Tài liệu Sử dụng kỹ thuật Fish để kểm tra sự hội nhập của gen IL-6 phân lập từ người trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen

ĐẠI ĐẠIHỌC HỌCQUỐC QUỐCGIA GIAHÀ HÀNỘI NỘI BÌA TRƯỜNG TRƯỜNGĐẠI ĐẠIHỌC HỌCKHOA KHOAHỌC HỌCTỰ TỰNHIÊN NHIÊN ----------------------------------------- Nguyễn NguyễnTiến TiếnLung Lung SỬ SỬDỤNG DỤNGKỸ KỸTHUẬT THUẬTFISH FISHĐỂ ĐỂKIỂM KIỂMTRA TRA SỰ SỰHỘI HỘINHẬP NHẬPCỦA CỦAGEN GENIL–6 IL–6PHÂN PHÂNLẬP LẬPTỪ TỪNGƯỜI NGƯỜI TRONG TRONGTẾ TẾBÀO BÀOGỐC GỐCPHÔI PHÔIGÀ GÀCHUYỂN CHUYỂNGEN GEN LUẬN LUẬNVĂN VĂNTHẠC THẠCSĨSĨKHOA KHOAHỌC HỌC Hà HàNội Nội– –2013 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Tiến Lung SỬ DỤNG KỸ THUẬT FISH ĐỂ KIỂM TRA SỰ HỘI NHẬP CỦA GEN IL–6 PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI TRONG TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60.42.0114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Lai Thành Hà Nội – 2013 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cố GS.TS. Nguyễn Mộng Hùng, nguyên Trưởng phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, người đã sáng lập nên phòng thí nghiệm nơi tôi học tập và làm việc hơn năm năm qua. Trong những ngày tháng ít ỏi được làm việc cùng thầy, tôi đã học hỏi được rất nhiều điều, không chỉ kiến thức, thao tác thực hiện thí nghiệm mà cả sự kiên trì, tìm tòi, chịu khó. Thầy đã truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu về công nghệ tế bào động vật, đặc biệt là trong lĩnh vực công nghệ tế bào gốc. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Lai Thành, người thầy đã hướng dẫn tôi thực hiện cả khóa luận tốt nghiệp Đại học và luận văn cao học. Thầy đã rất tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm làm việc giúp tôi hoàn thành những nghiên cứu này. Trong quá trình làm việc, tôi luôn nhận được những lời nhận xét, góp ý quý báu từ thầy để có thể thực hiện tốt nghiên cứu của mình. Không những vậy, trong cuộc sống, tôi cũng luôn nhận được sự giúp đỡ của thầy. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, học viên và sinh viên phòng Công nghệ Tế bào Động vật, đặc biệt là CN. Đinh Duy Thành đã chỉ dẫn, giúp đỡ trong thời gian tôi thực hiện nghiên cứu này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô công tác tại bộ môn Sinh học Tế bào cũng như các thầy cô trong Khoa Sinh học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức cơ sở để tôi có thể thực hiện được luận văn cũng như vận dụng trong công việc sau này. Tôi xin chân thành cảm ơn tới Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein – trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Nghiên cứu Gia cầm Thụy Phương – Viện Chăn nuôi Quốc gia đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân đã quan tâm, động viên tinh thần trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp. Cuối cùng, nghiên cứu của tôi được thực hiện dựa trên kinh phí hỗ trợ từ đề tài thuộc Trung tâm Nghiên cứu Châu Á, Đại học Quốc gia Hà Nội “Sử dụng kỹ thuật FISH để kiểm tra sự hội nhập của gen IL–6 phân lập từ người trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen” do TS. Nguyễn Lai Thành làm Chủ nhiệm đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm cũng như Chủ nhiệm đề tài. Hà Nội, tháng 12 năm 2013 Nguyễn Tiến Lung Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mục lục MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 Chương 1 – TỔNG QUAN ...................................................................................... 3 1.1. CHUYỂN GEN Ở GÀ................................................................................ 3 1.1.1. Các phương thức chuyển gen vào tế bào........................................... 3 1.1.2. Các phương pháp tạo gà chuyển gen ................................................ 5 1.1.3. Những ứng dụng của gà chuyển gen ................................................10 1.2. KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH) ............................12 1.2.1. Nguyên lý........................................................................................12 1.2.2. Đầu dò cho phản ứng lai..................................................................13 1.2.3. Ưu điểm của kỹ thuật FISH .............................................................18 1.2.4. Ứng dụng của kỹ thuật FISH ...........................................................19 1.3. INTERLEUKIN 6 Ở NGƯỜI ....................................................................22 1.3.1. Giới thiệu ........................................................................................22 1.3.2. Chức năng .......................................................................................23 1.3.3. Những ứng dụng lâm sàng...............................................................24 1.3.4. Gen mã hóa IL–6 ở người................................................................25 Chương 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................26 2.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT .............................................26 2.1.1. Đối tượng – vật liệu nghiên cứu ......................................................26 2.1.2. Dụng cụ và vật tư tiêu hao ...............................................................29 2.1.3. Thiết bị nghiên cứu .........................................................................29 2.1.4. Hoá chất sử dụng.............................................................................30 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................................................32 2.2.1. Tổng hợp đầu dò gắn huỳnh quang cho phản ứng lai FISH..............32 2.2.2. Thu nhận tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người.......................34 2.2.3. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) ..................................38 Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................40 Nguyễn Tiến Lung i K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mục lục 3.1. TỔNG HỢP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR ........................................................................................................40 3.1.1. Thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen IL – 6 ............................................40 3.1.2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR ................................................46 3.1.3. Kết quả tổng hợp đầu dò bằng phản ứng PCR .................................49 3.2. THU NHẬN TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN IL–6 NGƯỜI .....50 3.2.1. Phân lập và nhân nuôi tế bào gốc phôi gà ........................................50 3.2.2. Thu nhận và duy trì tế bào gốc phôi gà chuyển gen .........................52 3.2.3. Kiểm tra sự có mặt gen chuyển trong tế bào bằng phản ứng PCR ....54 3.3. KẾT QUẢ LAI FISH PHÁT HIỆN GEN IL–6 TRONG cESCs ................55 3.4. THẢO LUẬN ...........................................................................................57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................61 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................62 PHỤ LỤC................................................................................................................ A Nguyễn Tiến Lung ii K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Danh mục hình minh họa DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình 1. Chu trình tái bản của retrovirus và cách thức sản xuất vector retrovirus ...... 4 Hình 2. Mô hình chuyển gen thông qua trung gian tế bào ở gà ................................ 8 Hình 3. Quy trình của kỹ thuật FISH ..................................................................... 12 Hình 4. Cấu trúc một số chất đánh dấu huỳnh quang thường được sử dụng ........... 14 Hình 5. Vị trí của các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào ở kỳ trung gian .................. 19 Hình 6. Kiểu nhân phổ của nhiễm sắc thể tủy xương bệnh nhân đa u tủy ............... 21 Hình 7. Một số ảnh hưởng của IL–6 trong cơ thể................................................... 23 Hình 8. Cấu trúc vector pLenti6/V5–DEST Gateway (ViraPower) của Invitrogen ............................................................................................... 27 Hình 9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ............................................................................. 32 Hình 10. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi với cADN của gen IL–6 ......... 42 Hình 11. Kết quả xác định vị trí tương đồng giữa cADN và mARN gen IL–6 ....... 43 Hình 12. Kết quả kiểm tra vị trí chèn của gen IL–6 trên vector .............................. 44 Hình 13. Kết quả kiểm tra vị trí bắt cặp của đầu dò trên vector .............................. 45 Hình 14. Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp giữa đầu dò với hệ gen gà bằng BLASTn ................................................................................................. 46 Hình 15. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi và nồng độ ion Mg2+ tới hiệu suất phản ứng PCR.................................................................................. 47 Hình 16. Kết quả giải trình tự nucleotide các sản phẩm PCR và so sánh với trình tự đầu dò theo lý thuyết................................................................... 48 Hình 17. Kết quả điện di sản phẩm PCR tổng hợp đầu dò ...................................... 49 Hình 18. cESCs 24 giờ nuôi cấy in vitro sau khi phân lập...................................... 51 Hình 19. cESCs nuôi cấy trên lớp tế bào nuôi ........................................................ 52 Hình 20. Đánh giá ảnh hưởng của lentivirus tới sự sinh trưởng của cESCs ............ 53 Hình 21. Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào chuyển gen ................................. 54 Hình 22. Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào qua các lần cấy chuyển ............... 55 Hình 23. Kết quả lai FISH trên tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người............ 56 Nguyễn Tiến Lung iii K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Một số chất đánh dấu huỳnh quang và thuốc nhuộm sử dụng trong FISH ....................................................................................................... 15 Bảng 2. Vai trò của một số yếu tố chính của vector pLenti6/V5–DEST Gateway .. 28 Bảng 3. Dụng cụ và vật tư tiêu hao được sử dụng trong đề tài ............................... 29 Bảng 4. Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng trong đề tài .................................... 29 Bảng 5. Các hóa chất được sử dụng trong đề tài .................................................... 30 Bảng 6. Thành phần phản ứng PCR tối ưu hóa điều kiện tổng hợp của mồi IL–6... 33 Bảng 7. Thành phần môi trường nuôi cấy cESCs ................................................... 35 Bảng 8. Thành phẩn phản ứng PCR phát hiện gen chuyển trong tế bào.................. 37 Bảng 9. Kết quả thiết kế cặp mồi sử dụng chương trình Primer3 ........................... 41 Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm iv Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Bảng ký hiệu và chữ viết tắt BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic BLAST Basic Local Alignment Search Tool BSA Bovine serum albumin cESCs Chicken Embryonic Stem Cells cADN Complementary ADN CMV Cytomegalovirus DAPI 4',6–diamidino–2–phenylindole DIG Digoxigenin DNase Deoxyribonuclease EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FBS Fetal Bovine Serum FISH Fluorescence in situ hybridization HIV Human Immunodeficiency Virus IL–6 Interleukin – 6 LTR Long Terminal Repeats NCBI National Center for Biotechnology Information PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PGCs Primordial germ cells RNase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulfate SSC Saline – sodium citrate buffer SSCs Spermatogonial Stem Cells Ta Annealing template Tm Melting temperature Nguyễn Tiến Lung v K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mở đầu MỞ ĐẦU Sử dụng động vật chuyển gen để sản xuất các loại protein dược phẩm là hướng đi đã được quan tâm từ lâu. Trong lĩnh vực này, gia cầm chuyển gen đang được chú ý đến với một số lợi thế vượt trội so với động vật có vú như thời gian tạo dòng ngắn, trứng có môi trường vô trùng tự nhiên, thành phần protein lòng trắng trứng đơn giản nên dễ tách sản phẩm chuyển gen,…. Tính đến nay, nhiều protein dược phẩm tái tổ hợp ở người đã được nghiên cứu tạo ra từ gà chuyển gen, trong đó một số sản phẩm đã bước vào giai đoạn thử nghiệm như kháng thể đơn dòng miR24 điều trị khối u ác tính, interferon β–1a chữa trị đa xơ cứng và interferon α–2a có trong thuốc Roferon A chữa viêm gan C, ung thư máu. Những nghiên cứu về gà chuyển gen gần đây tập trung chủ yếu vào phương pháp thông qua các tế bào gốc phôi, với ưu điểm là lựa chọn được ngay từ đầu những tế bào mang gen chuyển mong muốn trước khi tiêm chúng vào phôi nhận, do đó tiết kiệm được thời gian cũng như chi phí cho quá trình sàng lọc cơ thể chuyển gen từ bố mẹ khảm. Để tạo động vật chuyển gen hiệu quả thì cần phải có các hệ thống vector đủ mạnh để chuyển được gen mong muốn với hiệu suất cao, duy trì ổn định trong cơ thể vật chủ. Hệ thống được sử dụng thường xuyên nhất dựa vào retrovirus (virus ARN) trong đó sử dụng các enzyme của bản thân và bộ máy phiên mã trong tế bào chủ để sao chép hệ gen của chúng, sau đó tích hợp nó vào nhiễm sắc thể vật chủ trong quá trình phân bào. Gần đây, một nhóm nhỏ của retrovirus là lentivirus đã được coi như một công cụ hứa hẹn trong chuyển gen. Chúng mang đầy đủ các ưu điểm của retrovirus, hơn nữa còn có khả năng chèn gen vào tế bào không phân chia, loại vector này đặc biệt hiệu quả đối với tế bào gốc phôi do loại tế bào này rất khó chuyển gen bằng các phương pháp khác. Trong quá trình tạo động vật chuyển gen, các bước sàng lọc tế bào hay cơ thể mang gen mong muốn đóng vai trò rất quan trọng. Gen chuyển cần được cài vào ADN trong nhân tế bào để đảm bảo di truyền cho thế hệ sau qua con đường sinh sản hữu tính, đồng thời phải được duy trì bền vững qua nhiều thế hệ động vật. Ngoài ra, Nguyễn Tiến Lung 1 K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mở đầu gen chuyển phải nằm ở vị trí thích hợp: trong vùng ADN hoạt động, không chèn vào giữa gen cấu trúc hay các vùng ADN giữ chức năng điều hòa,... Vì vậy, các kỹ thuật nhằm xác định vị trí gen trong bộ nhiễm sắc thể đã được phát triển, trong số đó ít tốn kém và dễ thực hiện nhất là kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescence in situ hybridization – FISH). Cơ sở của kỹ thuật FISH dựa trên sự bắt cặp chính xác giữa giữa ADN đích và đầu dò đánh dấu huỳnh quang có trình tự tương đồng. Đây là một trong những kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong sinh học phân tử và chẩn đoán nhằm phát hiện những bất thường trên nhiễm sắc thể, nghiên cứu cấu trúc và chức năng tế bào, lập bản đồ kiểu nhân, xây dựng hệ thống phát sinh loài,... Có thể nói FISH là cầu nối giữa lĩnh vực di truyền học cổ điển với di truyền học hiện đại, kết hợp sự chính xác của các kỹ thuật di truyền phân tử và sự quan sát trực quan từ kính hiển vi. Ở Việt Nam, một số bệnh viện lớn như Bệnh viện K, Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, Bệnh viên Nhi Trung ương,... đã sử dụng kỹ thuật này để chẩn đoán một số bệnh di truyền ở người. Tuy nhiên trong nghiên cứu cơ bản, việc ứng dụng nó còn rất hạn chế. Đến nay, chưa có báo cáo nào về việc sử dụng để đánh giá sự chèn gen ngoại lai vào hệ gen của tế bào động vật. Mặt khác, trong những nghiên cứu trên, đầu dò sử dụng đều là các sản phẩm thương mại, hoặc được tự thiết kế nhưng đặt tổng hợp tại các hãng nổi tiếng, chưa tự tổng hợp tại phòng thí nghiệm sử dụng chúng. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá về tiềm năng ứng dụng vector chuyển gen lentivirus đối với tế bào gốc phôi gà, sử dụng kỹ thuật FISH để phát hiện vị trí gen chuyển IL–6 trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen, từ đó tạo tiền đề cho việc tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc. Nghiên cứu này cũng góp phần phát triển kỹ thuật FISH trong nghiên cứu cơ bản ở Việt Nam. Nguyễn Tiến Lung 2 K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1. CHUYỂN GEN Ở GÀ 1.1.1. Các phương thức chuyển gen vào tế bào 1.1.1.1. Chuyển gen sử dụng vector virus Các hệ thống chuyển gen hiệu quả nhất hiện nay khai thác tiềm năng của virus động vật đã tiến hóa hàng triệu năm qua. Những vector virus được tạo ra bằng cách thay thế một hoặc một số gen của chúng bằng gen mong muốn. Ưu điểm của hệ thống chuyển gen sử dụng virus là hiệu suất chuyển gen khá cao và ổn định. Tuy nhiên, chúng có nhược điểm về độ an toàn, cũng như phản ứng miễn dịch của vật chủ loại bỏ tác nhân virus. Những nhược điểm này đang dần được khắc phục trong những vector tái bản thiếu thế hệ mới [58]. Đối với gia cầm, chuyển gen bằng retrovirus và lentivirus thu được nhiều thành công nhất trừ trước đến nay. Retrovirus có vật chất di truyền là ARN, mang ba gen chính là gag (mã hóa kháng nguyên kết hợp nhóm), env (mã hóa protein vỏ) và pol (mã hóa enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase và enzyme hội nhập intergrase). Sau khi thâm nhiễm vào tế bào chủ (đang trong giai đoạn phân chia), ARN phiên mã ngược thành ADN, từ đó hợp nhất với ADN tế bào chủ, trở thành một bộ phận ổn định và hoạt động như các gen khác trong tế bào, có thể di truyền lại cho các thế hệ sau. Nhờ tín hiệu đóng gói tương thích (), ARN phiên mã từ hệ gen virus kết hợp trở lại với các protein virus (đều được tạo ra nhờ bộ máy tổng hợp của tế bào chủ), tạo nên các hạt virus mới (Hình 1A). Khi thiết kế vector, người ta chỉ sử dụng tín hiệu  và hai trình tự dài lặp lại ở hai đầu (long terminal repeat – LTR), gen chuyển được chèn vào giữa hai LTR này. Vector cần có một dòng tế bào đóng gói chứa retorvirus cải biến, có khả năng tạo ra các protein virus nhưng không có tín hiệu  (Hình 1B). Nhờ vậy, các hạt virus mới được sinh ra chỉ chứa vector chuyển gen quan tâm, không có khả năng tạo nên các virus khác [5, 72, 74]. Gần đây, một nhóm nhỏ của retrovirus là lentivirus cũng được sử dụng rộng rãi trong Nguyễn Tiến Lung 3 K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan chuyển gen. Chúng mang đầy đủ các ưu điểm của retrovirus, hơn nữa còn có khả năng thâm nhiễm vào tế bào không phân chia [58, 74]. Hình 1. Chu trình tái bản của retrovirus và cách thức sản xuất vector retrovirus Chu trình tái bản của retrovirus (hình trái): Virus xâm nhập vào tế bào chủ, sử dụng enzyme phiên mã ngược để tổng hợp ADN từ ARN của mình; ADN này hội nhập vào hệ gen tế bào, sử dụng bộ máy tổng hợp của tế bào để phiên mã thành ARN và dịch mã tạo các protein virus; các protein này đóng gói ARN lại tạo thành các hạt virus mới và giải phóng vào môi trường. Khi sản xuất vector retrovirus (hình phải), vector đóng gói mang các gen mã hóa protein virus nhưng không có tín hiệu đóng gói (–), nên vector tạo thành chỉ chứa cấu trúc gen chuyển trong vector retrovirus (chứa tín hiệu đóng gói +) [72]. 1.1.1.2. Chuyển gen không dùng virus Việc chuyển gen không sử dụng virus trên tế bào động vật đã được thực hiện từ cách đây hơn 40 năm, chúng có ưu điểm về độ an toàn, không gây miễn dịch và đơn giản, tuy nhiên hiệu quả thấp hơn nhiều so với khi sử dụng virus. Những phương pháp được sử dụng nhiều hiện nay bao gồm các phương pháp vật lý (vi Nguyễn Tiến Lung 4 K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan tiêm, xung điện, súng bắn gen,...) hoặc sử dụng hóa chất (calcium phosphate, DEAE–dextran, liposome,...) [77]. Phương pháp vật lý được sử dụng thường xuyên nhất là sử dụng xung điện (electroporation). Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên đặc điểm màng tế bào hoạt động như một tụ điện không cho dòng điện đi qua. Người ta sử dụng hiệu điện thế cao gây sốc trong một thời gian ngắn làm tăng tạm thời điện thế màng tế bào lên xấp xỉ 1V. Kết quả là xảy ra sự tái tổ chức các thành phần trên màng một cách đáng kể, tạo ra những kênh vận chuyển nước hoặc các lỗ. ADN thẩm thấu vào trong tế bào qua đó [34, 66]. Phương pháp này có những ưu điểm như chuyển gen hiệu quả, áp dụng được với đa số các loại tế bào, có thể tiến hành với mô còn nguyên vẹn [77]. Tuy nhiên, xung điện ảnh hưởng lớn tới khả năng sống sót và sinh trưởng của tế bào (sự chuyển nhiễm tối ưu có thể đạt được trong điều kiện gây chết tới 50% số lượng tế bào) [61, 77]. Các phương pháp hóa học đều có bản chất là sự liên kết giữa phần mang điện tích dương của hóa chất sử dụng với gốc phosphate âm của bộ khung acid nucleic, hình thành phức hệ đại phân tử (polyplex). Phức hệ này được đưa vào trong tế bào chủ yếu bằng con đường thực bào. Vì vậy, phương thức này có ưu điểm là không ảnh hưởng lớn tới tế bào, tuy nhiên thao tác thực hiện tương đối phức tạp, đồng thời nhiều loại tế bào khó chuyển nhiễm bằng những hóa chất này. Kết tủa calcium phosphate và DEAE–dextran được sử dụng sớm nhất và hiện nay vẫn còn phổ biến, ngoài ra còn nhiều loại hóa chất khác như các phân tử polycationic (dendrimers polyamidoamine), polypeptide (polylysine, polyornithine, các dạng kết hợp giữa chúng) và polyethylenimine [77]. 1.1.2. Các phương pháp tạo gà chuyển gen 1.1.2.1. Vi tiêm trực tiếp ADN vào đĩa phôi giai đoạn sớm Vi tiêm ADN ngoại lai vào nhân nguyên của trứng mới thụ tinh là phương pháp đầu tiên được sử dụng để tạo động vật có vú chuyển gen và hiện nay vẫn rất phổ biến. Trên gà, phương pháp này cũng thu được thành công nhất định: Love và Nguyễn Tiến Lung 5 K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan cộng sự vi tiêm trực tiếp ADN vào hợp tử, thu được bảy cá thể gà chuyển gen sống sót đến khi trưởng thành, trong đó 3,4% gà con thế hệ tiếp theo nhận gen chuyển từ một cơ thể gà trống thu được [53]. Tuy vậy, phương pháp này bộc lộ rất nhiều nhược điểm. Trước hết, phương pháp này không thể thao tác với số lượng lớn, do mỗi ngày chỉ có một quả trứng rụng và việc kích thích siêu bài noãn ở gà khó hơn nhiều so với ở động vật có vú. Thêm vào đó, để thu được mỗi trứng mới thụ tinh, người ta phải giết một con gà mái, đồng thời trứng sau vi tiêm phải được bao bọc trong lớp lòng trắng và vỏ đá vôi như tự nhiên để có thể phát triển [18, 51]. Các nhà nghiên cứu đã thay đổi phương pháp này phù hợp với gia cầm bằng cách tiếp cận hai giai đoạn: đĩa phôi của trứng chưa ấp (giai đoạn X theo hệ thống phân chia của Eyal–Giladi, Kochav [41]) và phôi sau khoảng 55–72 giờ ấp (giai đoạn 17–20 theo hệ thống phân chia của Humberger và Hamilton [27]). Kwon và cộng sự tạo gà chuyển gen mã hóa protein phát huỳnh quang màu xanh lá cây tăng cường (Enhanced Green Fluorescence Protein – EGFP) bằng cách vi tiêm vector retrovirus vào đĩa phôi giai đoạn X, trong đó nhiều bộ phận như đầu, chi, mắt và một số nội tạng đều biểu hiện EGFP [43]. Nhóm nghiên cứu của Kamihira đã chứng minh gen chuyển có khả năng biểu hiện cao khi được tiêm vào phôi 55–60 giờ ấp. Họ tiêm vector retrovirus chứa các gen mã hóa chuỗi đơn Fv và Fc của globulin miễn dịch G1 của người vào phôi gà, tạo được gà chuyển gen biểu hiện protein này trong huyết thanh và lòng trắng trứng (khoảng 5,6 mg/ml) [36]. Ở Việt Nam, năm 2010, Nguyễn Thị Hồng Hạnh và cộng sự cũng đã báo cáo về việc tạo gà chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm vector vào đĩa phôi giai đoạn X, trong đó gen chuyển được phát hiện trong máu gà con sinh ra bằng phương pháp PCR [2]. 1.1.2.2. Chuyển gen qua tinh trùng Đây là phương pháp dựa trên khả năng của tinh trùng có thể lưu giữ ADN ngoại sinh và chuyển nó vào trứng trong quá trình thụ tinh. Tinh trùng được ủ trực tiếp với ADN trần, ngoài ra người ta có thể tăng cường hiệu quả quá trình này bằng cách sử dụng xung điện hay các chất hóa học như liposome, calcium phosphate, Nguyễn Tiến Lung 6 K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan DEAE–dextran. Tinh trùng mang ADN được thụ tinh nhân tạo, thụ tinh trong ống nghiệm hay có thể được tiêm trực tiếp vào trứng. Lợi thế lớn nhất của phương pháp này là hiệu quả chuyển gen cao, giá thành thấp, dễ thực hiện [39, 47]. Sử dụng phương pháp này, năm 2000, Harel-Markowitz và cộng sự đã tạo được gà chuyển gen mã hóa EGFP và hormone kích thích nang trứng (follicle stimulating hormone – FSH) của người, trong đó tinh trùng được ủ với plasmid và một loại liposome là Lipofectamine®. ADN ngoại lai đã được phát hiện trong mẫu mô gan, da, tim và bạch huyết bằng kỹ thuật PCR, cũng như được chứng minh biểu hiện bằng RT–PCR và miễn dịch phóng xạ [28]. Mới nhất, năm 2013, nhóm nghiên cứu của Samoylov đã tạo gà chuyển gen mã hóa nhân tố kích tích tạo quần lạc bạch cầu hạt (Granulocyte Colony–Stimulating Factor – gcsf) của người, sử dụng Lipofectamin® 2000 để tăng hiệu quả hấp thu ADN của tinh trùng. Kết quả có 33,3% gà con sinh ra mang gen chuyển mong muốn, với hàm lượng protein gcsf trong huyết thanh đạt khoảng 50–220 pg. Sử dụng những gà trống này thụ tinh nhân tạo với gà mái bình thường đã thu được 37,5% gà con thế hệ tiếp theo mang gen chuyển [73]. Ở Việt Nam, Lê Thị Tuyết và cộng sự đã công bố nghiên cứu chuyển gen qua tinh trùng ở gà năm 2010, trong đó phát hiện được gen chuyển ở nhiều mô, cơ quan khác nhau của gà con thế hệ tiếp theo [10]. 1.1.2.3. Chuyển gen thông qua trung gian tế bào Các phương pháp trên đều có nhược điểm là gen chuyển được tích hợp ngẫu nhiên vào nhiễm sắc thể của phôi, do đó không đánh giá sớm được ảnh hưởng của vị trí chèn gen đến sức sống của gà con sinh ra. Gần đây, người ta sử dụng các tế bào nuôi cấy in vitro làm trung gian cho quá trình tạo gà chuyển gen, nhờ đó sàng lọc ngay từ đầu những tế bào mang gen chuyển ở vị trí mong muốn, giảm thời gian cũng như chi phí đánh giá và chọn lọc kiểu hình cơ thể biến đổi di truyền [6, 88]. Những loại tế bào được quan tâm gồm: tế bào gốc phôi, tế bào sinh dục nguyên thủy và tế bào gốc tinh nguyên bào (Hình 2). Nguyễn Tiến Lung 7 K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan Hình 2. Mô hình chuyển gen thông qua trung gian tế bào ở gà Các tế bào gốc phôi (ESCs) hoặc tế bào sinh dục nguyên thủy (PGCs) thu nhận từ phôi được chuyển nhiễm với vector mang gen mong muốn, những tế bào mang gen chuyển được sàng lọc và vi tiêm trở lại phôi nhận, từ đó thu được gà khảm. Phương pháp tương tự cũng được tiến hành với tế bào gốc tinh nguyên bào (SSCs) thu nhận từ tinh hoàn gà trống, những tế bào mang gen chuyển được tiêm trở lại vào tinh hoàn gà trống đã triệt sản [51]. Nguyễn Tiến Lung 8 K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan Tế bào gốc phôi (Embryonic Stem Cell – ESCs) là những tế bào đa tiềm năng chưa biệt hoá, trong điều kiện thích hợp có khả năng biệt hóa thành tất cả các loại tế bào có nguồn gốc từ ba lá phôi. Bên cạnh đó, ESCs có khả năng tự duy trì và nhân lên trong thời gian dài. Vì vậy chúng trở thành công cụ hữu hiệu trong việc tạo động vật chuyển gen [4, 46]. Năm 1990, Petitte đã lần đầu tiên tạo được gà khảm bằng phương pháp vi tiêm các tế bào đĩa phôi vào phôi giai đoạn X [68]. Đến năm 2006, Wang đã chuyển gen thành công vào ESCs bằng liposome và vector virus. Sử dụng các tế bào này tiêm vào phôi nhận, nhóm nghiên cứu đã thu được gà con mang gen chuyển ở hầu hết các mô cơ thể với một bản sao duy nhất. Tuy nhiên, sự đóng góp của các tế bào biến đổi di truyền vào dòng tinh là không thể hoặc hiệu suất rất thấp [92]. Đến nay, chưa có báo cáo nào về việc ESCs sau khi nuôi cấy quá một tuần có thể đóng góp vào dòng sinh dục của gà khảm, có thể việc nuôi cấy in vitro đã làm ESCs mất dần khả năng này [51]. Ở Việt Nam, năm 2012, Nguyễn Lai Thành và cộng sự cũng đã chuyển gen vào ESCs sử dụng vector lentivirus, sau khi tiêm chúng vào phôi nhận đã thu được gà con mang gen ở mô ruột. Tuy vậy các phôi được vi tiêm thường chết ở giai đoạn sớm của quá trình phát triển, chỉ có 10% trong số đó nở thành gà con, có thể do gen chuyển chèn vào những vị trí gen hoạt động, ảnh hưởng tới sức sống của phôi [6]. Một cách tiếp cận khác là hướng đến các tế bào sinh dục nguyên thủy (Primordial Germ Cells – PGCs). Đây là những tế bào đầu dòng của trứng và tinh trùng, có thể tìm thấy trong liềm mầm phôi giai đoạn 7–10 (sau 23–38 giờ ấp), sau đó chúng lưu thông trong mạch máu phôi, đến các vị trí sau này hình thành tuyến sinh dục trưởng thành [62]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng PGCs sau khi nuôi cấy in vitro vẫn có thể hội nhập được vào phôi nhận, đóng góp vào quá trình tạo trứng và tinh trùng. Van de Lavoir và cộng sự đã phân lập PGCs từ mạch máu phôi, chuyển gen và nuôi cấy trong thời gian dài (lên tới 209 ngày) vẫn có thể đóng góp vào sự hình thành các tế bào sinh dục khi được tiêm vào phôi giai đoạn X [87]. Tuy nhiên, việc thu nhận PGCs từ máu của phôi gà gặp nhiều khó khăn do chúng chiếm tỷ lệ rất thấp (0,05% tổng số tế bào máu) [65]. Một số nhóm nghiên cứu khác Nguyễn Tiến Lung 9 K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan đã tìm cách phân lập loại tế bào này từ các tuyến sinh dục phôi. Shiue và cộng sự đã thu nhận PGCs từ phôi 5,5 ngày ấp (giai đoạn 28). Những tế bào này trải qua 281 ngày nuôi cấy vẫn duy trì các đặc điểm đặc trưng, và khi được tiêm vào động mạch chủ lưng của phôi 2,5 ngày ấp (giai đoạn 17) vẫn có khả năng tạo thành gà khảm dòng sinh dục [81]. Motono và cộng sự cũng đã hoàn thiện phương pháp tạo gà chuyển gen bằng PGCs thu nhận từ phôi 2,5 và 5,5 ngày ấp, trong đó chứng minh rằng khả năng truyền lại gen chuyển của gà mái khảm tốt hơn so với gà trống [60]. Ngoài ra, một số phòng thí nghiệm đã hướng đến sử dụng tế bào gốc tinh nguyên bào (Spermatogonial Stem Cells – SSCs) làm trung gian cho quá trình chuyển gen. SSCs mang những đặc điểm đặc trưng của tế bào gốc đa tiềm năng, chiếm khoảng 0,33–0,44% số lượng tế bào trong tinh hoàn gà con 4 tuần tuổi, 0,029–0,072% ở gà trưởng thành 24 tuần tuổi [35]. Sử dụng những tế bào này tiêm vào ống sinh tinh của gà nhận, người ta đã thu được gà trống khảm trong tinh hoàn với hiệu suất lên tới 50% [67]. Sự phát triển của phương pháp này giúp giảm thiểu đáng kể thời gian tạo gà chuyển gen, minh chứng là thời gian từ khi chuyển nhiễm vector vào tế bào cho đến khi gà khảm thế hệ tiếp theo được nở ra chỉ khoảng 38– 45 ngày (tiêm vào gà trưởng thành) cho đến 137–188 ngày (tiêm vào gà con) [49]. 1.1.3. Những ứng dụng của gà chuyển gen 1.1.3.1. Tạo mô hình nghiên cứu y – sinh học Gà được coi là hệ thống thử nghiệm quan trọng trong các lĩnh vực sinh học phát triển, miễn dịch học, vi sinh vật học. Nhiều khám phá có ý nghĩa sinh học mang tính lịch sử (ví dụ như virus có khả năng gây nên khối u, hay các tế bào B là một nhóm nhỏ của tế bào lympho) được phát hiện lần đầu tiên ở gà [16]. Các dòng gà chuyển gen có thể sử dụng để khám phá chức năng của nhiều gen trong quá trình phát triển phôi thai của động vật có vú nói chung. Năm 2006, nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Sheffield (Anh) đã đánh giá khả năng bất hoạt gen của các ARN can thiệp (iARN) trên mô hình phôi gà. Kết quả, các iARN có khả năng làm im lặng một số gen trong khu vực đặc hiệu của hệ thống thần kinh phôi, với hiệu suất đạt Nguyễn Tiến Lung 10 K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Chương 1 – Tổng quan trên 90% [20]. Năm 2010, McGrew và cộng sự đã chứng minh một trong những yếu tố kiểm soát biểu hiện gen ở chuột nằm trên locus chuỗi nhẹ myosin 1/3 (myosin light chain 1/3 – MLC1/3) có khả năng hoạt động ở phôi gà. Yếu tố này có thể điều khiển sự biểu hiện của gen lacZ trong sợi cơ xương tương tự như ở chuột. Đây là một minh chứng cho thấy các yếu tố kiểm soát biểu hiện của một số gen trong quá trình phát triển có thể tương đồng giữa các loài, chúng có thể hoạt động trong mô hình phát triển tương đương [56]. 1.1.3.2. Sản xuất protein tái tổ hợp Việc sử dụng động vật có vú (bò, cừu, dê,…) chuyển gen làm “lò phản ứng sinh học” đã sản xuất được nhiều protein dược liệu từ sữa, như –1 antitrypsin, calcitonin, interleukin–2, erithropoeietin,… Sản lượng sản phẩm thu được từ động vật có vú rất ấn tượng, đối với bò là khoảng 8.000 lít sữa, với lượng protein tái tổ hợp có thể lên tới 40 kilogam mỗi năm [33]. Gần đây, gà chuyển gen được quan tâm hơn với nhiều lợi thế. Thứ nhất, chúng có thời gian tạo dòng ngắn, chi phí chăn nuôi cũng thấp hơn so với các động vật có vú khác. Thứ hai, trứng gà rất giàu protein, trong đó hơn một nửa (54%) được tạo bởi sự biểu hiện của gen duy nhất ovalbumin, do đó dễ dàng sản xuất lượng lớn protein tái tổ hợp với độ tinh khiết cao. Thứ ba, trứng gà chứa nhiều chất ức chế protease tự nhiên và môi trường vô trùng tạo điều kiện lý tưởng cho việc ổn định hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp. Ngoài ra, mô hình glycosyl hóa nhiều protein ở người giống với gà hơn động vật có vú, đồng thời một số protein gây độc cho động vật có vú có thể được tạo ra ở gà [18, 52]. Tính đến nay, nhiều protein dược phẩm tái tổ hợp ở người đã được nghiên cứu tạo ra từ mô hình này, như chuỗi đơn Fv và Fc của globulin miễn dịch G1 [36], hormone kích thích nang trứng (FSH) [28], nhân tố kích tích tạo quần lạc bạch cầu hạt (gcsf) [73],... Một số sản phẩm đã bước vào giai đoạn thử nghiệm như kháng thể đơn dòng miR24 điều trị khối u ác tính, interferon β–1a chữa trị đa xơ cứng và interferon α–2a có trong thuốc Roferon A chữa viêm gan C, ung thư máu [52]. Nguyễn Tiến Lung 11 K20 Sinh học thực nghiệm