Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và sắc ký dấu vân tay của thân rễ hai loài củ gấu (cyperus rotundus l.) và củ gấu biển (cyperus stoloniferus retz.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN MINH CHÂU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ SẮC KÝ DẤU VÂN TAY CỦA THÂN RỄ HAI LOÀI: CỦ GẤU (CYPERUS ROTUNDUS L.) VÀ CỦ GẤU BIỂN (CYPERUS STOLONIFERUS RETZ.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN MINH CHÂU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ SẮC KÝ DẤU VÂN TAY CỦA THÂN RỄ HAI LOÀI: CỦ GẤU (CYPERUS ROTUNDUS L.) VÀ CỦ GẤU BIỂN (CYPERUS STOLONIFERUS RETZ.) Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số: 62440114 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Trần Thƣợng Quảng 2. TS. Nguyễn Tiến Đạt Hà Nội – 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày Tập thể hƣớng dẫn TS. Trần Thƣợng Quảng TS.Nguyễn Tiến Đạt tháng năm 2016 Nghiên cứu sinh Nguyễn Minh Châu ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc nhất của mình tới TS. Trần Thƣợng Quảng và TS. Nguyễn Tiến Đạt, hai thầy đã chỉ ra hƣớng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện công việc của luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ tại Bộ môn Hóa Hữu cơ - Viện Kỹ thuật Hóa học - Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội, các cán bộ phòng Hoạt chất Sinh học - Viện Hóa Sinh Biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, ban lãnh đạo và các cán bộ Công ty Cổ phần Thiết bị Sài Gòn, đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành tốt bản luận án này. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Tác giả Luận án Nguyễn Minh Châu năm 2016 iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN............................................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................................ viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ .................................................................................. ix MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................................ 3 1.1. Giới thiệu về chi Cyperus L. ........................................................................................................ 3 1.1.1. Chi Cyperus L. trên thế giới ...................................................................................................... 3 1.1.2. Chi Cyperus L. tại Việt Nam..................................................................................................... 4 1.2. Thành phần hóa học của chi Cyperus L. ..................................................................................... 7 1.2.1. Các hợp chất terpenoid ............................................................................................................ 10 1.2.2. Các hợp chất flavonoid ............................................................................................................ 13 1.2.3. Các hợp chất quinone............................................................................................................... 14 1.2.4. Thành phần tinh dầu................................................................................................................. 15 1.2.5. Các hợp chất khác .................................................................................................................... 16 1.3. Nghiên cứu sắc ký dấu vân tay .................................................................................................. 16 1.4. Giới thiệu về hai loài củ gấu và củ gấu biển ............................................................................. 21 1.4.1. Vài nét về thực vật.................................................................................................................... 21 1.4.2. Công dụng và hoạt tính sinh học ............................................................................................ 23 1.4.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học.................................................................................. 24 1.4.4. Các nghiên cứu về sắc ký dấu vân tay ................................................................................... 34 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................... 36 2.1. Mẫu thực vật ............................................................................................................................... 36 2.1.1. Mẫu nghiên cứu thành phần hóa học ..................................................................................... 36 2.1.2 Mẫu nghiên cứu dấu vân tay sắc ký ....................................................................................... 36 2.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất .......................................................................................... 37 2.2.1. Phƣơng pháp ngâm chiết ......................................................................................................... 37 2.2.2. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ........................................................................................................... 37 2.2.3. Sắc ký cột (CC)......................................................................................................................... 38 2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất ............................................................. 38 2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp).............................................................................................................. 38 2.3.2. Độ quay cực ([α]D) ................................................................................................................... 38 2.3.3. Phổ hồng ngoại (IR) ................................................................................................................. 38 2.3.4. Phổ lƣỡng sắc tròn (CD) .......................................................................................................... 38 2.3.5. Phổ khối lƣợng (MS) ............................................................................................................... 38 2.3.6. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)...................................................................................... 38 2.4. Phƣơng pháp xây dựng dấu vân tay sắc ký .............................................................................. 39 2.4.1. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu ..................................................................................................... 39 iv 2.4.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) ............................................................................ 39 2.4.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........................................................................................ 39 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ......................................................................... 40 3.1. Chiết và phân lập các hợp chất từ thân rễ củ gấu ..................................................................... 40 3.1.1. Quy trình chiết và phân lập ..................................................................................................... 40 3.1.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các chất phân lập từ thân rễ củ gấu............................ 43 3.2. Chiết và phân lập các hợp chất từ thân rễ củ gấu biển ............................................................. 49 3.2.1. Quy trình chiết và phân lập ..................................................................................................... 49 3.2.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ thân rễ củ gấu biển............ 52 3.3. Phân tích định tính sắc ký dấu vân tay bằng HPTLC .............................................................. 55 3.3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích HPTLC ............................................................................................ 55 3.3.2. Điều kiện sắc ký HPTLC......................................................................................................... 55 3.3.3. Kết quả....................................................................................................................................... 55 3.4. Nghiên cứu sắc ký dấu vân tay bằng HPLC. ............................................................................ 55 3.4.1. Chuẩn bị mẫu phân tích HPLC ............................................................................................... 55 3.4.2. Điều kiện phân tích HPLC ...................................................................................................... 55 3.4.3. Kết quả....................................................................................................................................... 56 3.5. Nghiên cứu định lƣợng một số thành phần chính bằng HPLC. .............................................. 56 3.5.1. Chuẩn bị mẫu phân tích định lƣợng HPLC ........................................................................... 56 3.5.2. Phân tích định lƣợng bằng HPLC........................................................................................... 56 3.5.3. Kết quả....................................................................................................................................... 56 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................................ 57 4.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất.................................................................................... 57 4.1.1. Hợp chất CR1: ()-3,5,6,7,8,4-hexahydroxyflavane (Hợp chất mới) ............................... 57 4.1.2. Hợp chất CR2: (+)-catechin .................................................................................................... 60 4.1.3. Hợp chất CR3: eriodictyol....................................................................................................... 63 4.1.4. Hợp chất CR4: luteolin ............................................................................................................ 67 4.1.5. Hợp chất CR5: 7,4'-dihydroxy-5,3'-dimethoxyflavone ........................................................ 70 4.1.6. Hợp chất CR6: hovetrichoside C ............................................................................................ 71 4.1.7. Hợp chất CR7: piceatannol ..................................................................................................... 75 4.1.8. Hợp chất CR8: resveratrol ....................................................................................................... 78 4.1.9. Hợp chất CR9: trans-scirpusin A ........................................................................................... 79 4.1.10. Hợp chất CR10: trans-scirpusin B ....................................................................................... 83 4.1.11. Hợp chất CR11: cassigarol E ................................................................................................ 84 4.1.12. Hợp chất CR12: 1,4-dihydroxyeudesm-11-ene ............................................................. 88 4.1.13. Hợp chất CR13: 1β,4β-dihydroxyeudesm-11-ene.............................................................. 90 4.1.14. Hợp chất CR14: 5,7-dihydroxychromone ........................................................................... 91 4.1.15. Hợp chất CR15: (+)-lyoniresinol 3a-O--D-glucoside ...................................................... 94 4.1.16. Hợp chất CS1: (S)-5,5,7-trihydroxy-2,4-dimethoxy-6-methylflavanone (Hợp chất mới). ................................................................................................................................................. 97 v 4.1.17. Hợp chất CS2: 3',4',6-trihydroxy-4-methoxyaurone ........................................................102 4.1.18. Hợp chất CS3: -mangostin ...............................................................................................105 4.1.19. Các hợp chất khác ................................................................................................................109 4.2. Nghiên cứu định tính dấu vân tay sắc ký bằng HPTLC ........................................................ 112 4.3. Nghiên cứu định tính dấu vân tay sắc ký bằng HPLC ........................................................... 114 4.3.1. Đánh giá độ lặp lại phân tích dấu vân tay sắc ký ................................................................114 4.3.2. Kết quả phân tích dấu vân tay sắc ký ...................................................................................115 4.4. Nghiên cứu định lƣợng một số thành phần chính bằng HPLC ............................................. 124 4.4.1. Chuẩn bị chất chỉ thị và thiết lập đƣờng chuẩn định lƣợng ...............................................124 4.4.2. Đánh giá hàm lƣợng của các chất trong mẫu ......................................................................126 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 129 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 131 DANH MỤC CÁC C NG TR NH Đ C NG Ố CỦA LUẬN ÁN .......................................... 146 PHỤ LỤC .................................................................................................................................. 147 vi DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh 13 Cacbon-13 Nuclear Resonance Spectroscopy C-NMR Tiếng Việt Magnetic Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Cacbon 13 1 H-1H COSY 1 H-1H Correlation Spectroscopy 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Spectroscopy proton Phổ tƣơng tác proton-proton CC Column Chromatography Sắc ký cột CD Circular Dichroism spectroscopy Phổ lƣỡng sắc tròn CE Capillary Electrophoresis Điện di mao quản Công thức phân tử CTPT Đầu dò mảng diốt DAD Diode Array Detector DEPT Distortionless Enhancement Polarization Transfer DMSO Dimethyl sulfoxide ESI-MS ElectroSpray Spectroscopy GC Gas Chromatography GC-MS Gas Chromatography spectroscopy Glu Glucose Glucozơ HMBC Heteronuclear Multiple Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết by Phổ DEPT (CH3)2SO Mass Phổ khối phun mù điện tử Ionization Sắc ký khí Mass Sắc ký khí khối phổ Bond Correlation spectroscopy Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC High Performance Chromatography HPTLC High Performance Chromatography HR-ESI-MS High Resolution ElectroSpray Phổ khối ion hóa phun mù điện Ionization Mass Spectroscopy tử phân giải cao HSQC Heteronuclear Single Coherence spectroscopy IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại J Coupling constant Hằng số tƣơng tác KLPT Thin Layer Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Quantum Phổ tƣơng tác trực tiếp H-C Khối lƣợng phân tử vii Kí hiệu Tiếng Anh LC-MS Liquid Chromatography Spectroscopy MEEKC Microemulsion electrokinetic Tiếng Việt Mass Sắc ký lỏng khối phổ Sắc ký điện động vi nhũ tƣơng chromatography MeOH Methanol Methanol Mp. Melting point Điểm nóng chảy NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NOE Nuclear Overhauser Effect Hiệu ứng NOE NOESY Nuclear Overhauser Phổ hiệu ứng NOE Effect Spectroscopy ppm part per million Phần triệu QTOF Quadrupole Time Of Flight Tứ cực thời gian bay RT Retention time Thời gian lƣu SPME Solid-phase microextraction Vi chiết pha rắn TLC, SKLM Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng TMS Tetramethylsilane (CH3)4Si TOF-MS Time Of Flight Mass Spectroscopy Khối phổ thời gian bay UPLC Ultra performance chromatography UV Ultraviolet liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu năng Tử ngoại VAST Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam YHCT Y học cổ truyền δC Độ chuyển dịch hóa học của cacbon δH Độ chuyển dịch hóa học của proton viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách các loài thực vật thuộc chi Cyperus L. tại Việt Nam. ............................. 4 Bảng 1.2. Danh sách các chất đã đƣợc phân lập từ các loài trong chi Cyperus L. .................... 8 Bảng 1.3. Thành phần tinh dầu có trong các loài của chi Cyperus L. ..................................... 15 Bảng 1.4. Một số công trình trên thế giới nghiên cứu dấu vân tay sắc ký .............................. 18 Bảng 1.5. Các loại dƣợc liệu trong công trình [5]. .................................................................. 20 Bảng 1.6. Danh sách các chất đã đƣợc phân lập từ Cyperus rotundus L. ............................... 25 Bảng 2.1. Địa điểm thu thập mẫu nghiên cứu ......................................................................... 36 Bảng 3.1. Chƣơng trình dung môi sắc ký dấu vân tay HPLC. ................................................ 56 Bảng 3.2. Nồng độ các chất chỉ thị (µg/ml) để xây dựng đƣờng chuẩn. ................................. 56 Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất CR1 và chất tham khảo. ....................................... 60 Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất CR2 và chất tham khảo. ....................................... 63 Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất CR3 và chất tham khảo. ....................................... 67 Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất CR4 và chất tham khảo. ....................................... 70 Bảng 4.5. Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất CR5 và chất tham khảo. .................................. 71 Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất CR6 và chất tham khảo. ....................................... 74 Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất CR7 và chất tham khảo. ....................................... 78 Bảng 4.8. Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất CR8 và chất tham khảo. .................................. 79 Bảng 4.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất CR9 và chất tham khảo. ....................................... 82 Bảng 4.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất CR10 và chất tham khảo..................................... 84 Bảng 4.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất CR11 và chất tham khảo..................................... 87 Bảng 4.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất CR12 và chất tham khảo..................................... 90 Bảng 4.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất CR13 và chất tham khảo..................................... 91 Bảng 4.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất CR14 và chất tham khảo..................................... 93 Bảng 4.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất CR15 và chất tham khảo..................................... 96 Bảng 4.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất CS1 và chất tham khảo. .................................... 101 Bảng 4.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất CS2 và chất tham khảo. .................................... 105 Bảng 4.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất CS3 và chất tham khảo. .................................... 108 Bảng 4.19. Tổng hợp cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc từ thân rễ của 2 đối tƣợng nghiên cứu là củ gấu (Cyperus rotundus L.) và củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) trong khuôn khổ luận án. ........................................................................................................................... 109 Bảng 4.20. Giá trị Rf và cƣờng độ của các vết trên sắc ký đồ HPTLC quan sát dƣới ánh sáng UV 366 nm khi chƣa phun thuốc thử. ................................................................................... 112 Bảng 4.21. Danh sách các chất chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu sắc ký dấu vân tay. ............... 118 Bảng 4.22. Hệ số tƣơng đồng của các mẫu so với mẫu CGV1, CGB1. ................................ 122 Bảng 4.23. Hệ số tƣơng đồng của các mẫu so với mẫu CGV, CGB trung bình cộng. .............. 123 Bảng 4.24. Các thông số phân tích định lƣợng của một số chất bằng HPLC........................ 125 Bảng 4.25. Hàm lƣợng các chất (µg/g) trong mẫu nghiên cứu. ............................................ 126 ix DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Hình ảnh một số loài trong chi Cyperus L. ............................................................... 3 Hình 1.2. Hình ảnh cây củ gấu ................................................................................................ 21 Hình 1.3. Hình ảnh cây củ gấu biển ........................................................................................ 21 Hình 2.1. Mẫu tiêu bản thực vật cây củ gấu (Cyperus rotundus L.) ....................................... 36 Hình 2.2. Mẫu tiêu bản thực vật cây củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) ........................ 36 Hình 3.1. Sơ đồ chiết phân bố mẫu thân rễ củ gấu .................................................................. 40 Hình 3.2. Sơ đồ phân lập cặn chiết n-hexane của thân rễ củ gấu. ........................................... 41 Hình 3.3. Sơ đồ phân lập cặn chiết ethyl acetate của thân rễ củ gấu. ...................................... 42 Hình 3.4. Sơ đồ phân lập cặn nƣớc của củ gấu. ...................................................................... 43 Hình 3.5. Sơ đồ chiết phân bố mẫu thân rễ củ gấu biển .......................................................... 49 Hình 3.6. Sơ đồ phân lập cặn chiết chloroform của thân rễ củ gấu biển. ................................ 50 Hình 3.7. Sơ đồ phân lập cặn chiết ethyl acetate của thân rễ củ gấu biển. .............................. 51 Hình 3.8. Sơ đồ phân lập cặn nƣớc của thân rễ củ gấu biển.................................................... 52 Hình 4.1.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất CR1. .......................................................................... 57 Hình 4.1.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất CR1.......................................................................... 58 Hình 4.1.3. Phổ DEPT của hợp chất CR1. .............................................................................. 58 Hình 4.1.4. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất CR1. .................................................................... 59 Hình 4.1.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất CR1 và chất so sánh. ........................................... 59 Hình 4.2.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất CR2. .......................................................................... 61 Hình 4.2.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất CR2.......................................................................... 62 Hình 4.2.3. Phổ DEPT của hợp chất CR2. .............................................................................. 62 Hình 4.2.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất CR2. .................................................................... 63 Hình 4.3.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất CR3. .......................................................................... 64 Hình 4.3.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất CR3.......................................................................... 65 Hình 4.3.3. Phổ DEPT của hợp chất CR3. .............................................................................. 65 Hình 4.3.4. Phổ HMBC của hợp chất CR3. ............................................................................ 66 Hình 4.3.5. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác chính của hợp chất CR3....................................... 67 Hình 4.4.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất CR4. .......................................................................... 68 Hình 4.4.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất CR4.......................................................................... 69 Hình 4.4.3. Phổ DEPT của hợp chất CR4. .............................................................................. 69 Hình 4.4.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất CR4. .................................................................... 70 Hình 4.5.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất CR5. .................................................................... 71 Hình 4.6.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất CR6. .......................................................................... 72 Hình 4.6.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất CR6.......................................................................... 73 Hình 4.6.3. Phổ DEPTcủa hợp chất CR6. ............................................................................... 73 Hình 4.6.4. Phổ HMBC của hợp chất CR6. ............................................................................ 74 x Hình 4.6.5. Cấu trúc hóa học và tƣơng tác HM C chính của hợp chất CR6. ......................... 74 Hình 4.7.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất CR7. .......................................................................... 76 Hình 4.7.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất CR7.......................................................................... 77 Hình 4.7.3. Phổ DEPT của hợp chất CR7. .............................................................................. 77 Hình 4.7.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất CR7. .................................................................... 78 Hình 4.8.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất CR8. .................................................................... 79 Hình 4.9.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất CR9. .......................................................................... 80 Hình 4.9.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất CR9.......................................................................... 81 Hình 4.9.3. Phổ DEPT của hợp chất CR9. .............................................................................. 81 Hình 4.9.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất CR9. .................................................................... 82 Hình 4.10.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất CR10. ................................................................ 83 Hình 4.11.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất CR11....................................................................... 85 Hình 4.11.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất CR11. .................................................................... 86 Hình 4.11.3. Phổ DEPT của hợp chất CR11. .......................................................................... 86 Hình 4.11.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất CR11. ................................................................ 87 Hình 4.12.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất CR12....................................................................... 88 Hình 4.12.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất CR12. .................................................................... 89 Hình 4.12.3. Phổ DEPT của hợp chất CR12. .......................................................................... 89 Hình 4.12.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất CR12. ................................................................ 90 Hình 4.13.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất CR13. ................................................................ 91 Hình 4.14.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất CR14....................................................................... 92 Hình 4.14.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất CR14. .................................................................... 92 Hình 4.14.3. Phổ DEPT của hợp chất CR14. .......................................................................... 93 Hình 4.14.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất CR14. ................................................................ 93 Hình 4.15.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất CR15....................................................................... 94 Hình 4.15.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất CR15. .................................................................... 95 Hình 4.15.3. Phổ DEPT của hợp chất CR15. .......................................................................... 95 Hình 4.15.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất CR15. ................................................................ 96 Hình 4.16.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất CS1. ........................................................................ 98 Hình 4.16.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất CS1. ....................................................................... 99 Hình 4.16.3. Phổ DEPT của hợp chất CS1. ............................................................................. 99 Hình 4.16.4. Phổ HMBC của hợp chất CS1. ......................................................................... 100 Hình 4.16.5. Phổ khối HR-ESI-MS của hợp chất CS1.......................................................... 100 Hình 4.16.6. Cấu trúc hóa học, tƣơng tác chính của hợp chất CS1 và chất so sánh. ................. 101 Hình 4.17.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất CS2. ...................................................................... 102 Hình 4.17.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất CS2. ..................................................................... 103 Hình 4.17.3. Phổ DEPT của hợp chất CS2. ........................................................................... 103 Hình 4.17.4. Phổ HMBC của hợp chất CS2. ......................................................................... 104 Hình 4.17.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất CS2. ................................................................. 104 xi Hình 4.18.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất CS3. ...................................................................... 106 Hình 4.18.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất CS3. ..................................................................... 107 Hình 4.18.3. Phổ DEPT của hợp chất CS3. ........................................................................... 107 Hình 4.18.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất CS3. ................................................................. 108 Hình 4.19. Sắc ký lớp mỏng của các mẫu khi quan sát dƣới ánh sáng UV 366 nm.............. 112 trƣớc khi phun thuốc thử. ...................................................................................................... 112 Hình 4.20. Sắc ký lớp mỏng của các mẫu quan sát dƣới ánh sáng UV 366 nm .................... 113 sau khi phun thuốc thử........................................................................................................... 113 Hình 4.21. Sắc ký đồ mẫu đánh giá độ lặp lại. ...................................................................... 114 Hình 4.22. Sắc ký đồ các mẫu thân rễ củ gấu ở bƣớc sóng 275 nm. ..................................... 116 Hình 4.23. Sắc ký đồ các mẫu thân rễ củ gấu biển ở bƣớc sóng 275 nm. ............................. 116 Hình 4.24. Sắc ký đồ các mẫu dƣợc liệu Hƣơng phụ ở bƣớc sóng 275 nm. ......................... 116 Hình 4.25. Sắc ký đồ của 16 mẫu nghiên cứu ở bƣớc sóng 275 nm. .................................... 117 Hình 4.26. Sắc ký đồ của 16 mẫu nghiên cứu ở bƣớc sóng 230 nm. .................................... 117 Hình 4.27. Sắc ký đồ của 16 mẫu nghiên cứu ở bƣớc sóng 290 nm. .................................... 117 Hình 4.28. Sắc ký đồ của 16 mẫu nghiên cứu ở bƣớc sóng 320 nm. .................................... 118 Hình 4.29. Diện tích píc tại RT 1,44 phút ............................................................................. 119 Hình 4.30. Diện tích píc tại RT 10,08 phút ........................................................................... 119 Hình 4.31. Diện tích píc tại RT 20,42 phút ........................................................................... 119 Hình 4.32. Diện tích píc tại RT 22,82 phút ........................................................................... 120 Hình 4.33. Diện tích píc tại RT 31,53 phút ........................................................................... 120 Hình 4.34. Diện tích píc tại RT 12,04 phút ........................................................................... 120 Hình 4.35. Diện tích píc tại RT 12,67 phút ........................................................................... 120 Hình 4.36. Diện tích píc tại RT 18,21 phút ........................................................................... 120 Hình 4.37. Diện tích píc tại RT 18,89 phút ........................................................................... 120 Hình 4.38. Diện tích píc tại RT 8,98 phút ............................................................................. 120 Hình 4.39. Sắc đồ mẫu củ gấu và củ gấu biển thu thập tại Thái ình ................................... 121 Hình 4.40. Sắc đồ mẫu củ gấu và củ gấu biển thu thập tại Ninh ình .................................. 121 - 1- MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Hiện nay các bài thuốc trong y học cổ truyền ngày càng thu hút đƣợc sự quan tâm của thế giới bởi vì chi phí thấp, ít tác dụng phụ so với sử dụng tân dƣợc. Tại nhiều quốc gia trên thế giới, các nghiên cứu về thành phần hóa học của dƣợc liệu cổ truyền đã và đang đƣợc thực hiện nhằm mục đích tách chiết, tinh chế các chất có hoạt tính sinh học để làm dƣợc phẩm chữa bệnh. Mặc dù thuốc y học cổ truyền đƣợc xem là tƣơng đối an toàn cho ngƣời sử dụng so với các loại thuốc tổng hợp, tuy nhiên vẫn có thể có độc tính hoặc gây ra các phản ứng phụ nghiêm trọng. Nguyên nhân có thể do nguồn gốc nguyên liệu không đảm bảo, bảo quản nguyên liệu không tốt, dùng hóa chất độc hại để bảo quản hoặc sự giống nhau về hình thái học của dƣợc liệu nhƣng không có tác dụng tƣơng đƣơng. Sự kiểm soát nguyên liệu ban đầu cũng đòi hỏi có sự chuẩn hóa, nhiều khi sự nhầm lẫn xuất phát từ sự giống nhau về hình thái học của cây trong cùng nơi thu mẫu, từ sự nhận dạng cây hoặc từ những sai sót từ các mẫu thực vật nhập khẩu. Chính vì lý do đó, năm 1991, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã có các quy định về việc đảm bảo chất lƣợng cho dƣợc liệu cổ truyền. Nếu không xác định đƣợc hoạt chất thì cần phải có dấu vân tay sắc ký để xác định chất hoặc hỗn hợp các chất [151]. Ở trong nƣớc, ngày 12 tháng 3 năm 1996, Bộ trƣởng Bộ Y tế cũng đã có quyết định số 371/BYT-QĐ về việc ban hành "Quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu lực thuốc cổ truyền" [1]. Quy định này có mô tả quy trình xác định đặc điểm chất lƣợng dƣợc liệu và thuốc cổ truyền Việt Nam trong đó có đề cập đến việc nghiên cứu đánh giá thành phần hoá học kết hợp với kỹ thuật phân tích dấu vân tay sắc ký. Việt Nam là một trong những quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời với việc sử dụng các loại thảo dƣợc trong phòng chữa bệnh và tăng cƣờng sức khỏe. Một trong những dƣợc liệu đƣợc sử dụng rộng rãi là vị thuốc Hƣơng phụ. Trong YHCT có câu “Nam bất thiểu Trần bì, Nữ bất ly Hƣơng phụ” tức là chữa bệnh cho nam giới không thể thiếu vị thuốc Trần bì, còn chữa bệnh cho nữ giới không thể không có vị thuốc Hƣơng phụ. Điều này cho thấy tầm quan trọng của dƣợc liệu này. Dƣợc liệu Hƣơng phụ đƣợc chế biến từ thân rễ của loài củ gấu (Cyperus rotundus L.). Việc thu hoạch củ gấu chỉ dựa vào nguồn mọc hoang thiên nhiên, không ai trồng. Ngƣời ta thƣờng kết hợp thu hái củ gấu với việc làm cỏ vƣờn, ruộng hoặc tổ chức thu hái riêng [4]. Nhƣng hiện nay, để phục vụ cho nhu cầu sử dụng trong nƣớc và xuất khẩu, vị thuốc có tên là “Hƣơng phụ” ở Việt Nam, chủ yếu đƣợc khai thác từ loài củ gấu biển [13] (Cyperus stoloniferus Retz.). Tuy hai loài này đều đƣợc sử dụng làm dƣợc liệu Hƣơng phụ nhƣng cho tới nay chƣa có nghiên cứu so sánh về thành phần hoá học dịch chiết của hai loài này. Thực tiễn nêu trên đã định hƣớng tác giả lựa chọn nội dung nghiên cứu của luận án: “Nghiên cứu thành phần hóa học và sắc ký dấu vân tay của thân rễ hai loài: củ gấu (Cyperus rotundus L.) và củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.)”. - 2- 2. Mục đích, đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Mục đích của luận án là làm rõ hơn về thành phần hóa học, so sánh sự khác biệt về thành phần hóa học giữa hai loài củ gấu và củ gấu biển. Nghiên cứu cũng góp phần xây dựng bộ dữ liệu sắc ký dấu vân tay cho hai loài củ gấu và củ gấu biển, ứng dụng vào đánh giá chất lƣợng và phân biệt hai loài này. Nhiệm vụ của luận án bao gồm: - Nghiên cứu thành phần hoá học: phân lập các hợp chất sạch từ thân rễ hai loài củ gấu và củ gấu biển bằng các phƣơng pháp sắc ký, xác định cấu trúc hóa học các chất tách đƣợc bằng các phƣơng pháp phổ kết hợp. - Nghiên cứu sắc ký dấu vân tay: xây dựng dữ liệu vân tay sắc ký của hai loài củ gấu, củ gấu biển trên cơ sở các chỉ thị hóa học, xác định hàm lƣợng một số hoạt chất chính trong các mẫu thân rễ hai loài: củ gấu, củ gấu biển và dƣợc liệu Hƣơng phụ thu thập ở những địa điểm khác nhau. 3. Ý nghĩa khoa học của luận án Luận án đóng góp những hiểu biết mới về thành phần hóa học và sắc ký dấu vân tay của 2 loài thực vật: củ gấu, củ gấu biển ở Việt Nam. Ứng dụng những phƣơng pháp vật lý hiện đại trong nghiên cứu cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ. 4. Những đóng góp mới của luận án Hai loài củ gấu và củ gấu biển ở Việt Nam lần đầu đƣợc nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hóa học và dấu vân tay sắc ký. 4.1. Về thành phần hóa học - Từ củ gấu (Cyperus rotundus L.) đã phân lập và xác định đƣợc cấu trúc hóa học của 15 hợp chất, trong đó có hợp chất ()-3,5,6,7,8,4-hexahydroxyflavane (CR1) là hợp chất mới. - Từ củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) đã phân lập và xác định đƣợc cấu trúc hóa học của 12 hợp chất, trong đó có hợp chất (S)-5,5,7-trihydroxy-2,4dimethoxy-6-methylflavanone (CS1) hợp chất mới. - Trong số 12 chất phân lập từ củ gấu biển có 9 hợp chất trùng với các chất phân lập đƣợc từ củ gấu. 4.2. Về sắc ký dấu vân tay: - So sánh thành phần hoá học của 2 loài C. rotundus và C. stoloniferus dựa theo kết quả phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất sạch kết hợp với phân tích trên hệ thống sắc ký HPTLC và HPLC. - Thiết lập đƣợc các điều kiện phân tích dấu vân tay sắc ký bằng HPLC. Đánh giá độ tƣơng đồng giữa các mẫu nghiên cứu trên kỹ thuật HPLC. Xác định vùng trên sắc ký đồ cho việc nhận dạng dấu vân tay sắc ký để có thể phân biệt hai loài. - Xây dựng đƣợc điều kiện định lƣợng 7 thành phần hoạt chất trong đối tƣợng nghiên cứu trên hệ thống HPLC bằng việc sử dụng các chất sạch đã phân lập đƣợc làm chất đối chứng. - 3- CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về chi Cyperus L. 1.1.1. Chi Cyperus L. trên thế giới Chi Cyperus L. thuộc họ Cói (danh pháp khoa học: Cyperaceae) là một họ thực vật thuộc lớp thực vật một lá mầm. Họ Cói là họ lớn trong bộ Hòa thảo (Poales) có khoảng 90 chi với 4.000-4.500 loài [5]. Họ này phân bố rộng khắp thế giới, với trung tâm đa dạng là miền nhiệt đới châu Á và Nam Mỹ. Nhiều loài cói, lác có thể phát triển tốt trong mọi điều kiện, nhƣ các nơi đầm lầy, đất ít dinh dƣỡng, các vùng đất ƣớt, vùng đất phù sa bồi lấp gần các cửa sông ven biển. Họ này mặc dù đa số là cỏ dại nhƣng vẫn hiện diện một số loài có ích cho đời sống con ngƣời: đƣợc dùng làm cảnh nhƣ cây cói giấy (Cyperus papyrus L.). Các cây cói bông trắng (Cyperus tegetiformis Roxb.) hay lác voi đƣợc dùng để đan chiếu, làm dây, củ năng (Eleocharis dulcis (Burm.f.) Hensch.) ăn đƣợc, củ gấu (Cyperus rotundus L.) để làm thuốc… Chi Cyperus L. là một chi lớn, gồm khoảng 300 loài, phân bố rộng rãi khắp thế giới. Cyperus compactus Retz. Cyperus compressus L. Cyperus croceus Vahl. Cyperus difformis L. Cyperus digitatus Roxb. Cyperus exaltatus Retz. Hình 1.1. Hình ảnh một số loài trong chi Cyperus L. - 4- 1.1.2. Chi Cyperus L. tại Việt Nam Tại Việt Nam, họ Cói có 28 chi và 361 loài, 2 phân loài và 24 thứ, phân bố khắp đất nƣớc từ vùng núi cao, trung du đến đồng bằng, ven biển và các hải đảo. Chi Cyperus L. tại Việt Nam có 61 loài đƣợc liệt kê trong bảng sau [5, 14]: Bảng 1.1. Danh sách các loài thực vật thuộc chi Cyperus L. tại Việt Nam. STT Tên khoa học Tên tiếng Việt Phân bố tại Việt Nam 1 C. andereanus Maury. Cói andre Kon Tum. 2 C. arenarius Retz. Cói sa Nam bộ. 3 C. articulatus L. Cói đốt Nam bộ. 4 C. aschenbornianus Boeck. Cói aschenborn Lâm Đồng. 5 C. babakan Steud. Cói ba ba kan 6 C. brunnescens Boeck. Cói nâu Thừa Thiên – Huế. 7 C. castaneus Willd. Cói hạt dẻ Quảng Ninh, Bắc Giang, Thừa Thiên – Huế, Tp.HCM, Sóc Trăng. 8 C. cephalotes Vahl. Cói hoa đầu Hà Tây cũ, Ninh Bộ. 9 C. clarkei T.Cooke. Cói clarke Bình Thuận. 10 C. colymbetes Kotschy Cói bông & Peyr. Việt Nam. 11 C. compressus L. Cói hoa dẹp Sơn La, Yên ái, Cao ằng, Quảng Ninh, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình, Thừa Thiên – Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Khánh Hòa, Đắc Lắc, Tp.HCM, Long An, Bến Tre, Đồng Tháp, Kiên Giang. 12 C. corymbosus Rottb. Cói hoa tán Hải Phòng, Thừa Thiên – Huế, Nam Bộ. Cói mũi cong Sơn La, Cao ằng, Quảng Ninh,Thái Nguyên, Phú Thọ, Hà Nội, Ninh Bình, Thừa Thiên – Huế, Kon Tum, Đồng Tháp. Cói tò ty Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Cao ằng, Quảng Ninh, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nội, Hải Dƣơng, Hải Phòng, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Ngãi, Bình 13 14 C. cuspidatus B.H.K. C. difformis L. Long An, Đồng Tháp, Tiền Giang, An Giang, Kiên Giang. ình, Kon Tum, Nam - 5STT Tên khoa học Tên tiếng Việt Phân bố tại Việt Nam Định, Khánh Hòa, Tp.HCM, Bến Tre, Đồng Tháp. 15 16 17 C. diffusus Vahl. C. digitatus Roxb. C. distans L. Cói hoa xòe Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Hà Tây cũ, Hòa Bình, Hải Dƣơng, Ninh ình, Nghệ An, Thừa Thiên – Huế, Đắc Lắc, Lâm Đồng, Đồng Nai, Long An, Bến Tre, Kiên Giang. Cói bàn tay Cao Bằng, Phú Thọ, Hà Tây cũ, Hà Nội, Thừa Thiên – Huế, Đắc Lắc, Lâm Đồng, Đồng Tháp. Cói bông cách Lai Châu, Sơn La, Hà Giang, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hải Dƣơng, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Hà Tây cũ, Hòa ình, Hải Phòng, Ninh Bình, Thừa Thiên – Huế, Kon Tum, Lâm Đồng, Tp.HCM, Long An. 18 C. dives Dillie. Cói giàu Việt Nam 19 C. elatus L. Cói mào Hà Nam, Ninh ình, Khánh Hòa, Đắc Lắc, Đồng Nai, Tp.HCM, Đồng Tháp, Cần Thơ, ạc Liêu, Cà Mau. 20 C. esculentus L. Cói gấu tàu Hà Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng. 21 C. exaltatus Retz. Cói u du cao Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Nguyên, Hà Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Trị, Đắc Lắc, Tp.HCM, Long An, Đồng Tháp, Cần Thơ, Cà Mau. 22 C. flabelliformis Rottb. Cói quạt Tuyên Quang, Hà Nội, Hà Nam, Lâm Đồng, Tp.HCM. 23 C. fluvo-albescens T.Koyama. Cói trung bộ Lâm Đồng. 24 C. fuscus L. Cói sậm Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình, Trung Bộ. 25 C. grandis C.B.Clarke. Cói đại Cần Thơ. 26 C. haematocephalus Boeck. Cói đầu đỏ Kiên Giang. 27 C. halpan L. Cói đất chua Khắp Việt Nam. 28 C.imbricatus Retz. Cói bông lợp Khắp Việt Nam. - 6STT Tên khoa học Tên tiếng Việt Phân bố tại Việt Nam 29 C. iria L. Cói gạo Khắp Việt Nam. 30 C. laevigatus L. Cói láng Việt Nam. 31 C. leucocephalus Retz. Cói trắng 32 C. malaccensis Lamk. Cói nước Vùng ven biển Việt Nam. 33 C. michelianus Link. Cói vảy xoắn Quảng Ninh, Hà Nội. 34 C. microiria Steud. Cói tấm Bắc Bộ và Nam Bộ Việt Nam. 35 C. multispicatus Boeck. Cói đa gié Trung Bộ và Nam Bộ Việt Nam. 36 C. niveus Retz. Cói tuyết Ninh ình, Đồng Nai, Tp.HCM. 37 C. nutans Vahl. Cói ba cạnh Hà Nội, Hòa ình, Thanh Hóa, Đồng Tháp, Tp.HCM. 38 C. odoratus L. Cói thơm Trung Bộ và Nam Bộ Việt Nam. 39 C. ohwii Kuk. Cói ohwi Phú Yên, Khánh Hòa, Nam Bộ. 40 C. phaeorhizus K.Schum. Cú rễ nâu Kon Tum. 41 C. pilosus Vahl. Cói lông Phổ biến ở Việt Nam. 42 C. platystylis R.Br. Cói vòi giẹp Các tỉnh miền Tây Nam Bộ. Tp.HCM, Kiên Giang. 43 C. procerus Rottb. Cói quy Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình, Quảng Nam, Đồng Nai, Tp.HCM, Long An, Bến Tre, Kiên Giang. 44 C. pulcherrimus Willd. Cói giẹp Khánh Hòa. 45 C. puncticulatus Vahl. Cói có đốm Trung Bộ và Nam Bộ Việt Nam. Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Hà 46 47 48 C. pygmaeus Rottb. C. radians Nees & Mey. C. rotundus L. Cói lùn Cói xạ Nam, Thanh Hóa, Quảng Nam, Khánh Hòa, Bà Rịa – Vũng Tàu. Lạng Sơn, Quảng Ninh, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Quảng Trị, Quảng Nam, Khánh Hòa, Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc, Lâm Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu. Củ gấu, cỏ gấu, cỏ cú, Hương Phổ biến khắp Việt Nam kể cả ở quần phụ, cỏ hương đảo Trƣờng Sa. phụ 49 C. rupestris Kumth. Cói đá Cà Mau. 50 C. sphacelatus Rottb. Cói phù Kiên Giang. 51 C. squarrosus L. Cói mũi Nam Bộ Việt Nam. - 7STT Tên khoa học 52 53 54 C. stoloniferus Retz. C. tegetiformis Roxb. C. tenuiculmis Boeck. Tên tiếng Việt Phân bố tại Việt Nam Củ gấu biển, cỏ Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Bình, Nam cú biển, cói gấu Định, Ninh Bình, Thanh Hóa, Quảng biển, cú chồi, Nam, Khánh Hòa (quần đảo Trƣờng Sa), Ninh Thuận, Tp.HCM, Kiên Giang. Hương phụ biển Cói bông trắng Quảng Ninh, Hải Dƣơng, Hƣng Yên, Hải Phòng, Thái ình, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hóa, Quảng Trị, Bến Tre, miền Tây Nam Bộ. Cói ghinê Cao Bằng, Vĩnh Phúc, Hà Tây cũ, Khánh Hòa, Đắc Lắc, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Tp.HCM, An Giang. 55 C. tenuispica Steud. Cói gié mịn Tuyên Quang, Cao Bằng, Quảng Ninh, Bắc Giang, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nội, Ninh Bình, Bắc Bộ, Thừa Thiên – Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Tp.HCM, Long An, Đồng Tháp. 56 C. thomsonii Boeck. Cói thomson Hà Tây cũ, Hà Nội. 57 C. thorelii E.Camus. Cói thorel Đồng bằng Nam Bộ. 58 C. tonkinensis C.B.Clarke. Cói bắc Hà Tây cũ, Đắc Lắc, Đồng Nai, Tây Ninh. 59 C. trialatus J.Kern. Cói ba cạnh Lạng Sơn, Hải Dƣơng, Phú Thọ, Hòa ình, Hà Tây cũ, Ninh ình, Quảng Bình, Quảng Trị, Đà Nẵng, Quảng Nam, Khánh Hòa, Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Tp.HCM, Kiên Giang. 60 C. truncatus C.A.Mey. Cói ngang Lâm Đồng. 61 C. zollingeri Steud. Cói zollinger Lâm Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu. 1.2. Thành phần hóa học của chi Cyperus L. Cho đến nay có khoảng 16 loài trong tổng số gần 300 loài của chi Cyperus đƣợc công bố kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học, đó là các loài: C. alopecuroides Schrad., C. articulatus L., C. bulbosus Vahl., C. capitatus Michx., C. carinatus R.Br., C. conglomeratus Rottb., C. corymbosus Rottb., C. distans L., C. esculentus L., C. longus L., C. nipponicus Franch. & Sav., C. papyrus L., C. rotundus L., C. scariosus R.Br., C. stoloniferus Retz., C. tuberosus Rottb.