Tài liệu Sử dụng phương pháp pcr để chẩn đoán vi khuẩn lao ( mycobacterium tuberculosis, mycobacterium bovis)

1    TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP DH06SH BÁO CÁO TIỂU LUẬN CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC VÀ GIA CẦM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỀ TÀI SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO ( Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) Giáo viên hướng dẫn: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Sinh viên thực hiện: NGÔ THỊ TÚ TRINH MSSV: 06126169 Tháng 10/200 2    I. ĐẶT VẤN ĐỀ Lao là tình trạng nhiễm vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis, thường gặp nhất ở phổi nhưng cũng có thể ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương (lao màng não), hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao kê), hệ niệu dục, xương và khớp. Hiện nay lao là bệnh nhiễm khuẩn chính và thường gặp nhất, ảnh hưởng đến 2 tỉ người tức 1/3 dân số, với 9 triệu ca mới mỗi năm, gây 2 triệu người tử vong, hầu hết ở các nước đang phát triển. Hầu hết (90%) các trường hợp nhiễm khuẩn lao là tiềm ẩn không triệu chứng. 10% những người này trong cuộc đời họ sẽ tiến triển thành bệnh lao có triệu chứng, và nếu không điều trị, nó sẽ giết 50% số nạn nhân. Lao là một trong 3 bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất trên thế giới: HIV/AIDS giết 3 triệu người mỗi năm, lao giết 2 triệu, và sốt rét giết 1 triệu. Sự sao lãng trong các chương trình kiểm soát lao, sự bùng phát của đại dịch HIV/AIDS và việc di dân đã khiến lao trỗi dậy. Các chủng lao kháng đa thuốc (MDR, multiple drug resistant) đang tăng. Năm 1993, Tổ chức Y tế Thế giới tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu đối với lao. Do đó, việc phát hiện và điều trị kịp thời đối với bệnh lao rất quan trọng. Hiện nay, vi khuẩn lao được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như xét nghiệm đờm (nhuộm  Ziehl-Neelsen), xét nghiệm hình ảnh (X-quang), phản ứng tuberculin hay soi phế quản. Tuy nhiên, những phương pháp này vẫn tồn tại một số mặt hạn chế của nó như tốn nhiều thời gian để chẩn đoán, cho kết quả có độ chính xác không cao,… Ngày nay, với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử sẽ giúp cho quá trình chẩn đoán vi khuẩn lao nhanh chóng và hiệu quả hơn. Trong phạm vi bài tiểu luận này, tôi xin đề cập đến việc chẩn đoán vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) bằng kỹ thuật PCR. 3    II. TỔNG QUAN 1. Bệnh lao 1.1. Vi khuẩn lao 1.1.1. Mycobacterium tuberculosis Hình 1: Mycobacterium tuberculosis Phân loại Giới: Bacteria Ngành: Actinobacteria Bộ: Actinomycetales Phân bộ: Corynebacterineae Họ: Mycobacteriaceae Giống: Mycobacterium Loài: M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis (MTB), tác nhân gây bệnh lao, là vi khuẩn hiếu khí. Vi khuẩn này phân chia mỗi 16 đến 20 giờ, rất chậm so với thời gian phân chia tính bằng phút của các vi khuẩn khác (trong số các vi khuẩn phân chia nhanh nhất là một chủng E. coli, có thể phân chia mỗi 20 phút). MTB không được phân loại Gram dương hay Gram âm vì chúng không có đặc tính hoá học này, mặc dù thành tế bào có chứa peptidoglycan. Trên mẫu nhuộm Gram, nó nhuộm Gram dương rất yếu hoặc là không biểu hiện gì cả. Trực khuẩn lao có hình dạng giống que nhỏ, có thể chịu đựng được chất sát khuẩn 4    yếu và sống sót trong trạng thái khô trong nhiều tuần nhưng trong điều kiện tự nhiên, chỉ có thể phát triển trong sinh vật ký chủ. Trực khuẩn lao được xác định dưới kính hiển vi bằng đặc tính nhuộm của nó: nó vẫn giữ màu nhuộm sau khi bị xử lý với dung dịch acid, vì vậy nó được phân loại là "trực khuẩn kháng acid" (acid-fast bacillus, viết tắt là AFB). Với kỹ thuật nhuộm thông thường nhất là nhuộm Ziehl-Neelsen, AFB có màu đỏ tươi nổi bật trên nền xanh. Trực khuẩn kháng acid cũng có thể được xem bằng kính hiển vi huỳnh quang và phép nhuộm auramine-rhodamine. Phức hợp M. tuberculosis gồm 3 loài Mycobacterium khác có khả năng gây lao: M. bovis, M. africanum và M. microti. Hai loài đầu rất hiếm gây bệnh và loài thứ 3 không gây bệnh ở người. 1.1.2. Mycobacterium bovis Hình 2: Mycobacterium bovis Phân loại Giới: Bacteria Ngành: Actinobacteria Bộ: Actinomycetales Phân bộ: Corynebacterineae Họ: Mycobacteriaceae Giống: Mycobacterium Loài: M. bovis Mycobacterium bovis là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh lao phổi ở gia súc, nhưng cũng có thể gây bệnh cho những loài khác kể cả con người. Ở người, M.bovis có thể gây ra chủng lao ảnh hưởng đến phổi, hạch bạch huyết 5    và các bộ phận khác của cơ thể. Vi khuẩn này phân chia rất chậm, từ 16 đến 20 giờ, là vi khuẩn hiếu khí. Nó có liên hệ với M. tuberculosis. 1.2. Sức đề kháng của vi khuẩn Vi khuẩn có sức đề kháng mạnh nhất là chỗ thiếu ánh sáng và được làm khô. Trong phân gia súc, đờm, chỗ tối thì vi khuẩn có thể sống hàng tháng. Ánh sáng mặt trời có khả năng làm mất độc lực vi khuẩn sau 8 giờ. 1.3. Phương thức lây truyền Các loài động vật máu nóng, máu lạnh, gia súc, thú rừng, người đều có thể mắc bệnh. Có thể xếp thứ tự cảm nhiễm như sau: người, bò, gà, heo, chó, mèo, trâu. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo các con đường sau: 9 Đường hô hấp: phổ biến nhất là ở bò và người, mầm bệnh từ cơ thể bị bệnh bài xuất ra ngoài qua đường hô hấp hay qua phân, mầm bệnh có trong không khí, gia sú khỏe hít vào sẽ mắc bệnh. 9 Đường tiêu hóa: thông thường qua bú sữa, thức ăn, nước uống có mầm bệnh. 9 Ngoài ra còn có thể lây lan qua núm nhau, đường sinh dục, đường phối giống. 1.4. Triệu chứng 9 Nhóm lao phổi: ho khan, sau to hơn có âm ran, về sau ho ướt ho có đờm, vật ốm, đờm lúc đầu loãng sau đặc dần có thể có mủ máu. Thời gian sau là rối loạn hô hấp, thở hắt nhiều, niêm mạc mũi có thể xuất huyết, phổi có âm ran ướt. 9 Nhóm lao hạch: hạch sưng cứng, bề mặt hạch không trơn, hạch cứng lồi lõm, không di động được, các hạch dưới hàm, vai, hạch vú, hạch trước vai đều bị sưng. 9 Nhóm lao vú: chủ yếu ở bò sữa năng suất cao, vú sưng, núm vú bi biến dạng, nạch vú sưng to gồ ghề, sản lượng sữa giảm. 9 Nhóm lao đường tiêu hóa: ít gặp, thường gặp ở các ổ lao ở ruột có thể ở gan, gia súc tiêu chảy, gầy dần, rối loạn tiêu hóa, niêm mạc đường tiêu hóa bị phá hủy, hạch màng treo ruột bị thoái hóa dạng bã đậu. 6    1.5. Bệnh tích Có thể nghi ngờ bệnh khi có bệnh tích casein hóa hoặc calci hóa. Các hạt lao chủ yếu có ở phổi, màng treo ruột và hạch lamba, xương hay khớp. Các bệnh tích lúc đầu gồm các hạt nhỏ có casein hoặc calci hóa trong hạch lamba vùng hầu, ngực và đôi khi ở hạch màng treo ruột về sau chúng gồm rất nhiều hạt to, cứng, màu trắng xám ở khu vực màng phổi và màng bụng (hạt có màu xám), kích thước hạt thay đổi từ đầu đinh ghim tới hạt phỉ. Trong thể lao hạt kê, các hạt lao có rất nhiều ở phổi, gan lách và các cơ quan khác, chúng thường có màu xám vàng. (a) (b) (d) (c) (e) (g) (f) (h) Hình 3: Test dị ứng bằng Tuberculin (a) ; Hạt lao phổi giống như ngọc trai trên màng phổi trong xoang ngực (b) ; Hạt lao màu vàng trắng trên gan (c) ; Hạt lao trên gan (d) ; Các hạch phổi to lên rõ và có các hạt màu vàng trắng ngà (e) ; Thoái hóa dạng bả đậu ở hạch màng treo ruột (f) ; 7    Tế bào khổng lồ trong u hạt hạch phổi và tế bào kháng axit trong bào tương (g) ; khuẩn lạc Mycobacterium bovis nuôi cấy 8 tuần ở 37oC trong môi trường Herold (h). 2. Chẩn đoán vi khuẩn lao bằng phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) 2.1. Phương pháp PCR 2.1.1. Định nghĩa Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Phương pháp này được K.Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Phương pháp PCR được thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rất nhiều bản sao DNA. Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,…. 2.1.2. Nguyên lý Phản ứng chuỗi sử dụng enzyme polymerase hay còn gọi là PCR là một phản ứng tổng hợp sợi DNA đơn dựa vào một sợi DNA đơn khác làm khuôn và một đoạn oligonucleotide làm mồi. Sợi DNA đơn được tổng hợp nên có trình tự bổ trợ với sợi khuôn. Các oligonucleotide dùng làm mồi cho enzyme DNA polymerase và sợi biến tính của phân đoạn DNA lớn được dùng làm sợi khuôn. Kết quả là tổng hợp các sợi DNA mới bổ trợ cho các sợi khuôn bố mẹ. Những sợi mới này có đầu 5’ (chính là đầu 5’của mồi oligonucleotide), trong khi đó đầu 3’ thì chưa xác định được độ dài. Quá trình tổng hợp định hướng theo oligonucleotide của các sợi DNA con có thể được nhắc lại nếu sợi kép mới được biến tính (bằng nhiệt) và mồi bổ sung được phép gắn vào sợi khuôn (nhờ hạ xuống nhiệt độ thích hợp). Các bước này bao gồm: a) biến tính, b) gắn mồi, c) kéo dài mồi tạo ra một chu kỳ trong phương pháp khuếch đại PCR. 8    Sau mỗi chu kỳ sợi DNA mới tổng hợp có thể làm khuôn trong chu kỳ tiếp theo. Một sợi trong sợi mới được tổng hợp từ chu kỳ 2 trở đi có đầu 5’ và 3’ được xác định tại vị trí gắn mồi oligonucleotide. Sau n chu kỳ, sự khuếch đại các phân đoạn tuân theo quy luật sau: 1) chỉ có 1x bản sợi khuôn ban đầu (sợi kép 2 –dna-), PCR không bao giờ tái tạo được sợi dài như sợi khuôn, trừ trường hợp hai mồi nằm ở tận cùng hai đầu sợi khuôn. 2) Có n sợi đơn mỗi loại (-dna và dna-) với độ dài không xác định, trong đó n là số chu kỳ. Những phân đoạn có độ dài không xác định này có một đầu được giới hạn bởi mồi PCR còn đầu kia không xác định. 3) Có [2n – (n+1)] bản sao sợi đơn mỗi loại (dna xuôi và ngược) có độ dài xác định giữa hai mồi PCR. 2.1.3. Tối ưu hóa PCR Các yếu tố quyết định sự thành công của PCR có thể chia thành bốn nhóm chính, đó là: khuôn (độ tinh sạch và nồng độ), mồi thiết kế (tính đặc hiệu, cấu trúc và nồng độ), các thành phần khác (đệm, MgCl2, phụ gia, polymerase, dNTP), các chế độ phản ứng (nhiệt độ và thời gian). 2.1.3.1. Khuôn DNA PCR là một công cụ cực kỳ mạnh để khuếch đại DNA bởi vậy cần rất ít khuôn DNA. Nhưng để giảm khả năng tạo lỗi của Taq DNA polymerase, có thể sử dụng nồng độ DNA cao hơn, mặc dù quá nhiều khuôn có thể tăng hàm lượng thể lẫn tạp và giảm hiệu suất. Thường hàm lượng khuôn DNA trong khoảng 0.01-1 ng đối với plasmid hoặc DNA phage và 0.1-1 µg đối với DNA nhân bào, cho một phản ứng tổng thể tích 50 µl. Hàm lượng khuôn DNA cao hơn thường tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm PCR không đặc hiệu, nhưng nếu độ tin cậy tổng hợp là tới hạn, nên dùng hàm lượng khuôn DNA tối đa cho phép cùng với số chu kỳ PCR giới hạn để tăng tỷ lệ sản phẩm PCR đặc hiệu. 2.1.3.2. Mồi 9    Mồi là một phân đoạn nucleotide ngắn bổ trợ cho vùng DNA cần được khuếch đại trong PCR. Mồi có thể đặc hiệu hoặc chung (universal) với trình tự nucleotide đặc trưng. Mồi chung bổ trợ cho nhiều trình tự nucleotide là một bộ phân tử DNA đặc trưng nào đó. Do đó, chúng có thể liên kết rộng rãi với nhiều loại khuôn DNA. Mồi là một trong các yếu tố quan trọng nhất quyết định sự thành công của PCR. Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng nồng độ thích hợp sẽ dẫn đến PCR có sản phẩm hay không. Tính bổ trợ hoàn chỉnh của 18nt hoặc hơn là lý tưởng. 2.1.3.4. dNTP Nồng độ mỗi loại dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) trong hỗn hợp phản ứng thường là 200 µM. Một điều quan trọng là nồng độ mỗi loại dNTP phải như nhau. Chỉ cần một dNTP nào đó chênh về nồng độ có thể gia tăng mức độ gắn nhầm nucleotide vào sản phẩm PCR, dẫn đến kết quả trình tự có lỗi và sản phẩm biểu hiện có thể là một thể đột biến. Nồng độ nucleotide cần không quá 50µM mỗi lọai, tuy nhiên sản phẩm dài có thể cần nhiều hơn. Khi độ tin cậy tối đa của quy trình PCR là tới hạn, nồng độ dNTP cuối cùng phải là 10-50 µM, do độ tin cậy tổng hợp DNA là tối đa trong dãy nồng độ này. Ngoài ra, nồng độ MgCl2 phải được chọn nghiêm ngặt, bắt đầu từ 1 mM và tăng lên 0.1mM mỗi bước, cho tới khi thu được hiệu suất có đủ sản phẩm PCR. Nồng độ dNTP có thể được sử dụng tới 1.5 mM. Do dNTP bắt kẹp các ion Mg2+, nên [Mg2+] sử dụng có thể cần được thay đổi. Tuy nhiên thừa dNTP có thể tăng tỷ lệ lỗi và có khả năng ức chế Taq pol. Bởi vậy giảm dNTP (10-50 µM) có thể cũng giảm tỷ lệ lỗi. Phân đoạn PCR kích thước lớn hơn cần nhiều dNTP hơn. 2.1.3.5. Polymerase Có thể sử dụng Taq DNA polymerase, Tli, Pfu trong phản ứng PCR. Taq pol có một tỷ lệ lỗi cao hơn Tli hoặc Pfu. Tuy nhiên Taq pol lại ít phức 10    tạp hơn các polymerase khác và ít khi thất bại. Người ta có thể sử dụng Taq pol cùng với các enzyme khác để tăng độ tin cậy của phản ứng. Thường 1-1.5 unit Taq DNA polymerase được sử dụng trong một hỗn hợp phản ứng 50 µl. Hàm lượng Taq pol cao hơn có thể tổng hợp nhiều sản phẩm PCR không đặc hiệu. Tuy nhiên, nếu các chất ức chế có mặt trong hỗn hợp phản ứng (ví dụ khuôn DNA sử dụng không được tinh sạch cao), hàm lượng Taq pol (2-3 unit) cao hơn có thể là cần thiết để thu hiệu suất sản phẩm khuếch đại cao hơn. 2.1.3.6. Nồng độ Mg 2+ Nồng độ Mg 2+ ảnh hưởng tới bắt cặp mồi, Tm của sợi khuôn, sản phẩm và liên kết mồi-khuôn, tính đặc hiệu sản phẩm, hoạt tính enzyme và tính chính xác. [Mg2+] ảnh hưởng tới sự bắt cặp oligo với khuôn DNA bằng cách bền hóa với khuôn-mồi. Vì vậy nó cũng tăng sự bắt cặp không đặc hiệu và tổng hợp các sản phẩm PCR không mong muốn (cho nhiều băng trên gel). EDTA kẹp càng cua Mg 2+ có thể thay đổi [Mg2+]. Do ion Mg 2+ taọ ra các phức hợp với dNTP, mồi và khuôn DNA, nồng độ tối thích của MgCl2 được lựa chọn cho từng thí nghiệm. Quá ít ion Mg2+ cho hiệu suất thu nhận sản phẩm PCR thấp và quá nhiều ion tăng hiệu suất thu các sản phẩm không đặc hiệu và tăng gắn nhầm. [Mg2+] thấp hơn được mong muốn khi độ tin cậy tổng hợp DNA là tới hạn. Taq pol cần các ion Mg2+ tự do. Do các thành phần như dNTP, mồi khuôn, tất cả đều tạo càng cua và thu giữ cation, trong đó dNTP có nồng độ cao nhất, do đó [Mg2+] ít nhất phải là 0.5-2.5 mM cao hơn nồng độ của dNTP. 2.1.3.7. Phụ gia Phụ gia là những chất được bổ sung vào PCR nhằm thu các sản phẩm PCR mong muốn nhiều hơn. Phụ gia thường dùng cho các phân đoạn 11    PCR rất dài, giàu GC hoặc dễ hình thành cấu trúc bậc hai. Các phụ gia glycerol, formamide, NMP có tác dụng hạ thấp nhiệt độ bắt cặp vài độ và giảm biến tính, trong khi đó DMSO giảm hình thành cấu trúc bậc hai. 2.1.3.8. Đệm PCR Thường các kit thương mại đều cung cấp đệm đã pha sẵn. Nhưng người ta có thể sử dụng nồng độ đệm PCR tự pha chế cao hơn để nâng cao hiệu suất. Đệm bao gồm các thành phần: 16.6 mM ammonium sulfate, 67.7 mM Tris-HCl, pH 8.9, 10 mM β-mercaptoethanol, 170 µg/ml BSA, 1.5-3 mM MgCl2. Đệm PCR trong kit thường chứa các thành phần: 10-50 mM TrisHCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2 hoặc cao hơn, 100 µg/ml gelatin hoặc BSA, và/hoặc 0.05-0.1% chất tẩy rửa không ion như Tween-20 hoặc Nonidet P-40 hoặc Triton X-100. Nồng độ muối KCl hoặc NaCl cao hơn 50 mM sẽ ức chế Taq pol, nhưng lại cần thiết để tạo điều kiện dễ dàng bắt cặp mồi. Một số enzyme không cần bổ sung protein, một số khác lại phụ thuộc vào nó. Một số enzyme hoạt động tốt hơn với sự có mặt của chất tẩy rửa, có lẽ do nó ngăn cản xu hướng tự nhiên của enzyme liên kết với nhau. 2.1.4. Chu trình nhiệt 2.1.4.1. Biến tính Thường biến tính 0.5-2 phút ở 94-95oC là đủ, do sản phẩm PCR được tổng hợp ở chu kỳ khuếch đại thứ nhất ngắn hơn đáng kể so với khuôn DNA ban đầu và được biến tính hoàn toàn dưới các điều kiện này. Nếu DNA khuếch đại có hàm lượng GC rất cao, thời gian biến tính có thể được tăng lên 3-4 phút. 2.1.4.2. Gắn mồi 12    Thường nhiệt độ bắt cặp tối thích thấp hơn 5oC so với nhiệt độ nóng chảy của sợi kép mồi-khuôn DNA. Thời gian gắn mồi kéo dài 0.5-2 phút là đủ. Tuy nhiên, nếu sản phẩm PCR không đặc hiệu thu được ngoài sản phẩm mong đợi, nhiệt độ bắt cặp phải được tối ưu bằng cách tăng từng bước 1-2oC. 2.1.4.3. Kéo dài Thường bước kéo dài mồi (tổng hợp) được thực hiện ở 70-75oC. Tốc độ tổng hợp DNA bằng Taq DNA polymerase đạt cao nhất ở nhiệt độ này. Thời gian tổng hợp phân đoạn PCR dài 2 kb được đề xuất là 1 phút. Khi khuếch đại các phân đoạn PCR dài hơn, thời gian tổng hợp được tăng lên 1 phút cho mỗi kb. 2.2. Chẩn đoán vi khuẩn lao bằng PCR 2.2.1. Chẩn đoán nhanh Mycobacterium tuberculosis bằng PCR Với tác động ngày càng tăng của bệnh lao và sự xuất hiện của các chủng Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc, phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh lao phổi có một ý nghĩa quan trọng đối với sức khỏe cộng đồng. Ở các nước phát triển, tác động cao hơn của bệnh lao không chỉ liên quan đến bệnh AIDS và tình trạng vô gia cư mà còn liên quan đến tuổi của dân số. Mặc dù phổi là cơ quan chịu ảnh hưởng trực tiếp, các dạng bệnh do bị nhiễm phải hay các bệnh ngoài phổi là thường xuyên, được phát hiện đến khoảng 77% ở các bệnh nhân bị nhiễm HIV và 24% ở các bệnh nhân không nhiễm HIV. Sự có mặt của vi khuẩn lao trong máu đã được biết đến hơn 50 năm; tuy nhiên, người ta chỉ mới nhận thấy sự xảy ra thường xuyên cho đến khi có đại dịch AIDS. Ở thập kỷ trước, nuôi cấy trên môi trường máu đã trở thành công cụ có ích cho việc phát hiện M. tuberculosis và những vi khuẩn lao khác ở các bệnh nhân bị nhiễm HIV, đặc biệt ở những bệnh nhân có hàm lượng tế bào CD4 thấp. Mặc dù những kinh nghiệm từ những bệnh nhân AIDS, thông tin về lợi ích chẩn đoán của nuôi cấy trong môi trường máu ở những bệnh nhân không bị nhiễm HIV còn giới hạn và vẫn không được khuyến khích. 13    PCR là một kỹ thuật sử dụng rộng rãi để chẩn đoán nhiều bệnh nhiễm khuẩn, bao gồm bệnh lao. Trong nghiên cứu này, người ta áp dụng kỹ thuật PCR để phát hiện DNA của M. tuberculosis ở những mẫu máu của bệnh nhân với một phổ rộng bệnh nhân nhiễm lao, gồm cả bệnh nhân không bị nhiễm HIV cũng như bị nhiễm HIV. Phương pháp thực hiện Lấy mẫu máu ở vùng ngoại biên cho vào tube có chứa sẵn dung dịch chống đông tụ EDTA và phân tích mẫu. Toàn bộ mẫu trong tube được trải trên dung dịch Ficol-Hypaque và ly tâm 400 vòng trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Phần kết tủa được rửa 2 lần với muối phosphate-buffered (10 mM phosphate buffer [pH 7.2], 150 mM NaCl). Tế bào, 106, được ly tâm 9000 vòng trong 15 phút, và được ủ trong 100 µl buffer phân giải (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 0.45% Tween 20, 0.45% Nonidet P-40) có chứa 100 µg enzyme proteinase K trên mỗi ml ở 56oC trong 3h và sau đó nâng nhiệt độ biến tính ở 95oC trong 10 phút. Tất cả các mẫu được phân tích với 1 cặp primer (PCO4-GH20) khuếch đại 1 vùng của gene β-globin, với sự biến đổi như sau: các phản ứng PCR được thực hiện với thể tích cuối là 25 µl chứa 1.5 mM MgCl2 và 12.5 µl dung dịch dung giải mẫu. Tiến trình này cho phép sự định lượng toàn bộ DNA tế bào và sự có mặt của tác nhân ức chế của Taq polymerase. Sự khuếch đại được tiến hành như đã được mô tả, sử dụng kỹ thuật khởi động nóng ( hot start technique). Phản ứng phát hiện 1 vùng 123-bp từ trình tự chèn IS 6110 là phức hợp chuyên biệt của M. tuberculosis. PCR được thực hiện trong 1 chu kỳ nhiệt DNA ( Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn). Phản ứng khuếch đại được thực hiện với thể tích 25 µl chứa 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% gelatin, 0.2 mM mỗi deoxynucleoside triphosphate, primers (1mM mỗi loại), và 100000 PBMC. Sau khi hỗn hợp phản ứng đạt 82oC, 0.625 unit Taq pol được thêm vào. Sau đó mẫu được biến tính ở 94oC trong khoảng 5 phút, và thực hiện 30 chu kỳ khuếch đại với quy trình như sau: biến tính ở 94oC trong 2 phút, bắt cặp ở 14    68oC trong 2 phút, và kéo dài với mồi ở 72oC trong 2 phút. Thời gian kéo dài được tăng thêm 5s với mỗi chu kỳ tiếp theo. Sau khi khuếch đại, 10µl hỗn hợp phản ứng được điện di trong ethidium bromide- có chứa 2% gel agarose và quan sát bằng tia UV. DNA được chuyển qua màng nylon bằng alkaline blotting. Lai phân tử được thực hiện trong 53 SSPE (0.75 M NaCl, 50 mM sodium phosphate [pH 7.7], 5 mM EDTA)- dung dịch 13 Denhardt’s- 1% sodium dodecyl sulfate (SDS)–10% dextran sulfate ở 55oC để qua đêm với mẫu dò đánh dấu 32 P. Sự bắt cặp đặc hiệu của mẫu dò khoảng 108 cpm/mg, xấp xỉ 107 cpm được sử dụng trong phản ứng lai. Sau đó, màng lai được rửa trong 2x SSPE- 0.1 % SDS ở 55oC và được đưa vào máy …. Có chứa các màng hình khuếch đại trong khoảng 2 đến 24 h ở -70oC. Mẫu dương tính được nhìn thấy trong kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Trong tất cả các trường hợp, kết quả đạt được từ các mẫu nhân bản là giống nhau hoàn toàn. 15    2.2.2. Xác định đặc hiệu loài của Mycobacterium bovis bằng PCR Kỹ thuật RAPD được sử dụng trong xác định đoạn đặc hiệu loài của Mycobacterium bovis. Một đọan DNA có kích thước khoảng 500 bp được khuếch đại từ bộ gene của 15 dòng M. bovis, bao gồm cả M. bovis BCG Pasteur, nhưng không có mặt trong 26 vi khuẩn lao khác và 20 dòng khác của Mycobacterium tuberculosis. Khi đoạn DNA được sử dụng như là một mẫu dò trong phương pháp Southern blot, một vài band có hoạt tính phóng xạ thuộc về 16    M. tuberculosis và M. bovis được quan sát. Tuy nhiên, đoạn DNA này lai đặc hiệu với đoạn EcoRI 2900bp trên bộ gene của M. bovis, nhưng lại không lai với DNA nhiễm sắc thể của M. avium. Dựa trên tỷ lệ trình tự nucleotide của đoạn 500 bp, hai primer oligonucleotide được thiết kế và tiến hành phản ứng PCR. Sử dụng mẫu DNA vi khuẩn lao đã tinh sạch, chỉ có M. bovis và M. bovis BCG cho ra band khuếch đai duy nhất. Phản ứng PCR này có thể phát hiện được 10 fg DNA M. bovis đã tinh sạch. Thí nghiệm này cũng được sử dụng trong xác định trực khuẩn trực tiếp từ mẫu sinh vật không qua nuôi cấy, ví dụ như sữa. Phương pháp thực hiện Các dòng vi khuẩn lao được sử dụng cho ở bảng 1 được cho tăng trưởng trên môi trường Sauton loặc Lowensttein- Jensen, thu hoạch và bảo quản ở 4oC. Các dòng M. bovis được phân lập từ các con thú bị nhiễm. Các dòng M. tuberculosis phân lập được lấy từ phòng thí nghiệm vi sinh, bệnh viện San Juan de Dios. Tất cả các dòng được phân loại bằng các thử nghiệm sinh hóa và vi sinh theo tiêu chuẩn. 17    Ly trích DNA nhiễm sắc thể: Đối với tinh sạch DNA quy mô nhỏ, một vòng tròn trên khuẩn lạc trưởng thành được tổng hợp lại trong TE ( 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA) và được rửa 3 lần với cùng loại buffer. Vi khuẩn được ủ khoảng 1h ở 37oC với sự có mặt của lysozyme (2 mg/ml). Vách tế bào được phá vỡ bằng cách từ từ tăng nhiệt độ lên 60oC và thêm vào SDS và proteinase K (Bethesda Research Laboratory) đến nồng độ cuối 1% (w/v) và 250 µg/ml. Sau 1.5h, DNA được ly trích với phenol/ chloroform và kết tủa với 0.6 V 2-propanol. Phần lắng được rửa với 70% (v/v) ethanol và được tăng sinh lại trong 30-50 µl nước cất; 10 µl mẫu được sử dụng trong kỹ thuật RAPD, hoặc trong phản ứng PCR đặc hiệu. 18    Các primer được sử dụng trong kỹ thuật RAPD được liệt kê trong bảng 2. Các trình tự oligonucleotide được thiết kế theo hàm lượng GC của bộ gene vi khuẩn lao, và sử dụng chương trình Oligo version 4.0 ( National Biosciences). Các primer được tổng hợp bởi phương pháp phosphite triester pha rắn theo Pharmacia LKB Gene Assembler Special. 19    Khuếch đại bằng kỹ thuật RAPD: Thực hiện phản ứng với 50 µl có chứa 10µl DNA, 1x buffer phản ứng ( Gene amp kit, Perkin Elmer Cetus), 2.5 đơn vị Taq pol, 0.2 mM mỗi deoxynucleoside triphosphate, và 75 pmol mỗi primer. Phản ứng được thực hiện theo chu kỳ nhiệt DNA Perkin Elmer. Phản ứng được thực hiện trong 30 chu kỳ khuếch đại với bước biến tính ở 94oC trong 1 phút, bắt cặp trong 30s ở nhiệt độ nóng chảy (Tm, bảng 2) của primer, và bước kéo dài 1 phút ở 72oC. Phân tích sản phẩm RAPD: 5µl mẫu từ thử nghiệm RAPD được phân tích bởi điện di trên gel với 1% (w/v) gel agarose. DNA được quan sát bằng cách nhuộm với ethidium bromide ( 0.5 µg/ml; Sigma) và gel được chiếu qua tia UV. Các sản phẩm khuếch đại được đưa lên màng gắn mẫu dò Z-probe (Bio- Rad) để lai phân tích. Đoạn đặc hiệu được khuếch đại bằng kỹ thuật RAPD, dài xấp xỉ 500bp, được tinh sạch từ gel agarose sử dụng bộ Geneclean kit (Bio 101). Đoạn khuếch đại (10 ng) được đánh dấu với Rediprine kit ( Amersham) sử dụng [α-32P] dCTP ( Amersham). Màng Z-probe có chứa sản phẩm RAPD từ các dòng mycobacteria khác nhau được lai với probe đã đánh dấu ( 1x106 cpm/ml) ở 42oC ủ qua đêm trong dung dịch chứa 50% ( v/v) formamide, 0.12 M Na2HPO4, pH 7.2, 0.25 M NaCl, và 7% (w/v) SDS. Sau khi lai, màng được rửa khoảng 15 phút trong 2x SSC ( SSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate)/ 0.1% SDS ở 42oC; 30 phút trong 1x SSC/0.1%SDS ở 65oC, và được để dưới tia X-Omat Kodak ở -70oC qua đêm. Đối với phương pháp lai Southern, 5 µg DNA của M. tuberculosis, M.bovis và M. avium được phân cắt hoàn toàn nhờ EcoRI. Quá trình lai được thực hiện như đã mô tả ở trên. Tạo dòng và giải trình tự đoạn chuyên biệt. Đoạn DNA đã tinh sạch được dòng hóa vào plasmid pCR 1000 ( Invitrogene) và giải trình tự nucleotide của clone pLD1 được thực hiện bằng cách sử dụng T7 và M13 theo hướng primer với Sequenase kit từ USB ( Sanger et al., 1977). 20    Khuếch đại bằng PCR. Dựa trên tỷ lệ trình tự nucleotide của đoạn 500bp đặc hiệu, 1 cặp mồi được thiết kế cho việc sử dụng PCR đặc hiệu ( bảng 2). Điều kiện phản ứng được thực hiện tối đa trong 30 chu kỳ, với chu kỳ nhiệt như sau: bước biến tính ở 94oC trong vòng 1 phút, bước bắt cặp ở 68oC trong 1 phút, bước tổng hợp ở 72oC trong 1 phút.