Tài liệu Phân lập và lưu giữ 2 loài tảo silic lông chim sống đáy navicula sp. và nitzschia sp

i LỜI CẢM ƠN Để có được kết quả như ngày hôm nay, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Chủ Nhiệm Khoa cùng các quý thầy cô trong Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản - Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học và thực hiện công tác tốt nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy cô hướng dẫn: TS Hoàng Thị Bích Mai và ThS Tôn Nữ Mỹ Nga đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ hai phòng thí nghiệm: Thực hành Sinh Lý và Thực hành Môi Trường - Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản đã hết lòng giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tất cả những người thân trong gia đình, bạn bè cùng lớp đã giúp đỡ, động viên tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần để tôi có thể hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình. Xin chân thành cảm ơn! ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. Phân loại và đặc điểm sinh học chủ yếu của tảo Silic ................................. 3 1.1.1. Hệ thống phân loại................................................................................ 3 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu........................................................ 3 1.1.2.1. Đặc điểm hình thái cấu tạo của Navicula sp và Nitzschia sp......... 3 1.1.2.2. Sinh trưởng..................................................................................... 5 1.2. Thành phần sinh hóa của tảo ...................................................................... 7 1.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái đến sự phát triển của tảo............... 8 1.3.1. Ánh sáng ............................................................................................... 8 1.3.2. Nhiệt độ................................................................................................. 8 1.3.3. Độ mặn.................................................................................................. 9 1.3.4. pH.......................................................................................................... 9 1.3.4. Các yếu tố dinh dưỡng ........................................................................ 10 1.4. Khái quát các công trình nghiên cứu nuôi trồng vi tảo ............................. 11 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới .................................................... 11 1.4.2. Ở Việt Nam ......................................................................................... 14 CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................ 16 2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................... 16 2.1.1. Đối tượng ............................................................................................ 16 2.1.2. Thời gian. ............................................................................................ 16 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu........................................................................... 16 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 16 2.2.1. Sơ đồ khối nghiên cứu ........................................................................ 16 2.2.2. Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị, nước và môi trường thí nghiệm............... 18 2.2.2.1. Dụng cụ thí nghiệm...................................................................... 18 2.2.2.2. Nguồn nước.................................................................................. 19 2.2.3. Nguồn tảo............................................................................................ 19 2.2.4. Pha môi trường dinh dưỡng dùng trong các thí nghiệm..................... 19 2.2.5. Phương pháp phân lập ........................................................................ 20 2.2.5.1. Phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch ...... 20 2.2.5.2. Phân lập bằng phương pháp pha loãng ........................................ 21 2.2.6. Xác định điều kiện lưu giữ tảo thích hợp ........................................... 22 2.2.6.1. Xác định môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp . 22 2.2.6.2. Thí nghiệm xác định thời gian lưu giữ thích hợp ........................ 23 2.2.7. Định lượng tảo và xử lý số liệu .......................................................... 23 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 26 3.1. Phân lập tảo bằng các phương pháp khác nhau......................................... 26 iii 3.1.1. Phương pháp pha loãng ...................................................................... 26 3.1.1.1. Navicula sp................................................................................... 26 3.1.1.2. Nitzschia sp .................................................................................. 27 3.1.2. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch .................................... 28 3.1.2.1 Navicula sp.................................................................................... 28 3.1.2.2. Nitzschia sp .................................................................................. 30 3.2. Lưu giữ tảo trong các điều kiện khác nhau .............................................. 31 3.2.1. Navicula sp ......................................................................................... 31 3.2.1.1. Lưu giữ tảo trong môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau31 3.2.1.2. Lưu giữ tảo trong khoảng thời gian khác nhau ............................ 34 3.2.2. Nitzschia sp. ........................................................................................ 36 3.2.2.1. Lưu giữ trong môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau..... 36 3.2.2.2. Lưu giữ trong khoảng thời gian khác nhau .................................. 40 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ...................................... 42 4.1. Kết luận ..................................................................................................... 42 4.2. Đề xuất ý kiến............................................................................................ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần của vi tảo............................................................................ 7 Bảng 2.1. Các lô thí nghiệm xác định môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp đối với tảo Navicula sp. và Nitzschia sp. ............................................. 22 Bảng 3.1. Sự sinh trưởng của tảo Navicula sp. được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ ở môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau..................................... 32 Bảng 3.2. Sự sinh trưởng của tảo Navicula sp. được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ trong khoảng thời gian khác nhau. .......................................................... 35 Bảng 3.3. Sự sinh trưởng của tảo Nitzschia sp. được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ ở các môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau. ............................. 37 Bảng 3.4. Sự sinh trưởng của tảo Nitzschia sp. được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ trong khoảng thời gian khác nhau. .......................................................... 40 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình dạng tế bào Nitzschia sp. .............................................................. 3 Hình 1.2. Hình dạng tế bào Navicula sp. ............................................................... 3 Hình 1.3. Cấu tạo vỏ của tảo Silic ......................................................................... 4 Hình 1.4. Thể màu ở tảo Silic ................................................................................ 5 Hình 2.1. Sơ đồ khối nghiên cứu.......................................................................... 17 Hình 2.2. Cách pha độ mặn .................................................................................. 18 Hình 2.3. Phân lập tảo theo phương pháp pha loãng ........................................... 21 Hình 2.4. Nhân sinh khối tảo ............................................................................... 25 Hình 3.1. Quần tảo Navicula sp. thuần chủng...................................................... 26 Hình 3.2. Quần tảo Nitzschia sp. thuần chủng ..................................................... 27 Hình 3.3. Quần lạc tảo mọc trên các đĩa thạch..................................................... 28 Hình 3.4. Tảo chuyển sang các ống nghiệm ........................................................ 29 Hình 3.5. Diễn biến về mật độ tế bào tảo Navicula sp. được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ ở môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau ........................ 33 Hình 3.6. Diễn biến về mật độ tế bào Navicula sp. được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ trong khoảng thời gian khác nhau ..................................................... 36 Hình 3.7. Diễn biến về mật độ tế bào tảo Nitzschia sp. được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ ở môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau ........................ 38 Hình 3.8. Diễn biến mật độ tế bào Nitzschia sp. được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ trong khoảng thời gian khác nhau ..................................................... 41 CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT ctv: Cộng tác viên g: Gram mg/l: Minigram/lít ppt: Phần ngàn tb: Tế bào 1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam phát triển rất mạnh, nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất giống và nuôi lớn Bào ngư, Ốc hương, cua, Trai ngọc, Điệp, Hải sâm, giáp xác và một số loài cá biển đã thành công và có triển vọng lớn. Vi tảo (Microalgae) đã có những đóng góp nhất định vào thành công đó bởi chúng là nguồn thức ăn không thể thiếu trong công nghệ sản xuất giống cũng như nuôi thương phẩm. Vì vậy, việc nghiên cứu về vi tảo là vấn đề đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm, đặc biệt là tảo Silic. Ở trong các thủy vực nước ngọt, tảo Silic là thành phần chính của năng suất sơ cấp. Ở biển và đại dương, tảo Silic chiếm ưu thế cả về sinh khối và thành phần loài. Chúng đóng vai trò chủ đạo trong việc tạo nên các năng suất sơ cấp trong hệ sinh thái biển, nhất là những vùng không được tiếp nhận nguồn thức ăn hữu cơ mang tới từ các dòng lục địa [10]. Mặt khác, hiện nay trên thế giới, tảo Silic, đặc biệt là một số loài tảo Silic sống đáy như Navicula sp., Nitzschia sp.… đang là thức ăn rất phổ biến cho ấu trùng Bào ngư cũng như một số đối tượng thủy sản khác, phổ biến nhất là ở Mexico. Giống Nitzschia đã được phân lập từ trại nuôi Bào ngư ở Esenada, Mexico (Corea-Reyes và ctv), còn Navicula được phân lập từ vùng nước ven biển của Bahina, Mexico để làm thức ăn cho các loài động vật thân mềm ăn lọc (trích theo Cao Thị Xoan, 2006) [12]. Ở nước ta, tảo Silic nói chung, Navicula sp. và Nitzschia sp. nói riêng là những loài tảo phù hợp về kích thước và chất lượng dinh dưỡng cho ấu trùng động vật thủy sản, đặc biệt là động vật thân mềm 2 mảnh vỏ. Tảo có tốc độ tăng trưởng nhanh, có thể nuôi trong điều kiện nhân tạo, trong các trại giống. Đến nay, chúng ta đã phân lập được một số loài. Tuy nhiên, hiện nay hai loài Navicula sp., Nitzschia sp. phải nhập từ nước ngoài, chủ yếu là từ Úc và Trung Quốc, nhưng giá thành nhập rất cao. Việc nghiên cứu về ảnh hưởng của một số yếu tố như hàm lượng muối dinh dưỡng, độ mặn… đến sự phát triển của chúng đã có nhiều tài 2 liệu đề cập đến [10], [12], nhưng chưa tìm thấy tài liệu nào công bố về phương pháp phân lập cũng như điều kiện lưu giữ thích hợp cho mỗi loài. Vì vậy, để góp phần vào việc phân lập ra một số loài tảo Silic thuần chủng và điều kiện lưu giữ thích hợp hơn, tạo cơ sở cho việc thiết lập ngân hàng tảo, giảm chi phí nhập tảo, từ ngày 30/7/2007 đến ngày 10/11/2007, tôi thực hiện đề tài: “Phân lập và lưu giữ hai loài tảo Silic lông chim sống đáy Navicula sp. và Nitzschia sp.”. Mục tiêu của đề tài - Phân lập được hai loài tảo Navicula sp., Nitzschia sp. thuần chủng. - Xác định điều kiện lưu giữ giống thích hợp cho mỗi loài (môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, thời gian). Nội dung nghiên cứu - Phân lập hai loài tảo Navicula sp. và Nitzschia sp. bằng 2 phương pháp khác nhau (phương pháp pha loãng và phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch). - Lưu giữ giống Navicula sp. và Nitzschia sp. thuần chủng trong môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ và thời gian khác nhau. Ý nghĩa của đề tài - Góp phần vào việc thành lập ngân hàng tảo, nhằm cung cấp tảo giống cho công nghệ sản xuất giống thủy sản. - Lưu giữ giống Navicula sp., Nitzschia sp. hiệu quả hơn. Trong quá trình thực hiện đề tài, do thời gian ngắn, tài liệu tham khảo khan hiếm, trình độ chuyên môn có hạn nên một số nội dung nghiên cứu còn hạn chế. Được sự hướng dẫn của TS Hoàng Thị Bích Mai và ThS Tôn Nữ Mỹ Nga nên tôi đã hoàn thành được nội dung. Tôi xin chân thành cảm ơn đến sự giúp đỡ quý báu này. Nha Trang, tháng 11 năm 2007 Sinh viên thực hiện Bùi Thị Vân 3 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Phân loại và đặc điểm sinh học chủ yếu của tảo Silic 1.1.1. Hệ thống phân loại [8] Ngành: Bacillariophyta Lớp: Bacillariophyceae Bộ: Pennales Bộ phụ: Biraphidineae Họ: Nitzschiaceae Giống: Nitzschia Loài: Nitzschia sp. Ngành: Bacilariophyta Lớp: Bacillariophyceae Bộ: Pennales Bộ phụ: Biraphidineae Họ: Navicuceae Giống: Navicula Loài: Navicula sp. Hình 1.1. Hình dạng tế bào Nitzschia sp. Hình 1.2. Hình dạng tế bào Navicula sp. 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu 1.1.2.1. Đặc điểm hình thái cấu tạo của Navicula sp. và Nitzschia sp. Navicula sp. và Nitzschia sp. cũng như các loài tảo Silic khác, có thể nhận biết bằng kính hiển vi quang học nhờ thành tế bào (cấu tạo vỏ) bằng chất silic cứng. Kích thước tế bào 30 x 4 µm (Navicula sp.), 30 x 5 µm (Nitzschia sp.). Mỗi tế bào được bao bọc bởi vách tấm silic như một cái hộp có nắp đậy lại được gọi 4 là vỏ. Như vậy, vỏ có hai mảnh lồng vào nhau, giống như một hộp petri với cái nắp và đáy hộp, mảnh trên hơi to hơn và úp lên mảnh dưới với đai là 2 mảnh chồng vào nhau. Đối với Navicula sp., tảo có dạng hình thuyền, đường sống ở trên đường giữa nhỏ và gần với đường giữa, do đó hình dạng mặt phẳng thẳng, rãnh dọc cũng thẳng. Hình dạng mặt vỏ là hình chữ S hoặc hình cong. Rãnh dọc cũng hình chữ S hoặc hình cong, có đốt giữa và đốt cực. Hình 1.3. Cấu tạo vỏ của tảo Silic (Cupp) (trích theo Cao Thị Xoan, 2006) [12] a. Mảnh vỏ trên c. Đường rãnh b. Mảnh vỏ dưới d. U giữa e. U chót - Cấu tạo vách tế bào: Tế bào tảo được bao bọc bởi lớp vỏ cấu tạo bằng chất silic và chất pectin gồm 2 tầng: Tầng ngoài (silic) và tầng trong (pectin). - Sắc tố, thể sắc tố: 5 Số lượng ít, kích thước lớn, thể sắc tố sẻ thùy, có dạng hình sao, gồm chlorophyll, phycoxanthin, carotenoit và diatomi. - Nguyên sinh chất: Là chất sống căn bản của tế bào, có tính lỏng, nhớt, đàn hồi, và trong suốt. Hạt tạo bột Hạt tạo bột Hình 1.4. Thể màu ở tảo Silic (Geitler) (trích theo Cao Thị Xoan, 2006) [12] a. Thể màu của tảo thuộc Pennales c. Thể màu của Cocconeis b. Sơ đồ hình thể của chúng - Nhân: Mỗi tế bào tảo Silic có một nhân, thường có dạng hình cầu, kích thước phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của tế bào. Nhân nằm trên cầu nguyên sinh chất chạy qua trung tâm tế bào. Nhân có màng nhân cố định chứa một hay nhiều hạch nhân, quá trình phân chia không giảm nhiễm [1]. - Chất dự trữ: Dạng giọt dầu màu da cam với kích thước nhỏ. 1.1.2.2. Sinh trưởng Trên thế giới và ở Việt Nam có nhiều công trình nghiên cứu về sinh trưởng của tảo Silic. Những nghiên cứu về các giai đoạn sinh trưởng của tảo Silic 6 phải kể đến công trình của Đặng Ngọc Thanh (1974) [9], Fluks và Main (1991) [20], Sato (1991) [22]. Cũng như các ngành tảo khác, chu kỳ sinh trưởng của tảo Silic cũng trải qua 5 pha [4]: - Pha gia tốc dương: Tảo bắt đầu thích nghi với môi trường nuôi, hấp thụ chất dinh dưỡng và tiến hành phân cắt tế bào nhưng tốc độ tăng trưởng quần thể chậm. - Pha logarit: Ở pha này mật độ hay sinh khối tế bào tăng lên với tốc độ nhanh nhất, theo cấp số nhân do tảo hấp thụ chất dinh dưỡng mạnh và tăng tốc độ sinh sản. - Pha gia tốc âm: Được đặc trưng bởi tốc độ tăng trưởng chậm dần so với pha logarit. - Pha cân bằng: Sinh khối tảo không tăng và đạt mật độ cực đại. Quá trình quang hợp và phân chia tế bào vẫn xảy ra trong suốt pha này, nhưng số lượng tế bào mới sinh ra gần ngang bằng với số lượng tế bào chết đi, do đó không có sự tăng trưởng của tảo. - Pha tàn lụi: Sinh khối tảo giảm đi một cách rõ rệt do khả năng sinh sản của tảo mất dần sau khi đạt mật độ cực đại. Như vậy, các pha sinh trưởng khác nhau, tốc độ sinh trưởng của tảo cũng khác nhau. Ngoài ra tốc độ sinh trưởng của tảo nói chung và tảo Silic nói riêng còn phụ thuộc vào loài tảo nuôi và sự thay đổi của các yếu tố môi trường như: cường độ và chế độ ánh sáng [17], nhiệt độ [15], [22], muối dinh dưỡng [4], [10], mức độ xáo trộn hoặc sục khí môi trường nuôi [15], [17], [20]. 7 1.2. Thành phần sinh hóa của tảo Thành phần sinh hóa của vi tảo được Brown và ctv (1989) [14] bổ sung trong bảng 1.1. Bảng 1.1. Thành phần của vi tảo (tính theo khối lượng khô của tế bào). Protein 30-55% Thành phần aminoacid tương tự trứng gà Cacbohydrat 10-30% Chủ yếu là polysaccharid Lipid 10-25% Khoáng 10-40% Acid nucleic 4-6% Các acid béo: 20-40% lipid tổng số Phospholipid: 10% lipid tổng số Silic (tảo Khuê), phospho, natri, canxi RNA:DNA = 3:1 Giá trị dinh dưỡng của những loài tảo khác nhau rõ rệt giữa các loài, và ngay giữa các dòng trong cùng một loài cũng khác nhau (Enright và ctv, 1986; Ryther và Goldman, 1975; trích theo Hà Lê Thị Lộc) [3]. Ngành Prymnessiophyceae có hàm lượng lipid 17%, và ngành Eustigmatophyta tảo có hàm lượng lipid là 17% khối lượng khô tế bào. Giống Navicula và Nitzschia thuộc ngành tảo Silic và có hàm lượng lipid cao nhất, với giá trị trung bình là 18% (trích theo Hà Lê Thị Lộc, 2000) [3]. Mặt khác, trong lipid của tảo có chứa một số axit béo không no, có thể mạch ngắn hay mạch dài, rất quan trọng cho động vật tiêu thụ tảo, ngay cả con người cũng không thể tổng hợp được axit béo không no này: DHA (Docosahec xaenoic-acid) chiếm 0,2-11%, EPA (Eicosapentaenoic - acid) chiếm 7-34% khối lượng khô của tảo. Đối với 2 loài tảo Navicula sp. và Nitzschia sp., EPA chiếm 1-5%, AA rất cao chiếm hơn 20% khối lượng khô. Ngoài ra, ở Navicula sp., DHA chiếm 0,2-1%, và Nitzschia sp. chiếm 1-5% khối lượng khô [13]. Tuy nhiên, giá trị dinh dưỡng của tảo có thể bị thay đổi rất lớn ở các pha sinh trưởng hay ở các điều kiện nuôi khác nhau (ánh sáng, nhiệt độ, độ mặn, pH, muối dinh dưỡng, …). Vào cuối pha logarit, tất cả các loài chứa khoảng 30-40% 8 protein, 10-20% lipid, 5-15% cacbohydrat [14]. Vì vậy, chúng ta cần xác định thời gian thu hoạch thích hợp để có tảo đạt giá trị dinh dưỡng cao nhất. 1.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái đến sự phát triển của tảo 1.3.1. Ánh sáng Ánh sáng là nguồn năng lượng chính cho quá trình quang hợp của vi tảo. Ánh sáng ảnh hưởng không chỉ đến sự phát triển số lượng của vi tảo, mà còn ảnh hưởng đến thành phần hóa sinh của vi tảo. Hầu hết các loài vi tảo sử dụng trong nuôi trồng thủy sản thích ứng với cường độ ánh sáng từ 50 đến 300 µEm-2s-1, tương ứng với thời gian chiếu sáng 12-18 giờ/ngày [16]. Brand và Guillard (1981) (trích theo Thinh, 1999) [23], khi nghiên cứu trên 22 loài tảo cho thấy có một số loài tảo không tăng trưởng trong điều kiện chiếu sáng liên tục. Một số loài tăng trưởng tốt nhất ở chế độ 14 giờ, cũng có một số thích nghi với thời gian chiếu sáng 12 giờ trong ngày. Navicula và Nitzschia thích nghi với thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày [10], [12]. 1.3.2. Nhiệt độ Nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến cấu trúc tế bào, tốc độ phản ứng trao đổi chất, sinh trưởng, quá trình quang hợp, mật độ phân bố, cường độ hô hấp, kích thước tế bào và sự thích nghi của loài. Vi tảo có thể sống được trong khoảng nhiệt độ 16-30oC. Ở nhiệt độ cao hơn 35oC và thấp hơn 16oC, vi tảo phát triển rất kém [3]. Tuy nhiên, nhiệt độ được coi là thích hợp cho sự phát triển của hầu hết các loài vi tảo là khoảng 20-25oC (Coutteau, 1996) [15]. Một số loài sinh trưởng ngoài tự nhiên ở nhiệt độ thấp, nhưng khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm thì lại thích nghi với độ mặn cao hơn. Chẳng hạn, Skeletonema costatum ngoài tự nhiên sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 12-13oC và 14-20oC, trong khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm thì nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của chúng là 20-30oC (Fogg, 1965) (trích theo Phan Thị Thu Trang, 2006) [10]. Navicula sp. và Nitzschia sp. có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ 10-35oC, trong đó, nhiệt độ tối ưu cho Nitzschia sp. là 20-30oC, và Navicula sp. là 26-31oC [10], [12]. 9 1.3.3. Độ mặn Khả năng chịu đựng sự thay đổi độ mặn của vi tảo biển rất lớn. Các loại tảo khác nhau thì khả năng thích nghi của chúng đối với các độ mặn cũng khác nhau. Có những loài tảo có khả năng phát triển tốt trong môi trường có độ mặn cao đến hơn 35 ppt, nhưng cũng có những loài chỉ sống được trong môi trường có độ mặn chỉ vài phần ngàn. Hầu hết, các loài tảo sinh trưởng và phát triển được trong khoảng độ mặn 12-40 ppt, nhưng phát triển tốt hơn trong khoảng 2035 ppt (Ukeles, 1976; Duerr và Misui, 1982; trích theo Fulks và Main, 1991) [20]. Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu của Hoàng Thị Bích Mai (1995) [4] cho thấy loài tảo Chaetoceros sp. thích hợp phát triển ở độ mặn 20-35 ppt, tốt nhất ở 30 ppt, còn S. costatum lại thích hợp phát triển ở độ mặn thấp từ 15-25 ppt,… Tảo Chaetoceros gracilis có thể phát triển tốt như nhau trong khoảng độ mặn 10-35 ppt (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2006) [6]. Hầu hết, các loài tảo thuộc giống Nitzschia, Navicula đều là những loài rộng muối, chúng có thể sinh trưởng ở độ mặn dao động từ 5-35 ppt [10], [12]. Trong thực tế, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III đã nuôi Navicula ở độ mặn 25-28 ppt. Trong điều kiện bị sốc mặn, khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu, duy trì cân bằng nội môi của tế bào tảo sẽ bị ảnh hưởng. Độ mặn cao có thể ảnh hưởng trực tiếp tới hoạt tính quang hợp, hô hấp, tốc độ sinh trưởng của tế bào tảo [10]. 1.3.4. pH pH được coi là yếu tố biến đổi nội tại, sự biến đổi của nhiệt độ cũng như ánh sáng đều tác động đến pH thông qua quá trình quang hợp của tảo. pH của môi trường quá cao hoặc quá thấp đều làm chậm tốc độ tăng trưởng của vi tảo. Mỗi loài tảo sinh trưởng tối ưu trong môi trường có pH nhất định. pH tốt đối với hầu hết các loài tảo trong khoảng 7-9, và thích hợp nhất từ 8,2-8,7 (Ukeles 1971; trích theo Fulks và Main, 1991) [20]. Khoảng pH này cũng thích hợp cho Navicula sp. và Nitzschia sp. [10], [12]. Tuy nhiên, có những loài chịu được 10 khoảng dao động pH khá rộng, như Isochrysis galbana có thể phát triển tốt trong khoảng dao động pH từ 5-9 (Fulk và Main, 1991) [20]. 1.3.4. Các yếu tố dinh dưỡng Dinh dưỡng là yếu tố vô cùng quan trọng, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo cả về số lượng và chất lượng. Mật độ tế bào tảo nuôi thường cao hơn nhiều so với mật độ tảo trong tự nhiên, nên việc bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi là cần thiết. Thành phần dinh dưỡng đa lượng cần thiết cho tảo nuôi gồm các muối nitơ, photpho, silic… Các nguyên tố vi lượng tác động đến quá trình trao đổi chất của vi tảo. Môi trường bổ sung dinh dưỡng cho tảo đang được sử dụng phổ biến hiện nay cho tảo Silic là môi trường L và L1 (Guillard & Hargraves, 1993) [17]. Ở Việt Nam, môi trường bổ sung dinh dưỡng của Hoàng Thị Bích Mai rất phù hợp cho ngành tảo trần, đang được sử dụng phổ biến tại các cơ quan nghiên cứu và trại nuôi tôm Sú Nha trang [3].
Nitơ: Mặc dù nitơ chỉ chiếm từ 1-10% khối lượng cơ thể trong hầu hết các loại tảo, nhưng nhu cầu nitơ rất quan trọng đối với sự phát triển của tảo. Khi mà amon được sử dụng như nguồn nitơ duy nhất cho tảo thì môi trường pH sẽ giảm nhanh, gây ra một số hiệu ứng phụ ảnh hưởng tới sinh trưởng của tảo. Mzapharov và ctv (1974) (trích theo Phan Thị Thu Trang) [10] cho biết tảo có khả năng sử dụng đạm dưới dạng 3 hợp chất: Amoni, nitrat, và nitrit. Mỗi loài có nhu cầu sử dụng hàm lượng nitơ khác nhau. Hàm lượng nitơ bổ sung tốt nhất cho tảo Chaetoceros gracilis là 12,41-17,41 ppm (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2006) [6]. Đối với Navicula sp. và Nitzschia sp., nhu cầu này từ 10-45 ppm, và tốt nhất ở 30 ppm [10], [12].
Photpho: Là một trong những yếu tố không thể thiếu trong nhu cầu dinh dưỡng của tảo. Nó có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và phát triển của tảo. Chức năng chính của photpho là tham gia vào việc hình thành nhiều hợp chất hữu cơ có vai trò là những khâu chuyển hóa trung gian hoặc những chất có ý nghĩa then chốt trong trao đổi năng lượng và trao đổi chất. Hàm lượng photpho cần bổ sung cho hầu 11 hết các loài vi tảo từ 2,5-15 ppm (trích theo Hà Lê Thị Lộc) [3], cho loài C. gracilis là 2,27-3,27 ppm (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2006) [6]. Đối với Navicula sp. và Nitzschia sp., hàm lượng photpho bổ sung tối ưu khoảng 10 ppm [10]. Lượng photpho nhiều quá hay ít quá đều không tốt cho sự phát triển của tảo [3].
Silic: Vừa là yếu tố tạo sinh, vừa là nguyên tố tạo nên vỏ silic của tảo Silic. Theo Nguyễn Trọng Nho (1972) (trích theo Phan Thị Thu Trang, 2006) [10], silic rất cần cho việc xây dựng vỏ tảo Khuê. Nếu thủy vực tồn tại nhiều tảo Khuê thì trong thời kỳ tảo Khuê phát triển mạnh, hàm lượng silic sẽ giảm nhiều, và do đó, sẽ hạn chế sự phát triển cực đại của tảo. Một số tác giả khác chỉ ra rằng khi thiếu silic, tảo Khuê vẫn phát triển bình thường nhưng cấu trúc tế bào sẽ bị thay đổi và khó khăn cho việc xác định loài. Cấu trúc phức tạp của vỏ silic giúp cho tảo có khả năng sử dụng đầy đủ ánh sáng mặt trời (trích theo Cao Thị Xoan, 2006) [12]. Đối với Chaetoceros gracilis, hàm lượng silic bổ sung tối ưu là 1,49 ppm (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2006) [6]. Trong phòng thí nghiệm, Richer (1961) đã nghiên cứu 2 loài tảo Navicula sp. và Nitzschia sp. và thấy rằng môi trường nuôi chúng nên bổ sung thêm silic (trích theo Phan Thị Thu Trang, 2006) [10]. Hàm lượng silic thích hợp đối với Navicula sp. là 5-30 ppm và tối ưu là 20-30 ppm [12]; còn ở Nitzschia sp., hàm lượng silic thích hợp từ 5-20 ppm, tốt nhất là 10 ppm [10]. 1.4. Khái quát các công trình nghiên cứu nuôi trồng vi tảo 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới Theo Hans R. và Robert A. (2005) [18], môi trường nuôi, phương pháp nuôi của tảo được nghiên cứu từ những năm 1800-1900, và kỹ thuật nuôi trồng vi tảo được mô tả trong khá nhiều sách báo, tạp chí. Vào thế kỷ 19-20, khá nhiều công trình về nuôi trồng vi tảo được công bố, song phần lớn các công trình này mô tả cách nuôi vi tảo, ít đề cập đến phương pháp phân lập, lưu giữ các loài tảo này như thế nào, đặc biệt là các loài tảo sống đáy. Mặc dù vậy, có thể đề cập đến một số công trình sau: 12 Vào năm 1850, mặc dù Ferdinand Cohn đã lưu giữ thành công tảo Lục đơn bào có roi Hamatococcus, song Cohn đã không phân lập được thuần chủng loài tảo này trong phòng thí nghiệm [18]. Năm 1971, Famintzin đã nuôi được hai loài tảo Lục Chlorococcum infusionum, Protcoccus viridis trong môi trường có chứa muối vô cơ. Môi trường này đã được phát minh bởi Knop (1865) khi ông nghiên cứu về thực vật [18]. Báo cáo đầu tiên về nuôi thuần chủng tảo được công bố bởi Beijerinck (1890) [18]. Ông đã giới thiệu kỹ thuật nuôi tảo trong môi trường hỗn hợp (nước muối, muối dinh dưỡng và gelatin). Vào năm 1893, ông đã phân lập được 2 loài tảo Lục (Chlorella, Scenedesmus) và một loài tảo Vàng Trebauxia. Ngoài ra, Beijerinck còn nuôi thuần chủng một số loài tảo khác (tảo Lam Anabana...). Miquel (Pháp) cũng được xem là người có nhiều đóng góp trong nuôi trồng tảo. Từ 1890-1898, ông đã pha loãng tảo tạp trong môi trường có chứa các nguyên tố khoáng khác nhau để phân lập một số loài tảo Silic trung tâm. Tuy nhiên, độ thuần chủng của tảo còn rất thấp [18]. Năm 1892, Noll và Oltmanns (Đức) [18] đã xuất bản những bài báo về nuôi trồng tảo, song chủ yếu là về nuôi và lưu giữ tảo chứ không đề cập đến phân lập chúng. Năm 1894, Kriiger (Đức) [18] đã nuôi thuần chủng quần lạc tảo Lục, bao gồm Prototheca, Chlorella. Năm 1896-1898, Klebs đã phân lập được tảo trong các đĩa petri có agar hay gelatin cho dù tảo vẫn còn bị nhiễm vi khuẩn [17]. Kế đó là Tischutkin (1897) [18], tại Belarus cũng đã nuôi thuần chủng được một số loài tảo Lam bằng môi trường có agar, nhưng độ thuần chủng cũng không cao hơn. Tại đại học Cambirdge (Mỹ), Ward (1899-1942) [18] đã giới thiệu phương pháp phân lập tảo thuần chủng bằng cách trộn agar, axit axetic loãng với môi trường giàu dinh dưỡng, sau đó đổ vào đĩa petri và nuôi trong phòng thí nghiệm, song một vài ngày sau đó chỉ có một số loài tảo mọc được trên bề mặt agar. Tuy nhiên, Ward cũng được xem là người đầu tiên phân lập tảo thành công trên bề mặt môi trường đặc. Đến năm 1900, Winkler đã tiến hành thu mẫu tảo ở 13 vùng nước ngọt xung quanh nhà và ông đã thuần chủng được một số loài tảo nước ngọt bằng phương pháp nuôi cấy trên thạch. Đồng thời, ông cũng đã tìm ra môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của chúng và nuôi ở các thể tích khác nhau (1-5 lít) [24]. Zumstein (1900) [18] cũng đã phân lập được loài tảo Mắt Euglena gracilis bằng pipet và tách được vi khuẩn khỏi môi trường nuôi mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của tảo. Năm 1903, bằng phương pháp phân lập tảo của Miquel, Richter đã lưu giữ được một số loài, trong đó có tảo Silic trung tâm. Ở Đức, từ năm 1926 đến 1960 [18], Vischer cũng đã thu và lưu giữ được một số loài thuộc các bộ Vovocales, Euglenales, Cryptomonadales. Tại Trung Quốc, nghiên cứu tảo nuôi đã được bắt đầu từ năm 1940. Guo và ctv (1959) đã phân lập và nuôi 2 loài tảo đơn bào Tetraselmis sp. và Dunaliella sp. (trích theo Hà Lê Thị Lộc, 2000) [3]. Vào năm 1997, Comtois [18] đã phân lập và nuôi thuần chủng được một số loài tảo Silic bằng phương pháp nhặt tế bào bằng Micropipette, một phương pháp mới và đòi hỏi kỹ thuật khá cao. Bristol đã phân lập được tảo Lục từ nhiều môi trường dinh dưỡng khác nhau (môi trường của Detmet, Beierinck 1, và Beierinck 2). Ông cũng là người khẳng định việc phân lập tảo thường khó hơn việc phân lập vi khuẩn kỵ khí [25]. Những năm gần đây, các nhà tảo học chủ yếu quan tâm đến việc cải tiến và nâng cao hiệu quả những phương pháp phân lập, lưu giữ và nuôi sinh khối các loài đã công bố trước đây (Robert A. Anderden, 2005) [18]. Năm 2007, Trường Đại học Murdoch (Úc) đã sử dụng phổ biến 4 phương pháp phân lập tảo (phương pháp pha loãng, nuôi cấy trên môi trường thạch, dùng Micropipette, và phương pháp làm giàu). Đặc biệt, khi phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch, được làm sạch bằng hỗn hợp kháng sinh khi tảo bị nhiễm vi khuẩn: 100 g Peniciline + 25 g Dihydrostreptomysin sulphate (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2007) [7]. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều loài tảo (300-400 loài) được phân lập, lưu giữ và nuôi sinh khối nhằm phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau (y học, 14 công nghệ thực phẩm, nông nghiệp…), nhưng chỉ có khoảng 40-50 loài tảo được sử dụng làm thức ăn cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản (trích theo Thinh, 1999) [23]. 1.4.2. Ở Việt Nam Các công trình nuôi trồng tảo được bắt đầu và phát triển cùng với sự phát triển của nghề nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, các báo cáo khoa học về vấn đề này lại không nhiều, đặc biệt là quá trình phân lập và lưu giữ giống tảo thuần chủng. Vào năm 1974, Khoa Nuôi trồng Thủy sản - Đại Học Nha Trang đã nghiên cứu và nuôi sinh khối ngoài trời một số tảo Lục (Chlorella), tảo Silic (Skeletonema) làm thức ăn cho động vật nổi, thức ăn cho cá và ấu trùng tôm… Từ năm 1976-1984, Viện Nghiên Cứu Hải Sản Hải Phòng đã có những nghiên cứu về tảo Silic hỗn hợp làm thức ăn cho cá biển. Năm 1989, trại giống non nước (liên doanh Vatech) Đà Nẵng đã phân lập và nuôi đại trà tảo Silic trung tâm Skeletonema costalum làm thức ăn cho ấu trùng tôm đạt kết quả khá tốt [2]. Cũng năm 1989, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III đã phân lập được Skeletonema costalum tại vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa. Theo Lê Viễn Chí và cộng sự 1994, Viện Nghiên Cứu Hải Sản Hải Phòng đã lưu giữ và nuôi đại trà một số loài tảo Silic trung tâm Chaetoceros calcitrans và tảo lục Chlamydomonas sp., Dunnalliela salina làm thức ăn cho ấu trùng Điệp quạt [10]. Hoàng Thị Bích Mai (1995) [4] đã đưa ra quy trình nuôi 2 loài tảo Silic trung tâm Chaetoceros sp. và Skeletonema costalum làm thức ăn cho ấu trùng tôm sú (giai đoạn Zoea-Mysis1). Lê Viễn Chí (1996) [1] cũng đã thành công trong nuôi và ứng dụng Skeletonema costalum làm thức ăn cho ấu trùng tôm Sú tại Hải Phòng. Năm 1995, Hoàng Thị Bích Mai [4] đã thiết lập được môi trường dinh dưỡng TH04 dùng để phân lập, lưu giữu và nuôi sinh khối một số loài tảo Lục đơn bào (Chlorella sp., Scenesmus sp., Chlamydomonas sp. ). Những năm gần đây, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III đã tiến hành lưu giữ và nuôi sinh khối các loài tảo Silic (Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros sp., Skeletonema costatum, Navicula sp., Nitzschia sp.), tảo Lục 15 (Nanochloris sp., Chlorella sp., Tetraselmis sp.), tảo Eutisgmatophyta (Nanochloropsis oculata), tảo vàng ánh (Isochrysis sp.) (trích theo Phan Thị Thu Trang, 2006) [10]. Tuy nhiên, phần lớn các loài tảo trên được di nhập từ nước ngoài (chủ yếu là từ Trung Quốc và từ Úc). Năm 2005, Vũ Thị Thùy Minh đã phân lập được loài tảo Chlorella sp. thu mẫu từ ao nuôi tôm, và Đoàn Văn Phúc cũng đã phân lập được loài tảo Silic Pseudo-nitzschia cuspidata tại vịnh Nha Trang trong phòng thí nghiệm. Hiện nay, Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản (Đại học Nha Trang) cũng đã và đang lưu giữ một số loài tảo (Tetraselmis sp., Nanochloropsis oculata, Isochrysis gabana) làm thức ăn chp Artemia, Rotatoria để nuôi ấu trùng cá chẽm… Tóm lại, có khá nhiều loài tảo (chủ yếu là tảo Lục và tảo Silic) được phân lập, lưu giữ và nuôi đại trà làm thức ăn cho đối tượng nuôi trồng thủy sản. Nhưng việc đề cập đến phương pháp phân lập và lưu giữ hai loài tảo Navicula sp., Nitzschia sp. thì ở Việt Nam chưa thấy có tài liệu nào đề cập đến. Hiện nay, trên thế giới đã có 4 phương pháp phân lập thường được sử dụng để thu tảo thuần chủng: nhặt tảo bằng Micropipet, pha loãng, nuôi cấy trên môi trường agar hoặc gelatin, hay phương pháp làm giàu [26]. Tuy nhiên, việc ứng dụng các phương pháp trên vào nuôi tảo ở Việt Nam còn chưa phổ biến. Các loài tảo dùng làm thức ăn cho đối tượng nuôi trồng thủy sản (đặc biệt là giai đoạn ấu trùng) chủ yếu được nhập giống thuần chủng từ nước ngoài và được lưu giữ trong phòng thí nghiệm. Hiện nay, một số loài đã bị tạp, nhiễm vi khuẩn hoặc thoái hóa.