Tài liệu Phân lập và nuôi sinh khối một số loài vi tảo từ biển nha trang sử dụng cho động vật thân mềm hai mảnh vỏ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THỊ HIỀN PHÂN LẬP VÀ NUÔI SINH KHỐI MỘT SỐ LOÀI VI TẢO TỪ BIỂN NHA TRANG SỬ DỤNG CHO ĐỘNG VẬT THÂN MỀM HAI MẢNH VỎ LUẬN VĂN THẠC SỸ Khánh Hoà - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THỊ HIỀN PHÂN LẬP VÀ NUÔI SINH KHỐI MỘT SỐ LOÀI VI TẢO TỪ BIỂN NHA TRANG SỬ DỤNG CHO ĐỘNG VẬT THÂN MỀM HAI MẢNH VỎ LUẬN VĂN THẠC SỸ Ngành : Nuôi trồng thuỷ sản Mã số: 60620301 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS LỤC MINH DIỆP CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Khánh Hoà - 2014 KHOA SAU ĐẠI HỌC i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do chính bản thân tôi thực hiện, các số liệu trong luận văn là hoàn toàn chính xác, trung thực và chưa từng có ai công bố. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những kết quả đã nêu trong luận văn này. Tác giả Trần Thị Hiền ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản III, đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi hoàn thành khoá học. Đề tài nghiên cứu này nằm trong khuôn khổ Dự án “Đảm bảo cung cấp giống các loài động vật hai mảnh vỏ có giá trị thương mại tại miền Trung Việt Nam bằng cách tối ưu hóa sản xuất ấu trùng” được tài trợ bởi VLIR-UOS (Bỉ). Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Quản lý dự án đã giúp đỡ tôi về kinh phí, tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và trang thiết bị, cũng như kỹ thuật chuyên môn trong quá trình thực hiện đề tài luận văn. Đặc biệt cảm ơn tiến sĩ Nancy Nevejan đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức trong quá trình nghiên cứu và thạc sĩ Phùng Bảy người đã trực tiếp khuyên bảo và tạo mọi điều kiện để giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này. Tôi rất cảm ơn sự giúp đỡ chuyên môn kỹ thuật của chuyên gia Annelies Pronker trong thời gian làm việc tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo hướng dẫn tiến sĩ Lục Minh Diệp đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài luận văn. Xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy, cô giáo trong Viện Nuôi trồng Thuỷ sản Trường Đại học Nha Trang, các bạn đồng nghiệp, các bạn cùng lớp khoá học 2012 2014 đã luôn sẵn lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin cảm ơn gia đình - cha mẹ, anh em và chồng, những người đã nâng đỡ tôi về mặt vật chất và tinh thần từ bao lâu nay, đặc biệt là trong suốt quá trình học tập. iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. ii MỤC LỤC.................................................................................................................. iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT....................................................................................... v DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH................................................................................................... vii MỞ ĐẦU..................................................................................................................... 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ........................................................................................ 3 1.1. Tình hình nghiên cứu vi tảo ngoài nước............................................................. 3 1.1.1. Phân loại vi tảo............................................................................................ 3 1.1.2. Sinh trưởng của tảo...................................................................................... 5 1.1.3. Giá trị dinh dưỡng của vi tảo trong nuôi trồng thuỷ sản ............................... 8 1.1.4. Sử dụng vi tảo trong nuôi trồng thủy sản ................................................... 11 1.1.4.1. Sử dụng vi tảo trong nuôi động vật thân mềm ...................................... 13 1.1.4.2. Sử dụng vi tảo trong nuôi tôm.............................................................. 15 1.1.4.3. Sử dụng vi tảo trong nuôi cá biển......................................................... 16 1.1.5. Tình hình nghiên cứu về phân lập, lưu giữ và sản xuất vi tảo..................... 16 1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vi tảo trong nước ......................................... 20 CHƯƠNG II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................ 24 2.1. Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu ................................................... 24 2.1.1. Thời gian nghiên cứu................................................................................. 24 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu.................................................................................. 24 2.1.3. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 24 2.2. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu ...................................................................... 24 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 25 2.3.1. Tuyển chọn, phân lập và định tên khoa học một số vi tảo từ vùng biển Nha Trang bằng phương pháp pha loãng và phương pháp cấy trên đĩa agar. ............... 25 2.3.2. Lưu giữ và nuôi sinh khối hai loài tảo Isochrysis galbana và Thalassiosira sp.27 2.3.2.1. Lưu giữ hai loài tảo Isochrysis galbana và Thalassiosira sp. ............... 27 2.3.2.2. Nuôi sinh khối hai loài Isochrysis galbana và Thalassiosira sp........... 29 2.3.3. Phương pháp thử nghiệm làm thức ăn cho động vật thân mềm .................. 31 iv 2.3.4. Phương pháp xác định các thông số ........................................................... 32 2.3.4.1. Phương pháp xác định yếu tố môi trường............................................. 32 2.3.4.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu....................................................... 32 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 34 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU................................................................. 35 3.1. Tuyển chọn, phân lập và định tên khoa học một số vi tảo phân lập từ vùng biển Nha Trang .............................................................................................................. 35 3.1.1. Loài Isochrysis galbana............................................................................. 35 3.1.2. Loài Thalassiosira sp................................................................................. 36 3.2. Lưu giữ tảo Isochrysis galbana và Thalassiosira sp. ......................................... 37 3.2.1. Lưu giữ tảo Isochrysis galbana.................................................................. 38 3.2.2. Lưu giữ tảo Thalassiosira sp. .................................................................... 38 3.3. Nuôi sinh khối tảo Isochrysis galbana và Thalassiosira sp. .............................. 39 3.3.1. Nuôi sinh khối tảo Isochrysis galbana ....................................................... 39 3.3.1.1. Nuôi sinh khối tảo Isochrysis galbana trong nhà.................................. 39 3.3.1.2. Nuôi sinh khối tảo Isochrysis galbana ngoài trời ................................. 45 3.3.2. Nuôi sinh khối tảo Thalassiosira sp. .......................................................... 46 3.3.2.1. Nuôi sinh khối tảo Thalassiosira sp. trong nhà..................................... 46 3.4. Thử nghiệm tảo làm thức ăn cho ấu trùng hàu Crassostrea gigas...................... 53 CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................... 56 4.1. Kết luận........................................................................................................... 56 4.2. Đề xuất ý kiến.................................................................................................. 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AA Axít arachidonic (20:4n-6) Ctv Cộng tác viên DGR Tốc độ sinh trưởng hằng ngày (Daily Growth Rate) DHA Axít decosahexaenoic (22:6n-3) ĐVTM Động vật thân mềm EPA Axít eicosapentaenoic (20:5n-3) HUFA (Highly unsaturated fatty acids) Axít béo có mức chưa no cao KLK Khối lượng khô MĐCĐ Mật độ cực đại MĐTB Mật độ tế bào NTTS Nuôi trồng thủy sản PUFAs (Polyunsaturated fatty acids) Axít béo không bão hoà đa nối đôi SGR Tốc độ sing trưởng đặc trưng (Specific Growth Rate) Tb/mL Tế bào/ mL TĐTT Tốc độ tăng trưởng vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại các nhóm ngành tảo [8] ................................................................4 Bảng 1.2. Lớp và giống tảo nuôi dùng làm thức ăn cho các đối tượng thủy sản [27]..12 Bảng 1.3. Các loài tảo được sử dụng làm thức ăn cho hàu và ngao [36].....................15 Bảng 3.1. Khoảng biến thiên pH của môi trường nuôi sinh khối tảo Isochrysis galbana .... 39 Bảng 3.2. Sinh trưởng quần thể tảo Isochrysis galbana khi nuôi ở mật độ ban đầu khác nhau ..........................................................................................................40 Bảng 3.3. Tốc độ sinh trưởng (µ) quần thể tảo Isochrysis galbana khi nuôi ở mật độ ban đầu khác nhau .....................................................................................42 Bảng 3.4. Giá trị pH và sinh trưởng quần thể tảo Isochrysis galbana khi nuôi bằng môi trường f/2 với hoá chất tinh khiết và hoá chất công nghiệp ........................43 Bảng 3.5. Giá trị pH, nhiệt độ và sinh trưởng quần thể của tảo Isochrysis galbana nuôi ngoài trời...................................................................................................45 Bảng 3.6. Khoảng biến thiên pH môi trường nuôi sinh khối tảo Thalassiosira sp. .....46 Bảng 3.7. Sinh trưởng quần thể tảo Thalassiosira sp. khi nuôi ở mật độ ban đầu khác nhau ..........................................................................................................47 Bảng 3.8. Tốc độ sinh trưởng (µ) quần thể tảo Thalassiosira sp. khi nuôi ở mật độ ban đầu khác nhau............................................................................................49 Bảng 3.9. Giá trị pH và sinh trưởng quần thể tảo Thalassiosira sp. khi nuôi bằng môi trường f/2 với hoá chất tinh khiết và công nghiệp ......................................50 Bảng 3.10. Giá trị pH, nhiệt độ và sinh trưởng quần thể của tảo Thalassiosira sp. nuôi ngoài trời...................................................................................................51 Bảng 3.11. Sinh trưởng của ấu trùng hàu với các loại thức ăn khác nhau...................53 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Các pha sinh trưởng của một quần thể vi tảo [27] ........................................5 Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu ................................................................24 Hình 2.2. Sơ đồ khối phân lập vi tảo .........................................................................25 Hình 2.1. Sơ đồ pha loãng tảo ở các nồng độ khác nhau............................................27 Hình 2.4. Sơ đố bố trí thí nghiệm xác định thời gian lưu giữ thích hợp......................28 Hình 2.5. Quy trình nhân sinh khối tảo......................................................................29 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy phù hợp .....................30 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thức ăn phù hợp cho ấu trùng hàu Thái Bình Dương ...........................................................................................31 Hình 3.1. Hình thái tế bào Isochrysis galbana chụp trên kính hiển vi độ phóng đại 400x.......36 Hình 3.2. Hình thái tế bào Thalassiosira sp. chụp trên kính hiển vi độ phóng đại 400x ...............................................................................................................37 Hình 3.3. Lưu giữ giống trên môi trường lỏng...........................................................37 Hình 3.4. Đường cong sinh trưởng quần thể tảo Isochrysis galbana sau khi lưu giữ với các thời gian khác nhau ..........................................................................38 Hình 3.5. Đường cong sinh trưởng quần thể tảo Thalassiosira sp. sau khi lưu giữ ở các thời gian khác nhau ................................................................................39 Hình 3.6. Sự phát triển của tảo Isochrysis galbana ở các mật độ ban đầu khác nhau .41 Hình 3.7. Đường cong sinh trưởng của tảo Isochrysis sp. khi nuôi bằng môi trường f/2 với hoá chất tinh khiết và công nghiệp ...................................................44 Hình 3.8. Sự phát triển của tảo Isochrysis galbana nuôi ngoài trời ............................46 Hình 3.9. Sự phát triển của tảo Thalassiosira sp. ở các mật độ ban đầu khác nhau ....48 Hình 3.10. Đường cong sinh trưởng của tảo Thalassiosira sp. khi nuôi bằng môi trường f/2 với hoá chất tinh khiết và công nghiệp...................................51 Hình 3.11. Sự phát triển của tảo Thalassiosira sp. khi nuôi ngoài trời .......................52 Hình 3.12. Tỷ lệ sống của ấu trùng hàu với thức ăn khác nhau ..................................54 1 MỞ ĐẦU Quá trình sản xuất giống và nuôi thương phẩm các đối tượng thủy sản đều cần đến vi tảo ở các mức độ khác nhau. Vi tảo là thức ăn tươi sống đặc biệt quan trọng cho tất cả các giai đoạn phát triển của động vật thân mềm (ĐVTM) hai mảnh vỏ như: hàu, vẹm, điệp, sò…, thức ăn cho ấu trùng của một số loài giáp xác và thức ăn cho một số loài cá ở giai đoạn đầu của quá trình sinh trưởng. Mặt khác tảo lại là nguồn thức ăn của động vật phù du và động vật phù du lại là nguồn thức ăn cho ấu trùng của cá và giáp xác giai đoạn ấu trùng và giai đoạn cá hương [27]. Ngoài ra, vi tảo còn giúp ích trong việc ổn định các yếu tố môi trường, biểu hiện trong nuôi trồng thủy sản thông qua môi trường nước xanh. Tảo đơn bào có giá trị trong nuôi trồng thủy sản phải có kích thước phù hợp, 1 - 15 µm cho những loài ăn lọc, 10 - 100 µm cho những loài khác, phải được tiêu hóa dễ dàng. Chúng cần có tốc độ tăng trưởng nhanh, dễ dàng nuôi sinh khối, có khả năng thích ứng với những thay đổi môi trường như: nhiệt độ, ánh sáng và dinh dưỡng, cuối cùng chúng cần có thành phần dinh dưỡng tốt, không chứa độc tố [24]. Mặc dù đã có một số nỗ lực nhằm thay thế thức ăn tươi sống bằng thức ăn nhân tạo nhưng cho tới nay tảo tươi vẫn là thức ăn không thể thay thế được trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là trong nuôi động vật thân mềm [30]. Động vật thân mềm hai mảnh vỏ lọc trực tiếp vi tảo, vì vậy sự phát triển của chúng liên quan trực tiếp đến chất lượng và số lượng của thực vật phù du sản xuất. Ương nuôi ĐVTM hai mảnh vỏ phụ thuộc vào sản xuất tảo sống, chi phí sản xuất tảo chiếm 30% chi phí vận hành trại giống [27]. Trong những năm gần đây, nghề nuôi động vật thân mềm ở nước ta phát triển rất mạnh trước yêu cầu của thị trường, tận dụng ưu thế tiềm năng tự nhiên sẵn có và góp phần định hướng phát triển nghề nuôi trồng thủy sản bền vững. Một số đối tượng ĐVTM hai mảnh vỏ đã được phát triển nuôi theo hướng hàng hóa tập trung như: nghêu, sò, tu hài, hàu, ngọc trai…. Vì con giống tự nhiên không đủ cung cấp nên nhiều trại giống mọc lên ở khắp nơi. Tuy nhiên, việc sản xuất giống gặp không ít khó khăn nhất là về khâu giải quyết thức ăn cho ấu trùng. Mặc dù kiến thức cũng như quy trình gây vi tảo đã được trang bị cho người dân nhưng đảm bảo cung cấp đủ về số lượng cũng như chất lượng vi tảo cho ấu trùng vẫn còn là khó khăn. Nguyên nhân được xác định là các loài tảo nhập nội khó đáp ứng được điều kiện nuôi cấy vi mô sản xuất ở nước ta. 2 Ở Việt Nam đa số các loài tảo hiện nay có nguồn gốc nhập ngoại nên chưa có phương pháp lưu giữ giống thuần cũng như quy trình công nghệ nuôi trồng chúng chưa thích hợp với điều kiện khí hậu. Do đó hiệu quả của các loài tảo nhập ngoại đem lại chưa cao, sinh khối đạt được thấp, bị tạp nhiễm nhiều, nguồn giống sơ cấp không chủ động được, đặc biệt là các chủng giống phân lập được từ nước biển địa phương rất ít nên tính chống chịu với điều kiện như: nhiệt độ, độ mặn cao là rất thấp. Vì vậy việc phân lập vi tảo hiện có mặt ở các vùng biển Việt Nam là hết sức cần thiết bởi khả năng phát triển tốt dưới điều kiện môi trường địa phương. Sự thuận lợi khác của phân lập tảo từ nước biển là có thể chủ động cung cấp tảo cho các trại sản xuất giống, không phụ thuộc vào nhà cung cấp tảo. Đặc biệt phân lập một số vi tảo có giá trị dinh dưỡng sử dụng cho ĐVTM hai mảnh vỏ tại địa phương là hết sức quan trọng để tối ưu hóa sản xuất giống thương mại. Với mong muốn phân lập và nuôi sinh khối một số loài tảo mới từ nước biển tự nhiên để cung cấp cho ĐVTM hai mảnh vỏ, ứng dụng cho nuôi trồng thủy sản (NTTS) và được sự đồng ý của Viện Nuôi trồng Thuỷ sản, Trường Đại học Nha Trang; Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản III, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập và nuôi sinh khối một số loài vi tảo từ biển Nha Trang sử dụng cho động vật thân mềm hai mảnh vỏ”. Mục tiêu Phân lập và nuôi được một số loài vi tảo từ biển Nha Trang có giá trị làm thức ăn cho động vật thân mềm hai mảnh vỏ. Nội dung nghiên cứu 1. Tuyển chọn, phân lập và định tên khoa học một số vi tảo từ vùng biển Nha Trang. 2. Lưu giữ và nuôi sinh khối một số loài vi tảo được tuyển chọn. 3. Thử nghiệm làm thức ăn cho ấu trùng hàu Thái Bình Dương. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu sâu hơn nữa các loài vi tảo và bổ sung cơ sở dữ liệu cho tập đoàn giống vi tảo của Việt Nam. - Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu thu được có ý nghĩa thực tiễn đối với các trại sản xuất giống động vật thân mềm hai mảnh vỏ trong việc chủ động nuôi, lưu giữ và thu sinh khối vi tảo làm thức ăn. 3 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Tình hình nghiên cứu vi tảo ngoài nước 1.1.1. Phân loại vi tảo Hệ thống phân loại của các nhà nghiên cứu tiếp cận các loài vi tảo từ hình thái hình dạng, màu sắc như hệ thống phân loại của Harvey (1836) chia thành 4 ngành: Tảo Silic, tảo Lục, tảo Đỏ, tảo Nâu. Smith (1933, 1950, 1962) dựa vào số lượng tế bào, sắc tố, roi, cấu trúc tế bào đã chia thành 8 ngành: tảo Lục, tảo Mắt, tảo Vàng Ánh, tảo Nâu, tảo Giáp, tảo Lam, tảo Đỏ và Chloromonadophyta. Vaden Hock (1980, 1994) dựa vào sắc tố, sản phẩm quang hợp, cấu trúc vách, cấu trúc roi, kiểu phân bào có tơ, màng bọc của lục lạp, sự liên hệ với lưới nội chất (CER) đã chia tảo thành 11 ngành. Lee ER (1999) dựa vào tế bào nhân sơ và nhân chuẩn chứa roi, sản phẩm dự trữ, kiểu phân chia tế bào chia tảo thành ngành tảo Lam (nhân sơ), tảo có nhân chuẩn, không có sự liên hệ lưới nội chất (CER) như: tảo Lục, tảo Đỏ, tảo Glaucophyta, Dinophyta, nhóm tảo nhân thực có CER như: tảo Mắt, Crytophyta, Heterokontophyta, Haptophyta. Graham Lee (2000) dựa vào trình tự gen 18S chia thành 9 ngành. Có nhiều hệ thống phân loại tảo rất khác nhau. Hệ thống các ngành Tảo (bao gồm cả Vi khuẩn lamCyanophyta) và các lớp, bộ chủ yếu theo Peter Pancik được chỉ ra ở bảng 1.1 [7]. Trong đó, vi tảo chủ yếu thuộc về các chi trong các ngành sau đây:  Ngành Tảo lục (Chlorophyta): Các chi Closterium, Coelastrum, Dyctyosphaerium, Scenedesmus, Pediastrum, Staurastrum, Dunaliella, Chlamydomonas, Haematococcus, Tetraselmis, Chlorella,...  Ngành Tảo lông roi lệch (Heterokontophyta): Các chi Melosira, Asterionella, Cymatopleurra, Somphonema, Fragilaria, Stephanodiscus, Navicula, Malomonas, Dinobryon, Peridinium, Isochrysis, Chaetoceros, Phaeodactylum, Skeletonema, Nitzschia......  Ngành Tảo mắt (Euglenophyta): Các chi Phacus, Trachelomonas, Ceratium ...  Ngành Tảo đỏ (Rhodophyta): Các chi Porphyridium, Rhodella... 4 Bảng 1. 1. Phân loại các nhóm ngành tảo [8] Ngành Cyanophyta (ngành vi khuẩn lam) Prochlorophyta (ngành tảo tiền lục) Rhodophyta (ngành tảo đỏ) Lớp Cyanophyceae Prochlorophyceae Bangiophycidae Florideophycidae Chrysophyceae (tảo vàng ánh) Heterokontophyta (ngành tảo lông roi lệch) Bộ Chroococcales Oscillatoriales Xanthophyceae (tảo vàng lục) Bacillarophyceae (tảo silic) Phaeophyceae (tảo nâu) Chrysomonadales Rhizochrysidales Chrysocapsales Chrysosphaerales Phaeothamniales Heterochloridales Rhizochloridales Heterogloeales Mischococcales Heterotrichales Botrydiales Coscinodiscales Naviculales Isogeneratae Heterogeneratae Cyclosporae Raphidophyceae Haptophyta (ngành tảo lông roi bám) Eustigmatophyta (ngành tảo hạt) Cryptophyta (ngành tảo 2 lông roi) Dinophyta (ngành tảo hai rãnh) Euglenophyta (tảo mắt) Chlorophyta (ngành tảo lục) Haptophyceae Eustigmtophyceae Eustigmatales Cryptophyceae Dinophyceae Euglenophyceae Prasinophyceae Chlorophyceae (lớp tảo lục) Conjugatophyceae (lớp tảo tiếp hợp) Charophyceae (Lớp tảo vòng) Volvocales Tetrasporales Chlorococcales Ulotrichales Bryopsidales Siphonocladales Zygnematales Mesotaeniales Desmidiales 5 Hiện nay, phương pháp phân loại vi tảo vẫn chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái. Nhìn chung, các chi đều có các đặc điểm cơ bản về hình thái để tạo dựng khoá phân loại, nhưng một số loài trong cùng một chi nếu chỉ quan sát dưới kính hiển vi thường thì rất khó phân biệt các đặc điểm sai khác vì quá nhỏ và cần phải xác định dưới kính hiển vi điện tử. Hơn nữa, nhiều loài hoặc chủng rất giống nhau về mặt hình thái và hình thái của chúng lại có thể bị biến đổi khi điều kiện môi trường thay đổi. Sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử đã mở ra một phương pháp nghiên cứu mới là phân loại học phân tử, có thể dựa trên sự nghiên cứu các gen trong hệ gen nhân, hệ gen của các bào quan (ti thể và lục lạp) hoặc các sản phẩm của gen (protein, enzym). Nhìn chung, các kỹ thuật phân tích ADN và protein có đóng góp rất quan trọng vào việc đánh giá chính xác tính đa dạng di truyền cũng như cấu trúc di truyền chủng quần của các loài tảo. Đồng thời, các nghiên cứu ADN và protein cũng cho phép đánh giá về địa lý phân bố chủng loại (loài, loài phụ, quần thể), góp phần vào việc đánh giá tính đa dạng sinh học của tảo. Để tháo gỡ những hạn chế của phương pháp phân loại dựa trên các đặc điểm hình thái, các kỹ thuật sinh học phân tử như đọc và so sánh trình tự nucleotit của các gen bảo thủ như: 18S rRNA, ITS1-5,8S-ITS2, 28S rRNA (LSU)… đã hỗ trợ tích cực cho việc định tên khoa học một cách chính xác hơn các loài vi tảo [6]. 1.1.2. Sinh trưởng của tảo Theo Coutteau (1996) [27], sự tăng trưởng của các vi tảo được đặc trưng bởi 5 pha được thể hiện qua Hình 1.1. Hình 1. 1. Các pha sinh trưởng của một quần thể vi tảo [27] 6 - Pha ban đầu: Số lượng tế bào tăng dần đều. Ở pha này tảo bắt đầu làm quen với môi trường nuôi và bắt đầu hấp thụ chất dinh dưỡng, tiến hành phân cắt tế bào nhưng tốc độ tăng trưởng của quần thể chậm. - Pha logarit (pha gia tốc dương): Số lượng tế bào tăng theo cấp số nhân, hình biểu diễn số lượng tế bảo gần như là đường thẳng. Tảo ở giai đoạn này hấp thụ chất dinh dưỡng mạnh. - Pha gia tốc âm: Môi trường dinh dưỡng có chiều hướng giảm mạnh cùng với mật độ tảo cao làm tốc độ sinh sản giảm, tuy vậy số lượng tế bào vẫn còn tăng. - Pha cân bằng: Mật độ tảo ở pha này đạt cực đại và số lượng ổn định. - Pha tàn lụi: Tảo sau khi đạt mật độ cực đại, khả năng sinh sản mất dần và số lượng tảo giảm một cách rõ rệt. Theo O’Meley và Daintith (1993) [42], sự sinh trưởng của tảo nuôi chỉ có 4 pha: pha tăng trưởng chậm (lag phase), pha hàm mũ (exponential phase), pha cân bằng (stationary phase) và pha chết (death phase). Bằng việc đo mật độ tế bào theo thể tích, ví dụ: tế bào/mL ở các khoảng thời gian đều đặn, có thể xây dựng một đường cong sinh trưởng và các giai đoạn sinh trưởng có thể nhận ra từ đường cong sinh trưởng đó. Theo Lee và Shen (2004) [38], trong nuôi thu hoạch toàn bộ, tảo trải qua ba pha khác nhau gồm pha tăng trưởng chậm, pha hàm mũ và pha tăng trưởng tuyến tính. Các pha phản ánh sự thay đổi về sinh khối và môi trường nuôi của nó. Trong tăng trưởng tuyến tính, một khi mật độ tế bào đạt đến cực đại, sinh khối sẽ tích lũy ở một tốc độ không đổi, cho đến khi một số chất trong môi trường nuôi hoặc hóa chất ức chế trở thành yếu tố hạn chế. Ở các pha khác nhau, tốc độ sinh trưởng của tảo khác nhau. Tuy nhiên, sự sinh trưởng của tảo còn tùy thuộc vào từng loài và bị chi phối rất mạnh bởi các yếu tố môi trường. Các thông số quan trọng nhất điều hòa sự sinh trưởng của tảo bao gồm các chất dinh dưỡng, nguồn cung cấp năng lượng (ánh sáng cho quang hợp hay các hợp chất hữu cơ trong trường hợp dị dưỡng), nhiệt độ, độ mặn, pH, mức xáo trộn. Mỗi loài tảo đều có khoảng cực thuận và giới hạn chịu đựng nhất định đối với các yếu tố môi trường. Một số yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng của tảo: - Môi trường nuôi: Mật độ tế bào trong môi trường nuôi thường cao hơn mật độ trong tự nhiên. Do đó, môi trường nuôi tảo phải được làm giàu bằng các chất dinh dưỡng để bù đắp những thiếu hụt trong nước biển là hết sức cần thiết. Thành phần đa lượng cần thiết bao gồm nitrat và photphat (xấp xỉ tỷ lệ 6:1) và silicat. Silicat đặc biệt dùng cho tảo 7 khuê vì chúng sử dụng hợp chất này để sản xuất vỏ bên ngoài. Thành phần dinh dưỡng vi lượng gồm những nguyên tố kim loại khác nhau (Cu, Fe, Mg, Mo, Mn, Zn,...), các vitamin như thiamin (B1), Cyanocobalamin (B12) và Biotin. Hai môi trường làm giàu được sử dụng rộng rãi và thích hợp cho sinh trưởng của hầu hết loại tảo là môi trường Walne và môi trường f/2. Do tính phức tạp và chi phí của các môi trường nuôi nêu trên nên chúng thường không được áp dụng trong hoạt động nuôi ở quy mô lớn. Môi trường làm giàu thay thế thích hợp đối với sản xuất hàng loạt các vi tảo trong hệ thống quảng canh quy mô lớn chỉ chứa các chất dinh dưỡng thiết yếu nhất và thường là các phân bón dùng trong nông nghiệp thay vì phân bón dùng trong phòng thí nghiệm [27]. - Ánh sáng: Ánh sáng là nguồn năng lượng chính cho quá trình quang hợp của tảo. Yêu cầu cường độ ánh sáng thay đổi rất lớn theo độ sâu của môi trường nuôi và mật độ nuôi tảo. Ở độ sâu lớn và mật độ tế bào cao thì cường độ ánh sáng phải tăng để có thể xuyên qua được môi trường nuôi (1000 lux thích hợp cho bình tam giác và 5000 - 10000 thích hợp cho các dung tích lớn hơn). Có thể là ánh sáng tự nhiên hoặc ánh sáng của đèn huỳnh quang. Cường độ ánh sáng quá lớn (ví dụ ánh sáng trực tiếp của mặt trời hoặc các thùng chứa nhỏ để gần ánh sáng nhân tạo) có thể làm ức chế sự quang hợp. Tuy nhiên dù là ánh sáng tự nhiên hay ánh sáng nhân tạo cũng tránh làm nóng quá mức [27]. - Độ pH: Hầu hết các loài tảo sinh trưởng và phát triển pH trong khoảng 7 - 9 và thích hợp nhất từ 8,2 - 8,7. Nhiều khi công việc nuôi bị thất bại hoàn toàn do nhiều tế bào bị phá vỡ và nguyên nhân có thể do không duy trì độ pH thích hợp. Điều này có thể khắc phục được bằng cách sục khí môi trường nuôi. Trong trường hợp nuôi với mật độ cao việc bổ sung CO2 có thể làm giảm độ pH, mà trong quá trình tảo phát triển, pH có thể tăng tới giá trị giới hạn là 9. - Sục khí (đảo nước): Sục khí là việc làm cần thiết để ngăn ngừa tảo không bị lắng nhằm đảm bảo sao cho tất cả các quần thể đều được tiếp xúc với ánh sáng và các chất dinh dưỡng như nhau và để cải thiện sự trao đổi khí giữa môi trường nuôi với không khí. Không khí là yếu tố hàng đầu vì nó chứa nguồn cacbon ở dạng CO2 phục vụ cho quang hợp. Việc bổ sung CO2 có thể làm đệm nước chống lại những thay đổi về độ pH do sự cân bằng giữa CO2 và HCO3. Tuy nhiên cần lưu ý không phải các loài tảo đều chịu được việc khuấy đảo mạnh. - Nhiệt độ: Nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến cấu trúc tế bào, tốc độ phản ứng trao đổi chất, sinh trưởng, quá trình quang hợp, mật độ phân bố, cường độ hô hấp, kích 8 thước tế bào và sự thích nghi của loài. Phần lớn các loài vi tảo sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 17 - 220C [36]. Nhiệt độ thấp 170C sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng của chúng. Nếu nhiệt độ cao hơn 350C, tảo có thể chết (kể cả những loài tảo nhiệt đới). Do vậy, khi nuôi tảo ta có thể cho dòng nước lạnh chảy trên bề mặt của bình nuôi để làm mát môi trường nuôi hoặc kiểm soát nhiệt độ không khí bằng thiết bị điều hòa. - Độ mặn: Khả năng chịu đựng sự thay đổi độ mặn của tảo biển rất lớn. Hầu hết, các loài tảo đều phát triển rất tốt ở độ mặn thấp hơn độ mặn của môi trường sống một chút và điều này có thể thực hiện được bằng cách pha loãng nước biển bằng nước ngọt. Khoảng độ mặn từ 25 - 30‰ thường tốt cho nuôi tảo lông roi, từ 20 - 25‰ tốt cho sinh trưởng tảo silic [36]. 1.1.3. Giá trị dinh dưỡng của vi tảo trong nuôi trồng thuỷ sản Mặc dù có nhiều loài tảo được sử dụng trong nghề nuôi hải sản nhưng không phải tất cả chúng đều mang lại hiệu quả cho sự sinh trưởng của đối tượng nuôi. Nguyên nhân do khả năng tiêu hóa của động vật thủy sản, kích cỡ và đặc biệt là giá trị dinh dưỡng của tảo. Giá trị dinh dưỡng của vi tảo dùng làm thức ăn cho động vật thủy sản phụ thuộc cơ bản vào thành phần sinh hóa và nhu cầu dinh dưỡng cụ thể của các đối trượng nuôi [26]. Thành phần sinh hóa của vi tảo gồm: protein, carbohydrate, lipid và khoáng chất, chiếm 90 - 95% khối lượng khô (KLK) của vi tảo. Phần còn lại là các axit nucleic chiếm 5 10% [26]. Qua phân tích 40 loài tảo thuộc 7 lớp (Bacillariophyceae, Chlorophyceae, Prymnesiophyceae, Cryptophyceae, Eustigmatophyceae, Rhodophyceae, Prasinophyceae), Brown và ctv (1997) đã xác định rằng trong tảo đơn bào có hàm lượng protein cao nhất dao động từ 6 - 52 %; carbohydrate từ 5 - 23 % và lipid từ 7 - 23 % [25]. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng thành phần sinh hóa của tảo có thể bị thay đổi khi nuôi ở các điều kiện khác nhau hay thu hoạch ở các pha phát triển khác nhau. Ở pha cân bằng của tảo Pavlova lutheri và Isochrysis sp. (T.ISO) có lượng carbohydrate nhiều gấp 2- 4 lần và lượng protein kém hơn 30 - 50% pha logarit. Nuôi tảo khuê Thalassiosira pseudonana dưới điều kiện ánh sáng liên tục (50 và 100 µE m-2 s-1) lượng cacbohydrate nhiều hơn 2 - 3 lần nuôi dưới điều kiện 12: 12 (sáng: tối) (100 µE m-2 s-1) [25].  Protein Hàm lượng của các acid amin tương tự giống nhau giữa các loài tảo và đặc biệt rất giàu các acid amin thiết yếu. Aspartate và glutamate có nồng độ cao nhất (7,1 12,9%), cystine, methionine, tryptophan và histidine có nồng độ thấp nhất (0,4 - 3,2%) và các amino axit khác từ 3,2% đến 13,5% [25]. 9 Bown và ctv (1989) đã thống kê thành phần sinh hóa của các loài tảo thường được sử dụng trong NTTS. Kết quả cho thấy hàm lượng protein của lớp Prymnesilophyceae (I. galbana, Isochrysis sp. và P. lutheri ) dao động từ 41 - 49%, lớp Bacillariophyceae dao động từ 29 - 37%, trong đó Thalassiosira pseudonana chiếm 29% [26]. Nhu cầu về giá trị dinh dưỡng của protein tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cũng như các giai đoạn phát triển. Ở giai đoạn ấu trùng và con non thì nhu cầu protein cao hơn ở giai đoạn trưởng thành. Ấu trùng động vật thân mềm (ĐVTM) hai mảnh vỏ yêu cầu 30 - 60 % protein trong chế độ tảo cho sinh trưởng của chúng. Theo Webb và Chu (1983) cho rằng tảo có hàm lượng protein cao thì có giá trị dinh dưỡng tốt. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy mối quan hệ đó là không chặt chẽ. Ví dụ, I. galbana và P. lutheri có hàm lượng protein thấp nhưng lại là thức ăn tốt cho động vật thân mềm. Trong khi đó Dunnaliella tertiolecta có hàm lượng protein rất cao nhưng khi cho ấu trùng ĐVTM sử dụng thì tốc độ tăng trưởng lại thấp [26]. Đối với giáp xác, tảo có hàm lượng từ 30 - 60% protein được sử dụng thành công trong nuôi tôm giai đoạn hậu ấu trùng. Nhu cầu protein của cá là 40 - 60% trong chế độ ăn của chúng [26].  Cacbonhydrate Theo Bown và ctv (1989), hàm lượng carbohydrate của lớp Prymnesilophyceae dao động từ 9 - 31%, lớp Bacillariophyceae dao động từ 17 - 24%, trong đó Thalassiosira pseudonana chiếm 17% [26]. Hàm lượng carbohydrate trong tảo từ 5 - 30% được coi là tốt cho sinh trưởng của động vật thân mềm hai mảnh vỏ. Mức carbohydrate tối ưu cho ấu trùng tôm P. japonicus từ 15 - 25% KLK trong chế độ ăn [25].  Lipid và axit béo Chất lượng của lipid được đánh giá dựa vào thành phần và hàm lượng acid béo trong thức ăn. Các lớp tảo khác nhau chỉ ra sự khác nhau về hàm lượng acid béo. Acid béo no của tảo lục chiếm 15 - 30% tổng số acid béo, tảo silic và Prymnesiophyta chiếm 30 - 40%. Ngành tảo silic và Prymnesiophyta có acid béo không no mạch đơn chiếm 20 - 40% và acid béo không no mạch dài (PUFA) chiếm 20 - 50%. Còn tảo lục, acid không no mạch đơn chiếm 5 - 20% và acid béo không no mạch dài chiếm 50 80% tổng acid béo. Các PUFA có trong tảo như axit docosahecxaenoic (DHA), axit eicosapentaenoic (EPA), axit arachidonic (AA) rất cần thiết đối với động vật thủy sản. 10 Hầu hết các loài tảo đều chứa loại acid béo không no EPA ở mức độ từ trung bình tới cao (7-34%). Lớp tảo Bacillariophyceae, Prymnesiophyceae, Cryptophyceae, Rhodophyceae, Eustigmatophyceae rất giàu một hoặc cả hai loại acid béo không no DHA và EPA. Lớp tảo Prymnesiophyceae (ví dụ Isochrysis sp., và Pavlova spp.) và Cryptophyceae tương đối giàu DHA (0,2 - 11 %), trong khi đó lớp Eustigmatophyceae (Nannochloropsis spp.) và tảo silic lại có nhiều AA (0 - 4 %), lớp Prasinophyceae chứa khoảng 4 - 10 % DHA hoặc EPA, ngược lại Chlorophyceae (như Dunaliella spp. và Chlorella spp.) thiếu cả hai DHA và EPA, vì vậy chúng được xem là có giá trị dinh dưỡng thấp [24]. Mỗi một loài tảo đều có thể thiếu ít nhất một thành phần dinh dưỡng cần thiết, ví dụ I. galbana có nhiều DHA ít EPA, ngược lại tảo silic có nhiều EPA và ít DHA. Vi tảo có hàm lượng PUFAs (EPA, DHA) dao động từ 1 - 20 mg/mL tế bào được xem là thích hợp cho sự sinh trưởng của động vật thân mềm, nếu hàm lượng này thấp hơn 0,5 mg/mL tế bào thì được coi là thức ăn nghèo dinh dưỡng. Còn đối với giáp xác nhu cầu này đều rất cần thiết và tùy thuộc vào từng loài. Ở tôm he Nhật Bản (Penaeus japonicus), thức ăn chứa khoảng 1% EPA và DHA là phù hợp cho sinh trưởng và có vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi sinh lý của cơ quan sinh sản và tổng hợp các hormone sinh sản. Trong khi nhu cầu này ở cá biển từ 1 - 2% trọng lượng khô thức ăn. Vì vậy, việc chọn lựa và sử dụng hỗn hợp các loài vi tảo làm thức ăn cho đối tượng thủy sản sẽ cung cấp đầy đủ các thành phần dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển và đem lại hiệu quả cao hơn [24].  Vitamin Vi tảo là nguồn cung cấp vitamin quan trọng cho các đối tượng nuôi thuỷ sản. Những loại vitamin chính gồm: thiamin (vitamin B1), riboflavin (vitamin B2), pyridoxine (vitamin B6), cyanocobalamin (vitamin B12), biotin, acid ascorbic (vitamin C), vitamin A, D, E, K [26]. Theo thống kê của Brown (2002), hàm lượng vitamin C trong vi tảo có sự khác nhau rất lớn giữa các loài (16 mg/g trọng lượng khô ở tảo C. muelleri; 1,1 mg/g ở tảo T. pseudonana). Còn lại các vitamin khác (thiamin, riboflavin, pyridoxine, cyanocobalamin, biotin,…) chỉ khác nhau từ 2 - 4 lần giữa các loài tảo. Điều này chứng tỏ rằng, việc lựa chọn một cách cẩn thận các loại vi tảo kết hợp với nhau sẽ cung cấp đầy đủ vitamin cho chuỗi thức ăn của động vật nuôi thủy sản. Hàm lượng vitamin của tảo khác nhau ở các pha sinh trưởng khác nhau. Ở pha logarit, hàm lượng của Thalassiosira pseudonana là 20 µg/g, Isochrysis sp. là 40 µg/g. 11 Ở pha cân bằng, hàm lượng riboflavin tăng lên 2 tới 4 lần ở Chaetoceros muelleri, Thalassiosira pseudonana và Nannochloris atomus [25].  Khoáng chất và sắc tố Các khoáng chất và sắc tố trong tảo cũng đóng góp một vai trò quan trọng trong việc xây dựng nên giá trị dinh dưỡng của một loài tảo. Thành phần chủ yếu của sắc tố là chlorophyll và các loại carotenoid chiếm 0,5 - 5 % trọng lượng khô. Ngoài ra còn có phycoerythin và phycocyanin nhưng chỉ chiếm một lượng nhỏ khoảng 1% khối lượng khô, ß-carotene (tiền vitamin A) được xem là rất quan trọng trong chuỗi thức ăn của giáp xác. Nghiên cứu của Ronnestad, Helland & Lie (1998) đã phát hiện ra rằng sắc tố lutein và astaxanthin (có nhiều trong tảo xanh - Tetraselmis spp.) có khả năng chuyển đổi thành vitamin A trong chuỗi mắt xích thức ăn của động vật nuôi thủy sản [24] 1.1.4. Sử dụng vi tảo trong nuôi trồng thủy sản Vi tảo sử dụng trong nuôi trồng thủy sản như là nguồn thức ăn cho tất cả các giai đoạn sinh trưởng của động vật hai mảnh vỏ (ngao, hàu, điệp), giai đoạn ấu trùng của một số động vật chân bụng (bào ngư, ốc) và ấu trùng của một số loài cá biển, tôm he và các động vật phù du [27]. Đến nay đã có khoảng trên 40 loài tảo đã được phân lập và nuôi thuần chủng trong các hệ thống thâm canh phục vụ cho sản xuất giống hoặc làm thức ăn cho các đối tượng nuôi hải sản. Hầu hết những loài tảo dùng thường xuyên trong nuôi biển là tảo khuê Skeletonema costatum, Thalassiosira pseudonana, Chaetoceros gracilis, Chaetoceros calcitrans, tảo roi Isochrysis galbana, Tetraselmis suecica, Monochrysis lutheri và Chorella spp. [27]. Bảng 1.2 cho biết 8 lớp chính và 32 giống tảo nuôi chủ yếu đang được dùng để nuôi dưỡng những nhóm động vật nước quan trọng.