Tài liệu Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và độc tố đường ruột (enterotoxin) của vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., Staphylococcus aureus ô nhiễm trong thịt lợn ở một số tỉnh phía Bắc

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẶNG THỊ MAI LAN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VÀ ĐỘC TỐ ĐƯỜNG RUỘT (ENTEROTOXIN) CỦA VI KHUẨN Listeria, Salmonella spp., Staphylococcus aureus Ô NHIỄM TRONG THỊT LỢN Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC Chuyên ngành: Ký sinh trùng và VSV học thú y Mã số: 62.64.01.04 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y Thái Nguyên, năm 2017 Công trình được hoàn thành tại: ............................................................................................................... Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Đặng Xuân Bình 2. PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh Phản biện 1:…………………………………………… ……………………………………………. Phản biện 2:…………………………………………… ……………………………………………. Phản biện 3..................................................................... ..................................................................... Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận cấp Đại học Thái Nguyên họp tại: ……………………………………………………………………. ……………………………………………………………………… Vào hồi giờ ngày Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia; - Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên; - Thư viện Trường Đại học Nông Lâm. tháng năm DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Đặng Thị Mai Lan, Đỗ Hồng Anh, Nguyễn Thị Huê, Trần Phi Vương (2014), “Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus trong thịt lợn ở thành phố Thái Nguyên”, Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, Chuyên đề Nông lâm nghiệp trung du, miền núi phía Bắc, tháng 6/2014, tr. 104 - 110. 2. Nguyễn Thị Hoài Thu, Phạm Thùy Linh, Bùi Văn Ngọc, Đặng Thị Mai Lan, Nghiêm Ngọc Minh (2015), “Biểu hiện và tinh sạch vùng quyết định kháng nguyên Staphylococcus enterotoxin B (SEB) được mã hóa bởi đoạn gen seb phân lập từ chủng tụ cầu vàng tại Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 13 (2), tr. 295 - 301. 3. Đặng Xuân Bình, Đặng Thị Mai Lan, Nguyễn Thị Thu Huyền (2015), “Indentification and Characterrization of Staphylococcus aureus Bacteria In Fresh Pork At Public Markets In The North of Vietnam”, Research Journal of Animal and Veterinary Sciences, 8(2) Special 2015, pp. 24 - 32. 4. Đặng Thị Mai Lan, Đặng Xuân Bình (2016), “Xác định tỷ lệ nhiễm và đặc tính sinh vật hóa học của một số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm trên thịt lợn tươi bán tại chợ trên địa bàn các tỉnh miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XXIII, số 6, tr. 53 - 63. 5. Đặng Thị Mai Lan, Đặng Xuân Bình (2016), “Xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp., Staphylococcus aureus phân lập được trên thịt lợn tươi bán tại chợ một số tỉnh miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XXIII, số 7, tr. 46 - 53. 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm gần đây, ngộ độc thực phẩm (NĐTP) xảy ra thường xuyên và với số lượng vụ NĐTP rất lớn làm ảnh hưởng không nhỏ đến sức khoẻ con người và kinh tế của người dân. Nguyên nhân là do thức ăn không đảm bảo vệ sinh, nhiều tạp chất, chất hoá học… đặc biệt do thức ăn nhiễm một số loại vi khuẩn như: E. coli, Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Staphylococcus aureus và Listeria monocytogenes… Xuất phát từ thực tiễn chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và độc tố đường ruột (enterotoxin) của vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., Staphylococcus aureus ô nhiễm trong thịt lợn ở một số tỉnh phía Bắc”. * Mục tiêu nghiên cứu - Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S. aureus… nhiễm trên thịt lợn bán tại chợ ở các tỉnh khu vực phía Bắc. - Nghiên cứu và xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của chủng vi khuẩn Salmonella spp. và S. aureus phân lập được. * Ý nghĩa khoa học - Cung cấp tư liệu khoa học về loài Salmonella spp. và trình tự gene độc tố enterotoxin type B của S. aureus phục vụ nghiên cứu tiếp theo nhằm phòng, chống hiệu quả NĐTP. - Là cơ sở khoa học từ đó đề xuất biện pháp khống chế ô nhiễm thịt lợn do Salmonella spp. và S. aureus gây ra. * Ý nghĩa thực tiễn - Bổ sung tư liệu về tình hình nhiễm khuẩn nói chung, ô nhiễm Listeria, Salmonella spp. và S. aureus nói riêng trên thịt lợn. 2 - Bổ sung tư liệu về độc lực và khả năng sản sinh độc tố enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp., S. aureus và giải trình tự gene sản sinh độc tố của chúng. * Điểm mới của đề tài - Xác định được khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp., S. aureus ô nhiễm trên thịt lợn. - Đã nhân dòng và xác định trình tự của gene seb dạng tự nhiên kích thước 534 bp và gene sản sinh độc tố enterotoxin của Salmonella spp.. Đồng thời, đã nhân, biểu hiện và tinh sạch thành công protein tổ hợp seb 534 ở dạng tự nhiên. * Bố cục của luận án Luận án gồm 154 trang được chia thành các 3 chương, phần mở đầu: 3 trang, chương 1: Tổng quan tài liệu 49 trang; chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 19 trang; chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 57 trang; Kết luận và đề nghị 2 trang; Danh mục các công trình có liên quan đến luận án 01 trang; Tài liệu tham khảo 16 trang; Hình ảnh của luận án 4 trang, Phụ lục 3 trang. Luận án có 29 bảng, 22 hình, 152 tài liệu tham khảo (65 tài liệu tiếng Việt, 79 tài liệu tiếng nước ngoài, 08 tài liệu Internet) và 12 ảnh màu được cấu trúc từ ảnh điện di. Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bộ Y tế (2008) đã tổng hợp số liệu thống kê của Cục an toàn Vệ sinh thực phẩm trong vòng 8 năm (2000 - 2007) cho thấy: Nước ta, xảy ra 1.616 vụ NĐTP làm 41.898 người mắc, 436 người tử vong thì có 178 vụ làm 4.036 người mắc và 7 tử vong người do sử dụng thức ăn đường phố. Trong các nguyên nhân gây NĐTP thì nguyên nhân do vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao nhất (43,20 %). Đặng Xuân Bình và Dương Thùy Dung (2010) cho biết: Trong tổng số 136 mẫu thịt lợn tươi được thu thập tại các chợ khu vực 3 Trung tâm thành phố Thái Nguyên từ 5/2009 - 4/2010 có chỉ tiêu tổng số vi khuẩn gây ô nhiễm thịt chiếm 50 - 56 %; E. coli chiếm 37,9 - 48,7 %; Salmonella spp. chiếm 10 - 19,5 %; Bacillus cereus chiếm 27,5 - 31,7 %; S. aureus chiếm 31,0 - 38,8 %; C. perfringens chiếm 10 - 14 %. Lê Huy Chính (2003) cho biết: vi khuẩn Listeria ít kháng thuốc kháng sinh, có thể điều trị bệnh do Listeria bằng penicillin hoặc erythromycin cho kết quả tốt. Tuy nhiên, một số loại vi khuẩn đã kháng lại tetracycline như: Listeria là 48,3 %; Salmonella spp. là 63,6 %; Yersinia spp. là 51,3 % (Jamali H. và cs., 2014). Trần Thị Xuân Mai và cs. (2011) đã thực hiện kỹ thuật PCR đa mồi để phát hiện Salmonella enteritica trong thực phẩm. Kết quả nghiên cứu cho thấy cặp mồi invA đặc hiệu cho Salmonella spp. và cặp mồi spvC đặc hiệu cho S. enteritica (gồm S. typhimurium và S. enteritidis) đã được phát triển thành công. Theo Walter Chaim và David A. Eschenbach (2014) thì các yếu tố độc lực của Listeria monocytogenes bao gồm: listeriolysin O (LLO), protein ACTA, phospholipases, metalloprotease, protein P60, protease CLP và ATPases. Steven R. G. và cs. (2005) đã thành công trong việc giải trình tự bộ gene dài 2809422 bp của chủng Staphylococcus aureus COL. Kết quả giải trình tự đã được ghi nhận trên Genbank với mã số: CP000046.1 cho hệ gen nhân và CP000045 cho hệ gene plasmid. Nghiêm Ngọc Minh và cs. (2011) đã lựa chọn ngẫu nhiên dòng khuẩn lạc số 1 để tiến hành biểu hiện protein tái tổ hợp seb ở nồng độ IPTG 0,1 mM; nhiệt độ 30oC và thời gian cảm ứng là 5 giờ. Kết quả cho thấy protein seb đã được biểu hiện có khối lượng khoảng 28 kDa đúng theo lý thuyết tính toán. 4 Hao D. và cs. (2015) cũng đã phát hiện các gene mã hóa độc tố tụ cầu vàng, trong đó gene chiếm ưu thế là sec (38,5 %); tiếp theo là seg (19,7 %); sej (16,2 %); see (12,8 %); sea (11,1 %) và seb (10,3 %). Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu - Thịt lợn tươi sống bán tại chợ của Thái Nguyên, Hà Tây - Hà Nội, Bắc Giang, Vĩnh Phúc - Vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S. aureus 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu 2.1.2.1. Địa điểm triển khai - Chợ Trung tâm của tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây - Hà Nội, Vĩnh Phúc 2.1.2.2. Địa điểm xét nghiệm mẫu - Bộ môn Vi sinh - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên - Phòng Công nghệ sinh học môi trường và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học 2.1.3. Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2012 đến năm 2015 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Động vật thí nghiệm - Chuột bạch, có khối lượng 18 - 20g/con. - Thỏ, có khối lượng 2 - 2,5kg/con 2.2.2. Các loại môi trường sử dụng trong quá trình nghiên cứu - Môi trường thông thường và đặc hiệu để nuôi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S. aureus: Nutrient 5 Broth, Selenite Broth, XLD, TSI, BHI, Chapman, Fraser, Palcam,… và các loại đệm sử dụng trong nghiên cứu được chuẩn bị theo Sambrook và Russell (2001) hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất. - Máy móc, trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất khác: do Bộ môn Vi sinh - Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên và Công nghệ sinh học môi trường và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học cung cấp. 2.3. Nội dung nghiên cứu 2.3.1. Xác định tỷ lệ nhiễm và đặc tính sinh học của vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus trên thịt lợn tươi bán tại chợ Trung tâm của một số tỉnh phía Bắc - Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp., S. aureus trên thịt lợn bán tại chợ Trung tâm của một số tỉnh phía Bắc - Xác định các đặc tính sinh hóa, độc lực, tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn đã phân lập được. - Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn đã phân lập được trên chuột thí nghiệm. - Xác định tính mẫn cảm của các chủng vi khuẩn đã phân lập được đối với một số loại kháng sinh. 2.3.2. Xác định serovar các chủng Salmonella spp. phân lập được bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính 2.3.3. Xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp. và S. aureus bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ”. 2.3.4. Xác định gene sản sinh độc tố enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp. và S. aureus phân lập được - Xác định gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp. và S. aureus bằng phương pháp PCR 6 - Đọc trình tự ADN trên máy đọc tự động và phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên dụng - Biểu hiện và tinh sạch gene seb của vi khuẩn S. aureus phân lập được - Đề xuất biện pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm 2.4. Phương pháp nghiên cứu Để thực hiện đề tài này, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu thường quy định trong phòng thí nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn Quốc tế (ISO). 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu Mẫu thịt lợn tươi được lấy theo TCVN 4833 - 1 : 2002, TCVN 4833 - 2 : 2002, ISO 3100 - 1 : 1991. 2.4.2. Phương pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus nhiễm trên thịt lợn tươi Xác định chỉ tiêu vi khuẩn hiếu khí nhiễm trên thịt lợn tươi theo TCVN 7046 : 2002, vi khuẩn Salmonella spp. theo TCVN 5153 : 1990, vi khuẩn Staphylococcus aureus theo TCVN 5156 : 1990; vi khuẩn Listeria theo TCVN 7700 - 1 : 2007. 2.4.3. Phương pháp nhuộm Gram xác định hình thái vi khuẩn Nhuộm Gram nhằm xác định đặc điểm hình thái và khả năng bắt màu của vi khuẩn, quan sát hình thái, và tính chất bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi với vật kính dầu (100). 2.4.4. Xác định các đặc tính sinh hóa của các chủng Listeria, Salmonella spp. và S. aureus đã phân lập được Tiến hành giám định đặc tính vi sinh vật hóa học: kiểm tra hình thái, kích thước, tính chất bắt màu Gram, khả năng di động, phản ứng 7 sinh Indole 45oC (+), H2S; urease, catalaza, coagulase, phản ứng lên men đường… 2.4.5. Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus phân lập được trên chuột thí nghiệm Tiến hành thử độc lực cho chuột thí nghiệm theo quy trình thường quy sử dụng trong phòng thí nghiệm tại Bộ môn Vi sinh - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên. 2.4.6. Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của chủng vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus phân lập được Để đánh giá tính mẫn cảm với kháng sinh, sử dụng phương pháp của Kirby- Bauer và đánh giá kết quả thử khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh dựa vào bảng đánh giá của NCCLS - 2000 Mỹ. 2.4.7. Phương pháp xác định serovar của vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được Tiến hành định type theo bảng định type huyết thanh học của vi khuẩn Salmonella spp. theo sơ đồ của Kauffman - White (1972). 2.4.8. Phương pháp xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp. và S. aureus bằng “Phản ứng khuyếch tán trong da thỏ” Tiêm độc tố vào dưới da thỏ thí nghiệm, khoảng 2h sau tiêm dung dịch Evan Blue vào tĩnh mạch tai, liều 40 mg/kg thể trọng. Nuôi tiếp 2 giờ rồi giết thỏ, lột da và đọc kết quả phản ứng trên da. 2.4.9. Xác định gene sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn Salmonella spp. và S. aureus bằng phương pháp PCR 8 Để thu nhận ADN tinh sạch, dùng nhiệt độ cao (95oC) để biến tính chuỗi ADN sợi kép, kết hợp với enzym Taq ADN polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động. Phân tử ADN quan tâm sẽ được giữ lại trên cột tinh sạch có bản chất là các hạt sepharose, sau đó sử dụng đệm để thu lại các phân tử ADN này để tiến hành xác định trình tự trên máy tự động. 2.4.10. Phương pháp đọc trình tự ADN trên máy đọc tự động và phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên dụng đối với vi khuẩn S. aureus Trình tự nucleotide của gene được xác định bằng phương pháp xác định trình tự gene tự động trên máy ABI PRISM R 3100 Avant Genetic Analyzer theo phương pháp của Sanger và được xử lý bằng phần mềm ABI PRISM 3.100 Avant Data Collection v 1.0, sau đó được so sánh với trình tự của các vi khuẩn đã được công bố trong ngân hàng gene thế giới. 2.4.11. Phương pháp biểu hiện và tinh sạch gene seb 534 của vi khuẩn S. aureus Đoạn gene wtSEB được khuếch đại từ khuôn là ADN tổng số của S. aureus bằng phương pháp PCR. Sau khi kiểm tra bằng cắt với enzyme hạn chế và PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu, những dòng chứa plasmid pET21a(+) mang đúng gene wtSEB sẽ được sử dụng cho biểu hiện gene và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng như: nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng, thời gian cảm ứng để tìm ra các điều kiện tối ưu nhất cho việc sinh tổng hợp protein ngoại lai wtSEB. Protein tái tổ hợp wtSEB được tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực Ni2+ của Invitrogen. 9 2.5. Phương pháp xử lý số liệu Đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu thường quy trong phòng thí nghiệm, phương pháp thống kê sinh học Minitab, SAS 3.1, Nguyễn Văn Thiện (2002) và trên phần mềm Microsoft office excel 2007. Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tình hình tiêu thụ và tỷ lệ nhiễm khuẩn trên thịt lợn ở một số tỉnh phía Bắc 3.1.1. Khảo sát tình hình giết mổ lợn trên địa bàn một số tỉnh phía Bắc Bảng 3.1. Tình hình giếết mổ và tếu thụ thịt lợn bán tại chợ Trung tâm ở Thái Nguyến, Bắếc Giang, Hà Tây và Vĩnh Phúc Thời Số Địa điểm gian hoạt lượng động quầy (chợ) (giờ) Thái Nguyên 4 - 20 bán thịt Tỷ lệ quầy Số lượng Khối lượng được kiểm lợn giết thịt thịt tiêu thụ tra vệ sinh thú y (%) trung bình trung bình (con/ngày) (tấn/ngày) X ± mX X ± mX 29 100 54,56 ± 2,12 2,39 ± 0,58 Bắc Giang 4 - 20 27 100 55,05 ± 1,86 2,81 ± 0,19 Hà Tây 5 - 19 14 100 17,36 ± 1,25 0,75 ± 0,11 Vĩnh Phúc 5 - 19 18 100 22,42 ± 1,51 0,96 ± 0,16 Kết quả từ bảng 3.1, cho thấy: Các chợ bán thịt bắt đầu hoạt động trong khoảng thời gian từ 4 hoặc 5 giờ đến 19 hoặc 20 giờ. Đây là thời điểm thuận lợi để người tiêu dùng đến chợ trao đổi/mua bán thực phẩm nói chung và thịt lợn nói riêng. Số lượng các quầy hàng 10 bán thịt lợn tươi cũng có sự thay đổi do quy mô và vị trí địa lý - tự nhiên xã hội của từng chợ. Mặt khác có sự tương quan giữa số lượng con lợn được giết thịt mỗi ngày với khối lượng thịt tiêu thụ do mật độ dân cư ở mỗi địa điểm lấy mẫu có sự khác nhau. 3.1.2. Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus trên thịt lợn bán tại chợ Trung tâm của tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây và Vĩnh Phúc Bảng 3.2. Kết quả tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Listeria, Salmonella spp. và S. aureus trên thịt lợn bán tại chợ Trung tâm của tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây và Vĩnh Phúc Listeria Salmonella spp. S. aureus Địa điểm Số mẫu xét nghiệ m Thái Nguyên 105 9 8,57 12 11,43 79 75,24 Bắc Giang 89 16 17,98 11 12,36 74 83,15 Hà Tây 88 12 13,64 9 10,23 67 76,1 4 Vĩnh Phúc 76 10 13,16 9 11,84 55 72,37 Tính chung 358 47 13,13 41 11,45 275 76,82 Số Số mẫu Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ dươn (%) dương (%) g tính tính Số mẫu Tỷ lệ dươn (%) g tính Kết quả bảng 3.2 cho thấy: các mẫu thịt lợn được bày bán có tỷ lệ nhiễm Listeria chiếm 13,13 %. Salmonella spp. chiếm 11,45 % và S. aureus chiếm 76,82 %. 3.2. Tỷ lệ nhiễm Listeria, Salmonella spp., S. aureus trên thịt lợn bán tại chợ Trung tâm của tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà 11 Tây, Vĩnh Phúc Các chủng vi khuẩn phân lập được tại 4 chợ Trung tâm của Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Tây và Vĩnh Phúc được xác định tỷ lệ nhiễm và ký hiệu lần lượt với Listeria từ L1 - L47 (13,13 %), Salmonella spp. từ Sal1 - Sal41 (11,45 %) và S. aureus từ S1 - S275 (76,82 %). 3.3. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn L. monocytogenes, Salmonella spp., S. aureus nhiễm trên thịt lợn bán tại các chợ 3.3.1. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn L. monocytogenes nhiễm trên thịt lợn Tỷ lệ mẫu thịt lấy tại các chợ nhiễm L. monocytogenes chiếm từ 8,57 % đến 17,98 %. Có từ 4,76 % đến 12,36 % mẫu không đạt TCVN. Mức nhiễm cao nhất từ 1,36 x 10 5 CFU/g - 4,91 x 105 CFU/g; mức thấp nhất từ 2,73 x 104 CFU/g - 7,27 x 104 CFU/g. 3.3.2. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella spp. nhiễm trên thịt lợn Trong tổng số 358 mẫu thịt kiểm tra có 41 mẫu nhiễm Salmonella spp. chiếm 11,45 %. Trong đó, tại Thái Nguyên: mẫu thịt nhiễm Salmonella spp. không đạt TCVN chiếm 11,43 %; tại Vĩnh Phúc là 11,84 %; Bắc Giang là 12,36% và Hà Tây là 10,23 %. 3.3.3. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn S. aureus nhiễm trên thịt lợn Các mẫu thịt có tỷ lệ nhiễm S. aureus chiếm từ 72,37 % đến 83,15 %. Có từ 34,21 % đến 47,19 % mẫu thịt bị nhiễm S. aureus không đạt TCVN. Mức nhiễm cao nhất từ 3,76 x 106 CFU/g - 5,31 x 106 CFU/g; mức thấp nhất từ 1,05 x 106 CFU/g - 1,18 x 106 CFU/g. 3.4. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn L. monocytogenes, Salmonella spp., S. aureus nhiễm trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu sau bán hàng 12 3.4.1. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn L. monocytogenes trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu Tỷ lệ mẫu thịt lợn nhiễm L. monocytogenes vào các thời điểm lấy mẫu trong ngày có sự khác nhau khá rõ rệt, tỷ lệ thịt lợn nhiễm L. monocytogenes cao nhất vào 4 - 5 giờ chiều (7,54 %), sau đó là thời điểm 10 - 11 giờ trưa (4,19 %) và thấp nhất là 6 - 7 giờ sáng (1,40 %). 3.4.2. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella spp. trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu Các mẫu thịt được lấy vào buổi sáng sớm (6 - 7 giờ sáng) tại các chợ phát hiện có 4/358 mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. chiếm tỷ lệ 1,12 %. Thời điểm 10 - 11 giờ trưa tỷ lệ mẫu thịt nhiễm Salmonella spp. tăng lên là 3,63 %. Đến cuối buổi chiều, (khoảng 4 - 5 giờ chiều) tỷ lệ nhiễm lên tới 6,70 %. 3.4.3. Xác định chỉ tiêu vi khuẩn S. aureus nhiễm trên thịt lợn theo thời gian lấy mẫu Sau bán hàng từ 1 - 2 giờ (6 - 7 giờ sáng) các mẫu thịt thu thập từ các chợ phát hiện có 18/358 mẫu nhiễm vi khuẩn S. aureus chiếm tỷ lệ 5,03 %. Khoảng 10 - 11 giờ trưa tỷ lệ mẫu thịt nhiễm S. aureus tăng lên là 28,49 %. Đến cuối buổi chiều (khoảng 4 - 5 giờ) tỷ lệ nhiễm lên tới 43,30 %. 3.5. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn L. monocytogenes, Salmonella spp., S. aureus nhiễm trên thịt lợn theo mùa 3.5.1. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn L. monocytogenes, trên thịt lợn theo mùa Tỷ lệ thịt lợn nhiễm vi khuẩn L. monocytogenes vào mùa Hè có 18/101 mẫu kiểm tra chiếm 17,82 % là cao nhất với cường độ nhiễm trung bình ở các mẫu không đạt TCVN là 1,80 x 10 5 CFU/g; sau đó đến mùa Xuân là 12/80 mẫu kiểm tra chiếm 15,00 % với cường độ nhiễm trung bình ở các mẫu không đạt TCVN là 1,07 x 10 5 CFU/g. 13 Mùa Thu và mùa Đông có tỷ lệ thịt lợn nhiễm L. monocytogenes thấp hơn mùa Hè và mùa Xuân, tỷ lệ dao động từ 9,09 % đến 10,26 % với cường độ nhiễm trung bình ở các mẫu không đạt TCVN là 1,07 x 105 CFU/g. 3.5.2. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trên thịt lợn theo mùa Đã phát hiện có 19/101 mẫu thịt nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. vào mùa Hè chiếm 18,81 %; 8/99 mẫu nhiễm vào mùa Xuân chiếm 10,00 %. Và đây cũng là hai mùa có tỷ lệ thịt nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. cao hơn so với mùa Đông (7,69 %) và mùa Thu (8,08 %). Tất cả các mẫu dương tính với Salmonella spp. này đều không đạt TCVN. 3.5.3. Tỷ lệ và cường độ nhiễm vi khuẩn S. aureus trên thịt lợn theo mùa Tỷ lệ thịt lợn nhiễm vi khuẩn S. aureus vào mùa Hè là 96/101 mẫu kiểm tra chiếm 95,05 % cao nhất, mùa Xuân là 65/80 mẫu kiểm tra chiếm 81,25 %. Mùa Thu và mùa Đông có tỷ lệ thịt lợn nhiễm S. aureus thấp hơn mùa Hè và mùa Xuân, tỷ lệ dao động từ 53,85 % đến 72,73 %. Số mẫu không đạt TCVN mùa Hè là 65,63 %; mùa Xuân là 55,38 %; mùa Thu là 44,44 % và mùa Đông là 40,48 %. 3.6. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn L. monocytogenes, Salmonella spp. và S. aureus phân lập được 3.6.1. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn L. monocytogenes phân lập được Các chủng vi khuẩn L. monocytogenes phân lập được bắt màu Gram (+) và có tính di động, dương tính với phản ứng rhamnose, xylose và catalase (100 %); âm tính với phản ứng oxidase và không có khả năng lên men mannitol. 89,36 % số chủng L. monocytogenes dương tính gây dung huyết (β - hemolysis). 14 3.6.2. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được Các chủng vi khuẩn Salmonella spp. đều là vi khuẩn Gram (-), có khả năng lên men glucose, manitol, phản ứng catalase và sản sinh H2S (100 %). Các chủng vi khuẩn này đều không dung huyết, không lên men lactose. Có 34/41 chủng có khả năng di động (82,93 %), còn 7/41 chủng không có khả năng di động (17,07 %) chứng tỏ là Salmonella pollorum hoặc Salmonella gallinarum. 3.6.3. Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn S. aureus phân lập được Các chủng S. aureus phân lập được có đặc tính sinh học điển hình của giống như mô tả trong các tài liệu kinh điển; bắt màu tím của thuốc nhuộm Gram (+), có phản ứng lên men catalase dương tính, lên men sucrose dương tính, phản ứng sản sinh coagulase làm đông tụ huyết tương, hoàn nguyên nitrate thành nitrit (100 %); không lên men gatactose và không có khả năng di động. Phần lớn các chủng S. aureus này có khả năng dung huyết (255/275 chủng) chiếm 92,73 %. 3.7. Thử độc lực của các chủng vi khuẩn L. monocytogenes, Salmonella spp. và S. aureus phân lập được trên chuột thí nghiệm 3.7.1. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn L. monocytogenes phân lập được trên chuột thí nghiệm Có tới 100 % số chuột được tiêm canh khuẩn L. monocytogenes qua phúc xoang đều chết trong khoảng thời gian từ 8 - 72 giờ. Từ 8 24 giờ có 12/47 chủng và 25 - 72 giờ có 16/47 chủng gây chết 100 % chuột thí nghiệm. Tổng các chủng L. monocytogenes đem thử độc lực gây chết 89,36 % chuột thí nghiệm. Chuột chết được mổ khám để kiểm tra bệnh tích đồng thời tiến hành phân lập lại vi khuẩn từ máu tim đều cho kết quả dương tính 100 %. 15 3.7.2. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được trên chuột thí nghiệm Các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập đã xác định được độc lực qua khả năng gây chết chuột thí nghiệm. Có 26 chủng gây chết cả 100 % chuột thí nghiệm. Trong đó, có 15 chủng gây chết 100 % chuột gây nhiễm trong vòng 8 - 24 giờ, Các chủng còn lại gây chết chuột từ 25 - 72 giờ. Có tới 92,68 % chuột thí nghiệm đem thử độc lực với các chủng Salmonella spp. phân lập được đã chết. Điều này chứng tỏ, độc lực của các chủng Salmonella spp. phân lập được là rất mạnh. 3.7.3. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn S. aureus phân lập được trên chuột thí nghiệm Sau 48 giờ tiêm canh khuẩn, các chủng vi khuẩn S. aureus đã gây chết tới 100 % chuột thí nghiệm thể hiện độc lực mạnh. Trong khoảng từ 8 - 24 giờ đã có 53 chủng gây chết 100 % chuột, đến 48 giờ có tổng 117 chủng gây chết 100% chuột thí nghiệm. Đây là cơ sở để xác định độc tố đường ruột của S. aureus bằng phương pháp giải trình tự gene mã hoá cho protein độc tố đường ruột nhóm B (seb) của các chủng S. aureus có độc lực mạnh trên chuột thí nghiệm. 3.8. Kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng L. monocytogenes, Salmonella spp. và S. aureus phân lập được 3.8.1. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng L. monocytogenes phân lập được Các chủng vi khuẩn L. monocytogenes phân lập được có 47/47 chủng rất mẫn cảm với amoxicilline, erythrommycin, SMX/TMP (100 %); 61,70 % số chủng mẫn cảm trung bình với streptomycin; 53,19 % mẫn cảm với norfloxacin và 38,30 % - 53,19 % chủng kháng lại streptomycin, clindamycin và oxacill. 16 3.8.2. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng Salmonella spp. phân lập được Các chủng Salmonella spp. mà chúng tôi phân lập và thử nghiệm rất mẫn cảm với cephalexin, SMX/TMP, norfloxacin, enrofloxacin tỷ lệ từ 56,10 % - 73,17 %. Các loại khác như: erythromycin, spectinomycin, lincomycin thì mẫn cảm trung bình với Salmonella spp. tỷ lệ từ 51,22 % - 58,54 %. Có một số chủng Salmonella spp. kháng với clindamycin, erythromycin, lincomycin (41,46 % - 56,10 %) và kháng rất cao với oxacill (68,29 %). 3.8.3. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng S. aureus phân lập được S. aureus rất mẫn cảm với SMX/TMP, doxycycline, cephalexin, clindamycin và norfloxacin tỷ lệ từ 50,18 % - 87,64 %. Mẫn cảm trung bình với spectinomycin, penicillin, neomicin (52,36 % - 74,55 %). Tuy nhiên, S. aureus lại kháng khá mạnh với oxacill (51,64 %). 3.9. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella và S. aureus bằng “Phản ứng khuếch tán trong da thỏ” Bảng 3.24. Khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella spp. bắằng “Phản ứng khuếếch tán trong da thỏ” Đợt thử Đợt 1 Đợt 2 Đợt 3 Số chủng thử 8 10 8 Tính chung 26 Số chủng Tỷ lệ sản sinh (%) độc tố 3 37,50 6 60,00 4 50,00 13 50,00 Số chủng Tỷ lệ không sản (%) sinh độc tố 5 62,50 4 40,00 4 50,00 13 50,00 17 Đã tiến hành thực hiện “phản ứng khuếch tán trong da thỏ” và phát hiện 50,00 % chủng vi khuẩn Salmonella spp. sản sinh độc tố và 50,00 % chủng không sản sinh độc tố. Sau đó, sử dụng các chủng sản sinh độc tố này để xác định serovar và tách chiết AND. Bảng 3.25. Khả năng sản sinh độc tố đường ruột của vi khuẩn S. aureus bắằng “Phản Đợt 1 Đợt 2 Đợt 3 Số chủng thử 33 46 38 Tính chung 117 Đợt thử ứng khuếếch tán trong da thỏ” Số chủng Tỷ lệ sản sinh (%) độc tố 14 42,42 23 50,00 17 44,74 54 46,15 Số chủng Tỷ lệ không sản (%) sinh độc tố 19 57,58 23 50,00 21 55,26 63 53,85 Tương tự như đối với vi khuẩn Salmonella spp., chúng tôi cũng đã phát hiện 46,15 % chủng vi khuẩn S. aureus sản sinh độc tố và 53,85 % chủng không sản sinh độc tố. 3.10. Kết quả xác định serovar các chủng Salmonella spp. phân lập được bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính theo sơ đồ của Kauffmann - White Bảng 3.26. Kết quả xác định serovar của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được bắằng type kháng thể chuẩn STT Ký hiệu mẫu O H1 H2 Serovar 1 Sal 1 A4 Ai 1, 2 Typhimurium 2 Sal 2 A4 Ai 1, 2 Typhimurium