TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I
KHOA CÔNG NGH SINH H C
DƯƠNG MINH KH I
NGHIÊN C U VI KHU N LACTIC
CÓ KH NĂNG PROBIOTIC, SINH T NG H P
GAMMA - AMINOBUTYRIC ACID VÀ
NG D NG
LU N VĂN TH C SĨ NÔNG NGHI P
Chuyên ngành: CÔNG NGH SINH H C
Mã S :
60.42.02.01
Ngư i hư ng d n khoa h c 1 : TS. Nguy n La Anh
Ngư i hư ng d n khoa h c 2 : GS.TS. Nguy n Quang Th ch
Hà N i – 2013
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
1
L I CAM ðOAN
Tôi xin cam ñoan r ng, s li u và k t qu nghiên c u trong lu n văn này
là trung th c.
Tôi xin cam ñoan r ng, m i s giúp ñ cho vi c th c hi n lu n văn này
ñã ñư c cám ơn và các thông tin ñư c trích d n ñã ñư c ghi rõ ngu n g c.
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
i
L I C M ƠN
ð hoàn thành ñ tài t t nghi p, ngoài s c g ng c a b n thân tôi ñã
nh n ñư c r t nhi u s quan tâm giúp ñ nhi t tình c a th y cô, gia ñình, b n
bè, ñ ng nghi p và ngư i thân.
Trư c tiên, tôi xin ñư c bày t lòng bi t ơn sâu s c t i TS. Nguy n La Anh
– Ch nhi m B môn Công ngh Sinh h c vi sinh - Vi n Công nghi p Th c
ph m ñã t n tình hư ng d n, t o m i ñi u ki n thu n l i và giúp ñ tôi trong
quá trình th c hi n ñ tài và hoàn thành b n lu n văn này.
ð ng th i, tôi xin ñư c c m ơn GS.TS. Nguy n Quang Th ch - Vi n Sinh
h c Nông nghi p - ð i h c Nông nghi p Hà N i ñã nhi t tình giúp ñ và ch
b o cho tôi trong su t quá trình làm lu n văn.
Tôi xin ñư c g i l i c m ơn chân thành t i các th y cô giáo trong Khoa
Công ngh sinh h c, t p th l p K20-CNSHA, và các anh ch em trong B môn
Công ngh sinh h c Vi sinh- Vi n Công nghi p th c ph m.
C m ơn gia ñình ñã t o ñi u ki n v th i gian ñ tôi hoàn thành khoá lu n
này.
Hà N i, ngày tháng năm 2013
Tác gi
Dương Minh Kh i
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
ii
M CL C
L I CAM ðOAN
i
L I C M ƠN
ii
M CL C
iii
DANH M C B NG
vi
DANH M C HÌNH
vii
B NG CÁC KÝ HI U VÀ T
VI T T T
viii
B NG VI T T T CÁC LO I KHÁNG SINH
ix
M
1
ð U
I. ð t v n ñ
1
II. M c ñích và yêu c u và ý nghĩa c a ñ tài
2
1. M c ñích
2
2. Yêu c u
2
3. Ý Nghĩa khoa h c
2
PH N I: T NG QUAN
3
1.1. T ng quan v vi khu n lactic
3
1.1.1. L ch s phát hi n
3
1.1.2. Phân lo i vi khu n lactic
4
1.1.3. ð c ñi m sinh lý sinh hoá.
8
1.1.4. Nhu c u dinh dư ng c a vi khu n lactic
1.1.5. M t s y u t
10
nh hư ng t i s sinh trư ng và phát tri n c a vi khu n
Lactic
11
1.1.6. L i ích c a vi khu n lactic
12
1.2. T ng quan v Probiotic
13
1.2.1. L ch s và ñ nh nghĩa probiotic
13
1.2.2. Thành ph n m t s ch ph m Probiotic
15
1.2.3. Tiêu chu n l a ch n ch ng vi sinh v t probiotic
16
1.2.4. Tình hình nghiên c u và s d ng probiotic trên th gi i và Vi t Nam
17
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
iii
1.2.5.
ng d ng c a ch ph m probiotic trong b o v s c kh e con ngư i
19
1.3. T ng quan v gama - aminobutyric acid
21
1.3.1. ð nh nghĩa
21
1.3.2. L ch s phát tri n
22
1.3.3. Hình d ng và c u trúc
23
1.3.4. T ng h p GABA
24
1.3.5. Cơ ch ho t ñ ng c a GABA
25
1.3.6. Ch c năng c a GABA
25
1.3.7. Các ngu n sinh t ng h p GABA
26
1.4.
31
ng d ng c a vi khu n lac tic trong s n xu t lên men s a chua
PH N II NGUYÊN V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U
35
2.1. Hóa ch t, thi t b , d ng c và môi trư ng
35
2.1.1. Hoá ch t
35
2.1.2. D ng c
35
2.1.3. Thi t b
36
2.1.4. Môi trư ng
36
2.2. Ch ng vi sinh v t
38
2.3. Phương pháp nghiên c u
38
2.3.1. Tuy n ch n ch ng vi khu n lactic có kh năng sinh t ng h p GABA
38
2.3.2. Tuy n ch n ch ng vi khu n lactic có kh năng probiotic
39
2.3.3. Phương pháp nhu m Gram
44
2.3.4. Ph n ng th catalaza
45
2.3.5. Ki m tra kh năng s d ng ñư ng c a vi khu n lactic
45
2.3.6. Xác ñ nh m t ñ t bào b ng phương pháp ñ m khu n l c
46
2.3.7. Phương pháp s c ký b n m ng TLC (Thin layer chrotomagraphy)
47
2.3.8. Phương pháp ñ nh tên b ng trình t
48
16S rDNA ch ng NCTH24
2.4. Qui trình làm s a chua sinh h c bio – yorgurt trong thí nghi m
49
2.5. Phương pháp x lý s li u
51
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
iv
PH N III K T QU VÀ TH O LU N
52
3.1. K t qu tuy n ch n ch ng vi khu n lactic sinh t ng h p GABA
52
3.2. ðánh giá kh năng probiotic c a ch ng vi khu n lactic NCTH24
56
3.2.1. Kh năng s ng sót trong d ch d dày c a ch ng vi khu n NCTH24
56
3.2.2. Kh năng s ng sót trong d ch m t c a ch ng NCTH24
57
3.2.3. Ph tương tác v i m t s kháng sinh c a ch ng NCTH24
59
3.2.4 . Xác ñ nh kh năng kháng vi sinh v t gây b nh
61
3.3. Nghiên c u ñ c ñi m hình thái, sinh lý, sinh hoá và ñ nh tên ch ng NCTH24
62
3.3.1. Nghiên c u ñ c ñi m hình thái c a ch ng NCTH24
62
3.3.2. Các ñ c ñi m sinh lý, sinh hóa c a các ch ng vi khu n NCTH24
63
3.3.3. Kh năng s d ng các ngu n cacbon
63
3.3.4. Nghiên c u ñ c ñi m sinh h c phân t c a ch ng NCTH24
64
3.4. Nghiên c u ñi u ki n lên men t o sinh kh i
66
3.4.1. Kh o sát thành ph n cacbon phù h p cho lên men sinh kh i
66
3.4.2. Xác ñ nh t l ti p gi ng
68
3.4.3. L a ch n ngu n nitơ phù h p cho lên men sinh kh i
69
3.4.4. L a ch n n ng ñ nitơ phù h p cho lên men sinh kh i
70
3.5.
72
ng d ng th nghi m s n xu t s a chua sinh h c có ch a GABA
3.5.1. Kh năng sinh GABA c a s a bio-yogurt sau 45 ngày bào qu n
73
3.5.2. Xác ñ nh bán ñ nh lư ng GABA trong th i gian b o qu n
74
PH N IV: K T LU N VÀ KI N NGH
76
4.1. K t lu n
76
4.2 Ki n Ngh
76
TÀI LI U THAM KH O
77
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
v
DANH M C B NG
B ng 1: Ch ng vi sinh v t s d ng cho s n xu t s a lên men trên th gi i
34
B ng 2: Thành ph n môi trư ng MRS
36
B ng 3: Các lo i kháng sinh khác nhau
40
B ng 4: M t s ch ng vi sinh v t gây b nh
41
B ng 5: K t qu tuy n ch n các ch ng vi khu n lactic có kh năng sinh GABA
52
B ng 6. Kh năng s ng sót trong d ch d dày nhân t o c a ch ng NCTH24
57
B ng 7: Kh năng s ng trong môi trư ng d ch m t c a ch ng NCTH24
58
B ng 8: Kh năng bám dính trên mucus ch ng NCTH24
59
B ng 9. Ph tương tác m t s kháng sinh c a ch ng NCTH24
60
B ng 10. Kh năng kháng vi sinh v t gây b nh c a NCTH24
62
B ng 11: Kh năng s ng trong các ñi u ki n pH và nhi t ñ khác nhau c a các
ch ng vi khu n lactic NCTH24
63
B ng 12: Kh năng s d ng các ngu n cacbon khác nhau c a ch ng NCTH24
64
B ng 13: K t qu xác ñ nh trình t gen 16S rDNA c a ch ng NCTH24
66
B ng 14. Thành ph n ngu n nitơ trong môi trư ng lên men ch ng NCTH24 69
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
vi
DANH M C HÌNH
Hình 1: Hai con ñư ng chính lên men glucose c a vi khu n lactic
7
Hình 2: C u trúc phân t c a GABA
22
Hình 3: Quá trình t ng h p GABA
24
Hình 4: Quy trình th nghi m làm s a chua sinh h c bio-yogurt
50
Hình 5: M t s hình nh ñ nh tính GABA b ng phương pháp s c ký b n m ng 55
Hình 6: Hình nh bám dính t bào NCTH24 trên màng nh y ru t invitro
59
Hình 7: Hình nh ph tương tác ch ng NCTH24 v i m t s lo i kháng sinh
61
Hình 8: Hình thái vi khu n ch p NCTH24 ch p b ng SEM
62
Hình 9: Kh o sát ngu n cacbon ñ n s phát tri n NCTH24
67
Hình 10: nh hư ng n ng ñ ñư ng glucose ñ n s phát tri n c a NCTH24 67
Hình 11: Kh o sát t l ti p gi ng trên ch ngNCTH24
68
Hình 12: Kh o sát ngu n nitơ ñ n s phát tri n ch ng NCTH24
70
Hình 13 : nh hư ng c a n ng ñ nitơ ñ n s phát tri n NCTH24
71
Hình 14: M t ñ t bào NCTH 24 trong s a chua theo th i gian b o qu n
72
Hình 15: M u s a chua trang c y ki m tra m t ñ t bào
73
45 ngày
Hình 16: Kh năng sinh GABA c a ch ng NCTH24 trong s a chua sinh h c 73
Hình 17: nh ch p k t qu bán ñ nh lư ng GABA
các ngày khác nhau
75
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
vii
B NG CÁC KÝ HI U VÀ T
VI T T T
ATP
Adenosine 5’- triphosphate
Bio-yogurt
S a chua sinh h c
DNA
Acid Deoxyribo Nucleic
BMI
Body Mass Index
EMP
Embden-Meyerhof-Parnas path way
FAO
Food and Agriculture Organization of the United Nations
FDA
Food and Drug Administration
FOSHU
Food for Specialized Use
GABA
Gama - aminobutyric acid
GAD
Glutamic acid decarboxylase
GRAS
Generally Recognized as Safe
HGH
Human growth hormone
LAB
Lactic acid bacteria
MSG.
Monosodium glutamate
MRS
De Man, RoGoSa and Sharbe
NEC
Necrotizing enterocolitis
NB
Nutrient broth
PP
Pentose phosphat
PMS
Premenstrual syndrome
PBS
Phosphate-buffered saline
PCR
Polymerase Chain Reaction
rRNA
Ribosomal ribonucleic acid
SG
Sodiumglutamate
SSADH
Semialdehyde succinic dehydrogenase
TLC
Thin layer chrotomagraphy
VLBW
Very low birth weight
WHO
World Health Organization
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
viii
B NG VI T T T CÁC LO I KHÁNG SINH
CLI :
Clindamycin
CHL:
Chloramphenicol
ERY:
Erythromycin
CEP:
Cefoperzone
CTR:
Ceftriaxone
PEN:
Penicillin
CAZ:
Ceftazidime
PB:
Polymycin B
GEN:
Gentamycin
STR:
Streptomycin
OFL:
Ofloxacin
AZI:
Azithromycin
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
ix
M
ð U
I. ð t v n ñ :
Vi khu n lactic ñã ñư c ng d ng nhi u trong s n xu t, b o qu n th c ph m
ñ c bi t trong s n xu t các s n ph m lên men truy n th ng như lên men s a,
th t, rau qu . Ngày nay, vi khu n lactic còn ñư c ng d ng cho s n xu t các s n
ph m probiotic, các s n ph m ch c năng, th c ph m có l i cho s c kh e.
Vi khu n lactic sinh t ng h p GABA còn có kh năng probiotic khi chúng
s ng sót qua d dày- ru t, và
ñây chúng có tác d ng h tr h tiêu hóa và sinh
t ng h p GABA in situ [30]. M t trong các hư ng ng d ng LAB sinh GABA
có kh năng probiotic là làm s a chua sinh h c (bio-yogurt). Có nhi u phương
pháp s n xu t s a chua sinh h c, nhưng khá ph bi n là lên men s a b i ch ng
gi ng kh i ñ ng thông thư ng và b sung sinh kh i vi khu n probiotic vào giai
ño n sau lên men [24]. Yêu c u c a các s n ph m probiotic ng d ng trong s a
chua sinh h c là m t ñ t bào s ng c a ch ng LAB ph i ñ t ít nh t 106 CFU/g,
t n t i trong th i gian s d ng s n ph m.
G n ñây vi c nghiên c u và ng d ng vi khu n lactic có kh năng sinh t ng
h p GABA ñư c quan tâm r ng rãi bao g m m t s ch ng Lactobacillus (Lb),
Lactococcus (Lc.) và Lactobacillus Brevis….. ñư c phân l p t nhi u lo i th c
ph m lên men, bao g m kim chi Hàn Qu c, paocai và s a tươi Trung Qu c,
shochu c a Nh t B n [16, 22, 40]…vv. Nh ng s n ph m ch a GABA t nhiên
này ñư c xác ñ nh là an toàn và thân thi n v i môi trư ng qua b d y l ch s lâu
ñ i c a chúng và g n ñây ñư c ch ng minh là có l i cho s c kh e [24].
Trong nghiên c u này, ch ng vi khu n probiotic Lactobacillus brevis
NCTH24 có kh năng sinh t ng h p GABA ñư c ng d ng th nghi m ñ làm
bio-yogurt ( s a chua sinh h c). Ch ng này ñư c phân l p t th c ph m lên men
truy n th ng là nem chua Thanh Hóa. Các nghiên c u v ñ c ñi m ch ng gi ng
và kh năng t n t i trong s a chua ñã ñư c kh o sát. Xu t phát t các v n ñ nêu
trên em th c hi n ñ tài: “Nghiên c u vi khu n lactic có kh năng probiotic,
sinh t ng h p Gamma- aminobutyric acid và ng d ng”
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
1
II. M c ñích và yêu c u và ý nghĩa c a ñ tài
1. M c ñích
Tuy n ch n ñư c ch ng vi khu n lactic có ñ c ñi m phù h p làm
probiotic, sinh t ng h p GABA và có ti m năng ng d ng trong làm s a chua
sinh h c.
2. Yêu c u
- Tuy n ch n ñư c ch ng vi khu n có kh năng sinh t ng h p GABAvà
probiotic.
- Xác ñ nh các ñi u ki n nuôi c y ñ sinh t ng h p sinh kh i ñ t hi u qu
cao.
-
ng d ng sinh kh i ch ng vi khu n này th nghi m làm s a chua sinh
h c (bio-yogurt).
3. Ý Nghĩa khoa h c
Tuy n ch n ñư c ch ng vi khu n lactic có kh năng sinh t ng h p nhi u
ho t ch t sinh h c ñ
ng d ng th nghi m trong s n xu t s a chua sinh h c
bio-yogurt phù h p v i ñi u ki n Vi t Nam.
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
2
PH N I: T NG QUAN
1.1. T ng quan v vi khu n lactic
1.1.1. L ch s phát hi n
Vào trư c th k th 20 thu t ng vi khu n lactic s d ng ñ ch nh ng vi
khu n làm s a chua. Vi khu n lactic có m t vai trò to l n trong t nhiên cũng
như trong ñ i s ng th c ti n c a con ngư i. Th c ph m lên men lactic (dưa
mu i, cà mu i, s a chua…) ñã ñư c s d ng r ng rãi trong cu c s ng, nhưng
mãi ñ n năm 1780 nhà hóa h c ngư i Th y ñi n Scheele m i l n ñ u tiên tách
ñư c vi khu n lactic (nguyên nhân chính làm chua th c ph m) t s a bò lên
men chua. G n m t th k sau vào năm 1857 hi n tư ng làm chua s a m i ñư c
Pasteur ch ng minh là do m t nhóm vi khu n ñ c bi t g i là vi khu n lactic gây
ra. Vào năm 1873 J. Lister l n ñ u tiên phát hi n ñư c m t loài vi khu n ñ t tên
là Bacterium lactic (hi n nay g i là Lactococcus lactic) là vi khu n lactic
(Lactococcus lactic). T nh ng nghiên c u trên ngư i ta ñã ñưa ra nh ng ñi m
chung v vi khu n lactic: là nh ng vi khu n Gram dương , b t ñ ng và không
sinh bào t , là l ai vi khu n k khí tùy nghi, có kh năng lên men k khí cũng
như hi u khí và có kh năng lên men ñư ng ñ t o lactic acid, có kh năng ch u
ñ ng cao v i môi trư ng axit. Có ho t tính Protease th y phân protein c a s a
thành peptit và acid amin, ho t tính này các loài là khác nhau, thông thư ng tr c
khu n là cao nh t. ð c bi t có kh năng sinh ch t kháng sinh ñ
c ch vi sinh v t
gây b nh. T ñó ñ n nay hàng lo t các vi khu n lactic ñã ñư c phát hi n và
nh ng ng d ng c a chúng ngày càng ñư c m r ng ra nhi u lĩnh v c [1,2,5].
Trong t nhiên, vi khu n lactic phân b r ng rãi trong phân, rác, xác
ñ ng, th c v t phân h y, trong niêm m c mi ng và niêm m c ru t c a ngư i và
gia súc, gia c m, ñ c bi t tìm th y nhi u trong các s n ph m lên men lactic.
Ngày nay v i k thu t công ngh hi n ñ i con ng ơi ñã miêu t rõ hơn v
hình dáng, kích thư c, c u t o và ñ c ñi m sinh lý, sinh hóa c a vi khu n lactic.
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
3
1.1.2. Phân lo i vi khu n lactic
Vào năm 1919, Orla-Jensen ñã ñưa ra m t s ñ c ñi m ñ c trưng ñ phân
lo i vi khu n lactic. Nh các ñ c ñi m này mà vi c phân lo i vi khu n lactic
ñư c rõ ràng hơn r t nhi u và chúng v n còn là m t công c phân lo i h u ích
cho ñ n ngày nay. Các ñ c ñi m ñ phân lo i lactic mà Orla-Jensen ñưa ra bao
g m: các ñ c ñi m hình thái (d ng hình que, c u hay d ng tetrad), ki u lên men
ñư ng glucose (lên men ñ ng hình hay lên men d hình), kh năng sinh trư ng
các ngư ng nhi t ñ (100C hay 450C) và kh năng s d ng m t s các lo i
ñư ng khác nhau. Nói chung các vi khu n lactic không sinh s c t nhưng khi
sinh trư ng trên môi trư ng có b sung máu thì m t s loài l i có kh năng t o
nên các s c t hemin tương ng [35]. D a trên nh ng ñ c ñi m phân lo i c a
Orla – Jensen thì LAB ñư c chia thành 4 chi: Lactobacillus, Leuconostoc,
Pediococcus, và Streptococcus. N u phân lo i theo ñ nh nghĩa ph r ng v ñ c
ñi m sinh lý và sinh hoá thì nhóm vi khu n lactic bao g m kho ng 20 chi [32].
Th c t trong ngành công nghi p th c ph m thì các chi ñư c coi là nhóm vi
khu n lactic chính bao g m:
Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus,
Lactobacillus,
Leuconostoc,
Streptococcus,
Lactococcus,
Tetragenococcus,
Oenococcus,
Vagococcus,
và
Pediococcus,
Weissella.
Chi
Bifidobacterium thư ng ñư c coi như vi khu n lactic vì nó có mang m t s ñ c
ñi m c a vi khu n lactic. Các chi m i như Alloiococcus, Dilosicoccus,
Dilosigranulum,
Eremococcus,
Facklamia,
Globicatella,
Helcococcus,
Ignavigranum và Lactosphaera bao g m m t s ch ng có quan h v i LAB c
v ñ c ñi m sinh lý cũng như h th ng phát sinh loài [32].
S phân lo i vi khu n lactic thành các chi khác nhau ph n l n d a trên s
khác nhau v hình thái, cơ ch lên men ñư ng, kh năng sinh trư ng
các ñi u
ki n nhi t ñ khác nhau, d ng s n ph m lactic acid, kh năng sinh trư ng
các
n ng ñ mu i khác nhau và kh năng ch u acid hay ki m. ð c ñi m hoá h c như
thành ph n acid béo và thành ph n c u t o thành t bào cũng ñư c s
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
d ng ñ
4
phân lo i. Hơn n a, các k thu t phân lo i ngày nay d a trên m i quan h v
phylogenetic, phân lo i d a trên vi c xác ñ nh trình t rRNA, m i quan h g n
gũi
m c ñ loài hay dư i loài có th ñư c xác ñ nh d a trên các nghiên c u s
tương ñ ng DNA-DNA. ð xác ñ nh s phát sinh ki u gen c a loài và chi, thì
phương pháp nghiên c u d a trên trình t rRNA là phù h p hơn c vì nó có
ch a c các vùng có trình t b o th và ít b o th .
D a vào ñ c ñi m hình thái thì vi khu n lactic ñư c chia thành hai lo i ñó
là d ng hình que (g m có Lactobacillus và Carnobacterium) và hình c u (t t c
các chi còn l i). Riêng chi Weissella theo ñ nh nghĩa thi nó g m c hai d ng là
hình que và hình c u. Trong d ng hình c u l i có m t s chi t n t i
d ng tetrad
như Aerococcus, Pediococcus, và Tetragenococcus.
D a theo kh năng lên men ñư ng thì vi khu n lactic ñư c chia làm hai
nhóm: là nhóm lên men ñ ng hình (Glycolysis hay là con ñư ng EmbdenMeyerhof-Parnas) và nhóm lên men d hình (con ñư ng 6 phosphogluconate /
phosphoketolase) [2, 3,4]. H u h t các LAB s d ng quá trình ñư ng phân theo
con ñư ng Embden-Meyerhof-Parnas. Ngo i tr
leuconostoc, oenococci và
weissella và m t s dư i nhóm lactobacilli có cơ ch lên men d hình còn t t c
các LAB khác ñ u lên men ñ ng hình [32].
Các vi khu n lactic lên men ñ ng hình phân gi i ñư ng theo con ñư ng
EMP (Embden-Meyerhof-Parnas path way) và cho ta s n ph m ch
y u là
lactic acid t 90 – 98% [39]. Ch m t ph n nh pyruvat ñư c decarboxyl hóa
thành acid axetic, etanol, axetoin và CO2. M c ñ t o thành các s n ph m này
ph thu c vào s có m t c a O2. ð i di n c a các vi khu n lactic lên men ñ ng
hình như: Lc. lactis, E. faecalis, Str. salivarius, Str. pyogenes, S. thermophilus,
Lb. helveticus, Lb. acidophilus, Lb. bulgaricus, Lb. platarum …
Các vi khu n lactic d hình do thi u hai 2 enzyme ch y u c a con ñư ng
EMP là aldolase và triozophosphat-isomerase nên giai ño n ñ u c a quá trình
phân gi i glucose x y ra theo con ñư ng PP (Pentose phosphat). Quá trình
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
5
chuy n hóa triozophosphat thành lactic acid x y ra gi ng như trong lên men
ñ ng hình [2, 32]. S n ph m ch y u c a quá trình lên men lactic d hình v n là
lactic acid (40%), ngoài ra, tùy t ng loài có th t o thêm các s n ph m khác
như: xucinic acid và rư u etylic kho ng 20%, axetic acid kho ng 10%, các
ch t khí còn l i chi m 20% [2]. ð i di n các vi khu n lên men d hình như: Ln.
mensenteroides, Ln. cremoris và m t s vi khu n lactic hình que như Lb. brevis,
Lb. fermentum, ….
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
6
Hình 1. Hai con ñư ng chính lên men glucose c a vi khu n lactic:
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
7
(A) lên men lactic ñ ng hình (glycolysis hay Embden-Meyerhof-Parnas
pathway); (B) con ñư ng lên men lactic d
hình (6-phosphogluconate/
phosphoketolase pathway). Th t các enzyme ñư c ñánh d u cho ph n ng:
1. Glucokinase; 2. fructose-1,6-diphosphate aldolase; 3. Glyceradehyde-3phosphate dehydrogenase; 4. pyruvate kinase; 5. Lactate dehydrogenase; 6.
glucose-6-phosphate dehydrogenase; 7. 6-phosphogluconate dehydrogenase; 8.
phosphoketolase; 9. acetaldehyde dehydrogenase; 10. alcohol dehydrogenase.
1.1.3. ð c ñi m sinh lý sinh hoá.
Vi khu n lactic là vi khu n Gram dương, không sinh bào t , không di
ñ ng, ch u ñư c acid, chuy n hóa ñư ng thành lactic acid. Chúng thu nh n
năng lư ng nh phân gi i hydratcacbon và sinh ra lactic acid. Lactic acid sinh
ra có th
d ng D(-), L(+) hay DL. Khác v i m t s vi khu n khác như vi
khu n ñư ng ru t cũng sinh ra lactic acid thì t t c các vi khu n lactic ñ u là vi
khu n lên men b t bu c không ch a các cytocrom và enzyme catalaza. Chúng là
các vi khu n k khí không b t bu c. Khu n l c c a vi khu n lactic tròn nh ,
bóng, có màu môi trư ng, màu tr ng ñ c ho c vàng kem. Vi khu n lactic ñư c
x p chung vào h Lactobacteriaccae. Các chi bao g m Lactobacillus ñây là chi
chính c a vi khu n lactic, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus.
Vi khu n lactic có kh năng sinh trư ng t t trong môi trư ng k khí và vi
hi u khí. Năng lư ng dùng ñ trao ñ i ch t có ñư c là nh quá trình lên men các
carbonhydrate. Lactic acid luôn là s n ph m cu i cùng c a quá trình lên men.
Ngoài ra m t s loài c a Lactobacillus, Leuconostoc ho c Streptoccus có kh
năng t o hương, sinh ra diaxetyl ho c axetoin.
ph n l n vi khu n, axetoin
ñư c sinh ra t
pyruvate và vì v y là s n ph m c a quá trình
trao ñ i
carbonhydrate.
vi khu n lactic r t ít trư ng h p axetoin ñư c hình thành có
ngu n g c t carbonhydrate n u như không có ngu n pyruvat b sung. Thư ng
pyruvat này có ngu n g c t xitrat. ðây là quá trình lên men k khí xitrat
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
vi
8
khu n lactic. Tuy g i là lên men nhưng th c ra xitrat không ñư c s d ng như là
m t ngu n năng lư ng mà ch dùng ñ t o ra các s n ph m trao ñ i ch t. M t s
loài Leuconostoc và Lactobacillus lên men d hình trong môi trư ng trung tính
không t o ra axetoin ho c diaxetyl m c dù trong môi trư ng này chúng v n s
d ng xitrat. Tuy nhiên trong môi trư ng axit các lo i này l i t o ra m t lư ng
ñáng k axetoin.
M c dù vi khu n Lactic có th phát tri n ñư c trên môi trư ng hi u khí
nhưng chúng không thu nh n năng lư ng nh quá trình hô h p. ði u này ch ng
t chúng không t ng h p ñư c nhân hem, do ñó không có cytocrom hay nh ng
enzyme ch a nhân hem khác. Chúng có th ti n hành m t s ph n ng oxy hoá
m t s ít các h p ch t h u cơ khác nh
flavoprotein. Các ph n ng này không
kèm theo vi c t ng h p ATP.
Riêng
vi khu n lactic tuy catalaza âm tính song l i có m t enzyme khác
là peroxidaza b n ch t là flavoprotein. Enzyme này là trung gian xúc tác quá
trình oxy hoá các cơ ch t h u cơ dư i tác d ng c a H2O2. Nh ñó vi khu n
Lactic v n có kh năng sinh trư ng trong môi trư ng hi u khí. ðây cũng là ñ c
ñi m quý báu ñ nh n d ng vi khu n Lactic vì chúng g n như là nh ng vi khu n
catalaza âm tính duy nh t có kh năng sinh trư ng khi có m t oxy.
Nhu c u dinh dư ng c a vi khu n Lactic cũng r t ph c t p, tuỳ theo ñ c
ñi m t ng loài mà khác nhau. Do ñó môi trư ng ñ nuôi c y vi khu n Lactic
thư ng ch a pepton (cao th t, cao n m men) và các d ch chi t t th c v t ho c
ñ ng v t khác .
M t s ñ c ñi m sinh lý ñi n hình n a c a vi khu n Lactic là kh năng
ch ng ch u acid r t t t. Nh ng vi khu n lactic hình c u có th sinh trư ng trong
môi trư ng pH trung tính ho c hơi ki m, vi khu n hình que không có kh năng
ch u môi trư ng có pH l n hơn 6. Vi khu n lactic có kh năng ch u pH môi
trư ng ñ t giá tr là 5. ð c tính sinh acid và ch u acid r t t t giúp vi khu n lactic
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
9
c nh tranh v i vi khu n khác trong môi trư ng giàu dinh dư ng và do ñó chúng
là ñ i di n tiêu bi u c a nhóm vi khu n trong giai ño n cu i c a quá trình lên
men.
Tuỳ thu c ph m vi nhi t ñ sinh trư ng c a vi khu n lactic, ngư i ta chia
chúng thành hai lo i:
- Vi khu n lactic ưa m (mesophile): có th sinh trư ng trong kho ng
nhi t ñ 10 - 350C.
- Vi khu n lactic ưa nhi t (thermophile): có th ch u nhi t ñ 450C.
1.1.4. Nhu c u dinh dư ng c a vi khu n lactic
1.1.4.1. Nhu c u v cacbon
Vi khu n lactic có th s d ng ñư c nhi u lo i hydratcacbon khác nhau
ñ ñáp ng nhu c u dinh dư ng cacbon c a chúng. Tuy nhiên ngu n cacbon
quan tr ng nh t ñ i v i vi khu n lactic v n là monosaccarit và disaccarit. Chúng
ñư c dùng ñ cung c p năng lư ng, xây d ng c u trúc t bào và sinh ra các acid
h u cơ như acid lactic, malic, pyruvic, fumaric, axetic... Nhu c u cacbon còn tuỳ
thu c vào t ng loài vi khu n. Trong quá trình lên men ngoài vi c s d ng các h p
ch t ch a cacbon, vi khu n lactic còn có th s d ng các acid amin như arginin,
tizonin, gluconic làm ngu n cung c p năng lư ng.
1.1.4.2
Nhu c u v nitơ
Nitơ có m t trong t t c các thành ph n quan tr ng c a t bào như protein,
enzyme...vì th vi khu n lactic cũng như t t c các cơ th s ng khác c n nitơ ñ
ñ m b o cho quá trình sinh trư ng và phát tri n, tham gia vào xây d ng c u trúc
t bào.
Ngu n nitơ hay ñư c cung c p dư i d ng các h p ch t h u cơ t nhiên như
d ch ngũ c c, d ch thu phân protein, pepton, cao ngô, cao th t, cao n m men…Trong
ñó cao n m men là s l a ch n t t nh t trong các ngu n nitơ ph c t p.
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ………………………
10
- Xem thêm -