Tài liệu Nghiên cứu thu nhận n acetylglucosamine (nag) bằng chitinase từ penicillium oxalicum 20b định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

MỞ ĐẦU Ở nước ta, trong những năm gần đây, diện tích và sản lượng tôm nuôi không ngừng tăng; đến năm 2015, diện tích nuôi tôm nước lợ đạt trên 692000 ha với sản lượng trên 596000 tấn, kim ngạch xuất khẩu khoảng 3 tỷ USD. Tuy nhiên ngành sản xuất này hàng năm cũng thải ra một lượng lớn phụ phẩm giáp xác (khoảng 70000 tấn) gây ô nhiễm mạnh mẽ tới môi trường. Do vậy, để nâng cao lợi ích kinh tế và giảm thiểu ô nhiễm môi trường, cần khai thác tận thu những thành phần có lợi từ phế liệu như chitin, protein, astaxantin. Chitin đại diện cho polymer sinh học tự nhiên và đứng thứ hai sau cellulose, có mặt trong vỏ xương ngoài loại giáp xác: vỏ cua, vỏ tôm,… Chitin không được sử dụng nhiều do tính không tan trong nước. Một trong những sản phẩm được tạo ra từ chitin là N- acetylglucosamine (N-acetylD-glucosamine, hay GlcNAc, hay NAG). NAG có tiềm năng chữa bệnh như viêm khớp, viêm dạ dày,... Ngoài ra NAG còn có đặc tính chống ung thư và được dùng trong chữa trị bệnh tự miễn dịch [69]. Đa số NAG được sản xuất bằng thủy phân hóa học HCl đậm đặc ở nhiệt độ cao. Xử lý hóa học gây nhiều bất lợi như lượng phế thải acid, hiệu suất tạo NAG thấp (dưới 65%) và giá thành cao. Thêm nữa, NAG có vị mặn và hơi đắng bởi các hợp chất còn dư lại. Do vậy, nhiều nghiên cứu đã tập trung thủy phân chitin sản xuất NAG bởi chitinase. Công bố sản xuất NAG từ chitin bởi chitinase thô từ vi sinh vật còn khiêm tốn. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận Nacetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ Penicillium oxalicum 20B định hƣớng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng”. * Mục tiêu nghiên cứu: - Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật từ Penicillium oxalicum 20B. - Thu nhận NAG từ chitin phế liệu tôm Việt Nam bằng chế phẩm chitinase kỹ thuật * Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase từ P. oxalicum 20B. - Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật. - Nghiên cứu thủy phân chitin để thu NAG bằng chế phẩm chitinase kỹ thuật nhận được. - Nghiên cứu thu nhận chế phẩm NAG tinh sạch hướng tới ứng dụng vào thực phẩm chức năng. * Những đóng góp mới của luận án: 1 - Là công trình công bố đầu tiên một cách hệ thống về đặc tính enzym và điều kiện lên men sinh tổng hợp chitinase từ P. oxalicum 20B. - Đã tạo ra chế phẩm chitinase kỹ thuật từ P. oxalicum 20B và xác định các đặc tính của chế phẩm, ứng dụng để thủy phân chitin thu N-acetylglucosamine. Đặc biệt ảnh hưởng của từng cấu tử endochitinase và N-acetylhexosaminidase trong hỗn hợp chế phẩm chitinase kỹ thuật đến hiệu suất tạo N-acetylglucosamine đã được xem xét. - Đã đưa ra qui trình tinh sạch N-acetylglucosamine từ dịch thủy phân chitin và xác định các đặc tính của chế phẩm N-acetylglucosamine phù hợp để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. N- ACETYLGLUCOSAMINE 1.1.1. Các đặc tính của N- acetylglucosamine N-Acetylglucosamine là dẫn xuất của đường glucoza, có nhóm amit liên kết giữa glucosamine và axit axetic. Công thức phân tử C8H15NO6, khối lượng phân tử là 221,21 g/mol. NAG có dạng bột màu trắng, vị ngọt nhẹ, nóng chảy ở 221oC, khả năng hoà tan của NAG là 25% trong nước. NAG hiếm khi tồn tại ở dạng tự do, ngoại trừ trong sữa người (khoảng 600 - 1500 mg/ml). Hình 1.1. Công thức cấu tạo NAG NAG là thành phần cấu trúc chính của polysaccharide như chitin. Ngoài ra nó có trong thành tế bào vi khuẩn (trong các đơn phân murein) và lipopolysaccharide của màng ngoài. Ở vi khuẩn, khi murein phân hủy thì NAG lại hình thành liên quan đến sự phosphoryl hóa, vì GlcNAc-6-phosphate (GlcNAc-6-P) được sử dụng để tổng hợp murein hay lipopolysaccharide hoặc có thể được chuyển hóa bằng con đường đường phân. 1.1.2. Vai trò N- acetylglucosamine trong sản xuất thực phẩm chức năng NAG đã được ứng dụng rộng trong cung cấp dinh dưỡng sử dụng điều trị tổn thương xương khớp, để cải thiện các triệu chứng do thoái hóa khớp, tăng cường khả năng tái tạo sụn khớp, điều trị tận gốc nguyên nhân gây bệnh về khớp. NAG được dùng để phục hồi lớp sụn nối, hỗ trợ chữa bệnh viêm khớp mãn tính [54]. Ở người cao tuổi khả năng tổng hợp NAG của cơ thể bị giảm sút dễ mắc bệnh viêm xương khớp, vì thế mà người ta phải đưa từ bên ngoài vào cơ thể dưới dạng thuốc, có tác dụng chống viêm và kích thích sản xuất sụn. Nhiều thử nghiệm lâm sàng đã được thực hiện điều trị cho bệnh nhân rối loạn khớp bao gồm các bệnh: viêm khớp, viêm xương khớp, viêm khớp dạng thấp, tổn thương sụn, tổn thương khớp, thoái hóa khớp. Kết quả nghiên cứu cho thấy NAG có vai trò quan trọng trong việc phòng chống tổn thương khớp, chống viêm xương khớp mãn, viêm khớp mãn tính và bệnh tổn thương sụn xương [27]. Bên cạnh đó NAG được dùng như tác nhân chống viêm chữa nhiều bệnh: nhiễm vi khuẩn mãn tính, viêm ruột và dạ dày. NAG còn có khả năng tăng cường giải phóng mucopolysaccharide acid nguyên bào sợi, hình thành cấu trúc bảo vệ đường tiêu hóa do vậy làm tăng tính đàn hồi các mô xung quanh mạch và hoạt động như một tác nhân bảo vệ, khôi phục sự toàn vẹn và chức năng bình thường niêm mạc ruột ở người. 3 Một thử nghiệm thí điểm lâm sàng để xác định hiệu quả điều trị của NAG trên bệnh viêm ruột. Trẻ em bị bệnh Crohn đã cho thấy sự cải thiện rõ ràng sau khi được dùng NAG đường uống hay đường hậu môn. Thực tế, trong thử nghiệm này, 8 trong số 12 trẻ em cho thấy cải thiện rõ rệt khi được cho uống NAG như là một liệu pháp song song với liệu pháp hiện hành, trong khi 4 trường hợp còn lại không thấy chuyển biến. Ngoài ra, 7 trẻ bị bệnh viêm ruột khác cũng được dùng NAG đường hậu môn như là một liệu pháp duy nhất đã cho thấy cải thiện rõ rệt ở 5 em và 2 em còn lại không đáp ứng liệu pháp. Đáng lưu ý là 2 em không đáp ứng với NAG đường hậu môn trước đó đã đề kháng lại các liệu pháp khác [125]. Do đó, NAG hứa hẹn là một phương pháp điều trị rẻ tiền và không độc hại đối với bệnh viêm ruột mãn tính. Gần đây, thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III vừa được hoàn thành [87]. Da người gồm hai lớp là lớp sừng (lớp ngoài) và lớp hạ bì (lớp bên trong) để bảo vệ cơ thể khỏi các điều kiện khắc nghiệt của môi trường như thời tiết khô, tia cực tím…Tầng lớp sừng đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì độ ẩm, độ săn chắc cho da. Lớp hạ bì bao gồm collagen, elastin… được tạo ra bởi các nguyên bào sợi giúp làm tăng khả năng phục hồi, độ bền, độ đàn hồi, giúp cho làn da luôn khỏe mạnh. Một trong những nhóm carbonhydrate phức tạp như acid hyaluronic (HA) và proteoglycan có khả năng giữ nước cao và là thành phần quan trọng trong việc duy trì độ ẩm cho da. Lượng cabonhydrate giảm dần theo lứa tuổi, khả năng giữ nước và phục hồi của da giảm và do đó làm cho da khô, xuất hiện các nếp nhăn. Bổ sung NAG giúp tăng cường sự phát triển và biểu hiện collagen của nguyên bào sợi, thúc đẩy sự gia tăng của tế bào sừng có tác dụng giữ ẩm, giảm sự xuất hiện các sắc tố da trên khuôn mặt, cải thiện nếp nhăn trên da [29]. NAG còn có đặc tính chống ung thư và được dùng trong chữa trị bệnh tự miễn dịch [69]. Ngoài ra, dùng NAG trong mỹ phẩm, băng bó vết thương, và như phụ gia thực phẩm sữa. Lợi ích và ứng dụng NAG thể hiện trên Bảng 1.1. Bissett và cs (2007), Chen và cs (2010) công bố nghiên cứu lâm sàng về NAG lên người bệnh khi uống như: sự hấp thụ, phân phối và đào thải khi uống nó [15]. Nghiên cứu của Chen và cs (2010) đã chỉ ra tỷ lệ hấp thụ đạt 98% và mỗi khi NAG được hấp thụ, nó sẽ phân phối chính vào tế bào khớp nhằm kết nối chặt chẽ thành ma trận tế bào khớp nối của sụn, dây chằng, gân [27]. Trong cơ thể người, NAG giữ nguyên dạng glucoprotein, như chất kích hoạt hàng loạt các chất trong huyết tương có thể hoạt hóa thành plasma [143]. Chế phẩm chứa NAG được sử dụng bằng đường tiêm, uống. NAG bị phân giải một cách từ từ và giữ cấu trúc giống như chất có trong cơ thể người nên khả năng hấp thu cao gấp 3 lần so với glucosamine thông thường. Một liều lượng lớn NAG (20 g) tiêm tĩnh mạch không hề độc tính và không thay đổi nồng độ glucose trong máu [133]. Người ta cũng đã chứng minh rằng: 54% NAG cung cấp được bài tiết qua đường nước tiểu trong 1 ngày, điều đó chỉ rõ trong chuỗi các phản ứng sinh hóa của NAG. 4 Bảng 1.1. Ứng dụng và lợi ích của NAG Chức năng Đối tƣợng Thử nghiệm Tài liệu tham khảo Điều trị bệnh Ung thư và di căn Bệnh đường ruột Bệnh rối loạn đường ruột Tổn thương khớp Động vật, con người Con người Con người Con người [176] [177] [153] [90] Phòng ngừa bệnh Ngộ độc thuốc và chất hóa học Thuốc kháng sinh Tác dụng phụ của điều trị hóa trị và điều trị sóng vô tuyến Say tàu xe Tế bào vi sinh vật, động vật Vi khuẩn Con người [178] [175] [176] Con người [174] Bệnh ngoài da Vệ sinh da Con người [172] Thực phẩm bổ sung Phụ gia trong sữa Phụ gia trong đồ uống thể thao Động vật, con người Động vật, con người [173] [167] Làm mỹ phẩm Giữ độ ẩm cho da Tăng tính đàn hồi và màu sắc Giảm sản xuất melanin Con người Con người Con người [27] [130] [15] Các phép thử độc tố cho thấy NAG không độc. Ngoài ra NAG được tạo ra bởi enzym có vị ngọt và bền nhiệt. Chính vì vậy, gần đây NAG và dẫn xuất từ NAG đã được sử dụng để bổ sung vào chế độ ăn uống, phát triển rộng trong chữa bệnh cho con người [7]. 1.1.3. Các phƣơng pháp sản xuất N- acetylglucosamine 1.1.3.1. Phương pháp hóa học Theo phương pháp hóa học, NAG được sản xuất bằng cách dùng axit HCl đậm đặc để thủy phân chitin ở nhiệt độ cao. Nhiệt độ và nồng độ axit cần phải kiểm soát một cách chặt chẽ, đủ cao để thủy phân chitin và tránh phân hủy NAG. Thường quá trình thủy phân diễn ra ở nhiệt độ khoảng từ 40 - 80ºC và nồng độ HCl từ 15 - 36%. Sản lượng NAG có thể đạt 6,42 g/l trong 1 h [22]. Phương pháp này thường đạt hiệu suất thủy phân thấp (dưới 65%), giá thành cao và thải ra một lượng lớn axit gây ô nhiễm môi trường xung quanh, sản phẩm cuối có vị mặn và có tác dụng phụ do quá trình hóa học [128]. Đặc biệt nhóm axetyl bị mất đi nên lại phải axetyl hóa trở lại khá phức tạp. Do vậy sản phẩm không được coi là tự nhiên bởi sự có mặt các chất hóa học (như O-axetyl, diaxetyl, dung môi) trong sản phẩm đã gây vị đắng [71]. 1.1.3.2. Phương pháp chuyển hóa sinh học Sản xuất NAG qua quá trình chuyển hóa trực tiếp chitin bởi vi sinh vật tổng hợp 5 chitinase không thông qua giai đoạn thu các chế phẩm trung gian. Phương pháp có ưu điểm là ít công đoạn nhưng quá trình khó kiểm soát do sự tạo thành các sản phẩm trao đổi chất khác ngoài NAG. Theo Li và cs (2005) nếu dùng 2% gel chitin làm cơ chất nuôi cấy vi khuẩn Aeromonas caviae DYU-BT4 từ mẫu đất ở Taiwan có thể thu NAG với hàm lượng 7,8 g/l [83]. Theo nghiên cứu khác của Chen và cs (2011), Chitinibacter tainanensis phân lập từ đất phía Nam Taiwan thủy phân cơ chất -chitin và ß-chitin cho hiệu suất thu hồi NAG lần lượt là 76% và 98%. Kết tinh dịch lên men thu NAG với độ tinh sạch trên 99% [30]. Các nhân tố phân giải chitin (CDFs) có thể thủy phân chitin và được tạo ra trong suốt thời kỳ phát triển của C. tainanensis khi có mặt chitin. Hoạt tính NAHase và endochitinase được tìm thấy trong vi khuẩn sống và phần tế bào chết. Hoạt độ riêng NAHase cao hơn nhiều so với endochitinase. Cơ chế hoạt động các nhân tố phân giải chitin được minh họa trên Hình 1.2. Hình 1.2. Sản xuất NAG bằng chuyển hóa sinh học [71]. Ngoài ra NAG được sản xuất thông qua chủng biến đổi di truyền sử dụng glucose làm cơ chất. Các đường hướng chuyển hóa D-glucosamin và tổng hợp NAG có thể thay đổi bằng kỹ thuật di truyền nhằm tăng hoạt tính enzym, giảm các sản phẩm kìm hãm và tăng ái lực với cơ chất, nên có thể tạo ra sản phẩm nồng độ cao. Dùng vi sinh vật biến đổi gen và không tận dụng được nguồn chitin là nhược điểm của phương pháp. 1.1.3.3. Phương pháp enzym Chitinase là hệ enzym thủy phân chitin để thu nhận NAG bằng phương pháp enzym. Ở qui mô công nghiệp lớn, có thể sản xuất NAG bằng chitinase tinh sạch. Tuy nhiên chitinase tinh sạch rất đắt kể cả từ các chủng biến đổi gen. Nên trong thực tế hay dùng enzym thô thu nhận NAG. Phân giải chitin thành NAG bởi chitinase diễn ra theo hai giai đoạn. Đầu tiên endochitinase (EC 3.2.1.14) phân giải chitin thành các oligomer, sau đó các oligomer bị phân giải thành các monomer bởi NAHase (EC 3.2.1.96) [127]. Sáng chế của Haynes và cs 6 (1999) tại nước Mỹ đã thu nhận NAG bằng chitinase (bao gồm chitinase và chitobiosidase) thủy phân vỏ loài giáp xác [51]. Pichyangkura và cs (2002) đã dùng chitinase thô từ Burkholderia cepacia TU09 và Bacillus licheniformis SK-1 thủy phân bột mịn α-chitin, β-chitin tạo NAG. Chitinase từ B. cepacia TU09 thủy phân β-chitin trong 1 ngày và α-chitin trong 7 ngày đều có hiệu suất thu nhận NAG hơn 85%. Chitinase từ B. licheniformis SK-1 thủy phân β-chitin trong 6 ngày cho hiệu suất thu nhận NAG khoảng 75%. Ngoài ra, hiệu suất thu nhận NAG đạt 41% khi thủy phân α-chitin bằng B. licheniformis SK-1 [110]. Bohlmann và cs (2004) dã đưa ra sáng chế: NAG thu được với độ tinh sạch cao bằng cách thủy phân chitin bởi sinh khối nấm sợi [22]. Aiba (2005) đã dùng dịch enzym thô (gồm NAHase và chitinase) từ A. hydrophila H2330 để sản xuất NAG với quy mô lớn [7]. Jung và cs (2007) công bố sản xuất NAG và N-acetylchitooligosaccharide bởi dịch enzym thô từ Paenibacillus illinoisensis KJA-424 [60]. Sau thời gian 48h thủy phân β – chitin bằng chitinase từ nấm Aspergillus sp, hiệu suất thủy phân (HSTP) NAG đạt 65%. Pha trộn hai enzym thô từ Trichoderma viride và Acremonium cellulolyticus thủy phân tốt β - chitin dạng bột [57, 132]. Hiện nay, tiềm năng sản xuất NAG là sử dụng hệ enzym tái tổ hợp chitinase được nhân lên trong E.coli [76]. So với phương pháp hóa học, phương pháp thủy phân chitin bằng enzym diễn ra trong điều kiện nhẹ nhàng, không gây ô nhiễm môi trường và sản phẩm NAG có thể tinh sạch gần 100% nên được ưa thích hơn [74]. Đối với phương pháp thủy phân chitin bằng enzym thì phần chitin vô định hình thủy phân một cách dễ dàng, còn chitin liên kết chặt chẽ được thủy phân từ từ. Hỗn hợp endochitinase, exochitinase (chitobiosidase và NAHase) là cần thiết cho sự thủy phân hoàn toàn chitin, khi hàm lượng NAHase cao thì NAG tạo ra có độ tinh khiết cao. Do vậy, cấu trúc tinh thể chitin và thành phần enzym là hai yếu tố quan trọng trong sản xuất NAG bằng phương pháp enzym [27]. 1.2. CHITIN 1.2.1. Cấu tạo hóa học và tính chất lý hóa của chitin Chitin là 1 polysaccharide mạch thẳng gồm các β-(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-Dglucose. Hay nói cách khác: Chitin được cấu tạo từ các đơn phân là NAG liên kết bởi liên kết 1,4- β-glucoside và hình thành một mạng lưới các sợi có tổ chức. Cấu trúc hóa học chitin giống với cấu trúc hóa học cellulose, chitosan. Chúng chỉ khác nhau bởi các nhóm OH, -NH2, -NHCOCH3 (Hình 1.3). 7 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của chitin, chitosan, cellulose [70] Chitin có màu trắng, cứng, không đàn hồi, không tan trong nước và các dung môi hữu cơ thông thường nhưng có thể được hòa tan trong các dung môi như hexafluoro-2propanol, N,N-dimethylacetamid, hexafluroacetone, lithium thiocyanate. Ngoài ra, chitin có thể tan trong acid trichloroacetic (TCA), acid dichloroacetic (DCA). Muối LiCNS, Ca (CNS)2…có khả năng hydrat hóa mạnh mẽ để phân giải chitin [112]. Khi ở trong dung dịch HCl đậm đặc, chitin bị phân hủy hoàn toàn thành 88,5% DGlucosamine và 11,5% axit acetic, quá trình thủy phân bắt đầu xảy ra ở mối nối glucoside, sau đó là sự loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH3). Đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc sẽ tạo thành chitosan vì chitin bị mất gốc acetyl: Chitin + n NaOH (đậm đặc) Chitosan + n CH3COONa Trong cấu trúc tinh thể chitin, các chuỗi chitin tạo thành các tấm qua liên kết hydro. Cấu trúc tinh thể chitin ổn định là do liên kết hydro, tương tác kỵ nước trong phân tử và giữa các phân tử. Mỗi một chuỗi có nhiều liên kết hydro giữa các phân tử đường lân cận gọi là liên kết nội phân tử gồm liên kết hydro giữa nhóm cacbonyl với nhóm hydroxyl ở vị trí cacbon - 6 và một liên kết hydro thứ hai giữa nhóm OH ở cacbon - 3 và vòng oxi, tương tự như liên kết hydro trong chuỗi cellulose. Ngoài ra, các chuỗi còn được giữ vững bởi liên kết hydro mạnh giữa C = O và N – H [97]. Liên kết hydro lớn làm tăng cường độ cứng chuỗi tinh thể chitin. 8 Hình 1.4. Liên kết hydro nội phân tử chitin [97]. Chitin có trình tự sắp xếp cao, cấu trúc tinh thể. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X [97], người ta đã chứng minh chitin tồn tại ba dạng cấu hình: α-chitin, β-chitin và γ-chitin [45], các dạng này khác nhau về trình tự sắp xếp chuỗi trong vùng tinh thể. Dạng chitin khác nhau chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (NAG) trong mạch thể hiện Hình 1.5. Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ- chitin được mô tả sau: Hình 1.5. Dạng cấu hình α, β, γ- chitin [45]. Ba dạng đa hình chitin khác nhau về mức độ hydrat hóa, kích thước và số chuỗi chitin trong một đơn vị tế bào. -chitin (có nhiều trong vỏ tôm, cua) được phân bố rộng rãi nhất, là dạng rắn chắc và kết tinh nhất, các chuỗi được sắp xếp kiểu đối song song đều đặn [26], nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, còn có liên kết hydro giữa các lớp kề nhau. Do vậy làm đặc tính -chitin rất bền vững, cứng và không tan trong nước. Cấu trúc -chitin có thêm các liên kết hydro (được tạo bởi các nhóm hydroxymethyl (CH2OH) của các chuỗi liền kề nhau), trong khi đó không tìm thấy liên kết này ở cấu trúc β – chitin [100]. β-chitin (có nhiều trong mai mực) gồm các chuỗi song song, trong khi γ-chitin (nhiều trong nấm và nấm men) có hai chuỗi song song theo một hướng kết hợp chuỗi thứ ba với hướng đối diện song song, giữa các lớp không có loại liên kết hydro. Loại γ-chitin rất ít nghiên cứu vì nó được cho là cấu trúc lỗi của một trong hai dạng α hoặc β – chitin chứ không phải là một dạng cấu trúc thứ ba của chitin hoặc có thể coi nó là biến thể của αchitin [13]. 9 Sự phân bổ các dạng này không liên quan tới nguyên tắc phân loại vì các dạng khác nhau có thể xuất hiện trong một cơ thể, mặc dù đặc tính chức năng khác nhau: α-chitin là dạng đầy đủ nhất, rất cứng [121]. So sánh -chitin với ß-chitin, ß-chitin dễ bị thủy phân bởi enzym hơn nhưng -chitin tồn tại trong tự nhiên phổ biến hơn. β-chitin và γ-chitin có tính bền, mềm dẻo và nhiều chức năng sinh lý hơn. Dạng β có thể chuyển đổi sang dạng α bằng xử lý với kiềm nhưng không thể chuyển ngược lại và dạng γ-chitin có thể chuyển đổi sang α-chitin bằng cách xử lý với lithium thiocyanate [99]. 1.2.2. Nguồn thu nhận chitin Chitin được tách lần đầu tiên từ nấm vào năm 1811 [23]. Chitin là hợp chất polimer có mặt từ nhiều nguồn khác nhau. Chitin là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Ở động vật bậc cao, chitin là thành phần chủ yếu trong mô da, nó giúp sự tái tạo và gắn liền các vết trên da. Ở thực vật, chitin có trong thành tế bào nấm họ Zygenmyctes, sinh khối nấm mốc, một số loại tảo… Các nguồn chitin từ công nghiệp thủy sản bao gồm vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực ống và mực nang. Nhìn chung, hàm lượng chitin trong phế liệu giáp xác chiếm khoảng 10 – 60% so với trọng lượng khô [148]. Hiện nay chitin được tách chiết từ vỏ giáp xác chủ yếu là bằng các phương pháp hóa học; ứng dụng công nghệ điện hóa để tách chiết và tinh chế chitin từ vỏ đầu tôm [6]; trong thời gian gần đây các phương pháp sinh học đã bắt đầu nghiên cứu sử dụng sản xuất chitin [14]. Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản chiếm 30 – 35% tổng lượng nguyên liệu ở Việt Nam. Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm 70 - 80% công suất chế biến. Các nhà máy chế biến thủy sản tiêu thụ lượng lớn nguyên liệu nên đã thải ra lượng đáng kể phế liệu trong đó phế liệu vỏ - đầu tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ là chủ yếu. Ở Việt Nam, hàng năm các nhà máy chế biến đã thải bỏ lượng phụ phẩm giáp xác khá lớn khoảng 70000 tấn. Riêng tỉnh Khánh Hòa, lượng phế liệu này khoảng 2257 tấn/ năm. Phế liệu này thải trực tiếp ra môi trường và gây ô nhiễm lớn, nếu đem xử lý chất thải thì chi phí rất lớn. Chính vì vậy, phế liệu ngành thủy sản Việt Nam (vỏ tôm, ghẹ,..) cần được tận dụng nhằm nâng cao lợi ích kinh tế, đồng thời giải quyết bài toán ô nhiễm môi trường do ngành chế biến thủy sản mang lại. 1.3. CHITINASE 1.3.1. Hệ chitinase Hệ thống chitinase thủy phân chitin gồm: Endochitinase (E.C 3.2.1.14), exochitinase (EC 3.2.1.52) gồm 1,4-β-chitobiosidase (E.C. 3.2.1.30) và β-N-acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.96). 10 1.3.2. Đặc tính sinh hóa Chitinase từ các nguồn khác nhau có đặc tính sinh hóa tương đối khác nhau. Chitinase (E.C 3.2.1.14) có khối lượng phân tử khoảng 20 kDa đến 90 kDa. Khối lượng phân tử chitinase vi khuẩn từ 20 kDa đến 60 kDa, nhỏ hơn chitinase côn trùng (khối lượng phân tử từ 40 - 85 kDa); khối lượng phân tử chitinase thực vật giống khối lượng phân tử chitinase côn trùng (khoảng 40 kDa đến 85 kDa) [16]. Khối lượng phân tử chitinase từ nấm mốc khoảng 27 kDa đến 190 kDa. Chẳng hạn: khối lượng phân tử chitinase từ Aspergillus sp và Coccidioides immitis khoảng 83 đến 97 kDa. Hầu hết chế phẩm chitinase từ nấm cho nhiều hơn 1 loại enzym như: 7 loại enzym gồm 1,4-βchitobiosidase (40 kDa) [50], hai loại NAHase (102 và 73 kDa) bốn loại endochitinases (52, 42, 33 và 31 kDa) trong dịch chitinase từ Trichoderma harzianum [49]; ít nhất hai loại enzym từ Talaromyces flavus [81]; hai loại exochitinase và một endochitinase từ nấm ký sinh loại lớn Stachybotrys [155]. Chế phẩm chitinase chứa ít nhất sáu enzym khác nhau từ nấm Metarhizium anisopliae [61]. Endochitinase và exochitinase trong dịch enzym thô từ Aeromonas sp. PTCC 1691 [57]. Dịch chitinase từ Penicillium oxalicum chứa NAHase (132 kDa) [116] và endochitinase (54,9 kDa) [118]. Nhiệt độ tối ưu đối với chitinase từ Streptomyces sp. M-20 là 30ºC [66]; từ Streptomyces rimosus là khoảng 40 - 45ºC [24]; từ Sanguibacter là 37ºC [180]; từ Penicillium ochrochloron MTCC 517 là 40oC [108]; từ Aspergillus sp là 40ºC [132],... Hoạt độ chitinase từ Aspergillus sp khi để nhiệt độ ở 45ºC và 50ºC trong 63 h còn tương ứng lần lượt 90%, 50% so với hoạt độ ở điều kiện nhiệt độ tối ưu [132]. Hoạt độ tương đối của chitinase tinh sạch từ Lactobacillus plantarum WCFS1 đạt cao nhất ở khoảng nhiệt độ 35ºC - 40ºC trong thời gian 30 phút, nhưng giảm mạnh khi nhiệt độ trên 55ºC; ở nhiệt độ 37ºC và 50ºC, hoạt tính enzym còn lại lần lượt 82% và 58% sau thời gian 168 h; ở nhiệt độ lần lượt 37ºC và 50ºC, hoạt tính enzym còn lại ½ sau thời gian tương ứng 20 ngày và 8,4 ngày [12]. Chitinase tinh sạch từ Vibrio alginolyticus TK-22 hoạt động tối ưu ở 45ºC và ổn định ở 40ºC trong 30 phút [104]; chitinase tinh sạch từ Vibrio sp. P-6-1 ổn định ở 40ºC mất hoàn toàn hoạt tính ở 55ºC trong thời gian 30 phút [151]. Nhiệt độ tối ưu của hầu hết chitinase từ nấm mốc khoảng 20 - 40ºC [50, 77, 81, 82, 111, 159]. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu của chitinase chịu nhiệt trong khoảng 45ºC đến 80ºC như: Nhiệt độ tối ưu đối với chitinase từ Stenotrophomonas maltophilia là 45ºC [160]; từ Serratia marcescens là 50ºC [183]; từ Thermomyces lanuginosus là 55ºC, từ Aspergillus protuberus là 55ºC [48]; từ Talaromyces emersonii là 65ºC [93], hoạt độ chitinase từ Talaromyces emersonii khi để nhiệt độ 70ºC trong 20 phút hoặc để nhiệt độ 65ºC trong 25 phút đều còn 50% so với hoạt độ ở điều kiện nhiệt độ tối ưu [81]. Nhiệt độ tối ưu đối với chitinase từ Streptomyces thermoviolaceus OPC-520 là 80ºC [157]. Endochitinase và β-N- 11 acetylhexosaminidase từ A. flavus và F. oxysporum đều có nhiệt độ tối ưu 62ºC, nhưng các enzym này từ P. monoverticillium hoạt động tốt nhất tại 52ºC [147]. Chitinase từ Penicillium thường hoạt động ổn định ở nhiệt độ khá cao tới 45ºC; chitinase từ P. aculeatum hoạt động ổn định ở 50ºC [20]. Rodriguez và cs (1993) khẳng định nhiệt độ tối ưu đối với chitobiosidase và chitinase từ P. oxalicum lần lượt là 45ºC và 50ºC. Cả chitobiosidase và chitinase đều bền ở 45ºC trong thời gian 20 h [117]. Rodriguez và cs (1995) cho rằng chitinase tinh sạch từ P. oxalicum hoạt động tối ưu tại nhiệt độ 35ºC và ổn định ở nhiệt độ lên tới 45ºC trong thời gian 120 phút. Hoạt tính chitinase bị mất một nửa ở 45ºC và 50ºC trong khoảng thời gian tương ứng 53 phút và 23 phút [116]. Chitinase từ chủng vi sinh vật khác nhau hoạt động trong khoảng pH khác nhau. Khoảng pH hoạt động của chitinase tinh sạch từ Aeromonas hydrophila H- 2330 là pH 5,0 - 8,0 [52]; từ Aeromonas sp. No. 10S-24 chitinase là pH 4,0 - 9,0 [158]; từ Bacillus sp. BG-11 là pH 7,5 - 9,0 [17]; từ Bacillus 13.26 là pH 7,0 - 8,0 [182]; từ Bacillus sp. NCTU2 là pH 6,8 - 8,0 [165]; từ Vibrio sp là pH 4,0 - 9,0 [184]; từ Myrothecium verucaria là pH 4,0 - 6,5 [163]. Chitinase nấm mốc hoạt động trong vùng pH 4 - 7. Theo Lee và cs (2009) công bố chitinase từ nấm sợi hoạt động tốt trong vùng axit nhẹ pH 4,0 - 7,0 [80]. Chitinase từ từng chủng vi sinh vật hoạt động tốt nhất tại pH tối ưu riêng. Chitinase hoạt động tốt nhất tại pH tối ưu trong khoảng pH 3,5 - 5,5 như: pH tối ưu đối với chitinase từ Aspergillus sp là 3,5 [132], từ Aeromonas sp. No. 10S-24 là pH 4,0 [158]; từ Sanguibacter là 4,6 [146]; từ Aspergillus protuberus [48] và Streptomyces sp. M-20 đều là 5,0 [66]; từ Talaromyces emersonii CBS81470 là pH 5,0 - 5,5 [93]; từ Bacillus cereus [113]. Chitinase hoạt động cao nhất tại pH tối ưu trong khoảng pH 6,0 - pH 7,5 như: từ Enterobacter sp. G-1 là 6,0 [106]; từ Serratia marcescens là 6,0 [183]; từ Bacillus sp. NCTU2 là pH 6,3 [165]; từ Vibrio alginolyticus H-8 [104] và Vibrio sp [184] đều là 6,5; từ Stenotrophomonas maltophilia là 6,8 [160]; từ Stenotrophomonas maltophilia là 6,8 [160]; từ Streptomyces rimosus [24] cũng như từ Penicillium ochrochloron MTCC 517 là 7,0;.. Chitinase tinh sạch từ Lactobacillus plantarum WCFS1 hoạt động tối ưu tại pH 7,5, bị vô hoạt khi pH < 5, nhưng hoạt tính chitinase còn lại 80% ở 37ºC và khoảng pH 5 - 10 [12]. Ngoài ra chitinase ưa kiềm hoạt động ở pH tối ưu như pH 8,0 từ Bacillus circulans No.4.1; pH 9,2 từ Beauveria bassianse [146]; pH 11,0 từ Streptomyces sp [114]. So sánh với một số chitinase từ các chủng Penicillium, ta thấy chitinase từ P. aculeatum có pH tối ưu là 5,5 [20]; chitinase từ P. citrinum có hoạt tính mạnh nhất tại pH 6, bền ở khoảng pH từ 6 - 7 [4]. β- N - acetylglucosaminidase và chitinase từ P. oxalicum có pH hoạt động tối ưu lần lượt 4,5 và 6,5; bền trong khoảng pH lần lượt 3,5 đến 7,0 và 4,0 đến 8,0 [117]. Chitinase tinh sạch từ P. oxalicum hoạt động tối ưu ở pH 5,0 và ổn định ở khoảng pH từ 4,0 đến 6,0 trong thời gian 120 phút. Enzym này bị vô hoạt nhanh khi pH < 4 12 hoặc pH > 7 [116]. Chitinase bị mất hoạt tính, nhiễm vi sinh vật trong khoảng thời gian bảo quản nhất định, nên với mục đích bảo quản enzym các chất phụ gia như NaCl, glycerol, benzoat natri,.. được bổ sung kết hợp với giải pháp nhiệt độ thấp. Pradeep và cs (2015) đã đưa ra các phương pháp bảo quản chitinase từ Streptomyces sp. CS147: chế độ nhiệt độ 4ºC, nhiệt độ phòng từ 25 - 30ºC kết hợp với chất phụ gia như Na2S2O4 (0,1% w/v), KCl (15% w/v) và glycerol (30% v/v) để bảo quản chitinase từ Streptomyces sp. CS147. Ở nhiệt độ 4ºC, chitinase tinh sạch vẫn giữ nguyên 100% hoạt tính trong 18 tuần; nhưng còn lại 80% hoạt tính khi bổ sung chất phụ gia bảo quản như Na2S2O4, KCl và glycerol và còn lại 60% hoạt tính khi bảo quản bởi chất phụ gia NaN3. Mặt khác ở nhiệt độ phòng (từ 25 - 30ºC), không dùng chất phụ gia bảo quản thì chitinase mất hoàn toàn hoạt tính sau thời gian 14 tuần, nhưng hoạt tính chitinase vẫn giữ gần như 100% khi bảo quản bởi Na2S2O4, KCl và glycerol trong thời gian 14 tuần, hoặc bảo quản bằng NaN3 trong thời gian 11 tuần [114]. 1.3.3. Cơ chế thủy phân chitin bởi chitinase thành NAG Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch chitin và chitooligomer, sản phẩm tạo thành là hỗn hợp các chitooligomer trọng lượng phân tử khác nhau (diacetylchitobiose, chitotriose, chitotetraose,…), nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (NAG)2 do hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa [123]. Sau đó 1,4-β-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(NAG)n với n ≥ 3] từ đầu không khử và cho sản phẩm chính là diacetylchitobiose (NAG)2 [38], không chứa NAG hoặc chitooligomer. β-Nacetylhexosamindase phân cắt diacetylchitobiose cũng như các polymer chitin cao hơn gồm chitotriose và chitotetraose thành NAG [76]. Chính vì thế, nên phân biệt hoạt tính giữa endochitinase, 1,4-β-chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase. Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là NAG (Hình 1.6). Cơ chế thủy phân chitin thành NAG qua 2 giai đoạn: đầu tiên chitinase thủy phân chitin mạch dài thành các chitooligosaccharide ngắn mạch hơn, sau đó NAHase thủy phân chitooligosaccharide ngắn mạch ngắn thành NAG [57]. Tương tự, một số tác giả đã nghiên cứu quá trình thủy phân chitin bởi chế phẩm enzym chứa cả endochitinase và NAHase thành NAG và đều cho rằng đầu tiên endochitinase thủy phân chitin thành N-acetyl chitooligosaccharides, sau đó N-acetyl chitooligosaccharides tiếp tục lần lượt được thủy phân bởi NAHase thành NAG [19, 145, 146]. Mặt khác, Binod và cs (2007) cho rằng thủy phân chitin thành NAG qua một giai đoạn thủy phân thì chế phẩm enzym thô từ Penicillium aculeatum NRRL 2129 và từ Trichoderma harzianum TUBF 927 phải chứa cả endochitinase và chitobiosidase. Endochitinase hoạt tính cao nhất từ Penicillium aceleatum NRRL 2129 và chitobiosidase hoạt tính cao nhất từ Trichoderuma harzianum TUBF 927 thủy phân chitin thành NAG 13 đạt hiệu suất thu nhận cao [19]. Ngoài ra, để thủy phân chitin bằng enzym thành NAG đạt hiệu suất thu nhận cao chỉ qua một giai đoạn thì chế phẩm enzym phải chứa đồng thời cả endochitinase và NAHase, đặc biệt hoạt tính NAHase cao và hoạt tính endochitinase phải tương đối thấp [9, 19, 148]. Binod và cs (2007) sản xuất NAG bằng cách dùng endochitinase hoạt tính cao nhất từ Penicillium aceleatum NRRL 2129 và chitobiosidase hoạt tính cao nhất từ Trichoderuma harzianum TUBF 927 để thủy phân chitin thành NAG đạt hiệu suất thu nhận cao [19]. Sashiwa và cs (2002) cũng khẳng định endochitinase và exochitinase trong dịch enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 đều hỗ trợ nhau trong thủy phân cơ chất chitin thành NAG [129]. Hình 1.6. Minh họa cơ chế hoạt động của chitinase 1.3.4. Một số giải pháp kỹ thuật thủy phân chitin thu nhận NAG 1.3.4.1. Các giải pháp tiền xử lý chitin Chitin không hòa tan trong nước bởi tính kỵ nước, độ kết tinh cao, các liên kết hydro bền vững, nên nó khó bị thủy phân bởi enzym. Sự thủy phân chitin tự nhiên bởi enzym bị hạn chế có thể là do khả năng tiếp cận với liên kết β-glycosidic trong nội mạch cấu trúc tinh thể gặp khó khăn [27]. Mặt khác, khi thủy phân chitin bằng enzym thì phần chitin cấu trúc vô định hình dễ bị thủy phân hơn phần chitin cấu trúc tinh thể liên kết chặt chẽ [27]. 14 Do đó để nâng cao hiệu quả thủy phân chitin thành NAG bởi chitinase, nhiều công trình nghiên cứu đã sử dụng phương pháp xử lý chitin bằng hóa học [64], nghiền bi [101], bằng sóng siêu âm [43]. Ajavakom và cs (2012) cho thấy sóng siêu âm và vi sóng làm tăng quá trình thủy phân chitin thành NAG bằng acid [10]. A). Xử lý bởi tác nhân hóa học Karube và cs (1993) đã nghiên cứu thấy rằng tác động nhiệt lên chitin trong dung môi kỵ nước hoặc chất hoạt động bề mặt sẽ làm suy yếu liên kết hydro, tương tác kỵ nước của cấu trúc tinh thể và do đó tạo thuận lợi cho hoạt động của các enzym phân hủy [64]. Nới lỏng cấu trúc chitin bằng xử lý bởi các hydrocacbon mạch thẳng hoạt động bề mặt (như: Triton X-100, Tween 20, hexane, heptane, nonane, decane), hydrocacbon vòng thơm (benzene, toluene, o-oxylene, m-xylene, p-xylene), hoặc xử lý kết hợp làm nóng như đun sôi, nồi hấp, khuấy nhiệt, hoặc kết hợp siêu âm đã được nghiên cứu. Phương pháp xử lý như vậy giúp phá hủy cấu trúc tinh thể và tăng tỷ lệ chuyển đổi của chitin. Chitin khuấy nhiệt ở 100ºC với urea 0,1 M; 0,2 M; 0,3 M; trong thời gian lần lượt 30 phút và 2 h làm tăng tỷ lệ chuyển đổi chitin từ 7% đến 13,9% so với nguyên liệu ban đầu không qua xử lý khi thủy phân bằng lysozyme. Ngoài ra xử lý chitin với dodecane kết hợp siêu âm giúp tăng tỉ lệ chuyển đổi từ 4,4% đến 13,1% [64]. Bên cạnh đó, liên kết hydro và tương tác kỵ nước là cần thiết để duy trì cấu trúc ba chiều của enzym. Các enzym phân hủy chitin có thể bị bất hoạt trong điều kiện nghiêm ngặt. Vì vậy cần sử dụng nồng độ thấp các chất hóa học để hoạt động xúc tác enzym vẫn diễn ra trong phản ứng thủy phân chitin [27]. Gần đây, endochitinase chịu nhiệt nóng tốt đã được tìm thấy trong dịch dùng lên men của vi khuẩn, và có khả năng tương thích cao với chất hoạt động bề mặt sodium dodecyl sulfate (SDS) [27]. Trong tương lai, những enzym này có thể được áp dụng để nâng cao hiệu quả thủy phân chitin. B). Xử lý bởi tác nhân cơ học Cellulose từ rơm rạ là polysaccharide với cấu trúc tinh thể giống chitin có thể thay đổi mức độ tinh thể từ 74,2% xuống 4,9% bằng nghiền búa và hơn 50% cellulose từ rơm bị chuyển hóa thành glucose khi thủy phân enzym trong điều kiện nhẹ nhàng. Rơm cắt ngắn 5 – 8 cm đưa đi nổ hơi sau đó nghiền thành bột mịn kích thước 60 µm giúp quá trình thủy phân thu đường khử cao nhất. Tiến hành nghiền kết hợp nổ hơi có thể thủy phân 100% các chất lignocellulose bằng enzym [150]. Nghiền tác động làm chitin thay đổi cấu trúc và mức độ tinh thể [105]. Bên cạnh đó, sau xử lý bằng phương pháp nghiền, kích thước chitin thường giao động từ 50 µm đến 500 µm [27]. Do vậy, nghiền đã làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc của chitin với enzym nên giúp thủy phân tốt. 15 Chitin có kích thước khác nhau bị thủy phân bởi dịch enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 trong thời gian 10 ngày thành NAG đạt hiệu suất thu nhận khoảng 64% - 77%. Hầu hết NAG có độ tinh sạch 100% được sản xuất bởi dịch enzym này [129]. Ảnh hưởng giải pháp xử lý cơ học hoặc xử lý hóa học lên khả năng thủy phân chitin được Kim và cs (1998) nghiên cứu so sánh và khẳng định chitin cua hoặc chitin tôm đã xử lý hóa học (gel chitin) cho lượng NAG tạo thành cao hơn so với bột chitin cua hoặc tôm kích thước từ 180 - 250 μm [67]. Cùng chung nồng độ cơ chất chitin và thời điểm thủy phân 24 h, chế phẩm chitinase thô đã được cô đặc từ Penicillium monoverticillium CFR 2, từ Aspergillus flavus CFR 10 và từ Fusarium oxysporum CFR 8 thủy phân cơ chất gel chitin (chitin được xử lý bằng phương pháp hóa học) thành NAG với nồng độ lần lượt 95,6; 96,6 và 96,1 mmol/l. Trong khi đó, các chủng này lần lượt thủy phân cơ chất tinh thể α-chitin thành NAG đạt nồng độ lần lượt 10,11; 6,85 và 10,7 mmol/l [147] Trong số các dạng chitin (gel chitin, bột chitin kích thước khác nhau, chitin xử lý bởi tiệt trùng với 1,0% dimethylacetamide, chitin xử lý bởi tiệt trùng với 0,1% H2SO4), Kim và cs (1998) cho rằng bột chitin kích thước 180 - 250 μm giúp Serratia mareescens sinh tổng hợp chitinase cao nhất, nhưng kích thước < 180 μm hoặc > 250 μm làm giảm sinh tổng hợp chitinase [67]. C). Xử lý bởi tác nhân vật lý Phương pháp hấp và nổ hơi được sử dụng làm phồng hạt chitin, phương pháp này tăng hiệu quả khi kết hợp với dimethyl acetimide, và H2SO4 nồng độ thấp (0,1%) để phá vỡ liên kết hydro trong liên kết chuỗi chitin [51]. Nhiệt độ nổ hơi khoảng 160ºC đến 238ºC, giới hạn có thể lên tới 400ºC, sau thời gian từ 1 đến 10 phút thì hơi được xả đột ngột bởi xilanh, tạo hiện tượng vỡ cấu trúc vật liệu, làm khu vực tiếp xúc bề mặt tăng lên, có thể giúp phản ứng enzym tăng đến 10 lần so với vật liệu không được xử lý. Cơ chế dựa vào giảm áp suất đột ngột, nguyên liệu bị nén và nổ [46, 98]. Chitin đã được quan sát qua sự thay đổi cấu trúc sau nổ hơi cho thấy giảm 11,28% các chỉ số tinh thể khi xử lý với tỷ lệ chitin/nước là 0,1 g/ml [43]. D). Xử lý bởi tác nhân bức xạ Chiếu xạ bao gồm các tia gamma, chùm tia điện tử (electron), tia bức xạ lò vi sóng. Vi sóng có tần số 0,3 - 300 GHz nằm giữa ranh giới tia hồng ngoại và bức xạ sóng cao tần có thể chuyển hóa năng lượng điện từ thành năng lượng nhiệt thúc đẩy phản ứng hóa học và phản ứng enzym [120]. 16 Tia bức xạ có thể ưu tiên phân tách các liên kết glucoside trong chuỗi phân tử. Chiếu xạ ở mức cao có thể dẫn đến sự phân hủy các oligosaccharide và các cấu trúc vòng glucose. Tuy nhiên, các phương pháp chiếu xạ là tốn kém và khó khăn trong việc áp dụng công nghiệp [98]. E). Xử lý bởi tác nhân sóng siêu âm Sóng siêu âm gây biến dạng nén giãn môi trường làm cho các phân tử liên tục bị ép lại và giãn ra dao động xung quang vị trí cân bằng dẫn đến sinh nhiệt. Lực tác động này đủ lớn để thắng lực hút giữa các phân tử, tạo thành lỗ vi mô trên nguyên liệu. Nếu quá trình này xảy ra trong nước thì những lỗ đó sẽ bị hơi nước hoặc các khí hoà tan choán đầy, hình thành bóng bọt rồi dẫn đến hiện tượng vỡ bóng bọt, tạo nhiệt độ cao trong nguyên liệu [137]. Chitosan là dẫn xuất của chitin, xử lý siêu âm làm cấu trúc của nó thay đổi bằng cách giảm liên kết hydro giữa các phân tử và nội phân tử và làm giảm trọng lượng phân tử do tạo thành lỗ hổng và hiện tượng vỡ bóng bọt. Khi xử lý chitosan bằng siêu âm kết hợp hóa chất giúp giảm 22,34% đến 27,26% khối lượng phân tử ban đầu, mức độ tinh thể giảm từ 19,16% xuống 9,04%. Có thể thấy nhiều yếu tố tác động lên cấu trúc tinh thể sẽ là hiệu quả hơn nếu kết hợp các tác động khi xử lý. Tương tự siêu âm làm giảm mức độ tinh thể của chitin và do vậy nâng cao hiệu quả thủy phân [43]. 1.3.4.2. Điều kiện thủy phân chitin ra NAG bởi chế phẩm chitinase Chế phẩm chitinase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau có khả năng thủy phân chitin thành NAG cao nhất ở các điều kiện thủy phân khác nhau. A). Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả năng thủy phân chitin thành NAG Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới khả năng thủy phân chitin thành NAG bởi chitinase. Khoảng nhiệt độ thủy phân chitin bằng chế phẩm chitinase thành NAG chính là khoảng giới hạn nhiệt độ hoạt động chitinase. Chitinase được sinh tổng hợp từ vi sinh vật khác nhau sẽ có khoảng nhiệt độ hoạt động khác nhau. Ở nhiệt độ hoạt động tối ưu, chitinase có khả năng thủy phân chitin thành NAG là cao nhất. Cụ thể: Nhiệt độ tối ưu cho thủy phân cơ chất gel chitin thành NAG là 40ºC bằng chế phẩm chitinase thô từ chủng vi sinh vật như Aeromonas sp. GJ-18 [74], Aspergillus sp [132], Penicillium sp LYG 0704 [80], Penicillium chrysogenum [107], hoặc bằng NAHase tinh sạch từ P. oxalicum [116, 118],... Chế phẩm chitinase từ Trichoderma harzianum có khả năng thủy phân chitin trong khoảng nhiệt độ rộng từ 25 - 60ºC và nhiệt độ tối ưu cho thủy phân chitin thành NAG là 40ºC [59]. Ở nhiệt độ 37ºC, chế phẩm chitinase từ Aeromonas sp. PTCC 1691 thủy phân gel chitin thành NAG cao nhất đạt hiệu suất thu nhận 79% [57],.. Chế phẩm enzym thô từ Aeromonas sp chứa hoạt tính NAHase và chitobiosidase; ở nhiệt độ trên 50ºC, NAHase bị vô hoạt, nhưng chitobiosidase lại ổn định. Nên ảnh hưởng của nhiệt độ tới thủy phân gel chitin thành NAG bởi chế phẩm enzym thô từ Aeromonas sp 17 đã được các nhà khoa học nghiên cứu. Kuk và cs (2015) cho rằng chế phẩm enzym thô từ Aeromonas sp. GJ-18 thủy phân gel chitin ở nhiệt độ dưới 45ºC cho sản phẩm chính là NAG, cùng với lượng nhỏ (NAG)2 và (NAG)3, nhưng nhiệt độ thủy phân trên 50ºC thì (NAG)2 là sản phẩm chính [74]. Ngoài ra Kuk và cs (2005) cho rằng trong 120 h thủy phân, ở nhiệt độ 45ºC, NAG là sản phẩm chính (chiếm 94%) với hiệu suất thu nhận đạt 74%, nhưng ở 55ºC thì (NAG)2 lại là sản phẩm chính (chiếm 86%) [73]. Trong 120 h thủy phân, enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 thủy phân gel chitin cho sản phẩm tạo thành gồm 74% NAG và 4,8% (NAG)2 ở nhiệt độ 45ºC, nhưng nhiệt độ 55ºC thì sản phẩm tạo thành gồm 3,9% NAG, 34,7% (NAG)2 và 1,6% (NAG)3 [129]. B). Ảnh hưởng pH tới khả năng thủy phân chitin thành NAG pH môi trường ảnh hưởng trực tiếp tới trung tâm hoạt động của enzym. Chế phẩm chitinase thô từ vi sinh vật có khả năng thủy phân cơ chất chitin thành NAG trong khoảng pH nhất định và khả năng thủy phân này đạt cao nhất tại pH tối ưu. pH tối ưu cho sự thủy phân gel chitin thành NAG bởi chế phẩm enzym từ Aspergillus sp là pH 3,5 [132], bởi chế phẩm chitinase thô từ Aeromonas sp. GJ-18 là pH 5 [74], bởi chế phẩm enzym thô từ Aeromonas sp. PTCC 1691 là pH 8. Khoảng pH tối ưu cho chitinase từ Penicillium oxalicum thích hợp để thủy phân chitin là 4,5 - 6,5 [116]. C). Ảnh hưởng nồng độ cơ chất tới khả năng thủy phân chitin thành NAG Ở tỷ lệ gel chitin/ enzym là 10 mg/U trong điều kiện tối ưu và giữ nồng độ enzym không đổi, Kuk và cs (2005) cho rằng chế phẩm chitinase thô từ Aeromonas sp. GJ-18 thủy phân gel chitin thành NAG đạt HSTP lớn nhất 94,9% [74]. Jamialahmadi và cs (2011) khẳng định ở điều kiện tối ưu và tỷ lệ gel chitin/enzym là 0,5 mg/U thì chế phẩm enzym thô từ Aeromonas sp. PTCC 1691 thủy phân gel chitin thành NAG đạt hiệu suất thu nhận lớn nhất 79%; khi giữ nồng độ enzym không đổi, nồng độ cơ chất gel chitin tăng từ 5 đến 10 mg/ml thì HSTP ra NAG tăng mạnh, nhưng nồng độ gel chitin tăng thêm nữa lại làm HSTP NAG giảm xuống [57]. Sukwattanasinitt và cs (2002) khẳng định ảnh hưởng nồng độ cơ chất lên NAG tạo thành khi dùng hỗn hợp enzym (9:1 cellulase Ac và lipase An) như sau: tăng nồng độ β-chitin và giữ nồng độ enzym không đổi dẫn đến hiệu suất thu nhận NAG giảm xuống. Cụ thể nồng độ cơ chất tăng từ 10 đến 40 mg/ml làm hiệu suất thu nhận NAG giảm một nửa từ 61% xuống 28%. Và điều này đã được giải thích rằng: nồng độ cơ chất tăng làm tăng độ nhớt, dẫn đến giảm sự khuếch tán giữa enzym và cơ chất nên HSTP NAG giảm [144]. D). Ảnh hưởng thời gian và nồng độ enzym tới khả năng thủy phân chitin thành NAG Thời gian thủy phân không những ảnh hưởng đến chi phí của quá trình mà còn ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm sau thủy phân. Xác định thời gian thủy phân thích hợp sẽ giúp tiết kiệm chi phí, nâng cao hiệu suất của quá trình. 18 Theo nghiên cứu của Pichyangkura và cs (2002), α-chitin và β-chitin có thể thủy phân hoàn toàn với chitinase (EC 3.2.1.14) và β-N-acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.52) để sản xuất NAG. Chitinase từ B. cepacia TU09 thủy phân β-chitin và α-chitin tương ứng trong vòng 24 h và 168 h cho hiệu suất thu nhận NAG lớn hơn 85%, trong khi đó chitinase từ B. licheniformis SK-1 thủy phân hoàn toàn β-chitin trong 144 h đạt hiệu suất thu nhận NAG cuối cùng là 75% cùng 20% chitobiose [110]. Trong điều kiện thủy phân tối ưu, Kuk và cs (2005b) khẳng định chế phẩm chitinase từ Aeromonas sp. GJ-18 thủy phân gel chitin thu nhận NAG với hiệu suất thu nhận NAG 83,0% và 94,9% tương ứng thời gian thủy phân 120 h và 216 h [74]. Bên cạnh đó, Kuk và cs (2005a) cho rằng enzym thô từ Aeromonas sp thủy phân gel chitin thành NAG với hiệu suất 74% trong 120 h thủy phân [73]. Hiệu suất thu nhận NAG khoảng 66% - 77% tại thời điểm 240 h thủy phân bột αchitin bởi chế phẩm enzym từ A. hydrophila H-2330 được công bố bởi Sashiwa và cs (2002) [129]. Khi thủy phân chitin thành NAG bởi chế phẩm enzym với nồng độ càng cao thì thời gian thủy phân càng giảm. Để tiết kiệm thời gian và lựa chọn nồng độ enzym hợp lý, nhiều nhà nghiên cứu đã khảo sát nồng độ enzym đối với các loại chế phẩm chitinase thô khác nhau ảnh hưởng tới hiệu suất thủy phân chitin thành NAG trong khoảng thời gian khác nhau như: Kuk và cs (2005) cho rằng nồng độ enzym của chế phẩm chitinase thô từ Aeromonas sp. GJ-18 càng cao thì NAG tạo thành càng lớn khi cùng chung nồng độ cơ chất gel chitin; tuy nhiên lượng NAG tạo thành không khác nhau đối với tỷ lệ nồng độ enzym và cơ chất khoảng 10 U/100 mg và 8 U/100 mg; hiệu suất thủy phân gel chitin ra NAG tăng mạnh ở 120 h nhưng gần như không đổi sau 168 h [74]. Jamialahmadi và cs (2011) cho rằng ở điều kiện tối ưu, chế phẩm enzym thô từ Aeromonas sp. PTCC 1691 thủy phân gel chitin thành NAG lớn nhất khi tỷ lệ enzym/gel chitin là 2 U/mg, hiệu suất thu nhận NAG tăng dần và đạt lớn nhất 79% tại thời điểm 24 h nhưng sau đó gần như không đổi; trái lại không khác nhau khi tỷ lệ nồng độ enzym và cơ chất từ 4 U/10 mg và 8 U/10 mg [57]. Ngoài ra Jung và cs (2007) công bố enzym thô từ Paenibacillus illinoisensis KJA-424 thủy phân chitin thành NAG tăng liên tục trong 24 h và đạt hiệu suất thu nhận NAG cao nhất 62,2% tại 24 h [60] . Chitinase từ Burkholderia cepacia TU09 thủy phân β-chitin (bột chitin mai mực kích thước 3 µm) và α-chitin (bột chitin vỏ cua kích thước 14 μm) thành NAG với hiệu suất thu nhận hơn 85% trong thời gian tương ứng 24 h và 168 h. Chitinase từ Bacillus licheniformis SK-1 thủy phân hoàn toàn β-chitin trong 144 h, cho hiệu suất thu nhận NAG 75%. Ở tỷ lệ enzym/cơ chất β-chitin là U/100 mg, B. cepacia TU09 thủy phân β-chitin cho hiệu suất thu nhận NAG 90% trong 24 h thủy phân [110]. 19 Binod và cs (2007) sản xuất NAG bằng cách dùng endochitinase hoạt tính cao nhất từ Penicillium aceleatum NRRL 2129 và chitobiosidase hoạt tính cao nhất từ Trichoderuma harzianum TUBF 927 để thủy phân chitin thành NAG đạt hiệu suất thu nhận cao [19]. Jamialahmadi và cs (2011) công bố endochitinase và exochitinase trong dịch enzym thô từ Aeromonas sp. PTCC 1691 [57]; Sashiwa và cs (2002) cũng khẳng định endochitinase và exochitinase trong dịch enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 đều hỗ trợ nhau trong thủy phân cơ chất chitin thành NAG [129]. Để enzym thủy phân chitin thành NAG đạt hiệu suất thu nhận cao, thì chế phẩm enzym phải chứa endochitinase với hoạt tính thấp và β-N-acetylhexosaminidase hoạt tính cao [9, 19, 148]. 1.4. SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ VI SINH VẬT Trong các nguồn thu nhận chitinase thì chitinase từ vi sinh vật là quan trọng và chiếm số lượng nhiều hơn cả. Nhiều nghiên cứu thu hồi dịch chitinase thô từ vi sinh vật như: thu hồi dịch chitinase thô từ Bacillus licheniformis SK-1, Aeromonas hydrophila H2330 [129], Aeromonas sp. GJ-18 [74]. Aspergillus niger, Carcica papaya L và Acremonium cellulolyticus [128], Trichoderma viride [7], từ một số chủng nấm mốc như Penicillium monoverticillium CFR 2, Aspergillus flavus CFR 10 và Fusarium oxysporum CFR 8 [146],.. 1.4.1. Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase Vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau trong đất, phế thải giáp xác, khu vực bón phân, và dòng suối nóng [182]. Hầu hết chitinase được tạo ra từ vi sinh vật - phân lập từ mẫu đất biển. Chitinase được tạo ra nhằm phân giải chitin trong môi trường cung cấp nguồn cacbon cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Nguồn vi sinh vật đáng kể có khả năng sinh tổng hợp chitinase là vi khuẩn. Chitinase vi khuẩn tạo ra phần lớn từ họ Alteromonas [157], Bacillus (B. megaterium, B. licheniformis, B. circulans,..) [99], Escherchia [166], Pseudomonas (P. aeruginosa , P. maltophilia) [164], Serratia (S. marcescens, S. liquefaciens), Arthrobacter, Beneckea, Enterobacter Chromobacterium, Klebriella, Clostridium (C. perfringens, C. puraputrificum,..), Vibrio (V. fluvialis, V. harveyi, V. vulnificus). Nguồn xạ khuẩn: Chitinase xạ khuẩn đại đa số được tạo ra từ họ Streptomycetes (S. viridificans, S. aureofaciens, S. coelicolor, S. glaucescens, S. kanamycitis, S. lividans, S. parvies và S. venezuelae) [44]. Nguồn nấm sợi: Chitinase từ nấm mốc phần lớn do họ Trichoderma và Aspergillus (A. nidulans,…) sinh tổng hợp tạo ra, tiếp đó là Penicillium (P. citrinum [4], P. janthinellum [36], P. aculeatum NRRL. 2129 [20], P. chrysogenum [107], Pencillium sp. 20