Tài liệu Nghiên cứu tạo chế phẩm synbiotic từ vi khuẩn sinh bào tử và xylooligosaccharide

PHẠM THỊ THU PHƯƠNG BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 =======***======= PHẠM THỊ THU PHƯƠNG CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM SYNBIOTIC TỪ VI KHUẨN SINH BÀO TỬ VÀ XYLOOLIGOSACCHARIDE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC KHÓA: 2010 - 2012 HÀ NOI - 2012 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận văn này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, khích lệ, động viên của các Thầy, Cô giáo, các cán bộ nghiên cứu, bạn bè và những người thân trong gia đình. Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Thị Mai Phương, phòng Sinh hóa Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học (CNSH), Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (KH&CN), người đã hết lòng hướng dẫn, chỉ bảo em từng bước đi của đề tài, và cũng là người đã ủng hộ, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em cả về thời gian, kinh phí nghiên cứu và tinh thần để em có thể hoàn thành tốt được luận văn này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến tập thể phòng Sinh hóa Thực vật, TS. Hoàng Phương Hà cùng tập thể phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện CNSH, Viện KH&CN Việt Nam; TS. Nguyễn Thị Vân Anh cùng các thầy giáo, các anh chị, các bạn trong phòng thí nghiệm Enzyme-Protein, Trường Đại học Khoa học và Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; TS. Hồ Anh Sơn cùng tập thể bộ môn Sinh lý bệnh, Học viện Quân y đã tạo điều kiện giúp đỡ trong thời gian em đến học tập cũng như thực tập ở những nơi này. Và cuối cùng, em muốn nói lời cảm ơn chân thành với những người bạn thân thiết và các thành viên trong gia đình, đặc biệt là người mẹ và người chồng của em, đã luôn ở bên động viên khuyến khích và chia sẻ khó khăn cùng em. Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2012 Phạm Thị Thu Phương LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2012 Phạm Thị Thu Phương MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 NỘI DUNG .................................................................................................... 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 4 1.1 Thực phẩm chức năng (Functional foods) ............................................ 4 1.2 Prebiotic .................................................................................................. 5 1.2.1 Khái niệm về prebiotic........................................................................... 5 1.2.2 Oligosaccharide - chất xơ thực phẩm có hoạt tính prebiotic.................. 6 1.2.3 Xylooligosaccharide .............................................................................. 8 1.3 Probiotic ................................................................................................ 10 1.3.1 Giới thiệu về probiotic ......................................................................... 10 1.3.3 Vi khuẩn sinh bào tử Bacilllus ............................................................. 14 1.4 Synbiotic................................................................................................ 18 1.4.1 Giới thiệu về synbiotic ......................................................................... 18 1.4.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của synbiotic ................................. 19 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 23 2.1 Nguyên liệu .......................................................................................... 23 2.1.1 Chủng vi sinh vật ................................................................................. 23 2.1.2 Mẫu động vật....................................................................................... 23 2.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 23 2.1.4 Thiết bị chính....................................................................................... 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 24 2.2.1 Đo mức độ tăng trưởng tế bào ............................................................. 24 2.2.2 Định lượng xylose và XOS ................................................................... 24 2.2.3 Sắc ký lớp mỏng định tính đường XOS ................................................ 25 2.2.4 Định lượng axit béo bằng sắc ký khí ................................................... 25 2.2.5 Đánh giá độc tính cấp ......................................................................... 26 2.2.6 Đếm quần thể vi khuẩn ........................................................................ 26 2.2.7 Nhận dạng vi khuẩn B. subtilis HU58 trong phân chuột bằng đọc trình tự gen đoạn mã hoá ARNr 16S ..................................................................... 27 2.2.8 Đánh giá thể trạng chuột và một số thông số hóa sinh, miễn dịch trong máu chuột .................................................................................................... 28 2.2.9 Đánh giá tác dụng của chế phẩm synbiotic lên hội chứng rối loạn đại tiện ............................................................................................................... 31 2.3 Phương pháp xử lý số liệu .................................................................... 34 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 35 3.1 Tuyển chọn chủng probiotic có khả năng đồng hóa XOS .................. 35 3.1.1 Khả năng sinh trưởng của Bacillus trong môi trường có chứa XOS .... 36 3.1.2 Khả năng đồng hóa XOS của Bacillus subtilis HU58 .......................... 37 3.1.3 Khả năng hình thành butyrate của Bacillus subtilis HU58 khi đồng hóa XOS .............................................................................................................. 39 3.2 Tìm điều kiện thích hợp cho nuôi cấy sinh khối B. subtilis HU58...... 41 3.2.1 Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của B. subtilis HU58................ 41 3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của B. subtilis HU58 ........ 42 3.2.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của B. subtilis HU58 ........................................................................................................... 43 3.2.4 Ảnh hưởng của sự thông khí đến sự sinh trưởng của B. subtilis HU58 44 3.2.5 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự sinh trưởng của B. subtilis HU58 ........................................................................................................... 44 3.2.6 Quy trình lên men B. subtilis HU58 dạng bào tử quy mô 1 lít/mẻ ........ 46 3.3 Tạo chế phẩm synbiotic P&P ............................................................... 47 3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học chế phẩm synbiotic ................................ 47 3.4.1 Đánh giá độc tính cấp ......................................................................... 48 3.4.2 Đánh giá thể trạng chuột sau khi uống các chế phẩm .......................... 51 3.4.3 Đánh giá khả năng tăng số lượng quần thể vi khuẩn trong ruột .......... 52 3.4.4 Tác dụng của chế phẩm synbiotic lên một số thông số hóa sinh, miễn dịch trong máu chuột.................................................................................... 56 3.4.5 Tác dụng của chế phẩm synbiotic lên hội chứng rối loạn đại tiện........ 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 67 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .................................... 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 69 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CFU: Colony forming unit FOS: Fructooligosaccharide GOS: Galactooligosaccharide NIH: Viện Y học Quốc gia Hoa Kỳ (National Institute of Health) OS: Oligosaccharide PBS: Phosphate-buffered saline SD: Standard deviation TLC: Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) TPCN: Thực phẩm chức năng XOS: Xylooligosaccharide WHO: Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số sản phẩm probiotic thương mại chứa bào tử Bacillus Bảng 3.1: Hàm lượng axit butyric trong môi trường nuôi B. subtilis HU58 tại thời điểm ban đầu (0 giờ) Bảng 3.2: Hàm lượng axit butyric trong môi trường nuôi B. subtilis HU58 sau 24 giờ Bảng 3.3: Tỉ lệ hình thành bào tử B. subtilis HU58 ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau. Bảng 3.4: Số lượng chuột sống sau khi uống liều duy nhất chế phẩm synbiotic P&P Bảng 3.5: Số lượng tế bào máu ngoại vi trong máu chuột Bảng 3.6: Nồng độ ure, creatinin, SGOT và SGPT trong máu chuột Bảng 3.7: Thể trạng chuột sau 1 tháng khi uống các chế phẩm nghiên cứu Bảng 3.8: Số lượng bào tử vi khuẩn B. subtilis HU58 trong phân chuột sau khi cho uống chế phẩm probiotics B. subtilis HU58 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của các chế phẩm nghiên cứu lên số lượng tế bào Bảng 3.10: Ảnh hưởng của các chế phẩm nghiên cứu lên hàm lượng IgA Bảng 3.11: Số lượng phân bình thường của các nhóm chuột Bảng 3.13: Tỉ lệ nước trong phân nát của các nhóm chuột Bảng 3.12: Số lượng phân nát của các nhóm chuột Bảng 3.14: Trọng lượng ruột non, già có chứa phân của các nhóm chuột Bảng 3.15: Trọng lượng ruột non, già không chứa phân của các nhóm chuột Bảng 3.16: Thể tích ruột non, già của các nhóm chuột DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của XOS Hình 1.2: Chu kỳ sống của quá trình tạo bào tử Hình 1.3: Cấu trúc bào tử Bacillus dưới kính hiển vi, dưới kính hiển vi TEM và dưới kính hiển vi AFM Hình 1.4: Tác động của probiotic và prebiotic lên hệ thống miễn dịch Hình 2.1: Ruột non, già chứa phân và không chứa phân Hình 2.2: Theo dõi số lượng và chất lượng phân chuột sau uống dầu castor Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc các vi khuẩn Bacillus Hình 3.2: Khả năng phát triển của vi khuẩn Bacillus trong môi trường LB có chứa 0,25% XOS Hình 3.3: Hàm lượng đường XOS còn lại trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn B. subtilis HU58 Hình 3.4: Sắc ký đồ TLC môi trường nuôi cấy B. subtilis HU58 có chứa XOS Hình 3.5: Hàm lượng butyrate trong môi trường nuôi cấy B. subtilis HU58 có chứa XOS Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của B. subtilis HU58 Hình 3.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của B. subtilis HU58 Hình 3.8: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của B. subtilis HU58 Hình 3.9: Ảnh hưởng của sự thông khí đến sinh trưởng của B. subtilis HU58 Hình 3.10: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự sinh trưởng của B. subtilis HU58 Hình 3.11: Khả năng hình thành bào tử B. subtilis HU58 ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau Hình 3.12: Quy trình lên men B. subtilis HU58 ở quy mô phòng thí nghiệm Hình 3.13: Hình ảnh khuẩn lạc B. subtilis HU58 trên môi trường LB Hình 3.14: Hình ảnh bào tử B. subtilis HU58 trên môi trường LB Hình 3.15: Chế phẩm prebiotic XOS; probiotic B. subtilis HU58; synbiotic P&P Hình 3.16: Hình ảnh vi thể cấu trúc thận Hình 3.17: Hình ảnh vi thể cấu trúc gan Hình 3.18: Điện di kiểm tra trên gel agarose sản phẩm ADN tổng số của chủng vi khuẩn B. subtilis HU58 Hình 3.19: Điện di trên gel agarose các sản phẩm nhân bản đoạn gen ARNr 16S của chủng vi khuẩn B. subtilis HU58 Hình 3.20: Sự thay đổi số lượng bào tử vi khuẩn B. subtilis HU58 Hình 3.21: Ảnh hưởng của các chế phẩm chức nghiên cứu lên khả năng thực bào của macrophage chuột Hình 3.22: Ảnh hưởng của các chế phẩm nghiên cứu lên hàm lượng INF-  Hình 3.23. Mô hình rối loạn đại tiện cho nghiên cứu thử nghiệm tác dụng của probiotic, prebiotic và synbiotic Hình 3.24: Số lượng phân nát ở các nhóm chuột nghiên cứu Hình 3.25: Tỉ lệ nước trong phân nát ở các nhóm chuột nghiên cứu 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Thực phẩm bổ sung như probiotic và prebiotic là một dòng sản phẩm của thực phẩm chức năng (TPCN). Theo định nghĩa của Viện Y học Hoa Kỳ (National Institute of Health, NIH) thì TPCN (functional foods) “là những thực phẩm chứa các chất có khả năng tốt cho sức khỏe. Các thực phẩm này bao gồm bất cứ thực phẩm chế biến hoặc thành phần nào có thể cung cấp lợi ích cho sức khỏe ngoài giá trị dinh dưỡng cố hữu của thực phẩm". Theo định nghĩa này, các sản phẩm chất xơ (prebiotic) và probiotic là một trong những sản phẩm TPCN tiêu biểu. Trên thế giới, phần lớn các sản phẩm thực phẩm bổ sung được sản xuất ở dạng probiotic hay prebiotic (chất xơ hòa tan) riêng rẽ. Việc kết hợp hai chất này trong cùng một sản phẩm sẽ có giá trị sử dụng cao hơn nhiều và tiện lợi cho người tiêu dùng được gọi là synbiotic. Sự kết hợp của probiotic và prebiotic làm tăng khả năng sống sót của các vi khuẩn probiotic đồng thời làm giảm số lượng quần thể vi khuẩn có hại. Không có thức ăn prebiotic, vi khuẩn trong đường ruột không thể chịu đựng tốt điều kiện oxy, pH thấp, nhiệt độ trong hệ tiêu hóa. Khi được cung cấp nguồn prebiotic, vi khuẩn probiotic không phải cạnh tranh với các vi khuẩn khác về nguồn cơ chất đặc hiệu vốn không có nhiều trong ruột. Do đó, sự kết hợp của probiotic và prebiotic thành synbiotic là công thức lý tưởng. Các quốc gia Âu, Mỹ đang xem synbiotic là đột phá mới trong ngành dinh dưỡng dành cho trẻ nhỏ, bởi nó tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể và đặc biệt, giúp bảo vệ trẻ ngay từ bên trong. Synbiotic đã được sử dụng trong thực phẩm và được chứng minh mang lại những lợi ích cho sức khỏe trẻ em ở nhiều nước tiên tiến trên thế giới. Nghiên cứu về tác dụng của synbiotic tại Việt Nam trên sản phẩm sữa Friso Gold mới với synbiotic là sự kết hợp tối 2 ưu của các prebiotic oligosaccharide là galactooligosaccharide (GOS) và fructooligosaccharide (FOS) với vi khuẩn probiotic Bifidobacterium BB-12® và L. casei theo tỉ lệ 9/1 đã khẳng định khả năng tăng cường vi khuẩn có lợi cho cơ thể trẻ, giúp trẻ phòng chống bệnh tật thông qua việc làm tăng một lượng đáng kể vi khuẩn Bifidobacterium có lợi trong đường ruột của trẻ với tỉ lệ 83% so với 3% ở trẻ sử dụng sữa công thức không chứa synbiotic. Hiện nay, thị trường trong nước mới chỉ có bán các loại thực phẩm bổ sung probiotic hay chất xơ prebiotic ở dạng riêng rẽ như Bio King (probiotic) và Vi-tan 1 (chất xơ hòa tan). Chưa có công ty hay nhóm nghiên cứu nào sản xuất và thương mại loại sản phẩm kết hợp mới này. Vì thế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này để tạo ra một sản phẩm synbiotic mới có tác dụng sinh học trên động vật thực nghiệm có chứa xylooligosaccharides (XOS) và bào tử probiotic kết hợp trong cùng một sản phẩm với mục đích tăng hiệu quả tác dụng, độ bền và giá trị sử dụng. Sản phẩm synbiotic thu được có tính mới và độc đáo ở chỗ sử dụng probiotic dạng bào tử nên có có độ bền cao. Ngoài ra prebiotic XOS trong sản phẩm mới này là một loại chất xơ hòa tan dạng oligosaccharide có rất nhiều ưu việt so với các oligosaccharide khác đang được sử dụng như GOS hay FOS ở chỗ nó có tính bền và được đồng hóa bởi nhiều loại vi khuẩn probiotic. 2. Mục đích nghiên cứu Tạo được chế phẩm synbiotic là một loại thực phẩm bổ sung từ vi khuẩn sinh bào tử và đường xylooligosacharide (XOS). 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Tuyển chọn chủng vi khuẩn probiotic sinh bào tử có khả năng đồng hóa XOS. - Tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn đã lựa chọn ở quy mô phòng thí nghiệm. 3 - Tạo được chế phẩm synbiotic mới từ bào tử vi khuẩn đã lựa chọn và XOS. - Đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm synbiotic trên mô hình in vivo trên chuột. 4 NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thực phẩm chức năng (Functional foods) Những thập kỷ gần đây, người tiêu dùng phương Tây có xu hướng dùng thực phẩm không chỉ để chống đói mà để cung cấp những yếu tố dinh dưỡng thiết yếu và cao hơn nữa là có thể đồng thời phòng chống bệnh tật [38]. Chính vì vậy, “Thực phẩm chức năng” đã ra đời để phục vụ các nhu cầu trên và ngày càng phát triển vì con người ngày càng muốn nâng cao sức khỏe, phòng chống bệnh tật hơn là chữa bệnh để tránh phải trả chi phí y tế rất đắt đỏ [51]. Khái niệm “Thực phẩm chức năng” lần đầu tiên được đề cập vào những năm 1980 ở Nhật Bản cho thực phẩm chứa những thành phần đặc biệt đem lại tác dụng sinh lý tốt, gọi tắt là FOSHU. Đến nay, mặc dù chưa có một định nghĩa thống nhất quốc tế, nhưng TPCN được sử dụng rất rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới. Gần đây các định nghĩa về TPCN được đưa ra nhiều hơn và có xu hướng gần thống nhất. Theo định nghĩa của Viện Y học Hoa Kỳ thì TPCN (functional foods) “là những thực phẩm chứa các chất có khả năng tốt cho sức khỏe. Các thực phẩm này bao gồm bất cứ thực phẩm chế biến hoặc thành phần nào có thể cung cấp lợi ích cho sức khỏe ngoài giá trị dinh dưỡng cố hữu của thực phẩm”. Dựa trên mức độ tin cậy của các bằng chứng khoa học từ nhiều đến ít, Hội đồng Khoa học và Sức khỏe Mỹ đã xếp loại các TPCN theo mức độ có bằng chứng tin cậy từ cao đến thấp (tin cậy nhất, tin cậy cao, tin cậy vừa, chưa đủ tin cậy cần nghiên cứu thêm, và còn nhiều tranh cãi). Trong đó, các sản phẩm chế biến từ yến mạch, gạo, đậu nành có giàu chất xơ thuộc nhóm có độ tin cậy nhất, còn các probiotic bào tử vi khuẩn có độ tin cậy vừa. Từ vài thập kỷ qua, TPCN phát triển nhanh chóng trên toàn thế giới. Thị trường của TPCN là một trong những thị trường tăng trưởng nhanh nhất, lên 5 tới 10% đối với nhiều quốc gia. Thị trường thế giới năm 2007 đạt 70 tỷ USD, năm 2010 đạt 176,7 tỷ USD, dự kiến sẽ đạt 298 tỷ USD vào năm 2014. Châu Âu năm 2007 đạt 15 tỷ USD, tăng bình quân 16% trong một năm, dự kiến sẽ tăng 22,8% vào năm 2014. TPCN có thị trường lớn và ngày càng mở rộng, đồng thời số vốn đầu tư nghiên cứu lại thấp hơn nhiều so với dược phẩm trong khi lợi nhuận lớn và nhiều hứa hẹn nên đã thu hút sự nghiên cứu đầu tư của các công ty Dược phẩm nổi tiếng như Novartis Consumer Health, Glaxo SmithKline, Johnson & Johnson or Abbott Laboratories, Dannon [28] … TPCN có nhiều tác dụng khác nhau tùy thuộc vào thành phần và cơ chế tác dụng của nguyên liệu. Phân loại TPCN theo tác dụng có thể kể đến TPCN chống lão hóa, TPCN duy trì dinh dưỡng (để giảm cân, tăng cân), TPCN tạo sức khỏe sung mãn, TPCN tăng sức đề kháng giảm nguy cơ bệnh tật, TPCN hỗ trợ phòng và điều trị bệnh tật, TPCN làm đẹp… Các TPCN có khả năng chống lão hóa thường cung cấp các chất chống oxy hóa, chất chống các gốc tự do, các hormone, các chất chống stress, chống thoái hóa, bổ sung Vitamin, bổ sung khoáng chất… Các TPCN tạo sức khỏe sung mãn thường bao gồm các vitamin, khoáng chất, axitamin, hoạt chất sinh học, những chất cần thiết cho cấu tạo nên các cơ quan tổ chức cơ thể và cần thiết cho quá trình chuyển hóa vật chất trong cơ thể. Còn các TPCN tăng sức đề kháng thường chứa hoạt chất có khả năng kích thích miễn dịch thông qua hoạt hóa các tế bào miễn dịch và tăng sinh interferon [52]. Thực phẩm bổ sung như probiotic, prebiotic hay synbiotic là một dòng sản phẩm của TPCN và là dòng sản phẩm có khả năng thương mại lớn nhất của TPCN. 1.2 Prebiotic 1.2.1 Khái niệm về prebiotic "Prebiotic là một thành phần lên men chọn lọc, cho phép tạo ra những thay đổi cụ thể, cả về thành phần lẫn hoạt động của hệ vi sinh vật trong hệ tiêu hóa nhờ đó mang lại cho vật chủ tình trạng sức khỏe lành mạnh" [22]. 6 Các prebiotic không bị tiêu hóa và hấp thu ở dạ dày và ruột non, do cơ thể người không sinh ra các enzyme cần thiết để chuyển hóa chúng. Thay vào đó, chúng được vận chuyển đến ruột già và được tiêu thụ bởi vi khuẩn có lợi sống tại đây. Khi đã vào đến ruột già, các prebiotic phát huy tác dụng kích thích sự gia tăng về số lượng cũng như hoạt động của các vi khuẩn có lợi, ví dụ như các vi khuẩn loại Bifidobacterium hay Lactobacillus, đồng thời làm giảm số lượng của các chủng vi khuẩn kị khí tùy ý, có hại như Escherichia coli và Clostridia [34]. 1.2.2 Oligosaccharide - chất xơ thực phẩm có hoạt tính prebiotic 1.2.2.1 Cấu tạo và phân loại oligosaccharide Oligosaccharide (OS) có từ 2 đến 10 gốc monosaccharide, chúng liên kết với nhau bởi các liên kết glycoside. Phụ thuộc vào số phân tử monosaccharide trong phân tử mà người ta chia OS thành disaccharide, trisaccharide, tetrasaccharide... Tùy theo thành phần của các gốc monosaccharide, OS được chia thành homooligosaccharide (chứa các monomer cùng loại) và heteroligosaccharide (chứa các monomer khác loại). Theo cấu tạo của phân tử OS có thể chia ra thành nhóm mạch thẳng và nhóm mạch phân nhánh. 1.2.2.2 Tính chất chung của oligosaccharide Các tính chất chung của oligosaccharide đã được Hasm [23] tổng kết như sau: - Giảm độ ngọt của cacbonhydrate. - Không bị phân hủy bởi các enzyme trong dạ dày và ruột non. - Được sử dụng bởi nhóm vi khuẩn probiotic. - Làm thay đổi độ nhớt và điểm đông đặc của thực phẩm. - Tác động đến khả năng nhũ hóa, khả năng tạo gel và khả năng gắn kết của gel. 7 - Có khả năng ổn định hệ vi khuẩn. - Có thể thay thế chất màu thực phẩm. - Đóng vai trò như chất giữ nước và kiểm soát độ ẩm. - Có giá trị calo thấp. - Đóng vai trò như tác nhân chống lại bệnh sâu răng. 1.2.2.3 Hoạt tính prebiotic của các oligosaccharide Trong những năm gần đây, nhiều OS được nghiên cứu và sử dụng trong vai trò là một prebiotic. Điển hình có galactooligosaccharide (GOS), fructooligosaccharide (FOS). * Galactooligosaccharide (GOS) Trong số các chất xơ thực phẩm khác nhau được thử nghiệm hoạt tính prebiotic thì galactooligosaccharide rất được chú ý. GOS có chứa 3-10 phân tử bao gồm đường đơn galactose và cuối chuỗi là đường glucose. Đây là hợp chất có trong sữa người và gắn liền với sự cải thiện đại tràng của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ [7]. Sự có mặt của GOS làm tăng số lượng Bifidobacterium và Lactobacillus trong đại tràng [54]. * Fructooligosaccharide (FOS) FOS cũng là một nhóm điển hình có hoạt tính prebiotic đang có nhiều trên thị trường. FOS là một chuỗi oligosaccharit ngắn từ 2-7 đơn vị bao gồm D-fructose và D-glucose. FOS không bị tiêu hóa ở dạ dày trên và khi vào đến đại tràng nó vẫn còn nguyên vẹn [4]. Ở đại tràng, FOS đặc biệt kích thích sự phát triển của Lactobacillus và Bifidobacterium [67], đồng thời giúp cơ thể chống lại sự tấn công bởi Salmonella [66]. FOS đã được công nhận là an toàn (thuộc nhóm GRAS-Generally recognized as safe) [63] và đã được thêm vào các sản phẩm sữa chua, đồ ăn trẻ sơ sinh, các thực phẩm bổ sung và các sản phẩm thực phẩm khác. 8 1.2.3 Xylooligosaccharide Xylooligosaccharide (XOS) là các olygomer của đường xylose. Hiện nay thị trường thương mại cho sản phẩm này đang tăng lên do tính chất prebiotic đặc biệt của nó. XOS là nguồn cơ chất thích hợp cho các vi khuẩn Bifidobacterium và Lactobacillus, là những chủng vi khuẩn phổ biến trong đường ruột của người.. XOS có tính chất hóa lý khá đặc biệt so với các OS khác như là độ ngọt thấp, bền vững trong điều kiện pH và nhiệt độ rộng, sở hữu các đặc tính cảm quan thích hợp để kết hợp vào thực phẩm [3]. Vì thế, XOS có nhiều ưu việt hơn các OS khác ở cả khía cạnh lợi ích sức khoẻ và các đặc tính liên quan đến công nghệ. Nhu cầu về TPCN tăng lên đang mở ra một thị trường đầy triển vọng cho XOS. Các số liệu nghiên cứu thu được đã khẳng định XOS có vai trò sinh học thông qua việc: i) ức chế hoạt động của các vi khuẩn gây bệnh đường ruột do sinh ra các axit béo mạch ngắn như axit butyric; ii) làm tăng khả năng hấp thu khoáng của cơ thể [40]. Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của XOS 1.2.4.1 Tính chất sinh học của XOS * Điều hòa miễn dịch Ảnh hưởng của XOS lên hệ miễn dịch đã được phát hiện với các arabino(glucurono) xylan tách ra từ một số thực vật như Echinacea purpurea, Eupatorium perfoliatum và Sabal serrulata. XOS ở dạng acetyl hóa như Oacetyl hóa và de-acetyl hóa có tác dụng kích thích hoạt tính phân bào Tmitogen của các tế bào tuyến ức chuột [3]. 9 * Chống ung thư Các xylan có chứa axit glucuronic đã được phát hiện có khả năng ức chế đáng kể sự tăng trưởng của sarcoma-180 và các khối u khác [3]. Ando và các cộng sự [5] đã phát hiện thấy phân đoạn gồm xylose, XOS và lignin tan trong nước làm giảm đáng kể khả năng sống của bạch cầu nguyên bào lympho tạo lympho bào cấp tính (ALL)-Jurkat và MOLT-4. Đây cũng là phát hiện đầu tiên chứng minh tác động gây độc trên tế bào ung thư của XOS thu được từ các sản phẩm tự nhiên. Nghiên cứu của Hsu và các cộng sự [27] về XOS và FOS trên chuột Sprague-Dawley đực được xử lý DMH (1,2-dimethylhydrazine) cho thấy cả XOS và FOS đã làm giảm đáng kể số lượng tiểu nang bất thường trong ruột kết và XOS có hiệu quả tác dụng cao hơn FOS. * Kháng vi khuẩn Fooks và Gibson [14] đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum 0407 và Lactobacillus pentosus 905 kết hợp với FOS, inulin, XOS và các hỗn hợp của inulin, FOS hay FOS kết hợp XOS có hiệu quả ức chế sự phát triển của Escherichia coli và Salmonella enteritidis. XOS có tính axit được sản xuất từ xylan gỗ bạch dương [3] đã được thử nghiệm tính kháng các vi khuẩn hiếu khí Gram dương và Gram âm, cũng như kháng vi khuẩn Helicobacter pylori. Các chất này có hoạt tính kháng Bacillus cereus ở mức độ trung bình, trong khi axit aldopentauronic, một OS có tính axit khác, lại có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus. Tuy nhiên, các nghiên cứu đều không phát hiện thấy ảnh hưởng của XOS lên các vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa và Proteus mirabilis. * Các tác dụng sinh học khác Khi cho gà con ăn thức ăn chứa XOS, Graham và cộng sự [19] đã phát hiện thấy XOS không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của gà con, làm tăng 10 chiều dài ruột mà còn làm giảm nồng độ axit lactic trong hồi tràng và tăng nồng độ axit butyric trong manh tràng, tăng nồng độ tổng số axit béo không no mạch ngắn. Nghiên cứu của Hsu và cộng sự [27] trên cá chép Cyprinidae carassius gibelio đã chứng tỏ XOS có thể sử dụng như là một chất phụ gia thức ăn cho cá. Các ảnh hưởng khác đối với XOS có thể kể đến là hoạt tính chống oxi hóa (có được do sinh ra các chất thay thế phenolic), các tác dụng liên quan đến máu và da, chống dị ứng, chống nhiễm trùng và chống viêm, hoạt động điều hòa miễn dịch, chống hội chứng tăng lipid (hyperlipidemic) [3]. 1.3 Probiotic 1.3.1 Giới thiệu về probiotic 1.3.1.1 Khái niệm về probiotic Thuật ngữ probiotic có nghĩa là "cho cuộc sống," có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp. Thuật ngữ này lần đầu tiên được Lilly và Stillwell sử dụng [33] vào năm 1965 để mô tả "các chất tiết ra bởi một vi sinh vật kích thích sự tăng trưởng của cơ thể khác". Năm 1974 [44], Parker lần đầu tiên đề nghị sử dụng thuật ngữ probiotic với ý nghĩa như hiện nay, hay còn gọi là "vi khuẩn thân thiện-friendly bacteria". Những năm gần đây, probiotic được đánh giá cao và nghiên cứu sâu nên cũng xuất hiện nhiều định nghĩa về chúng. Có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong giới khoa học: (i) theo Fuller [16], probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO) [70], probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”.