Tài liệu Nghiên cứu và phát triển chế phẩm vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi sinh vật độc hại và ứng dụng trong lên men rau quả

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI. ********* CAO THỊ BÍCH NGỌC NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI SINH VẬT ĐỘC HẠI VÀ ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN RAU QUẢ LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI - 2009 MỤC LỤC MỤC LỤC........................................................................................................................1 MỞ ĐẦU..........................................................................................................................4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ............................................................................................6 1.1. VI KHUẨN LACTIC............................................................................................6 1.1.1. Đặc điểm hình thái ........................................................................................6 1.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hóa .............................................................................7 1.1.3. Phân loại vi khuẩn lactic.............................................................................10 1.2. LÊN MEN LACTIC............................................................................................12 1.2.1. Lên men đồng hình (Homofermentation) ....................................................12 1.2.2. Lên men dị hình (Heterofermentation)........................................................13 1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic....................................15 1.2.4. Quá trình tạo sinh khối và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối. .......................................................................................................................18 1.3. KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI SINH VẬT ĐỘC HẠI CỦA VI KHUẨN LACTIC..21 1.3.1. Cơ chế ức chế vi sinh vật độc hại của vi khuẩn lactic ................................21 1.3.2. Các sản phẩm phụ của lên men lactic có khả năng ức chế vi sinh vật độc hại ..........................................................................................................................21 1.4. CHẾ PHẨM VI KHUẨN LACTIC.....................................................................24 1.4.1. Chất mang cho chế phẩm ............................................................................25 1.4.2. Các phương pháp sấy ..................................................................................27 1.5. ỨNG DỤNG CỦA VI KHUẨN LACTIC ..........................................................30 1.5.1. Ứng dụng vi khuẩn lactic dùng làm chủng giống khởi động trong bảo quản và chế biến thực phẩm. ..........................................................................................30 1.5.2. Ứng dụng vi khuẩn lactic trong bảo quản và chế biến thức ăn chăn nuôi .30 2 1.5.3. Ứng dụng vi khuẩn lactic trong sản xuất các loại đồ uống lên men...........31 1.5.4. Ứng dụng vi khuẩn lactic trong sản xuất chế phẩm probiotic để tăng cường sức khỏe và vật nuôi và cải thiện môi trường........................................................32 1.5.5. Ứng dụng vi khuẩn lactic trong muối chua rau, củ, quả.............................33 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................37 2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...................................................37 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................37 2.1.2. Hóa chất và thiết bị chính dùng cho nghiên cứu.........................................37 2.1.3. Môi trường nuôi cấy (xem phụ lục) .............................................................38 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................38 2.2.1. Phân lập và giữ giống vi khuẩn lactic.........................................................38 2.2.2. Một số đặc điểm hình thái ...........................................................................39 2.2.3. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa ...............................................................40 2.2.4. Xác định các vi sinh vật độc hại..................................................................43 2.2.5. Phân loại vi khuẩn lactic.............................................................................45 2.2.6. Tạo chế phẩm vi khuẩn lactic......................................................................47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................50 3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC THUẦN KHIẾT ĐỂ KHỞI ĐỘNG QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC TRÊN RAU QUẢ....50 3.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin có khả năng ức chế sự phát triển của Lactobacillus sp. ....................................................................................50 3.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn, chịu nhiệt, chịu axit, chịu NaCl...............................................................................................51 3.1.3. Khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh của 2 chủng CM3 và CM22 ...........52 3.1.4. Định tên chủng vi khuẩn lactic CM3 ...........................................................55 3 3.2. XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH TẠO SINH KHỐI CỦA CHỦNG L.PLANTARUM CM3 ...................................................61 3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng phát triển của chủng Lactobacillus plantarum CM3 ...............................................................................61 3.2.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu tới sự phát triển của chủng L.plantarum CM3 ......62 3.2.3. Động thái quá trình lên men lactic của chủng L.plantarum CM3 ...............64 3.2.4. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng phát triển của chủng L.plantarum CM3 ...................................................................................................66 3.3. NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI KHUẨN L.PLANTARUM CM3..............68 3.3.1. Ảnh hưởng của chất mang và tỷ lệ chất mang ............................................68 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy ........................................................................71 3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian sấy.......................................................................72 3.4. ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM TRONG MUỐI CHUA CÀ PHÁO..........................73 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................................................76 TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................78 4 MỞ ĐẦU Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, được thiên nhiên ưu đãi nên rau quả được trồng quanh năm, chủng loại rau quả cũng rất đa dạng. Hàng năm rau quả được sản xuất với số lượng lớn nên có ý nghĩa rất quan trọng trong tăng trưởng kinh tế và phát triển công nghiệp chế biến, bảo quản thực phẩm. Tuy nhiên, việc tiêu thụ rau quả ở Việt Nam đang gặp nhiều khó khăn, giá cả bấp bênh gây thiệt hại cho nhà nông. Do đó, tìm một hướng mới tiêu thụ các sản phẩm rau quả trong mùa vụ là điều cần thiết, phương pháp bảo quản rau bằng cách muối chua là phương pháp chế biến cổ truyền ở nước ta và một số nước phổ biến trên thế giới. Việc muối chua rau quả vừa được xem là phương pháp chế biến vừa là phương pháp bảo quản dưới tác dụng của axit lactic được tạo ra trong quá trình lên men và muối được bổ sung vào trong quá trình muối. Ngoài ra, axit lactic và các sản phẩm khác được tạo ra trong quá trình muối sẽ tạo cho sản phẩm có hương vị đặc trưng và trạng thái dòn hấp dẫn. Các sản phẩm rau quả muối có thể được sử dụng ngay hoặc được sử dụng làm bán thành phẩm cho các quá trình chế biến khác như đóng hộp. Nhưng cho dù được sử dụng với mục đích nào đi nữa thì các sản phẩm rau quả muối chua cần phải đạt yêu cầu chất lượng nhất định. Nhưng với đặc tính của rau quả là loại nguyên liệu rất dễ bị tổn thương và hư hỏng do các tác động bên ngoài như nhiệt độ, ánh sáng cũng như các yếu tố tác động trong quá trình muối chua đặc biệt là sự nhiễm tạp của các vi sinh vật gây hư hỏng từ nguyên liệu, môi trường và các công đoạn chế biến. Trong khi đó, các sản phẩm rau quả muối chua ở nước ta chủ yếu được sản xuất ở mức độ thủ công, lên men tự nhiên và chỉ mới bắt đầu sản xuất công nghiệp ở qui mô nhỏ. Do đó khả năng nhiễm tạp rất cao, chất lượng không đảm bảo, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Hơn nữa ở nước ta hiện nay chế phẩm vi khuẩn lactic thuần chủng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm chủ yếu là nhập ngoại và để sản xuất sữa chua là chủ yếu. Chế phẩm lactic thuần chủng cho sản xuất thực phẩm lên men 5 truyền thống nói chung và lên men rau quả nói riêng hầu như chưa có. Vì vậy việc nghiên cứu đưa ra chủng giống khởi động cho quá trình lên men lactic và hoàn thiện chế phẩm lactic ứng dụng trong sản xuất rau quả lên men có khả năng hạn chế các vi sinh vật gây ngộ độc, tạo khả năng công nghiệp hóa cho việc sản xuất rau quả lên men có ý nghĩa quan trọng. Xuất phát từ những lý do nói trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu và phát triển chế phẩm vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi sinh vật độc hại và ứng dụng trong lên men rau quả" Mục tiêu của luận văn: - Tuyển chọn các giống vi khuẩn lactic thuần khiết có khả năng ức chế vi sinh vật có hại dùng làm chủng khởi động quá trình lên men lactic trên rau quả. - Xác định các điều kiện nuôi cấy tối ưu quá trình tạo sinh khối của chủng vi khuẩn lactic. - Nghiên cứu lựa chọn chế độ sấy, chất bổ trợ thích hợp để tạo chế phẩm có hoạt tính cao và kinh tế. - Ứng dụng chế phẩm cho lên men rau quả. 6 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. VI KHUẨN LACTIC Axit lactic được con người sử dụng từ rất lâu để bảo quản và chế biến thực phẩm (như muối dưa cà, tôm chua, nem chua…). Axit này lần đầu được phát hiện và tách ra từ sữa bò lên men chua bởi nhà hóa học người Thụy Điển Sheele năm 1780. Năm 1857 Louis Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm chua sữa là kết quả của hoạt động của một số nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuấn lactic. Năm 1878 Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactic (hiện nay gọi là Streptococcus lactic) [4]. Từ đó đến nay nhiều loài vi khuẩn lactic khác nhau đã được phân lập và nghiên cứu. Vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacillaeace. Nhóm vi khuẩn này không đồng nhất về mặt hình thái (gồm cả vi khuẩn hình que và hình cầu), song về mặt sinh lý chúng tương đối đồng nhất. Tất cả đều có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram (+), không tạo bào tử, không di động, chúng thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và sinh ra axit lactic, chúng là các vi khuẩn sống từ kỵ khí đến vi hiếu khí [4]. 1.1.1. Đặc điểm hình thái Tùy theo hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que. Dạng hình que thường ngắn kích thước 0,5 – 0,7µm, đôi khi có sợi dài tới 8µm. Chúng đứng riêng rẽ, kết đôi hoặc kết chuỗi. Dạng hình cầu hay oval đường kính 0,5 – 1µm đứng riêng rẽ, kết đôi hoặc kết chuỗi có chiều dài khác nhau. Sự thay đổi hình dạng và kích thước tế bào thường xảy ra trong quá trình sinh trưởng và thay đổi tùy từng loài khác nhau. Tuy nhiên hình thái tế bào còn phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy. 7 1.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hóa Nhu cầu về dinh dưỡng của vi khuẩn lactic khác nhau là khác nhau, đặc biệt là nhu cầu vitamin và nitơ. Chẳng hạn, Lactobacillus được coi là nhóm vi khuẩn có nhu cầu về dinh dưỡng cao nhất, chúng đòi hỏi không chỉ là các cơ chất phức tạp chứa cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu rất lớn về các yếu tố cần cho sự phát triển như vitamin và muối vô cơ. 1.1.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Hầu hết các vi khuẩn lactic đều không tự tổng hợp được các hợp chất nitơ hữu cơ phức tạp. Tuy nhiên nitơ lại là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng, nó đảm bảo cho sự phát triển bình thường của các vi khuẩn lactic với vai trò: - Là thành phần của protein, enzim, các axit nucleic. - Là chất cho và nhận điện tử trong quá trình chuyển hóa. Vì vậy để đảm bảo cho sự phát triển của tế bào chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các chất nitơ hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ, đôi khi trong một số trường hợp sự phát triển của một vài loài vi khuẩn lactic như Lactobacillus helveticus có thể bị kích thích bởi sự có mặt của muối amoni trong môi trường . 1.1.2.2. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là monosaccarit và disaccarit. Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit malic, piruvic, fumaric, axetic…[14]. Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các đường đơn (glucoza, fructoza, manoza, galactoza...), các đường đôi (saccaroza, lactoza, maltoza…) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin). Tuy nhiên khả năng sử dụng các nguồn thức ăn cacbon khác nhau còn tùy thuộc vào từng loài. Ví dụ: Lactobacillus debbrueckii có thể sử dụng các đường maltoza, glucoza, galactoza, saccaroza, dextrin 8 mà không sử dụng được lactoza; L.bulgaricus có thể sử dụng glucoza, lactoza, nhưng không sử dụng maltoza và saccaroza, một số vi khuẩn lactic có thể sử dụng được dextrin và tinh bột [14]. Nguồn cacbon khác nhau trong quá trình nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến khả năng chống chịu của vi khuẩn lactic với các quá trình xử lý sau này. Ví dụ như tỉ lệ tế bào L.bulgaricus sống sót sau khi sấy đông khô phụ thuộc vào loại đường được bổ sung trong quá trình nuôi cấy và khi thu hồi chế phẩm, nếu lên men từ đường manitol thì tỷ lệ tế bào chết nhiều hơn hẳn so với lên men từ đường fructoza và lactoza [24]. 1.1.2.3. Nhu cầu về vitamin Các vi khuẩn lactic, đặc biệt là loài Lactobacillus, rất cần vitamin cho sự phát triển. Thường thì phải bổ sung vào môi trường các chất có chứa vitamin như nước giá đỗ, nước khoai tây, nước chiết ngô… Các vitamin đóng vai trò là coenzym trong quá trình trao đổi chất của tế bào, rất ít vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp được vitamin [26]. Nhu cầu vitamin B6 ở cả dạng tự do và dạng liên kết (pyridoxin, pyridoxan, pyridoxamin…) là đặc biệt lớn đối với các loài Streptococcus và Lactobacillus. Các vitamin nhóm B này kích thích sự phát triển của vi khuẩn lactic [31]. Rogosa và cộng sự [41] đã chỉ ra rằng axit nicotinic và axit pantotenic rất cần thiết cho sự phát triển của tất cả các loài vi khuẩn lactic. Trong khi đó vi khuẩn lactic lên men dị hình rất cần thiamin, nhưng axit folic và axit paminobenzoic không ảnh hưởng đến sự phát triển của các loài Lactobacillus. Người ta cho rằng tế bào của loài Lactobacillus leichmannii và Lactobacillus delbruekii có chứa vitamin B12 hấp thụ từ môi trường với tỷ lệ khoảng 0,5µg/g chất khô. Khi đó hầu như toàn bộ lượng vitamin này được phát hiện thấy ở trong thành tế bào liên kết chặt chẽ với các chuỗi polypeptit ở đó. Nhu cầu vitamin còn bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ nuôi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử của môi trường, chẳng hạn khi thay đổi nhiệt 9 độ khoảng 3 – 4oC thì nhu cầu trao đổi riboflavin với môi trường bên ngoài của Lactobacillus heboeticus thay đổi khoảng 25%. Nhu cầu vitamin cũng ảnh hưởng bởi thành phần môi trường. 1.1.2.4. Nhu cầu về muối vô cơ Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic cần rất nhiều các hợp chất vô cơ như sắt, đồng, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, mangan, magie… đặc biệt là mangan. Chính mangan ngăn cản quá trình tự phân của tế bào và nó cần thiết cho quá trình sống bình thường của vi khuẩn này. Đối với Lactobacillus thì Mn2+, Mg2+, Fe2+ có tác động tích cực lên sự phát triển và sản sinh axit lactic [30]. Chẳng hạn như Mg2+ là chất hoạt động trong quá trình lên men lactic vì chúng giúp vi khuẩn lactic sử dụng tốt hơn các loại đường. Phức hợp các chất khoáng còn có tác dụng làm giảm độ axit trong môi trường nuôi cấy các vi khuẩn lactic. 1.1.2.5. Nhu cầu một số chất hữu cơ khác Ngoài axit amin và vitamin ra vi khuẩn lactic còn có nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển của chúng. Dưới đây là một số chất hữu cơ ảnh hưởng đến sự phát triển hoặc kích thích sự phát triển của vi khuẩn lactic [14]. - Các bazơ nitơ: Adenin, Guamin, Thimin… - Axit hữu cơ: axit axetic và nhiều axit hữu cơ không bay hơi khác. - Axit amin: L-asparagin, L-glutamin… Axit xitric, xitrat, axetat, axit axetic có tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Axetat được dùng làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy nhiều loài vi khuẩn lactic. Xitrat do ảnh hưởng tốt đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic nên ngày nay người ta thường sử dụng xitrat làm thành phần môi trường để nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic. Một số axit hữu cơ quan trọng có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của hầu hết các loài vi khuẩn lactic là axit oleic (có thể thay thế bằng axit linoleic và axit linolenic). Đó 10 chính là lý do tại sao mà người ta lại sử dụng Tween 80, một dẫn xuất của axit oleic trong thành phần môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn latic. Ngoài ra Tween 80 còn có hoạt tính bề mặt giúp cho vi khuẩn sinh trưởng và khuếch tán đều trong dung dịch.[14] 1.1.3. Phân loại vi khuẩn lactic Các loại vi khuẩn lactic bao gồm 4 giống sau đây: Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus và Lactobacillus. Trong số 4 giống trên thì Lactobacillus là trực khuẩn, còn lại các giống là cầu khuẩn [42]. Giống Lactobacillus có dạng hình que. Đây là loại lactic phổ biến nhất. Hình dáng của chúng thay đổi từ hình cầu méo ngắn cho đến hình que dài. Ví dụ Lactobacillus plantarum có dạng hình que kích thước từ 0,7 – 1,1µm đến 3 - 8µm, sắp xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ. Trong khi Lactobacillus casei có dạng hình que ngắn hoặc hình que dài, tế bào hình que mảnh, đôi khi hơi cong sắp xếp thành cặp hay chuỗi. Giống Streptococcus có tế bào hình tròn hoặc oval, đường kính khoảng 0,1µm, sắp xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc thành hình chuỗi dài. Tuy nhiên, một số chủng thuộc loài này có thể có dạng hơi giống trực khuẩn vì có kích thước chiều dài lớn hơn chiều rộng, chẳng hạn như Streptococcus lactis. Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc oval, đường kính từ 0,5 – 0,8µm và chiều dài khoảng 1,6µm. Đôi khi chúng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1 - 3µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành một đám tập chung. Giống Pediococcus có hình cầu, đường kính 0,6 – 1µm, sắp xếp thành đám, cặp đôi, cặp bốn. Tuy nhiên gần đây theo khóa luận phân loại mới vi khuẩn lactic được chia thành 11 giống sau: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, 11 Aerococcus, Weisella, Carnobacterium, Vagococcus, Tetragenococcus, và Oenococcus, Enterobacterium [14], [29]. Hiện nay các nhà khoa học thường sử dụng 3 phương pháp phân loại vi khuẩn lactic sau đây: - Phương pháp phân loại truyền thống: là phương pháp phân loại cổ điển nhất, dựa trên các đặc điểm hình thái tế bào khuẩn lạc, có đặc điểm sinh lý, sinh hóa… cho đến nay phương pháp này vẫn dùng phổ biến trong nghiên cứu phân loại vi khuẩn lactic. - Phương pháp phân loại dùng Kit chuẩn: đây là phương pháp xác định nhanh đến loài của một loài vi khuẩn lactic nào đó, nhưng phương pháp này phải sơ bộ biết được vi khuẩn đó là Gram (+) hay Gram (-), kỵ khí hay hiếu khí, trong quá trình xác định kết quả thu được đôi khi cũng khác so với bảng chuẩn. Tùy từng loài vi khuẩn khác nhau mà chúng ta sử dụng những bộ Kit chuẩn khác nhau. - Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử: đây là phương pháp hiện đại nhất, phương pháp này dựa trên cắt các đoạn gen bằng enzym giới hạn, chọn dòng phân tử, hội nhập vào một vectơ, cắt và nối với một phân tử khác. Sử dụng phương pháp kỹ thuật lai phân tử, cuối cùng đọc trình tự của đoạn gen. Đối chiếu với phả hệ của gen đã được công bố trên ngân hàng gen. Hiện nay phương pháp thường được sử dụng để phân loại là dựa vào phân tích trình tự ARN riboxom (rARN). Riboxom là cơ quan tổng hợp protein có cấu tạo là những hạt hình cầu, kích thước khoảng 25 – 30nm. Thành phần cấu tạo nên riboxom là protein và rARN, nó gồm hai tiểu phần: tiểu phần lớn và tiểu phần nhỏ. Tiểu phần nhỏ chứa một phân tử rARN và nhiều loại protein khác. Tiểu phần lớn chứa hai rARN và nhiều loại protein khác. Các tiểu phần của riboxom khác nhau ở tế bào nhân sơ và nhân thực. Riboxom của tế bào nhân sơ có hằng số lắng là 70S gồm hai tiểu đơn vị 50S và 30S. Tiểu đơn vị 50S có chứa hai dạng rARN 5S và 23S với 34 protein. Tiểu đơn vị 30S có rARN 16S và 21 protein. Riboxom của tế bào nhân thực có kích thước lớn hơn, 12 thành phần rARN và protein phức tạp hơn. Chúng có hằng số lắng 80S gồm hai tiểu đơn vị 60S và 40S. Tiểu đơn vị 60S có ba dạng rARN 28S; 5,8S và 5S với 45 protein. Tiểu đơn vị 40S có chứa rARN 18S và 33 protein. Vi khuẩn lactic thuộc loại tế bào nhân sơ vì vậy riboxom của nó có hằng số lắng là 70S. Các nhà khoa học đã nghiên cứu và phân loại các loài dựa vào trình tự mã hóa cho rARN của chúng. Vì vậy mỗi loài sẽ có những trình tự gen mã hóa cho rARN rất đặc thù. Họ cũng chứng minh được rằng rARN 23S có dung lượng thông tin phát sinh loài cao hơn rARN 16S. Tuy nhiên trình tự hoàn chỉnh của 23S cho đến nay vẫn được xác định rất ít trong khi trình tự mã hóa rARN 16S hoàn chỉnh đã được xác định rất phong phú và đa dạng. Riêng đối với vi khuẩn đã có hơn 450 loài đã xác định được đầy đủ và chính xác gen mã hóa cho 16S rARN [34]. Dựa vào nguồn gốc của sự phát sinh các nhà khoa học đã tiến hành tách chiết và xác định trình tự gen mã hóa cho 16S rARN (đối với sinh vật nhân sơ) và 18S rARN (đối với sinh vật nhân thật). Sau đó đưa trình tự này lên máy tính và sử dụng phần mềm fasta để so sánh trình tự mới với trình tự đã được công bố trên ngân hàng gen để tìm ra nguồn gốc phát sinh và có thể định tên chính xác loài đó. 1.2. LÊN MEN LACTIC Tùy theo cách lên men đường mà vi khuẩn lactic được chia làm hai nhóm: vi khuẩn lên men đồng hình và lên men dị hình, quá trình lên men được thể hiện ở sơ đồ 1.1. 1.2.1. Lên men đồng hình (Homofermentation) Lên men lactic đồng hình là kiểu lên men cho sản phẩm chủ yếu là axit lactic. Vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMP (EmbdenMayerhof- Panas). Mặc dù chỉ tạo thành hai ATP khi phân giải 1 phân tử đường glucoza thành 2 phân tử axit lactic nhưng các vi khuẩn này lại có ý nghĩa to lớn trong công nghiệp thực phẩm. Vì để đảm bảo cung cấp đủ năng lượng cho hoạt động sống, cho sự sinh trưởng và phát triển, chúng cần phải phân giải một lượng lớn đường thành 13 một lượng lớn axit lactic - một sản phẩm có vai trò quan trọng trong chế biến thực phẩm. C6H12O6 + 2ADP Vi khuẩn lactic Lên men đồng hình 2CH3-CHOH-COOH + 2ATP Các vi khuẩn lactic đồng hình thường gặp: Lactobacillus cremoris, L.acidophilus, L.plantarum, L.Bulgaricus, L.casei, Streptococcus lactic, S.cremoris, S. thermophilus. 1.2.2. Lên men dị hình (Heterofermentation) Lên men lactic dị hình là quá trình lên men tạo ra ngoài axit lactic còn có các sản phẩm khác như axit axetic, rượu etylic, axit sucinic, CO2… Phương trình tóm tắt của quá trình này: 2C6H12O6 2C3H6O3 + C2H4O2 + C2H5OH + C4H6O4 + CO2 + Q Tỷ lệ các sản phẩm tạo ra là axit lactic 40%, axit succinic và rượu etylic 20%, axit axetic 10%, các chất khí còn lại 20%. Quá trình lên men dị hình diễn ra theo chu trình PP (Pentozo- photphat). Nguyên nhân do thiếu 2 enzim chủ yếu của con đường EMP là aldolaza và trizophotphat – izomeraza nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải diễn ra theo con đường PP. Sau đó, quá trình chuyển hóa từ triozophotphat thành axit lactic xảy ra tương tự lên men đồng hình. Sản phẩm sinh ra phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh. Các vi khuẩn lên men lactic dị hình thường gặp là: Leuconostoc mensenteroides, L.oenos, L.cremoris, Lactobacillus brevis, L.fermentum, Bifidobacterium bifidum. Lên men lactic dị hình bởi Bifidobacterium đặc biệt ở chỗ không tạo ra CO2 như lên men lactic dị hình thông thường. 14 Lên men đồng hình Lên men dị hình Glucoza Glucoza Glucoza 6P Glucoza 6P Fructoza 6P Axit 6P gluconic Fructoza 1,6P di P Riboluza 5P Xyluloza 5P Dihydroxiaxeton P Glyxealdehyt Axit 1,3 di P glyxeric Axit 3 P glyxeric Axit 2 di P glyxeric Axetyl P Axetyl CoA Axetylaldehyt Etanol Axit photpho enol pyruvic Axit lactic Axit pyruvic Sơ đồ 1: Sơ đồ lên men đường glucoza ở vi khuẩn [14] Axit axetic 15 1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic 1.2.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ là yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic và hiệu suất lên men lactic. Giới hạn nhiệt độ cho vi khuẩn lactic phát triển khá rộng, từ 5 – 55oC, tốt nhất là 15 - 40oC [43]. Nhóm ưa ấm thích hợp trong khoảng 20 - 40oC, nhóm ưa nhiệt thích hợp trong khoảng 40 - 45oC. Trong phạm vi nhiệt độ thích hợp, nếu nhiệt độ càng tăng thì sự lên men lactic càng mạnh, thời gian lên men càng ngắn. Các nghiên cứu cho thấy giới hạn nhiệt độ thích hợp cho sự sinh sản và lên men của vi khuẩn lactic cũng chính là giới hạn hoạt động của enzim nội bào từ 30 - 45oC. Bảng 1.1: Nhiệt độ phát triển của nhóm vi khuẩn lactic Nhóm Nhiệt độ tối ưu Nhiệt độ phát triển bình thường Giống Ưa lạnh 10 - 15 0 - 27 Kỵ lạnh 30 - 40 0 - 45 Enterococcus, Pediococcus, Bifidobacterium Ưa ấm 18 - 35 5 - 45 Leuconostoc, Lactococcus, Lactobacillus Ưa nhiệt 36 - 46 20 - 60 Steptococcus, Lactobacillus 1.2.3.2. Ảnh hưởng của pH Hoạt động của vi khuẩn lactic, đặc biệt của hệ enzim chịu tác động mạnh của pH môi trường. Độ pH ban đầu thích hợp cho quá trình lên men của vi khuẩn lactic từ 5,8 - 6,3. Các vi khuẩn lactic có pH tối ưu cho sự phát triển là 5,5 - 6,2 (Lactobacillus); 5,5 - 6,5 (Pediococcus); 6,3 - 6,5 (Leuconostoc). Giá trị pH cuối cùng mà mỗi giống vi khuẩn lactic có thể chịu được là khác nhau. Chẳng hạn Lactobacillus có thể chịu được 16 pH 3,2 - 3,5; Pediococcus có thể chịu được pH 3,5 – 4,4; Leuconostoc có thể chịu được pH 5. Trong quá trình lên men lactic, sự tích tụ các axit lactic trong giai đoạn đầu có tác dụng ức chế các vi sinh vật khác nhau. Sau đó, lượng axit lactic tiếp tục phát triển làm cho pH của môi trường giảm, dẫn đến ức chế cả vi khuẩn lactic và kìm hãm quá trình lên men. Như vậy chính axit lactic là chất ức chế. Lượng axit lactic quá nhiều sẽ làm giảm tốc độ phát triển và làm giảm số lượng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic. 1.2.3.3. Ảnh hưởng của oxy Vi khuẩn lactic là loài hô hấp tùy tiện. Chúng là nhóm vi khuẩn không có hệ enzym hô hấp xitocrom cũng như hệ enzym catalaza. Tuy vậy, chúng vẫn có khả năng oxy hóa rất nhiều chất nhờ sử dụng oxy phân tử. Điều này được thực hiện nhờ hệ FAD (Flavin Adenin Dinucleotit). Người ta thấy rằng trên môi trường thạch, một số chất trong môi trường chỉ có thể được sử dụng khi có mặt oxy. Chẳng hạn Streptomyces faccium, Pediococcus sp., Lactobacillus plantarum có thể đồng hóa được glyxerin trong điều kiện hiếu khí. Một vài loài Leuconostoc có thể cần sự có mặt của oxy trong giai đoạn đầu để đồng hóa hexoza. Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri cần oxy để oxy hóa hexoza, gluconat. Sự ảnh hưởng của oxy đôi khi còn phụ thuộc vào cả nhiệt độ, một vài chủng của loài Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri phát triển tốt ở 30oC trong điều kiện yếm khí, trong khi ở 37oC nó chỉ phát triển trong điều kiện hiếu khí [22]. Người ta đã chứng minh được rằng hệ enzym peroxylaza có trong vi khuẩn lactic có thể thực hiện các chức năng thay cho hệ enzym dehydrogenaza, khi đó oxy được sử dụng như là chất nhận hydro. Quá trình oxy hóa ở vi khuẩn lactic thường kèm theo việc tạo thành H2O2 đồng thời một số vi khuẩn lactic (Streptococcus faccalis, 17 Streptococcus brevis, Leuconostoc mesenteroides) có thể khử được H2O2 thành nước cùng với sự tham gia của một số chất bị oxy hóa. Nói chung vi khuẩn lactic có hệ enzym peroxydaza sử dụng NDAH2 làm chất nhận điện tử và phân giải H2O2. NADH2 + H+ + H2O2 NAD+ + 2H2O Quan hệ với oxy giữa các loại vi khuẩn khác nhau là khác nhau. Trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt thì các trực khuẩn lên men dị hình chậm phát triển. Các vi khuẩn lactic lên men dị hình khi lên men arabinoza đạt tối ưu trong điều kiện kỵ khí, còn các loài không sử dụng được pentoza thì phát triển rất kém trong điều kiện này. Trong quá trình lên men axit lactic nếu lượng oxy vượt quá giới hạn thì sẽ làm vô hoạt enzym lactat dehydrogenaza, do đó quá trình tạo thành axit lactic không xảy ra. 1.2.3.4. Ảnh hưởng của các chất ức chế Sự phát triển của phần lớn vi khuẩn lactic bị ức chế bởi nồng độ NaCl (≥ 5%). Khi đó nồng độ ion trong tế bào tăng cao sẽ làm ức chế hoạt động các enzym và làm giảm hiệu suất quá trình lên men. Người ta có thể làm tăng khả năng chịu áp suất thẩm thấu của vi khuẩn lactic bằng cách bổ sung ion K+, gluxit hoặc axit amin hay các sản phẩm tương tự. Sự bổ sung những chất này làm giảm chênh lệch giữa áp suất nội bào và ngoại bào của vi khuẩn lactic, bởi vì khi nồng độ các ion cao thì ức chế hoạt tính enzym của tế bào nên vi khuẩn lactic sử dụng các chất hòa tan tương ứng này để duy trì mức độ trương cứng của tế bào, trong khi những chất này không tác động xấu đến protein của tế bào [37]. Nếu trong môi trường lên men việc cung cấp các chất dinh dưỡng lớn hơn nhu cầu của vi khuẩn lactic thì có thể làm ức chế hoạt động của vi khuẩn, dẫn đến ức chế quá trình lên men. 1.2.3.5. Ảnh hưởng của nồng độ đường 18 Đường là nguồn cacbon chủ yếu cho vi khuẩn lactic, nồng độ đường trong môi trường càng cao thì lượng axit lactic sinh ra càng nhiều. Tuy nhiên, nồng độ đường quá cao làm cho áp suất thẩm thấu môi trường cao gây ra hiện tượng co nguyên sinh ảnh hưởng đến sự phát triển tế bào của vi khuẩn lactic do đó giảm axit lactic tạo ra. 1.2.4. Quá trình tạo sinh khối và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối. 1.2.4.1. Quá trình tạo sinh khối Quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn được chia thành 4 pha chính [4]: * Pha tiền phát: Là giai đoạn từ khi bắt đầu nuôi cấy đến khi tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn bắt đầu tăng mạnh. Trong thời gian này vi khuẩn làm quen và thích nghi môi trường. Lúc này vi khuẩn chưa sinh sản hoặc mới bắt đầu sinh sản, tốc độ còn rất chậm. Thời gian của pha này phụ thuộc vào khả năng thích nghi của vi khuẩn đối với môi trường nuôi cấy mới. Ở giai đoạn này vi khuẩn cũng bắt đầu tổng hợp một số chất cao phân tử: protein, enzim… * Pha phát triển logarit: Đây là pha tăng trưởng mạnh nhất. Giai đoạn này, tế bào sinh trưởng với tốc độ lớn nhất (tăng theo hàm số mũ), do đó hàm lượng sinh khối cũng tăng nhanh, tế bào ở pha này trẻ về sinh lý, có hoạt tính sinh học cao, kích thước tế bào cũng lớn lên. Kích thước tế bào, số lượng tế bào, thành phần hóa học nói chung thay đổi theo thời gian. Tốc độ sinh sản đạt mức cực đại và không thay đổi trong suốt thời gian của giai đoạn phát triển logarit. Tế bào sinh ra nhanh, lượng cơ chất giảm rõ rệt và tỷ lệ nghịch với lượng tế bào sinh ra. * Pha cân bằng: 19 Trong pha cân bằng, quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi nên nhìn chung số lượng tế bào và cả sinh khối không thay đổi. Nguyên nhân tồn tại của pha này là do sự suy giảm thức ăn do giai đoạn trước gây nên. Cơ chất bị thiếu hụt không đủ đáp ứng cho mọi tế bào, do đó một số tế bào nhạy cảm, già cỗi dễ bị chết ngay còn một số khác còn có khả năng hô hấp. Sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất (như các loại rượu, axit hữu cơ…) sẽ làm thay đổi dần dần tính chất của môi trường. * Pha suy vong: Trong pha này, quá trình sinh sản gần như ngừng hẳn. Số lượng tế bào chết ngày càng cao (mặc dù số tế bào tổng cộng có thể không giảm). Sự cân bằng động học bị phá vỡ hoàn toàn. Tế bào ở giai đoạn này không còn tính chất đặc trưng, một số tế bào tự phân, một số chuyển sang dạng tiềm ẩn. Thông qua đánh giá các pha sinh trưởng của vi khuẩn, ta có thể xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn. Từ đó, ta có thể thấy rõ giai đoạn phát triển của vi khuẩn ở từng pha và thời điểm nào thì vi khuẩn phát triển mạnh nhất để thu được hàm lượng sinh khối lớn nhất. Thời điểm thu hồi sinh khối có ý nghĩa rất quan trọng vì nó sẽ ảnh hưởng đến số lượng tế bào sống sót trong quá trình sấy và bảo quản sau này. Nếu thu hồi sinh khối ở pha cân bằng, khi đó đã xuất hiện nhiều tế bào già và chết, nếu thu hồi sinh khối ở pha phát triển logarit thì tế bào còn non yếu chưa phát triển đầy đủ, khả năng chịu đựng với các phương pháp xử lý nhiệt sẽ kém. Theo một số nghiên cứu về vi khuẩn lactic thì sinh khối được thu hồi khi vi khuẩn phát triển đạt đến cuối pha phát triển logarit và đầu pha cân bằng là tốt nhất (vì khi đó lượng sinh khối tạo ra lớn nhất, tế bào lại có khả năng chịu đựng các tác động tốt). 1.2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối