-5.htm 2. http://www.alamy.com/stock-photo-physic-nut-jatropha-curcas-close-up-leaf-33120574.html 3. http://biofuelstp.eu/oil_crops.html 4. http://legalwealthcreation.com/2013/01/how-do-i-create-wealth-make-money-from-biodiesel-fuel-production-with-jatrophacurcas.html 5. http://www.seedscollector.com/1000-jatropha-curcas--physic-nut-s1000.html) 6. https://en.wikipedia.org/wiki/Jatropha_curcas 8 1.1.4. Giá trị sử dụng 1.1.4.1. Trong điều trị bệnh Trong thành phần cây cọc rào, ngư i t phân tích ược nh ng hợp chất chủ y u như terpen, fl von, coum rin, lipid, sterol, lk loid. Nhiều bộ phận củ cây này có th ch b nh như lá, vỏ cây, hạt và rễ. Rễ tr ti u vi m, cầm máu, tr ng ; dầu củ hạt có tác d ng nhuận tràng; d ch nhự trắng ti t r từ v t thương củ cành có th dùng ch b nh phong thấp, cơm; nước chi t từ lá có ch u răng, làm lành v t thương, ch tr b nh trĩ và m n phytotoxin (curcin), chất này cũng có trong hạt cọc rào, n u ược nghi n c u sâu hơn rất có th cung cấp cho chúng t một loại dược li u mới. 1.1.4.1. Cọc rào và nhiên liệu sinh học Ngoài các tác d ng tr b nh k tr n, cây cọc rào ược sự chú ý ặc bi t bởi nó là nguồn nguy n li u sản xuất nhi n li u sinh học. Hạt củ cây có ộ m (6,62%), protein (18,2%), chất béo (38%), c rbohydr te (17,3%), sợi (15,5%) và tro (4,5%). Dầu chi m 35 ˗ 40% hạt và 50 ˗ 60% nhân hạt. Trong dầu ch 21% các cid béo kh ng b o hò . Hạt ược x y và ép lấy dầu hoặc dầu ược tách bằng các dung môi. Dầu s u khi lọc ược sử d ng ng y như là nguồn nguy n li u sinh học ở dạng bổ sung, dầu cọc rào có th trộn với dầu thư ng với tỷ l l n lượng mới, n toàn, chi phí thấp, tái sinh ược, h n 20%. Đây là nguồn năng hẹn s là nguồn năng lượng th y th cho thủy i n, dầu diesel, dầu lử , khí hó lỏng (LPG), th n, củi. Nguồn năng lượng này s giúp các nước cắt giảm một khoản tiền cho năng lượng và phần nào xó i sự mất cân bằng về sử d ng năng lượng gi các vùng. Ưu i m là khói từ dầu cọc rào không có mùi và kh ng c y như khói dầu hỏ và kh ng lại mùi cho th c ăn s u khi nấu (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13]. 1.1.4.3. Bảo vệ môi trường Cọc rào là cây lâu năm, tuổi thọ củ cây là 50 năm phủ ất rất tốt, sinh trưởng phát tri n ược ở hầu h t các loại ất xấu, nghèo dinh dưỡng, ất dốc, ất trơ sỏi á. Vì vậy, cọc rào ược trồng tr n các vùng ất dốc s ược coi là cây “lấp ầy” l hổng sinh thái ở các vùng sinh thái xung y u miền núi, sớm tạo r thảm thực vật bề mặt dày ặc chống xói mòn, chống cháy, nâng c o ộ phì nhi u củ ất. Kh ng nh ng vậy, cây còn có th trồng ở nh ng vùng ất s mạc hó , b i thải kh i thác khoáng sản, góp phần 9 ph c hồi h sinh thái các vùng này, tạo r hi u ng to lớn về bảo v m i trư ng (Lele, 2006) [111]. Cọc rào hấp th nhiều CO2 trong kh ng khí. Theo tính toán sơ bộ, một cây có khả năng hấp th 100 g CO2/ngày trong kh ng khí, tính r m i cây có khả năng hấp th 30 kg CO2/năm, m i h có th hấp th 48 tấn CO2/năm, góp phần giảm thi u khí thải gây hi u ng nhà kính (Lele, 2006) [111]. 1.1.4.4. Phân bón và thức ăn gia súc S u khi ép dầu, b kh dầu có hàm lượng N 4,14 ˗ 4,78%; P2O5 0,50 ˗ 0,66%; CaO 0,60 ˗ 0,65%; MgO 0,17 ˗ 0,21% ược sử d ng làm phân h u cơ rất tốt bón cho các loại cây trồng, nhất là cho vùng sản xuất n ng nghi p h u cơ, n ng nghi p sạch, vừ góp phần sản xuất sản ph m sạch, vừ nâng c o ộ phì nhi u củ ất (Nguyễn C ng Tạn, 2008) [13]. 1.1.5. Nhân giống cây cọc rào Nh ng nghi n c u về nhân giống cây cọc rào tr n th giới và ở Vi t N m còn rất hạn ch . Cho n n y, phương pháp nhân giống cây cọc rào chủ y u vẫn theo phương pháp chuyền thống là giâm cành và gieo hạt. Các phương pháp nhân giống hi n ại áp d ng tr n cây cọc rào chỉ mới phát tri n trong khoảng hơn 10 năm trở lại ây. 1.1.5.1. Phương pháp nhân giống truyền thống N m Phi, ngư i dân trồng cây cọc rào làm rào dậu hoặc trồng cây xói mòn và bảo v chống ất. Họ thư ng sử d ng phương pháp giâm cành vì ưu i m củ phương pháp này là nh nh chóng tạo ược cây trưởng thành. Cành ược cắt từ các cây cọc rào h i trưởng thành cắm xuống ất, n u ược chăm sóc c n thận thì s u khoảng n b tháng là có ược cây ủ lớn em trồng. Cây tạo r từ phương pháp giâm cành s u khoảng 1 năm s bắt ầu cho quả. Trồng cây kh i thác dầu lâu năm thì phương pháp nhân giống bằng gieo hạt ược sử d ng nhiều hơn. Bởi nh ng nghi n c u giống bằng giâm cành có chỉ r rằng, cây tạo thành từ nhân i sống ngắn hơn, khả năng chống hạn và b nh tật kém hơn cây ược nhân giống bằng hạt. Rễ củ cây giâm cành phát tri n y u, dễ b g y ổ (Heller, 1996) [85]. Hạt trước khi em gieo ược lự chọn là nh ng hạt to, chắc, m y. Hạt ược ngâm nước qu m làm tăng tỷ l nảy mầm. S u ó, hạt ược gieo vào trong các bầu ất. Hạt s nảy mầm s u khoảng 1 tuần và cây con có th em i trồng 10 s u 45 ngày. Rễ củ cây con mọc từ hạt phát tri n, thư ng có 1 rễ cái và 4 rễ b n. Cây trồng ngoài thực s r ho s u khoảng 3 ˗ 4 năm (Heller, 1996) [82]. Nhược i m củ phương pháp nhân giống bằng hạt là chất lượng cây con kh ng ồng nhất bởi cây cọc rào là cây th phấn chéo n n gi các hạt có sự khác nh u về mặt di truyền. Chẳng hạn như xét tính trạng hàm lượng dầu trong hạt, các cây tạo r bằng gieo hạt có hàm lượng dầu trong hạt kh ng ổn nh, gi o ộng từ 4 n 40% (Jh và cộng sự, 2007) [89]. Do ó nhân giống bằng phương pháp gieo hạt kh ng th áp ng ủ nhu cầu cây giống chất lượng tốt cho vi c trồng cây tr n quy m c ng nghi p. 1.1.5.2. Phương pháp nhân giống hiện đại Các nghiên cứu trên thế giới Các phương pháp nhân giống hi n ại có ưu i m lớn là có khả năng tạo r cây giống với số lượng lớn trong khoảng th i gi n ngắn với chất lượng c o và ồng nhất. Tuy nhi n, nh ng nghi n c u này còn ít hoặc chư Suj th và Mukt (1996) [181] ược c ng bố. phát tri n kỹ thuật tái sinh cây cọc rào từ nhiều bộ phận khác nh u củ cây như phần tr hạ di p, cuống lá và lá. Sự tạo thành chồi non bất nh ược ch ng minh là hi u quả nhất ở m i trư ng MS bổ sung 0,5 mg/l BA và 1,0 mg/l IBA. Chồi non hình thành ược nu i và tạo rễ trong m i trư ng MS kh ng bổ sung chất iều hò sinh trưởng cho n khi phát tri n thành cây hoàn chỉnh ư r vư n ươm. Sự tái sinh cây con từ các mẫu cấy tr tr n lá mầm củ cây cọc rào cũng ược Wei và cộng sự (2004) nghi n c u thành c ng [216]. Các mẫu cấy tr tr n lá mầm in vitro ược nu i cấy tr n m i trư ng MS có bổ sung IBA và BA. Các chồi bất nh ược hình thành trực ti p tr n bề mặt củ mẫu cấy tr tr n lá mầm trong iều ki n k t hợp củ 0,1 mg/l IBA và 0,5 mg/l BA với tỷ l tái sinh chồi c o nhất. Trong khi ó, sự tái sinh chồi gián ti p th ng qu m sẹo cần phải có sự k t hợp 1,0 mg/l IBA và 0,5 mg/l BA. Chồi tái sinh có th hình thành rễ tr n m i trư ng MS kh ng có bổ sung các chất iều hò sinh trưởng. Suj th và cộng sự (2005) thành c ng trong nhân giống in vitro cây cọc rào bằng phương pháp tạo c m chồi [181]. Nghi n c u tạo chồi non bằng cách nu i cấy nách lá cây cọc rào tr n m i trư ng MS bổ sung 0,5 ˗ 1,0 mg/l TDZ, s u ó chuy n s ng m i trư ng MS bổ sung IBA và BA. Hi u quả tạo chồi c o 10,0 ˗ 12,3 chồi/mẫu 11 cấy. Vi c tạo chồi bất nh từ lá thu ược bằng cách nu i cấy mẫu lá tr n m i trư ng bổ sung 2,0 ˗ 10,0 mg/l BA và 1,0 mg/l IBA các chồi bất nh s tạo thành m sẹo có màu trắng x nh, ược tạo thành s u khoảng 3 tuần, s u ó chuy n s ng m i trư ng bổ sung 2,0 mg/l BA và 0,5 mg/l IBA. Cây cọc rào ược tạo dòng in vitro từ các mẫy cấy ốt thân (D tt và cộng sự, 2007) [47]. Các chồi ược tái sinh từ ốt thân tr n m i trư ng có bổ sung auxin và cytokinin riêng l hoặc k t hợp. Các chồi ược cấy chuyền s ng m i trư ng khác nhân nh nh số lượng chồi (D tt và cộng sự, 2007) hoặc cấy s ng m i trư ng chỉ có uxin hình thành rễ. Cây con s u khi chuy n r vư n ươm thì cho tỷ l sống sót c o (trên 80%) [47]. Nghi n c u tái sinh chồi từ hạt cũng ược thực hi n bởi W r k god và Sub singhe (2009) [215]. Hạt củ cây cọc rào (chư trưởng thành, trưởng thành, hoàn toàn trưởng thành) s u khi ược thu thập và khử trùng bề mặt s ược cấy vào m i trư ng MS, WPM và B5, có hoặc kh ng có bổ sung 1,0 g/l th n hoạt tính. Hạt giống trưởng thành trong m i trư ng B5 cho thấy tỷ l nảy mầm sớm và tăng trưởng tốt nhất so với các hạt chư trưởng thành và hoàn toàn trưởng thành trong m i trư ng B5, MS và WPM. Các chồi ược nảy mầm từ hạt s ược cấy vào m i trư ng B5 có ch BA, KIN, NAA ở các nồng ộ k t hợp khác nh u. Chồi ược nhân nh nh và phát tri n tr n m i trư ng B5 có bổ sung 1,0 mg/l BA, 1,0 mg/l KIN và 2,0 mg/l NAA ạt số lượng chồi c o nhất là 6,6 chồi/mẫu cấy. Bổ sung th n hoạt tính vào m i trư ng B5 kh ng có ảnh hưởng áng k n sự nảy mầm củ hạt và sự tăng trưởng củ cây con. Kaewpoo và Te˗ch to (2009) báo cáo về ảnh hưởng củ các loại mẫu cấy và chất iều hò sinh trưởng l n sự hình thành chồi cây cọc rào [91]. Các loại mẫu cấy khác nh u ( oạn thân, chồi b n, chồi ỉnh) ược nu i cấy tr n m i trư ng MS bổ sung BA và IBA ri ng l h y k t hợp với các nồng ộ khác nh u. K t quả ch ng minh rằng các chồi b n cấy tr n m i trư ng MS có bổ sung 0,5 mg/l BA k t hợp với 0,25 mg/l IBA ạt số chồi c o hơn so với các thí nghi m còn lại. Chồi tái sinh ược tạo rễ (60%) tr n m i trư ng MS bổ sung 0,5 mg/l IBA sau 30 ˗ 40 ngày nu i cấy. Phương pháp phát sinh ph i từ t bào som (som tic embryogenesis) ˗ một c ng c mạnh củ ngành c ng ngh sinh học tạo giống cây trồng - ược áp d ng thành c ng lần ầu ti n tr n cây cọc rào bởi Jh và cộng sự (2007) [89]. M sẹo có khả 12 năng phát sinh ph i ược thu nhận bằng cách nu i cấy mẫu lá tr n m i trư ng MS có bổ sung 2,0 mg/l KIN. Các khối m sẹo này ược chuy n s ng m i trư ng có bổ sung 0,5 mg/l KIN và 0,25 mg/l IBA cho thấy tần suất m sẹo phát sinh ph i hình cầu c o nhất. Ph i ược kích thích phát tri n bằng cách bổ sung th m denine sulph te trong m i trư ng nu i cấy. Các ph i trưởng thành s tạo các cây con tr n m i trư ng ½MS. Toàn bộ quá trình nhân giống kéo dài 12 ˗ 16 tuần. Quá trình phát sinh ph i som ở cây cọc rào có th trở thành một h thống lý tưởng cho nghi n c u chuy n gen trong tương l i. Ismidi nty và Esy nti (2010) trong các ph i som nghi n c u xác nh thành phần củ các cid béo ược nu i cấy bằng biore ctor với m c ích là thu nhận sinh khối ph i som [88]. Điều ki n tối ưu lưu lượng kh ng khí cũng ược nghi n c u duy trì sự tăng trưởng và tạo r thành phần cid béo ở ph i som thích hợp cho vi c tạo dầu diesel sinh học. Các mẫu tr dưới lá mầm ược nu i cấy tr n m i trư ng MS có bổ sung vit min B5; 13,5 M 2,4˗D; 4,4 M kinetin và 30 g/l sucrose cảm ng m sẹo có khả năng sinh ph i. Các m sẹo bở s u bốn tuần tuổi ược chuy n vào m i trư ng MS lỏng có bổ sung vit min B5; 6,75 µM 2,4˗D; 0,4 µM kinetin và 20 g/l sucrose khởi ầu nu i cấy tạo huyền phù các t bào ph i som . Năm 2012, Son l và cộng sự nghi n c u khả năng phát sinh ph i som từ mẫu lá mầm. M sẹo có khả năng phát sinh ph i ược hình thành tr n m i trư ng MS có bổ sung 0,2 mg/l IAA s u 3 ˗ 4 tuần nu i cấy. S u ó, ph i som hình thành tr n m i trư ng MS có bổ sung 0,2 mg/l IAA và 1,5 mg/l BAP. Đầu ti n, ph i hình cầu hình thành trong khoảng 3 ˗ 4 tuần s u khi cấy và s u ó nh ng ph i này phát tri n thành ph i dạng hình tim, hình thủy l i, lá mầm s u 6 tuần.Trong cùng m i trư ng tr n, các ph i bi t hó tạo rễ, chồi và thành cây hoàn chỉnh s u 4 ˗ 5 tuần nu i cấy. Cây ược chuy n r vư n ươm với tỷ l sống sót ạt 50% [174]. Năm 2014, Annggi Nindit và cộng sự báo cáo rằng ở cả h i dạng ph i: h i tr c và lá mầm ược lấy từ hạt cọc rào chỉ có th hình thành ph i som tr n m i trư ng MS có bổ sung 1,0 mg/l piclor m [24]. Năm 2014, M h l kshmi và cộng sự báo cáo về khả năng tái sinh thành cây con từ ộ già củ các cuống lá khác nh u. Các cuống lá ược ánh số từ ỉnh: cuống th nhất, th 2, th 3, th 4, th 5, th 6, th 7, th 8, th 9, th 10. Cuống lá ược 13 cấy tr n m i trư ng MS có bổ sung 1,0 mg/l NAA và 0,2 mg/l kinetin cho tỷ l hình thành m sẹo c o nhất ở cuống lá th nhất (83,24%), tỷ l hình thành ph i soma cao nhất ở cuống lá th nhất (35,16%) tr n m i trư ng 0,5 mg/l TDZ và 0,4 mg/l GA 3. M i trư ng MS có bổ sung 1,0 mg/l BAP, 0,5 mg/l IAA và 0,25 mg/l kinetin cho phần trăm tái sinh ph i som c o nhất (66,85%). M i trư ng MS bổ sung 0,5 mg/l TDZ, 0,1 mg/l BAP, 0,4 mg/l GA3 là m i trư ng tốt nhất kéo dài chồi. M i trư ng MS có sổ sung 0,3 mg/l NAA cho tỷ l hình thành rễ c o hơn tr n m i trư ng có bổ sung IAA h y IBA. Tỷ l sống sót củ cây con hình thành rễ trong in vitro ph thuộc vào loại mẫu cấy và nó th y ổi từ 47 ˗ 60% [115]. Các nghiên cứu ở Việt Nam Năm 2009, Đ Vũ Tuy t Trinh nghi n c u sự tạo m sẹo có khả năng phát sinh chồi và rễ từ nu i cấy lớp mỏng t bào mảnh lá cây cọc rào tr n m i trư ng WPM có bổ sung 0,1 mg/l IBA và 1,0 mg/l BA. M i trư ng WPM có bổ sung 1,0 mg/l BA thích hợp cho sự tái sinh chồi từ m sẹo trong khi NAA ở nồng ộ 1,0 mg/l có khả năng kích thích sự tạo rễ từ m sẹo rất tốt [15]. Thái Xuân Du và Đ Đăng Giáp (2010) hoàn thi n quy trình vi nhân giống bằng kỹ thuật nu i cấy lớp mỏng lá cây cọc rào. Lớp mỏng t bào cắt ng ng lá in vitro ược nu i cấy tr n m i trư ng MS bổ sung TDZ với các nồng ộ khác nh u (0,1 ˗ 0,9 mg/l). K t quả thực nghi m cho thấy, tỷ l tạo chồi bất nh tốt nhất ược ghi nhận ở m i trư ng MS bổ sung 0,5 mg/l TDZ. Sự hình thành rễ ở nh ng chồi bất nh có k t quả tốt tr n m i trư ng ½MS và bổ sung 1,0 mg/l IBA [7]. Bùi Văn Th Vinh và cộng sự (2011) nghi n c u tái sinh chồi trực ti p từ mẫu cấy lá cây cọc rào tr n m i trư ng MS có bổ sung 1,0 mg/l BA và 1,0 mg/l KIN. Các chồi này ược cấy chuyền s ng m i trư ng MS có bổ sung 0,5 mg/l GA3 và 20% nước dừ kéo dài chồi và ngăn hi n tượng r ng lá. Các chồi phát tri n tốt ược chuy n s ng m i trư ng MS½ có bổ sung 0,5 mg/l NAA cảm ng r rễ. Cây tái sinh sau 4 tháng ược chuy n r vư n ươm với tỷ l sống sót ạt tr n 80%. Đây là một quy trình hi u quả tái sinh chồi trực ti p từ mẫu cấy lá cây cọc rào, quy trình này có th ược áp d ng trong các nghi n c u chuy n gen nhằm nâng c o hàm lượng dầu trong hạt mà kh ng qu gi i oạn tạo m sẹo [17]. 14 1.1.6. Tình hình nghiên cứu và triển khai canh tác cây cọc rào trên thế giới và ở Việt Nam Tình hình nghiên cứu sử dụng cây cọc rào trên thế giới Từ năm 1991, Giáo sư ngư i Đ c, Kl use Becker, củ Trư ng Đại học Stuttg rt nhận ơn ặt hàng củ Tập oàn D imler Chrysler hợp tác với 1 h ng tư vấn củ Áo ti n hành nghi n c u cây cọc rào ở Nic r gu , làm nguy n li u sản xuất diesel sinh học. Năm 1996, Jo chim Heller nghi n c u thúc y vi c bảo tồn và sử d ng úng m c giá tr cây cọc rào tại Rome, It ly. Các nước nhi t ới, á nhi t ới ng phát tri n mạnh cây cọc rào. Thái L n hi n có 1600 h , dự ki n s tăng l n 320 nghìn h trong vài năm tới. Indonesi ặt m c ti u n năm 2010, nhi n li u sinh học áp ng 20% nhu cầu năng lượng trong ngành i n và gi o th ng vận tải. Ấn Độ xác nh cọc rào là cây cho hạt có dầu thích hợp nhất sản xuất diesel sinh học. Từ năm 2001, nhiều b ng ở Ấn Độ có chương trình khuy n khích trồng tr n quy m lớn ở các vùng ất ho ng hó , ược nhà nước h trợ giống và các nguồn vật tư ầu vào nhằm tạo vi c làm, xó ói giảm nghèo, phát tri n bền v ng x hội n ng th n Ấn Độ. Cơ qu n k hoạch củ Chính phủ Ấn Độ ặt chỉ ti u trồng 11 tri u h cây cọc rào vào năm 2012 có ủ nguy n li u sản xuất biodiesel phối trộn theo tỷ l 20%. Trong tương l i, Ấn Độ ti p t c mở rộng trồng tr n phạm vi cả nước, ư di n tích tr n 33 tri u h , trong số hơn 133 tri u h ất ng b bỏ ho ng. My nm r là nước phát tri n vi c trồng cây cọc rào với tốc ộ nh nh. Đ n 2006, di n tích trồng ở My nm r ạt 800.000 h . Trung Quốc là nước qu n tâm phát tri n mạnh cây cọc rào trong vài năm gần ây, chủ y u là 7 tỉnh gồm T Xuy n, Quý Châu, Vân N m, Phúc Ki n, Quảng Tây, Quảng Đ ng và ảo Hải N m; trong ó, ở khu tự tr Quảng Tây, n cuối năm 2007 trồng ược 15 nghìn h , dự vạn h trong vài năm tới. Các tỉnh khác có iều ki n nh ư l n khoảng 10 có k hoạch trồng tr n quy m lớn trong mấy năm tới. Theo ước tính củ Giáo sư Kl use Becker, cho th giới n 2009, cả trồng ược khoảng 5 tri u h cọc rào. Hi n n y, có khoảng 1000 nhóm nghi n c u về diesel sinh học và cọc rào. Cho n th i i m này, ây vẫn là một cây dại và mới ược ư vào ối tượng cây trồng ược khoảng tr n 15 năm, cũng có th 15 coi là cây nông ˗ lâm nghi p tr nhất trong l ch sử trồng cây nông ˗ lâm nghi p củ loài ngư i. Bahamas: Tháng mư i một năm 2013 vừ qu , c ng ty i n B h m Gr nd (GBPC) tổ ch c lễ kh i mạc cho dự án nhi n li u sinh học củ họ. Hợp tác với cảng Gr nd B h m , c ng ty phát tri n Gr nd B h m và G rden of the Groves, dự án tập trung vào tính khả thi củ vi c c nh tác cây dầu mè sản xuất nhi n li u sinh học chạy các ộng cơ tạo năng lượng i n. Botswana: Tháng tám năm 2013, Botsw n chính sách năng lượng quốc gi ặt m c ti u nhằm ph duy t n năm 2015, b o gồm một thành phần năng lượng tái tạo lớn, trong ó có cả nhi n li u sinh học. Chính phủ làm vi c với ngư i Nhật phát tri n các giống j troph có khả năng chống ch u với nh ng th y ổi th i ti t khắc nghi t trong nước. Bộ trưởng năng lượng thừ nhận rằng sự thi u chính sách này cản trở ầu tư vào nhi n li u sinh học cho n n y. Costa Rica: Cuối tháng mư i h i năm 2013, Altern tive Fuels Americ bắt ầu sản xuất thử nghi m b ph nhi n li u sinh học dầu mè. Các nguy n li u cho gi i oạn 1 s n từ trồng AFAI trong Temp te, Cost Ric . Ethiopia: Trong tháng bảy năm 2014, chính phủ Ethiopi , với sự giúp ỡ củ các nguồn tài trợ từ chính phủ N Uy, ng ầu tư 2,8 tri u sản xuất 500 tri u lít dầu diesel sinh học từ cây dầu mè m i năm. Dự án s diễn r tại 18 quận trong năm ti u b ng và ước tính s giúp hơn 14 tri u n ng dân và ngư i chăn nu i có nguồn năng lượng tái tạo sử d ng. Ghana: Vào tháng tám năm 2013, c ng ty TNHH Sm rt Oil ký k t một thỏ thuận cấp phép và các thoả thuận d ch v với QUINVITA. Thỏ thuận này cho phép truy cập n ng học ti n ti n QUINVITA bi t làm th nào gieo hạt giống Jatropha curcas tốt nhất củ QUINVITA (QVP). Niqel Ld , một c ng ty có tr sở hoạt ộng ở Moz mbique trong vi c sản xuất năng lượng tái tạo từ Jatropha curcas, cũng một thỏ thuận cấp phép và các thoả thuận d ch v với QUINVITA ký sản xuất năng lượng sinh học từ cây dầu mè. Sudan: Vào cuối năm 2012, có báo cáo rằng c ng ty củ Ả Rập S udi T l hợp tác với Nov toàn cầu củ C n d tr n một dự án mí 650.000.000$ rằng s sản 16 xuất ư ng và eth nol tại ti u b ng Sinn r, cũng như một dự án dầu mè s cung cấp dầu cho các h ng hàng kh ng Trung Đ ng. Dự án b o gồm khoảng 156.000 mẫu Anh. Hoa Kỳ: H w ii, vi c thu hoạch cây dầu mè bắt ầu vào tháng 8 năm 2013 tại n ng trư ng H w ii Pure Pl nt Oil (HIPPO) thành lập năm 2008 bởi ngư i ch và con tr i ối tác Christi n và J mes Twigg-Smith. HIPPO dầu mè ở quận Pun củ trồng tổng cộng 200 mẫu cây ảo H w ii với m c ích thu hoạch hạt và chi t xuất dầu sản xuất dầu diesel sinh học. S u 5 năm thành lập các tr ng trại, nhà Twigg-Smiths thi t lập hợp tác trực ti p với P cific Biodiesel Technologies thuộc dự án cây trồng H w ii Milit ry Biofuel Crop. Dự án b o gồm vi c phát tri n các m hình sản xuất cây dầu mè và các cây trồng khác chi s với ngư i trồng cây nhi n li u sinh học tiềm năng tr n toàn ti u b ng. Tình hình nghiên cứu sử dụng cây cọc rào ở Việt Nam Từ năm 2008, Khi Bộ N ng nghi p và Phát tri n N ng th n ph duy t ề án “Nghi n c u, phát tri n và sử d ng sản ph m cây cọc rào ở VN gi i oạn 2008 ˗ 2015 và tầm nhìn n 2025”. Theo ề án, m c ti u trong gi i oạn 2008 ˗ 2010 Vi t N m trồng thử nghi m, khảo nghi m và sản xuất ở các vùng sinh thái khác nh u ạt quy m di n tích khoảng 30.000 h . Gi i oạn 2011 ˗ 2015 và tầm nhìn mở rộng sản xuất quy m lớn theo nhu cầu th trư ng, tích gây trồng trong cả nước khoảng 300.000 h và th n 2025 từng bước n năm 2015 có th nh hướng tiềm năng ạt di n n 2025 có ạt 500.000 h … Tổng nhu cầu vốn thực hi n cho ề án ước tính khoảng 2.320 tỉ ồng trong ó nguồn vốn ngân sách Nhà nước khoảng 220 tỉ còn lại 2.100 tỉ là ầu tư củ các do nh nghi p. Từ năm 2007, Trung tâm C ng ngh sinh học (thuộc Vi n Kho học Lâm nghi p Vi t N m) curcas)”; tri n kh i ề tài “Nghiên cứu gây trồng phát triển cây cọc rào (Jatropha nn y thu thập ược 8 xuất x cọc rào (4 xuất x ở trong nước và 4 xuất x nhập từ nước ngoài) ồng th i tuy n chọn ược 29 cây trội với các ặc tính vượt trội về sinh trưởng, năng suất hạt từ 2,5 ˗ 5,0 kg/cây và hàm lượng dầu trong hạt ạt 25 ˗ 39%, nhưng theo k t quả theo dõi củ ề tài: cây mẹ có năng suất c o lại kh ng trùng với cây mẹ có hàm lượng dầu c o. Đơn v này cũng phối hợp với c ng ty GreenEnergy Vi t N m nghi n c u trồng thử nghi m tại nhiều tỉnh với tổng di n tích là 38 h . Trong các m hình thử nghi m, vi c ti n hành áp d ng các bi n pháp kỹ thuật 17 lâm sinh nhằm nâng c o năng suất 15% so với b n ầu. Trư ng Đại học Thành Tây cũng ng thực hi n ề tài “Chọn tạo giống và nghiên cứu các giải pháp kỹ thuật phát triển cây cọc rào thành vùng nguyên liệu sản xuất diesel sinh học”. Nhà trư ng ng nghi n c u khảo nghi m các xuất x giống có năng suất c o củ Vi t N m (40 ˗ 50 xuất x ) và một số nước trong khu vực như Trung Quốc, Thái L n, Ấn Độ, M l ysi , Indonesi (5 xuất x ) nhằm ánh giá năng suất và trồng thử nghi m ở một số tỉnh (vùng sinh thái khác nh u) củ Vi t N m. Trư ng và ng trồng giống ưu tuy n số 6 củ Quảng Tây và giống nhập từ C n Minh (Trung Quốc) tr n di n tích khá lớn ở Lạng Sơn. Trư ng cũng nghi n c u kỹ thuật giâm hom và nhân giống bằng phương pháp nu i cấy m . Trư ng Đại học Thành Tây xây dựng vư n giống từ gi i oạn cuối năm 2007 và hi n n y ng bắt ầu thu hạt với m c ích nhằm tạo r năng lượng sinh học mới. C ng ty Cổ phần Đầu tư và phát tri n Lũng L 5: ng thực hi n dự án “Phát triển vùng chuyên canh cây Bã đậu nam (cọc rào) và xây dựng nhà máy chế biến nhiên liệu sinh học, phụ phẩm kèm theo tại địa bàn tỉnh Quảng Trị; Năm 2008, C ng ty ti n hành nhập các giống cọc rào từ một số quốc gi trong khu vực, dưới sự hợp tác giúp ỡ củ chuy n gi Nhật Bản, hi n n y tạo ược vư n ươm di n tích tr n 1h với số lượng hàng vạn cây giống. Đơn v này hi n ng chu n b gi i oạn trồng thử nghi m. Vi n nghi n c u Dầu và cây có Dầu (Bộ C ng Thương) hi n và ng tri n kh i ề tài “Nghiên cứu khả năng thích nghi của các giống Jatropha sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất dầu biodiesel” từ năm 2007 tới n y; thu thập và khảo nghi m tập oàn gồm 41 mẫu giống trong và ngoài nước như: Úc, Pháp, Ấn Độ, Br zil, Indonesi , Lào, Thái L n, Trung Quốc tại vư n lưu gi tập oàn tại Tây Ninh. Hàm lượng dầu củ các mẫu giống từ 33 ˗ 39% ( m ộ hạt là 5%). Đ bố trí khảo nghi m giống tại vùng Đ ng N m Bộ và Duy n hải Miền Trung ồng th i ti n hành rất nhiều các nghi n c u thử nghi m về trồng trọt và kỹ thuật chăm sóc (kỹ thuật tạo tán, mật ộ trồng, ch cành cọc rào). Vi n ộ bón phân, ch ộ tưới nước, các bi n pháp kỹ thuật giâm ng hợp tác với số 1 ơn v củ Ấn Độ và Đ c trong lĩnh vực nghi n c u chọn tạo giống, kỹ thuật c nh tác và ch bi n các sản ph m từ cọc rào. 18 Ngoài nh ng ơn v k tr n còn một số ơn v khác ở các tỉnh cũng th m gi vào vi c nghi n c u, thử nghi m trồng cọc rào. Song, vấn ề qu n trọng nhất ng ược ặt r là cần phải lự chọn ược giống cho năng suất hạt và hàm lượng dầu c o, thích nghi ược với các iều ki n sinh thái khác nh u và có th gây trồng tr n di n rộng với năng suất ổn nh. 1.2. Giới thiệu về hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào (Thin cell layer – TCL) 1.2.1. Khái niệm hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) Khi nghi n c u về h thống c ch , K. Trần Th nh Vân nghĩ n khái ni m về h thống lớp mỏng t bào (Trần Th nh Vân, 2003) [198]. Với h thống này K. Trần Th nh Vân cố gắng phân tách một hoặc một vài lớp trong nh ng t bào bi t hó từ một h thống cơ qu n, m , hoặc t bào; và cố gắng chương trình hó lại chúng trong nu i cấy in vitro, trong ó “bi t hó ” là một ti u chí qu n trọng. Thực vật có nh ng ặc i m nổi bật là có th tái thi t lại chương trình bi t hó sự phát tri n củ cơ th và có khả năng xây dựng quá trình phân chi ch c năng mới (m sẹo, rễ, chồi, ph i som và ho ), mẫu phát sinh hình thái mới. Trong trư ng hợp hình thành cấu trúc mới là chồi và ph i som , cá th mới có th hình thành mà kh ng cần quá trình giảm phân và sinh sản h u tính. Sự phát tri n b n trong thực vật ược ki m soát về kh ng gi n và th i gi n trong một mạng lưới các ơn v khác nh u: cơ qu n, m , t bào. N u như có sự th y ổi trong mạng lưới này thì sự c ch ở m c cá th có th xảy r . H thống TCL b o gồm các mẫu m có kích thước nhỏ ược thu nhận từ các cơ qu n khác nh u củ thực vật (thân, rễ, lá, c m ho , chồi ho , các cơ qu n củ ho , lá, mầm, m phân sinh, ỉnh sinh trưởng hoặc ph i). Khi mẫu ược thu nhận theo chiều dọc gọi là lTCL (longitudi l TCL) và thu nhận theo chiều ng ng gọi là tTCL (tr nsverse TCL). Các mẫu lTCL (1 mm × 0,5 mm h y 1,0 mm) b o gồm chỉ một dạng m như một lớp ơn các t bào bi u bì (có th ược bóc khỏi cơ qu n) hoặc là vài lớp (3 ˗ 6) t bào bi u bì, trong khi các mẫu tTCL (0,2 ˗ 0,5 mm h y dày vài mm) b o gồm một số lượng nhỏ các t bào thuộc các dạng m khác nh u như: bi u bì, vùng thượng tầng, bó g , bó mộc và các t bào nhu m (Tr n Th nh V n và Gendy, 1996) [199]. Ngoài r , còn có h thống TCL chỉ dày vài micromete phải dùng máy vi phẫu cắt (Lee˗Stedlem mn và cộng sự, 1989), nhưng với kích thước này mẫu dễ b nhiễm khu n hoặc ch t [110].