Tài liệu Phân lập chủng vi khuẩn lactic và khảo sát khả năng sinh bacteriocin

ÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC BAÙCH KHOA KHOA KYÕ THUAÄT HOAÙ HOÏC LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP ÑAÏI HOÏC PHAÂN LAÄP CHUÛNG VI KHUAÅN LACTIC VAØ KHAÛO SAÙT KHAÛ NAÊNG SINH TOÅNG HÔÏP BACTERIOCIN SVTH: LEÂ THÒ HOÀNG VAÂN CBHD: THS. NGUYEÃN VUÕ TUAÂN TP Hoà Chí Minh, 01/2008 TOÙM TAÉT LUAÄN VAÊN Trong coâng ngheä thöïc phaåm vi khuaån lactic ñöôïc söû duïng roäng raõi töø raát laâu ñôøi bôûi öùng duïng phong phuù cuûa noù trong cuoäc soáng. Nhöõng nghieân cöùu gaàn ñaây cho thaáy vi khuaån lactic coøn coù khaû naêng sinh toång hôïp caùc bacteriocin, nhöõng peptide hoaït tính kìm haõm ñaëc hieäu hay öùc cheá maïnh meõ söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi sinh vaät. Ñeå coù nhöõng khaûo saùt saâu hôn tröôùc heát caàn phaûi coù chuûng vi khuaån lactic sinh toång hôïp ñöôïc bacteriocin cao. Vì vaäy chuùng toâi tieán haønh nghieân cöùu nhaèm muïc ñích: - Phaân laäp chuûng vi khuaån coù khaû naêng sinh toång hôïp ñöôïc bacteriocin - Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñieàu kieän nuoâi caáy leân söï sinh tröôûng vaø khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng phaân laäp ñöôïc. Chuûng vi khuaån seõ ñöôïc phaân laäp töø caùc nguoàn töï nhieân nhö söõa töôi töï leân men, caùc loaïi rau quaû muoái chua (caûi muoái chua, caø phaùo muoái chua, döa giaù), kim chi vaø giaù ñoã. Qua quaù trình thí nghieäm, ta coù ñöôïc chuûng vi khuaån lactic phaân laäp töø söõa töôi töï leân men theå hieän vuøng öùc cheá Listeria monocytogenes chöùng toû coù khaû naêng sinh toång hôïp ñöôïc bacteriocin. Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä vaø pH leân söï sinh tröôûng vaø söï sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng nhaèm naâng cao khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin. Töø keát quaû ñaït ñöôïc thì khi nuoâi caáy chuûng trong moâi tröôøng dòch theå MRS coù pH ban ñaàu 6.0 ôû nhieät ñoä 30oC chuûng seõ sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp bacteriocin toát nhaát. Khi ñoù, ñoä ño quang O.D. 600 nm = 1.417 vaø hoaït tính bacteriocin ñaït 2250 AU/ml. Toùm laïi, nghieân cöùu ñaõ phaân laäp ñöôïc chuûng vi khuaån lactic yeâu caàu töø söõa leân men töï nhieân vaø ñieàu kieän nuoâi caáy toái thích ñeå chuûng sinh tröôûng, sinh toång hôïp bacteriocin cao nhaát laø trong moâi tröôøng dòch theå MRS coù pH ban ñaàu 6.0 ôû 30oC. Vôùi nhöõng yù nghóa cuûa nghieân cöùu, em hy voïng seõ laøm ñöôïc nhöõng khaûo saùt coù yù nghóa vaø goùp phaàn taïo neàn taûng cho nhöõng nghieân cöùu sau naøy, mang laïi nhöõng giaù trò thaät lôùn trong vieäc baûo quaûn thöïc phaåm, ñaûm baûo an toaøn thöïc phaåm vaø naâng cao giaù trò soáng cuûa con ngöôøi. MUÏC LUÏC LÔØI CAÛM ÔN i TOÙM TAÉT LUAÄN VAÊN ii MUÏC LUÏC iv DANH MUÏC HÌNH vi DANH MUÏC BAÛNG vii MÔÛ ÑAÀU..........................................................................................................................1 Chöông 1: TOÅNG QUAN 1.1 VI KHUAÅN LACTIC.................................................................................................3 1.1.1 Ñaëc ñieåm chung.........................................................................................3 1.1.2 Caùc chuûng vi khuaån coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin..............8 1.2 BACTERIOCIN.......................................................................................................12 1.2.1 Sô löôïc veà bacteriocin.............................................................................12 1.2.2 Bacteriocin töø LAB.................................................................................13 1.2.3 Bacteriocin töø vi khuaån khaùc................................................................22 1.2.4 Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin......23 1.2.5 Ñònh vò vaø tinh saïch bacteriocin............................................................26 1.2.6 ÖÙng duïng cuûa bacteriocin .....................................................................27 1.2.7 Tình hình nghieân cöùu..............................................................................30 1.3 PHAÂN LAÄP VI KHUAÅN LACTIC..........................................................................33 Chöông 2: NGUYEÂN LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP 2.1 NGUYEÂN LIEÄU.......................................................................................................37 2.1.1 Chuûng vi sinh vaät vaø moâi tröôøng nuoâi caáy, giöõ gioáng.........................37 2.1.2 Nguoàn nguyeân lieäu phaân laäp..................................................................37 2.2 THIEÁT KEÁ THÍ NGHIEÄM.......................................................................................39 2.3 PHÖÔNG PHAÙP .....................................................................................................40 2.3.1 Phöông phaùp daøn ñeàu vaø caáy ria...........................................................40 2.3.2 Phöông phaùp ñònh danh teá baøo vi khuaån..............................................41 2.3.3 Khaûo saùt caùc ñieàu kieän nuoâi caáy aûnh höôûng leân söï sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp bacteriocin cuûa chuûng môùi phaân laäp.............................................43 Chöông 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN 3.1 PHAÂN LAÄP..............................................................................................................45 3.2 KHAÛO SAÙT SÖÏ SINH TRÖÔÛNG VAØ SINH TOÅNG HÔÏP BACTERIOCIN CUÛA CHUÛNG MÔÙI PHAÂN LAÄP THEO THÔØI GIAN NUOÂI CAÁY.....................................51 Chöông 4: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ 4.1 KEÁT LUAÄN..............................................................................................................60 4.2 KIEÁN NGHÒ.............................................................................................................60 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO...........................................................................................62 PHUÏ LUÏC......................................................................................................................68 MÔÛ ÑAÀU Ngaøy nay, nhu caàu aên uoáng cuûa xaõ hoäi ngaøy caøng ñöôïc naâng cao. Cuõng töø ñoù, vieäc an toaøn veä sinh thöïc phaåm ñang ñöôïc chuù troïng vaø ñaåy maïnh. Baûo quaûn thöïc phaåm noùi chung vaø phuï gia thöïc phaåm hay bao bì thöïc phaåm noùi rieâng ñang laø nhöõng vaán ñeà noùng boûng cuûa xaõ hoäi. Neáu nhö nhöõng chaát phuï gia thöïc phaåm coù nguoàn goác hoùa hoïc taùc duïng phoå roäng vôùi nhieàu loaøi sinh vaät vaø gaây aûnh höôûng ñeán söùc khoûe cuûa con ngöôøi thì nhöõng höôùng nghieân cöùu treân nhöõng chaát choáng vi sinh vaät môùi coù nguoàn goác töï nhieân, an toaøn vaø ñaëc hieäu ñoái vôùi töøng loaøi vi sinh vaät gaây haïi ñang ñöôïc quan taâm. [27] Vaø vieäc tìm ra bacteriocin laø moät böôùc ngoaët lôùn trong baûo quaûn thöïc phaåm. Ñaây laø nhöõng chaát coù nguoàn goác sinh hoïc ñaõ ñöôïc cho pheùp söû duïng trong baûo quaûn thöïc phaåm ôû nhieàu nöôùc phaùt trieån. Loaøi coù khaû naêng sinh toång hôïp ra noù cuõng khoâng coù gì xa laï vôùi chuùng ta, ñoù laø caùc vi khuaån lactic, nhöõng vi khuaån maø con ngöôøi söû duïng trong thöïc phaåm haøng ngaøn naêm nay [16]. Bacteriocin töø Lactococcus lactis laø caùc protein nhoû, beàn nhieät, choáng vi sinh vaät. Nisin laø moät bacteriocin ñöôïc söû duïng roäng raõi do coù hoaït tính vôùi phoå roäng khaùng caùc vi khuaån G+, bao goàm Listeria monocytogenes, ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa baøo töû naûy maàm Bacillus vaø Clostridium. [18] Caùc chuûng vi khuaån lactic laø caùc vi sinh vaät quan troïng nhaát trong saûn xuaát caùc thöïc phaåm leân men haèng ngaøy nhö bô, söõa chua, kem, phomai. Chuùng saûn xuaát raát nhieàu caùc hôïp chaát coù hoaït tính khaùng khuaån, bao goàm bacteriocin. Caùc hôïp chaát naøy xuaát hieän nhö laø saûn phaåm cuoái cuûa quaù trình bieán döôõng. [7] Nhöõng chuûng vi khuaån lactic khaùc nhau seõ coù khaû naêng sinh toång hôïp nhöõng loaïi bacteriocin khaùc nhau, vôùi soá löôïng khaùc nhau [27]. Vì vaäy maø vieäc tìm ra caùc nguoàn töï nhieân ñeå coù theå phaân laäp ra nhöõng chuûng vi khuaån coù khaû naêng sinh toång hôïp haøm löôïng chaát choáng vi sinh vaät cao laø caàn thieát. Töø nhöõng ñieàu thöïc tieãn ñoù, vieäc tìm ra ñöôïc caùc chuûng vi khuaån lactic coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin vaø saûn xuaát ñöôïc caùc loaïi bacteriocin söû duïng trong vieäc baûo quaûn thöïc phaåm an toaøn laø caàn thieát vaø coù yù nghóa quan troïng. Trong baøi nghieân cöùu naøy, chuùng ta seõ xaây döïng nhöõng böôùc khôûi ñaàu cho vieäc khaûo saùt saâu roäng hôn vaø coù giaù trò öùng duïng hôn. Muïc tieâu nghieân cöùu cuûa luaän vaên goàm: - Töø nhöõng nguoàn töï nhieân nhö söõa, kim chi, caùc rau quaû muoái chua, giaù ñoã phaân laäp chuûng vi khuaån lactic coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin. - Khaûo saùt söï sinh tröôûng vaø khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin chuûng phaân laäp ñöôïc. - Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa ñieàu kieän nuoâi caáy nhö pH, nhieät ñoä leân söï sinh tröôûng vaø khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin ñeå töø ñoù coù theå ruùt ra ñöôïc caùc ñieàu kieän nuoâi caáy thích hôïp cho chuûng vi khuaån. Chöông 1: TOÅNG QUAN 1.1 VI KHUAÅN LACTIC 1.1.1 Ñaëc ñieåm chung 1.1.1.1 Hình thaùi vaø dinh döôõng cuûa vi khuaån lactic Vi khuaån lactic (Lactic acid bacteria–LAB) laø caùc vi khuaån G +, chòu acid, khoâng hình thaønh baøo töû, hình que hoaëc hình caàu [2]. Moät soá loaøi hieáu khí vaø coù theå söû duïng oxygen thoâng qua enzyme flavoprotein oxidase, trong khi nhöõng gioáng khaùc kî khí nghieâm ngaët. Vi khuaån lactic phaùt trieån toái öu ôû pH 5.5–5.8 vaø vaø coù nhu caàu dinh döôõng phöùc taïp ñoái vôùi caùc amino acid, peptide, nucleotide base, vitamin, khoaùng, acid beùo vaø carbohydrate. [1, 45] Nhöõng vi khuaån naøy saûn xuaát acid lactic nhö laø saûn phaåm cuoái cuøng cuûa quaù trình leân men carbohydrate. Ñaëc ñieåm naøy ñaõ gaén lieàn LAB vôùi thöïc phaåm leân men ñeå acid hoaù ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa taùc nhaân gaây hö hoûng. Protein bacteriocin ñöôïc saûn xuaát bôûi nhieàu chuûng LAB, cung caáp moät haøng raøo ngaên caûn vi sinh vaät gaây hö hoûng vaø gaây beänh. [11] LAB ñöôïc söû duïng roäng raõi trong saûn xuaát saûn phaåm leân men bôûi vì hoaït tính trao ñoåi chaát ñaëc bieät cuûa noù. Söï acid hoaù, saûn phaåm cuûa acid höõu cô, vaø caùc chaát khaùng khuaån khaùc nhö bacteriocin, goùp phaàn to lôùn trong baûo quaûn thöïc phaåm baèng caùch öùc cheá maàm beänh vaø chaát gaây oâ nhieãm. Söï chuyeån hoaù lactose nhôø nuoâi caáy vi khuaån lactic ñaõ laøm cho thöïc phaåm leân men deã tieâu hoaù hôn. Nhieàu hoaït tính bieán döôõng vaø enzyme cuûa LAB daãn ñeán söï saûn xuaát caùc chaát deã bay hôi hình thaønh muøi thôm vaø höông vò ñaëc tröng cho saûn phaåm leân men. [45] Caùc gioáng cuûa LAB chuû yeáu laø Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Teragenococcus, Vagococcus, Weisella…[11, 45]. (a) (b) (c) Hình 1.1: Hình aûnh moät soá vi khuaån lactic: (a) Lactococcus lactis, (b) Streptococcus thermophilus, (c) Lactobacillus helveticus [11] 1.1.1.2 Trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån lactic Vi khuaån lactic ñöôïc chia thaønh ba nhoùm döïa treân moâ hình leân men. - Leân men ñoàng hình: saûn xuaát hôn 85% acid lactic töø glucose - Leân men dò hình: saûn xuaát chæ 50% acid lactic vaø moät löôïng ethanol, acid acetic vaø CO2 - Ñöôïc bieát ñeán nhö laø gioáng leân men dò hình saûn xuaát DL–lactic acid, acid acetic vaø CO2. [45] Döôùi ñieàu kieän dö glucose vaø haïn cheá oxygen, LAB bieán ñoåi moät phaân töû glucose theo con ñöôøng Embden–Meyerhof–Parnas thaønh hai phaân töû pyruvate. Caân baèng oxy hoaù khöû noäi baøo ñöôïc duy trì trong suoát quaù trình oxi hoaù NADH, ñoàng thôøi vôùi söï khöû pyruvate thaønh acid lactic. Quaù trình naøy sinh 2 phaân töû ATP cho moãi glucose ñöôïc tieâu thuï. Ñaïi dieän cho kieåu leân men naøy laø caùc gioáng Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus vaø Lactobacillus nhoùm I. LAB leân men dò hình phaân giaûi glucose theo con ñöôøng pentose phosphate. Moät phaân töû glucose-6-phosphate ban ñaàu bò khöû hydro thaønh 6-phosphogluconate vaø sau ñoù khöû nhoùm carboxyl hình thaønh moät phaân töû CO 2. Keát quaû laø pentose–5–phosphate bò chia ra thaønh moät glyceraldehyde phosphate (GAP) vaø moät phaân töû acetyl phosphate. GAP sau ñoù ñöôïc chuyeån hoaù thaønh lactate nhö trong leân men ñoàng hình, vôùi acetyl phosphate bò bieán ñoåi thaønh ethanol qua chaát trung gian laø acetyl–CoA vaø acetaldehyde. Veà maët lyù thuyeát, saûn phaåm cuoái (bao goàm ATP) ñöôïc saûn xuaát coù soá löôïng baèng vôùi töø quaù trình dò hoaù moät phaân töû glucose. Caùc LAB leân men dò hình baét buoäc goàm Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, vaø Lactobacillus nhoùm III [45, 47]. - Phaân giaûi protein [11] Protein bò caét thaønh nhöõng hôïp chaát nhoû hôn proteinase polypeptide Protein + H2O Hoaït tính naøy cuûa Lactobacillus trong heä thoáng ñöôøng ruoät laøm thuyû phaân protein bôûi heä vi sinh vaät tieâu hoaù deã daøng, moät ñaëc tính coù giaù trò cao cho treû em, ngöôøi beänh vaø ngöôøi giaø. - Phaân giaûi lipid [11] Phöùc hôïp chaát beùo bò caét thaønh caùc hôïp chaát nhoû hôn Triglyceride (chaát beùo) lipase Acid beùo + glycerol Hoaït tính naøy ñöôïc söû duïng trong vieäc thieát keá cheá ñoä dinh döôõng cho treû em, ngöôøi beänh vaø ngöôøi giaø. Baèng chöùng töø thöû nghieäm y khoa vaø laâm saøng cho thaáy Lactobacillus coù theå phaân huûy cholesterol. - Bieán döôõng lactose [11] LAB coù enzyme β–galactosidase, glycolase vaø lactic dehydrogenase (LDH) saûn xuaát acid lactic töø lactose. Acid lactic ñöôïc xem laø coù moät soá chöùc naêng sinh lyù nhö: - Laøm taêng söï tieâu hoaù protein söõa baèng caùch keát tuûa chuùng trong söõa ñoâng - Caûi thieän khaû naêng söû duïng calcium, phosphor vaø saét - Kích thích söï baøi tieát dòch töø daï daøy - Laøm gia taêng nhu ñoäng ruoät - Cung caáp nguoàn naêng löôïng cho quaù trình hoâ haáp Vò trí ñoàng phaân quang hoïc cuûa acid lactic ñöôïc saûn xuaát döïa vaøo baûn chaát cuûa moâi tröôøng. Hình daïng caáu truùc cuûa caùc isomer naøy nhö sau: D (-) levorotatory lactic acid L (+) dextrorotatory lactic acid ÔÛ ngöôøi, caû hai isomer ñeàu ñöôïc haáp thuï leân thaønh ruoät. Trong khi L (+) lactic acid ñöôïc chuyeån hoaù hoaøn toaøn nhanh choùng trong toång hôïp glycogen, D (-) lactic acid ñöôïc toång hôïp ít hôn, vaø acid khoâng ñöôïc chuyeån hoaù seõ ñöôïc thaûi ra trong nöôùc tieåu. Khaû naêng chuyeån lactose thaønh acid lactic ñöôïc söû duïng ñieàu trò thaønh coâng beänh khoâng dung hôïp lactose. Nhöõng ngöôøi maéc beänh naøy khoâng theå chuyeån hoaù lactose bôûi vì thieáu heä thoáng enzyme caàn thieát hoaëc chuùng hoaït ñoäng khoâng bình thöôøng. Acid lactic laøm thaáp pH moâi tröôøng ruoät xuoáng khoaûng 4 ñeán 5 ñeå ngaên caûn söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät gaây thoái röõa vaø E. coli, vi sinh vaät ñoøi hoûi pH moâi tröôøng toái öu laø 6 ñeán 7. Moät vaøi acid deã bay hôi saûn xuaát trong quaù trình leân men cuõng coù hoaït tính öùc cheá döôùi ñieàu kieän theá oxy hoaù khöû thaáp [45]. 1.1.1.3 Saûn xuaát caùc chaát ñoái khaùng LAB cuõng öùc cheá söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät coù haïi gaây thoái röõa thoâng qua caùc saûn phaåm chuyeån hoaù nhö hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl vaø ñaëc bieät laø bacteriocin. Saûn phaåm chuyeån hoaù cuûa LAB söû duïng ñeå choáng laïi caùc vi sinh vaät gaây thoái röõa vaø chöùc naêng sinh hoùa coù theå öùc cheá vi sinh vaät cuûa chuùng ñöôïc toùm taét trong baûng döôùi ñaây. Baûng 1.1: Moät soá saûn phaåm chuyeån hoùa cuûa LAB vaø phöông thöùc hoaït ñoäng cuûa chuùng [44, 45] Saûn phaåm chuyeån hoaù 1.Carbon dioxide Phöông thöùc hoaït ñoäng Ngaên caûn söï khöû nhoùm carboxyl, giaûm tính thaám cuûa maøng 2. Diacetyl Phaûn öùng vôùi protein gaén arginine 3. Hydrogen peroxide/ Lactoperoxidase Oxy hoaù caùc protein cô baûn Acid lactic bò phaân ly ñi xuyeân qua 4. Acid lactic maøng, laøm thaáp pH noäi baøo. Noù gaây trôû ngaïi quaù trình chuyeån hoaù nhö oxi hoaù khöû phosphor 5. Bacteriocin AÛnh höôûng ñeán maøng, toång hôïp protein vaø DNA. Bacteriocin saûn xuaát bôûi LAB laø chuû ñeà cuûa caùc nghieân cöùu lôùn bôûi vì hoaït tính khaùng khuaån cuûa chuùng choáng laïi söï saûn sinh vi khuaån laøm hö hoûng thöïc phaåm. Chuûng saûn xuaát bacteriocin cuûa LAB raát quan troïng trong vieäc caïnh tranh vôùi caùc vi sinh vaät khaùc trong ñöôøng ruoät. Bacteriocin laø protein coù hoaït tính sinh hoïc, coù khaû naêng ngaên ngöøa söï xaâm nhieãm cuûa vi sinh vaät baèng caùch öùc cheá chuùng vaø lieân keát vôùi receptor ñaëc bieät cuûa teá baøo. Hieän nay, coù nhöõng moái quan taâm veà vieäc öùng duïng bacteriocin trong caû baûo quaûn thöïc phaåm vaø öùc cheá maàm beänh vi khuaån. Haàu heát caùc bacteriocin ñeàu ñöôïc chieát xuaát töø vi khuaån lieân quan trong leân men thöïc phaåm. Söï saûn xuaát bacteriocin vaø tính khaùng ñöôïc xem laø caùc ñaëc tính quan troïng cuûa chuûng, coù theå ñöôïc söû duïng trong thöông maïi nhö laø chaát loaïi boû hoaëc laøm giaûm söï phaùt trieån cuûa chuûng gaây beänh khoâng mong muoán. [34] Hieän nay, caùc nghieân cöùu ñi saâu vaøo vieäc môû roäng hoaït tính khaùng khuaån cuûa bacteriocin, ñaùng chuù yù laø nisin cuøng vôùi nhöõng nhaân toá khaùng khuaån khaùc nhö heä thoáng lactoperoxide hieän dieän trong söõa, caùc taùc nhaân khaùc vaø caùc bacteriocin khaùc [16]. 1.1.2 Caùc chuûng vi sinh vaät coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin 1.1.2.1 Chuûng Lactococcus lactis (a) Giôùi thieäu [11] Chuûng Lactococcus lactis (Lc. lactis) laø caùc vi sinh vaät quan troïng nhaát trong saûn xuaát thöïc phaåm leân men haèng ngaøy nhö bô, söõa chua, kem, fromage. Chuùng saûn xuaát nhieàu hôïp chaát coù hoaït tính khaùng khuaån, bao goàm bacteriocin. Caùc hôïp chaát naøy xuaát hieän nhö laø saûn phaåm cuoái cuûa quaù trình bieán döôõng. Döïa vaøo ñaëc tính sinh hoùa, Lc. lactis ñöôïc phaân thaønh: Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris vaø Lc. lactis subsp. cremoris. Lc. lactis subsp. lactis coù khaû naêng phaùt trieån ñöôïc ôû nhieät ñoä 40oC, soáng ñöôïc ôû noàng ñoä muoái aên leân ñeán 4.0% vaø saûn xuaát ñöôïc amonia töø arginine trong khi Lc. lactis subsp. cremoris khoâng coù tính chaát naøy. Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis ñöôïc phaân bieät döïa vaøo khaû naêng chuyeån hoùa citrate. Moät trong nhöõng ñaëc ñieåm quan troïng nhaát trong coâng nghieäp cuûa chuûng Lc. lactis laø plasmid ñöôïc maõ hoaù, coù nghóa laø plasmid mang gen coù caùc ñaëc tính nhö bieán döôõng lactose vaø saûn xuaát proteinase cuõng nhö tính khaùng bacteriophage. Caùc plasmid bieán döôõng quan troïng khaùc vaø chöùc naêng cuûa chuùng ôû Lactococcus cuõng ñaõ ñöôïc moâ taû. Do ñoù, hieän nay chuùng ta ñaõ coù nhöõng hieåu bieát veà gen plasmid kieåm soaùt bieán döôõng ñöôøng sucrose, galactose, mannose, xylose, glucose, söû duïng citrate, tính khaùng phage, bieán döôõng vaø giôùi haïn DNA, söï taäp hôïp teá baøo, saûn xuaát bacteriocin... Theâm vaøo ñoù, Lactococcus chöùa nhieàu plasmid, kích côõ töø 1 ñeán >100 kbp. Plasmid maõ hoaù cho bacteriocin thöôøng lôùn vaø kích thöôùc cuûa chuùng töø 81 ñeán 133 kbp. Chuûng Lc. lactis thöôøng coù töø 2 ñeán 11 plasmid DNA, trong khi soá löôïng phoå bieán thöôøng laø töø 4 ñeán 7. (b) Tính chaát cuûa chuûng Lc. lactis [10, 11]  Bieán döôõng protein Gioáng nhö taát caû caùc LAB khaùc, Lactococcus coù nhu caàu dinh döôõng phöùc taïp. Ñeå phaùt trieån, chuùng ñoøi hoûi caùc protein, peptide, caùc amino acid ñaëc bieät, caùc nucleic acid vaø vitamine,... Trong söõa, noàng ñoä isoleucine, leucine, valine, histidine vaø methionine caàn thieát cho Lactococcus laø thaáp hôn 1 mg/l. Noù bao goàm caùc amino acid töï do, coù maët ban ñaàu trong söõa, cung caáp nguoàn nitô cho khoaûng 2% maät ñoä teá baøo cuoái cuøng. Casein, coù khoaûng 80% protein hieän dieän trong söõa, trôû thaønh nguoàn nitô sô caáp sau khi duøng heát nitô töø caùc nguoàn khoâng phaûi protein.  Bieán döôõng lactose Bieán döôõng lactose cuûa chuûng Lc. lactis khaùc vôùi bieán döôõng lactose cuûa caùc vi khuaån lactic khaùc. Khaùc bieät laø ôû söï dò hoaù cuøng luùc glucose vaø galactose. Chöùc naêng cuûa con ñöôøng ñoù ñoái vôùi Lactococcus laø ñeå sinh naêng löôïng vaø acid lactic laø saûn phaåm phuï.  Bieán döôõng citrate Trong nhoùm Lactococcus thì chæ Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis laø coù khaû naêng bieán döôõng citrate hieän dieän trong söõa. Saûn phaåm cuoái cuøng cuûa bieán döôõng citrate laø diacetyl, acetoin, 2,3 butanediol, acid acetic vaø carbondioxide, chuùng taïo neân höông vò cho caùc loaïi thöïc phaåm bô söõa leân men. Citrate ñöôïc vaän chuyeån vaøo teá baøo maø khoâng caàn coù söï bieán ñoåi. ÔÛ Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, phaûn öùng naøy ñöôïc xuùc taùc bôûi citrate permease.  Sinh toång hôïp bacteriocin Caùc chuûng thuoäc loaøi Lc. lactis coù khaû naêng sinh toång hôïp raát nhieàu caùc hôïp chaát coù hoaït tính khaùng khuaån bao goàm caû bacteriocin. Caùc hôïp chaát naøy xuaát hieän nhö laø saûn phaåm cuoái cuûa quaù trình bieán döôõng. Bacteriocin töø Lactococcus laø caùc protein nhoû, beàn nhieät, choáng laïi caùc vi khuaån laân caän. Nisin laø bacteriocin ñöôïc bieát ñeán nhieàu nhaát, coù 34 amino acid, khoái löôïng phaân töû 3354 kDa, thuoäc nhoùm lantibiotic, ñöôïc öùng duïng nhieàu trong baûo quaûn thöïc phaåm. Nisin gaây caûn trôû vieäc cung caáp naêng löôïng cuûa teá baøo baèng caùch taïo neân baøo töû treân maøng vaø laøm maát ñieän theá maøng. Nisin coù hoaït tính vôùi phoå roäng khaùng caùc vi khuaån G +, bao goàm caû L. monocytogenes, ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa baøo töû naûy maàm Bacillus vaø Clostridium vaø thoâng qua vieäc theâm calcium, noù seõ coù hoaït tính khaùng laïi moät soá vi khuaån G +. Moät hôïp chaát khaùc, lacticin 3147 ñöôïc xaùc ñònh laø töø Lactococcus thu nhaän töø chuûng Irish Kefir söû duïng trong saûn xuaát bô. Bacteriocin naøy ngaên caûn caùc maàm beänh töø vi khuaån G + nhö Staphylococcus, Clostridium, Listeria spp., Streptococcus. [10] Ngaøy nay, nisin laø bacteriocin töø LAB duy nhaát ñöôïc cho pheùp laøm chaát phuï gia thöïc phaåm. Hai saûn phaåm khaùc laø ALTA 2431 vaø Microgard ñaõ ñöôïc phaùt trieån laøm chaát keùo daøi tuoåi thoï thöïc phaåm döïa treân saûn phaåm leân men thoâ cuûa LAB. 1.1.2.2 Caùc chuûng vi khuaån lactic khaùc coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin Moät soá chuûng vi khuaån lactic khaùc coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin ñöôïc toång hôïp trong baûng 1.2. Baûng 1.2: Bacteriocin Moät soá bacteriocin, chuûng saûn xuaát vaø ñaëc tính tieâu bieåu Vi sinh vaät MW Ñaëc tính (Da) Laticin Lc. lactis 2847 Beàn nhieät ôû 1000C trong 10 phuùt ôû pH 5 hay 900C ôû pH baèng 7 trong 10 phuùt. Nhaïy caûm 3714 vôùi trypsin, α–chymotrypsin, proteinase K, vaø pronase E, khaùng pepsin [37]. Plantaricin Lactobacillus 3500- OÅn ñònh ôû nhieät ñoä phoøng vaø nhieät ñoä thaáp, C plantarum 4000 beàn nhieät ôû 1000C trong 60 phuùt hay 121 0C trong 10 phuùt. Haàu heát oån ñònh ôû pH acid hay trung tính. Nhaïy caûm vôùi pronase, trypsin, vaø α–chymotrypsin, khaùng laïi pepsin, proteinase K, α–amylase, vaø lipase [21]. Bavaricin A Lactobacilus 3500- Beàn nhieät ôû 1000C trong 60 phuùt. OÅn ñònh ôû bavaricus 4000 pH baèng 2.0 ñeán 9.7, nhaïy caûm vôùi pepsin, trypsin, pronase E, proteinase K vaø chymotrypsin A, khaùng laïi vôùi catalase [30]. Piscicolin Carnobacterium 4416 piscicola JG126 126 OÅn ñònh ôû pH baèng 2 sau khi löu tröõ 2 thaùng taïi 40C. Beàn nhieät taïi 1000C trong 120 phuùt taïi pH 2–3, trôû neân ít oån ñònh hôn khi pH taêng. Nhaïy caûm vôùi α–chymotrypsin, β– chymotrypsin, protease type I, XIV, XXIII, vaø trypsin, khaùng catalase, lipase vaø lyzozyme [25]. Variacin Micrpcoccus varians 2658 OÅn ñònh ôû pH töø 2 ñeán 10, beàn nhieät 115 0C trong 20 phuùt, nhaïy caûm vôùi pronase E, proteinase K, ficin, khaùng catalase [14]. 1.2 BACTERIOCIN 1.2.1 Sô löôïc veà bacteriocin Bacteriocin laø teân chung cuûa caùc peptide do vi khuaån toång hôïp coù hoaït tính kìm haõm ñaëc hieäu hay öùc cheá maïnh meõ söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa moät soá vi khuaån khaùc. Ñieåm ñaëc bieät cuûa caùc bacteriocin laø chuùng khoâng coù hoaït tính khaùng sinh ñieån hình, nghóa laø chuùng chæ kìm haõm nhöng khoâng tröïc tieáp laøm cheát vi sinh vaät. Chính vì lyù do naøy neân thôøi kyø ñaàu ngöôøi ta chæ taäp trung vaøo phaùt trieån caùc chaát khaùng sinh, coøn caùc cheá phaåm bacteriocin bò xem nheï vaø khoâng ñöôïc quan taâm ñuùng möùc. Theo thôøi gian söû duïng chaát khaùng sinh hieän töôïng khaùng thuoác xuaát hieän vaø ngaøy caøng trôû neân traàm troïng ñaõ giaùn tieáp xaùc nhaän ñaëc tính quyù giaù cuûa caùc bacteriocin laø nguy cô gaây ra hieäu öùng treân cuûa chuùng raát thaáp. Nhôø vaäy maø vieäc nghieân cöùu, saûn xuaát vaø söû duïng caùc bacteriocin ñaõ ñöôïc phuïc hoài vaø phaùt trieån. Caùc cheá phaåm bacteriocin ñieån hình laø nisin, diplococin, subtilin, lactostrepcin, bacteriocin S50, monocin (töø Lactococcus), pediocin A, pediocin PA–1, pediocin AcH (töø Pediococcus), lactocidin, acidolin, acidolin, acidophilin, reuterin, lactocin F, lactocin 27, helveticin J (töø Lactobacillus), leuconocin S, carnocin UI49, micrograd (töø Leuconostoc), propionicin PLG–1, jensenin G (töø Propionicbacterium). [28] Bacteriocin ñöôïc tìm thaáy laàn ñaàu tieân bôûi Gratia vaøo naêm 1925, ñöôïc saûn xuaát bôûi moät chuûng E. coli ñeå choáng laïi caùc chuûng khaùc trong dòch nuoâi caáy. Thuaät ngöõ “colicine” ñöôïc ñaët teân bôûi Gratia vaø Fredericq (1946), coøn “bacteriocin” ñöôïc söû duïng bôûi Jacob et al. (1953) nhö laø thuaät ngöõ chung cho caùc protein coù ñaëc tính khaùng khuaån cao. Thuaät ngöõ colicine ngaøy nay laø ñeå chæ caùc protein coù tính khaùng khuaån ñöôïc saûn xuaát bôûi nhieàu loaøi E. coli vaø caùc loaøi thuoäc hoï Enterobacteriaceae. [28] 1.2.2 Bacteriocin töø LAB Haàu heát caùc nghieân cöùu veà bacteriocin taäp trung chuû yeáu ôû nhoùm vi khuaån lactic vì töø xa xöa ngöôøi ta ñaõ bieát söû duïng vi khuaån lactic trong baûo quaûn thöïc phaåm vaø ngaên ngöøa söï nhieãm caùc vi khuaån gaây beänh. Bôûi vì LAB vaø chaát chuyeån hoaù cuûa chuùng ñaõ ñöôïc tieâu thuï vôùi soá löôïng cao qua nhieàu theá heä ngöôøi tieâu thuï caùc thöïc phaåm truyeàn thoáng maø khoâng coù aûnh höôûng coù haïi naøo, LAB tieáp tuïc nhö laø nguoàn saûn xuaát bacteriocin söû duïng trong thöïc phaåm, keå caû daïng hôïp chaát tinh khieát hay dòch chieát töø moâi tröôøng phaùt trieån. Coù theå thu ñöôïc bacteriocin thoâ baèng caùch nuoâi chuûng LAB saûn xuaát bacteriocin treân moät phöùc hôïp cô chaát. Dòch leân men thoâ coù chöùa caùc chaát khaùc beân caïnh bacteriocin. LAB laø vi khuaån nuoâi caáy ñöôïc söû duïng ñaàu tieân trong ngaønh saûn xuaát thöïc phaåm leân men, chuùng hieån nhieân ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát cho söï bieán ñoåi gen ñeå taïo caùc chuûng coâng nghieäp bò thieáu gen ñieàu hoaø sinh toång hôïp neân bacteriocin mong muoán. [27] 1.2.2.1 Phaân loaïi bacteriocin [18, 24, 27, 28] Haàu heát caùc bacteriocin töø LAB ñeàu coù tính cation, kî nöôùc hay phaân töû löôõng cöïc hình thaønh töø khoaûng 20 ñeán 60 goác amino acid. Caùc bacteriocin thöôøng ñöôïc phaân chia thaønh 3 hay 4 nhoùm. Nhoùm I: goàm caùc lantibiotic laø caùc peptide nhoû coù chöùa caùc amino acid khoâng phoå bieán nhö lanthionine (Lan), α–methyllanthionine (MeLAn), dehydrodlanine, vaø dehydrobutyrine. Nhoùm I ñöôïc chia thaønh 2 nhoùm nhoû tuyø theo caáu truùc hoaù hoïc vaø hoaït tính khaùng khuaån. - Nhoùm Ia: lantibiotic type A laø caùc peptide ñöôïc keùo daøi ra vôùi maïng löôùi tích ñieän döông, hoaït ñoäng thoâng qua vieäc hình thaønh caùc loã treân maøng teá baøo vi khuaån. Moät soá nhoùm nhö pep-5 chöùa 3 noái monosulfite, epidermin chöùa 4 noái monosulfite, nisin A vaø Z, subtilin thì laïi chöùa 5 caàu noái monosulfite. Kích thöôùc phaân töû cuûa lôùp phuï Ia dao ñoäng töø 1959 kDa ôû duramycin ñeán 4635 kDa ôû carnocin U9. - Nhoùm Ib: lantibiotic type B laø caùc phaân töû peptide hình caàu nhoû hôn vaø coù moät ñieän tích aâm hoaëc khoâng tích ñieän, hoaït tính khaùng khuaån lieân quan ñeán söï öùc cheá caùc enzyme ñaëc bieät. Moät soá caùc bacteriocin lôùp phuï Ib nhö mersacidin, actagardin, cinnamycin vaø mutacin A. Trong ñoù mutacin A taïo ra bôûi Streptococcus mutan. Nhoùm II: Caùc peptide nhoû (< 10 kDa), beàn nhieät, khoâng coù caùc amino acid bieán ñoåi sau dòch maõ coù chöùa ít nhaát moät caàu noái disulfur caàn thieát cho hoaït ñoäng cuûa chuùng. Laø nhoùm bacteriocin lôùn nhaát trong heä thoáng phaân lôùp naøy, caùc peptide ñöôïc chia thaønh 3 nhoùm phuï. - Nhoùm IIa bao goàm peptide gioáng pediocin, coù trình töï lieân öùng ñaàu N–Tyr Gly– Asn–Gly–Val–Xaa–Cys. Nhoùm phuï naøy ñöôïc quan taâm nhieàu bôûi vì hoaït tính khaùng Listeria, chuùng laøm maát caân baèng ñieän tích vaø taïo loã thuûng laøm roø ró caùc chaát phaân höõu cô vaø gaây cheát teá baøo ñích. - Nhoùm IIb goàm caùc bacteriocin ñoøi hoûi phaûi coù 2 peptide khaùc nhau ñeå coù hoaït tính nhö lactococcin Gα/ Gβ, lactococcin M/N, plantaricin EF, JK, enteriocin L50A vaø enteriocin L50B. - Nhoùm IIc: bao goàm taát caû caùc bacteriocin nhoùm 2 khoâng phuï thuoäc IIa vaø IIb, peptide coù nhoùm thiol coù hoaït tính, ñoøi hoûi phaûi caét giaûm nhoùm cysteine ñeå coù hoaït tính. Nhoùm III: nhoùm naøy hieän vaãn chöa ñöôïc moâ taû kyõ. Nhoùm naøy coù caùc protein lôùn (>30 kDa), deã bieán ñoåi bôûi nhieät ñoä. Moät soá bacteriocin lôùp naøy laø helveticin J taïo bôûi L. helveticus 481 vaø lactacins A vaø B taïo bôûi L. acidophilus, helveticin V, acidophilicin A. Nhöõng loaïi naøy ít ñöôïc caùc nhaø khoa hoïc trong lónh vöïc thöïc phaåm quan taâm. Klaenhammer (1999) ñeà nghò theâm nhoùm 4, laø nhoùm chöùa caùc bacteriocin phöùc taïp, ñoøi hoûi carbohydrate hay lipid ñeå coù hoaït tính. Tuy nhieân bacteriocin cuûa nhoùm naøy chöa ñöôïc mieâu taû nhieàu ôû möùc ñoä sinh hoaù ñeå môû roäng ñònh nghóa. Nhoùm naøy bao goàm caû glycoprotein nhö lactocin 27 hoaëc lipoprotein nhö lacstrepcin. [27] Hình 1.2: Coâng thöùc cuûa Nisin A [24] 1.2.3.2 Cô cheá sinh toång hôïp bacteriocin a. Gene vaø sinh toång hôïp Bacteriocin ñöôïc toång hôïp vôùi ribosome. Gen maõ hoaù cho saûn xuaát vaø mieãn dòch cuûa bacteriocin thöôøng ñöôïc toå chöùc thaønh caùc operon cluster. Nhoùm gene bacteriocin coù theå ñöôïc ñònh vò treân nhieãm saéc theå (subtilin vaø mersacidin), cuõng coù theå ñöôïc ñònh vò treân plasmid (divergicin A vaø sakacin A), hay laø treân transposon (nisin vaø lacticin 481). [18] Operon sinh toång hôïp lantibiotic thöôøng chöùa gen maõ hoaù treân tieàn peptide, enzyme chòu traùch nhieäm cho caùc phaûn öùng bieán ñoåi, quaù trình phaân huûy protein chòu traùch nhieäm taùch rôøi peptide chæ ñaïo, ABC (ATP–binding cassette), hoï protein vaän chuyeån bao goàm protein vaän chuyeån peptide, protein ñieàu hoaø, vaø caùc protein töï baûo veä teá baøo saûn xuaát. Peptide chæ ñaïo coù moät vai troø raát quan troïng. Noù giöõ cho tieàn peptide ôû daïng baát hoaït trong teá baøo, phaùt ra tín hieäu vaän chuyeån lantibiotic ra khoûi teá baøo, chöùa caùc trình töï ñaëc bieät chæ ñöôøng cho enzyme sinh toång hôïp ñi tôùi nôi thích hôïp ñeå thöïc hieän söï bieán ñoåi caùc amino acid vaø oån ñònh hình daïng cuûa domain propeptide. [18, 28] Gene maõ hoaù cho sinh toång hôïp bacteriocin nhoùm II nhö lactococccin A, B, vaø M, pediocin PA–1/AcH, vaø plantaricin A coù nhieàu ñieåm gioáng nhau trong toå chöùc gen, bao goàm moät gen caáu truùc maõ hoaù cho tieàn peptide, theo sau bôûi moät gen mieãn dòch, gen ñeå vaän chuyeån vaø protein phuï theâm. Moät soá tröôøng hôïp ñaõ tìm ra ñöôïc gen ñieàu hoaø. Caùc protein phuï theâm laø raát caàn thieát ñeå caùc bacteriocin nhoùm II ñöôïc xuaát ra. Khoâng coù baûn sao naøo cuûa caùc protein phuï theâm ôû lantibiotic ñöôïc tìm thaáy. [16, 18] Söï taïo caùc bacteriocin vi khuaån G+ thöôøng caàn nhieàu gen ví duï nhö cuïm gen taïo nisin: - Nis A: prepeptid - Nis B, nis C: enzyme bieán ñoåi amino cacid - Nis P: caét caùc peptide leader - Nis L, nis FEG: mieãn dòch - Nis R, nis K: ñieàu hoaø vaø bieåu hieän [18]. b. Cô cheá Haàu heát caùc bacteriocin ñöôïc toång hôïp nhö laø caùc tieàn peptide ôû daïng baát hoaït mang moät peptide chæ ñaïo coù ñaàu N gaén vôùi tieàn peptide taïi ñaàu C. Ñoái vôùi lantibiotic, goác serine, threonine, vaø cystein trong phaàn tieàn peptide phaûi traûi qua böôùc keùo daøi bieán ñoåi sau dòch maõ ñeå hình thaønh Lan/MeLan. Con ñöôøng sinh toång hôïp cuûa lantibiotic ñi theo moät keá hoaïch chung: hình thaønh tieàn peptide, phaûn öùng bieán ñoåi, phaûn öùng taùch rôøi phaân huûy peptide chæ ñaïo vaø di chuyeån tieàn peptide ñaõ ñöôïc bieán ñoåi hay tieàn peptide tröôûng thaønh xuyeân qua maøng teá baøo chaát. Söï taùch rôøi peptide chæ ñaïo coù theå dieãn ra tröôùc, trong suoát quaù trình hay sau khi xuaát ra khoûi teá baøo. Trong saûn xuaát lantibiotic nhoùm I, nhö trong tröôøng hôïp cuûa nisin, epidermin, subtilin, vaø Pep5, phaûn öùng dehydrate coù leõ ñöôïc xuùc taùc bôûi enzyme LanB. [18] Hình 1.3: Cô cheá sinh toång hôïp Nisin theo 5 böôùc [18] Bacteriocin nhoùm II ñöôïc sinh toång hôïp nhö laø moät tieàn peptide coù chöùa moät trình töï chæ ñaïo ñaàu N baûo toàn vaø moät ñieåm laøm phaân taùch protein, vôùi ngoaïi leä laø bacteriocin nhoùm IIc, ñöôïc saûn xuaát vôùi moät trình töï ñôn ñaàu N ñieån hình daïng sec vaø ñöôïc tieán haønh thoâng qua moät con ñöôøng coøn chöa ñöôïc bieát roõ. Khoâng gioáng nhö lantibiotic, bacteriocin nhoùm II khoâng traûi qua quaù trình bieán ñoåi sau dòch maõ. Sau khi hình thaønh tieàn peptide, tieàn peptide ñöôïc taùch khoûi peptide chæ ñaïo ñoàng thôøi vôùi vieäc ñöôïc xuaát ra khoûi teá baøo. [18] Peptide chæ ñaïo coù moät vuøng nhaän bieát ñieàu khieån tieàn peptide trong suoát quaù trình tröôûng thaønh, vaø protein vaän chuyeån, baûo veä chuûng hoang daïi baèng caùch giöõ lantibiotic ôû traïng thaùi khoâng coù hoaït tính khi noù ôû beân trong sinh vaät saûn xuaát, vaø töông taùc vôùi domain tieàn peptide ñeå chaéc chaén raèng coù moät caáu hình phuø hôïp caàn thieát cho töông taùc enzyme– cô chaát. [16, 18]