Tài liệu Tách dòng và xác định trình tự lycopene cyclase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN ------------------- BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP BỘ TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GENE LYCOPENE BETA CYCLASE MÃ SỐ: B2009 – TN03 – 21 Chủ nhiệm đề tài: ThS. Dương Văn Cường THÁI NGUYÊN - 2011 1 Phần I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên được tổng hợp chủ yếu trong thực vật, tảo, vi khuẩn và nấm (Schmidt-Dannert et al., 2000). Carotenoid có vai trò trong hình thành màu sắc, che chắn ánh sáng và hình thành các hormone (Vershinin, 1999). Trong công nghiệp carotenoid được dùng làm dược phẩm, thực phẩm dinh dưỡng, chất phụ gia thức ăn cho động vật, phẩm màu làm mỹ phẩm và thực phẩm (Lee and Schmidt-Dannert, 2002). Do khả năng chống oxi hóa, carotenoid mang lại lợi ích cho sức khỏe con người, bảo vệ da dưới tác động của ánh nắng mặt trời, tăng cường chức năng hệ miễn dịch, ngăn ngừa hay làm chậm quá trình phát bệnh của các bệnh mãn tính, có tác dụng trong điều trị và phòng ngừa một số bệnh ung thư (Giovannucci, 1999; Lee and Schmidt-Dannert, 2002; Lenore Arab and Steck, 2000; Lu et al., 2001). ß-carotene, với vai trò là tiền chất vitamin A, tăng cường hệ miễn dịch và chống một số bệnh ung thư (Bendich, 2004) đã trở thành một trong những chất được quan tâm nhất trong nhóm carotenoid. Cơ thể con người không tự tổng hợp được ß-carotene mà phải hấp thụ từ thức ăn (Fujisawa et al., 2008) Carotenoids được xây dựng từ đơn phân isopentenyl diphosphate (IPP) và dimethylallyl diphosphate (DMAPP). Hiện nay đã có hơn 20 gene crt chịu trách nhiệm tổng hợp nên carotenoids được tách dòng từ các loại sinh vật như vi khuẩn, vi khuẩn lam, nấm, tảo cho đến thực vật bậc cao (Joseph Hirschberg, 1997 ). Một trong những vi khuẩn có thể cung cấp các gene carotenoid để tổng hợp carotenoid là vi khuẩn Pantoea ananatis (trước đây gọi là Erwinia uredevora) (Misawa et al., 1990). ß-carotene được tổng hợp từ lycopene nhờ enzyme lycopene cyclase được mã hóa bởi gene crtY. Hiện nay, mới chỉ có một số carotenoid bao gồm β-carotene, lycopene, astaxanthin, canthaxanthin, capsanthin, lutein, Annatto, β-Apo-8-carotenal, và β-Apo-8-carotenal-ester có thể được sản xuất thương mại bằng tổng hợp hóa 2 học, lên men hoặc tách chiết với số lượng nhỏ từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên (Johnson and Schroeder, 1996) . Ngày nay, khi mà các phương pháp tổng hợp carotenoid bằng thực vật hay hóa học đều có những nhược điểm nhất định thì phương pháp dùng vi sinh vật để tổng hợp carotenoid thân thiện với môi trường hơn và có khả năng đáp ứng ngày càng tăng nhu cầu về carotenoid. Xuất phát từ những thực tế trên tôi thực hiện đề tài : “Tách dòng và xác định trình tự gene crtY mã hóa cho enzyme Lycopene cyclase từ vi khuẩn Pantoea ananatis”. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tạo ß-carotene tái tổ hợp và các hợp chất khác trong nhóm carotenoids. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu - Tách dòng và xác định trình tự gene crtY từ vi khuẩn Pantoea ananatis 1.3. Yêu cầu của đề tài - Thực hiện được quy trình phân lập và tách dòng gene crtY từ vi khuẩn Pantoea ananatis. 3 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cơ sở khoa học 2.1.1 Tổng quan về Carotenoids và ß-carotene 2.1.1.1. Carotenoid Carotenoid : Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên được tổng hợp chủ yếu trong thực vật, tảo, vi khuẩn và nấm (Schmidt-Dannert et al., 2000). Carotenoid có màu từ màu vàng, màu cam tới đỏ (Devitt et al., 2010), được Wackenroder phát hiện vào năm 1831 khi ông phân lập hợp chất từ cà rốt. Năm 1837 Berzelius chiết xuất thành công hợp chất màu vàng từ lá mùa thu, đặt tên là xantophyl. Năm 1911, một nhà khoa học phát hiện sự liên quan của hai hợp chất này và đặt tên chung là “carotenoid” (Britton et al., 1996). Năm 1948 Kauren phát hiện ra cấu trúc hóa học của carotenoid. Năm 1950 Kauren lần đầu tiên tổng hợp nhân tạo β-carotene và licopen trong phòng thí nghiệm. Kể từ đó carotenoid trở thành đối tượng quan tâm của những nghiên cứu liên ngành trong hóa học, sinh học, y học, vật lí học và nhiều ngành khoa học khác (Britton et al., 1996). a. Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa của carotenoid Cấu trúc hóa học : Cơ sở cấu trúc hóa học của các carotenoid là cấu trúc polyizopren gồm 40 nguyên tử cacbon, mỗi carotenoid chứa 8 phân tử izopren (hình 1). Hình 2. 1: Phân tử izopren Mạch polyisopren ở nhiều sắc tố tận cùng bằng vòng ionon, một số khác ở dạng mạch hở. Bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân, các nhà khoa học đã xác định được vị trí nhóm -CH3 và - CH2 – trong phân tử. Nhóm 4 -CH3 có quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân khác biệt với nhóm - CH2 – được quyết định bởi sprin và prin của các proton trong hệ thông liên kết đôi đơn xen kẽ. Phương pháp này đã cho phép xác định được cấu trúc của các nhóm tận cùng ở các Carotenoid. Phần trung tâm phân tử carotenoid gồm 18 nguyên tử cacbon hình thành một hệ thống các liên kết đôi xen kẽ liên kết đơn, trên đó có gắn thêm 4 nhóm CH3. Vòng ở 2 đầu có thể giống hoặc khác nhau như ở lycopen, phần trung tâm nối liền nối liền với 2 vòng theo kiểu 1-1, ở γ-caroten là 1-2, ở βcaroten là 2-2, … Tính chất lý hóa : Tính chất lí hóa của carotenoid được quyết định bởi đặc tính cấu trúc. Các carotenoid có một lượng lớn các gốc kị nước, quyết định tính kị nước của hợp chất này. Carotenoid không tan trong nước, tan trong lipit và các dung môi hữu cơ, tính ưa lipit giảm dần khi tăng dần số nguyên tử oxi. Carotenoid được tách chiết bằng các dung môi hữu cơ không phân cực (benzen, ete dầu hỏa…) hay phân cực (ete etylic, rượu, axeton…). Sự hình thành màu sắc của carotenoid được quy định bởi hệ thống các liên kết đơn, đôi xen kẽ trong các mạch phân nhánh, phần lớn là những hidratcacbon được tạo nên từ 40 nguyên tử cacbon liên kết với Hidro hình thành mạch phân nhánh dài. Màu sắc của carotenoid còn phụ thuộc vào cấu trúc, trạng thái hòa tan trong các dung môi, dạng tinh thể hay phức hợp, tồn tại ở dạng đồng phân cis hay trans (Britton et al., 1996). b. Phân loại carotenoid Hiện nay đã tìm thấy hơn 600 loại carotenoid khác nhau, được sắp xếp theo hai nhóm : carotene và xanthophylls (Britton et al., 1996). Caroten (C40H56) : Là một loại hidratcacbon chưa bão hòa, không tan trong nước, chỉ tan trong lipit và các dung môi hữu cơ. Caroten khi để ngoài không khí hấp thụ oxi (đến 40% so với trọng lượng), trở thành dạng oxi hóa. Caroten nguyên chất là các tinh thể có màu đỏ sáng và có ánh kim, dung dịch caroten có màu đỏ cam. Phần trung tâm phân tử gồm 18 nguyên tử cacbon hình thành một hệ thống các liên kết đơn, đôi xen kẽ, có 4 nhóm CH3 mạch nhánh. 5 Các loại caroten quan trọng như α-carotene, β-carotene, γ-carotene và lycopen. Xantophyl : Xantophyl là nhóm sắc tố màu vàng sẫm, có công thức chung là C40H56On (n từ 1-6). Xantophyl là dẫn xuất của caroten, chứa oxi trong các nhóm hydroxyl, ceto, cacboxyl…. Các Xantophyl quan trọng như Lutein, Zeaxantin. Oxi trong các nhóm % ở thực vật 40 2 34 19 4 Ở thanh tảo Ở tảo nâu Spiriloxantin 2 nhóm -OH 2 -OH 2 -OH, 2 O< (epoxi) 3 -OH, 1 O< 1 -OH 1 O= (xeto) 2 -OH, 1 O<, 1 O=, 1 nhóm axeton 2 -O-CH3 Astaxantin Astaxin 2 -OH, 2 O= 4 O= Xantophyl Lutein Zeaxantin Violaxantin Neoxantin Kryptoxanti Ekinenon Fucoxantin Ở tảo và vi khuẩn Bảng 2. 1: Những xantophyl thường gặp ở thực vật bậc cao và tảo c. Sinh tổng hợp carotenoid Carotenoid đều là hợp chất có mạch 40 cacbon, gồm 8 đơnvị giống nhau, mỗi đơn vị gồm 5 cacbon phân nhánh (izopren). Các carotenoid được tạo ra từ tiền chất isopentenyl diphosphate (IPP) và đồng phân của nó dimethylallyl diphosphate (DMAPP) (Das et al., 2007). Hiện nay đã tìm ra 2 con đường sinh tổng hợp IPP và DMAPP là mevalonate và non-mevalonate (Hình 2.2) 6 Hình 2. 2 : Con đường sinh tổng hợp IPP và DMAPP A : Con đường Non-Mevalonate B : Con đường Mevalonate Sinh tổng hợp các carotenoid trong sinh vật có nhiều con đường khác nhau. Carotenoid này có thể chuyển hóa thành carotenoid khác và ngược lại. Quá trình chuyển hóa giữa các carotenoid được quy định bởi các gene mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình chuyển hóa (hình 2.3). 7 Hình 2. 3: Con đường sinh tổng hợp các carotenoid trong sinh vật A: con đường sinh tổng hợp của C30 B: con đường sinh tổng hợp của C40 C: con đường sinh tổng hợp của C50 d. Vai trò của carotenoid Carotenoid có vai trò trong hình thành màu sắc, che chắn ánh sáng và hình thành các hormone (Vershinin, 1999). Trong công nghiệp carotenoid được dùng làm dược phẩm, thực phẩm dinh dưỡng, chất phụ gia thức ăn cho động vật, phẩm màu làm mỹ phẩm và thực phẩm (Lee and Schmidt-Dannert, 2002). Ở thực vật, carotenoids đóng một vai trò trong trung tâm phản ứng quang hợp. Carotenoids tham gia vào quá trình chuyển giao năng lượng, bảo vệ trung tâm phản ứng. Ngoài ra carotenoids còn có ý nghĩa đối với chức 8 năng sinh sản, là thành phần của giao tử đực và giao tử cái. Ở thực vật bậc cao, carotenoid quyết định màu vàng của phấn hoa (Thủy, 2005). Cơ thể con người không tự tổng hợp được carotenoids mà phải hấp thụ từ thức ăn (Fujisawa et al., 2008). Hiện nay, phát hiện khoảng 50 loại carotenoid trong thực phẩm mà con người sử dụng hằng ngày trong đó 15 loại carotenoid được tìm thấy trong máu và chúng đang được chứng minh có vai trò khác nhau đối với sức khỏe và đời sống con người. Do khả năng chống oxi hóa, carotenoids mang lại lợi ích cho sức khỏe con người, bảo vệ da dưới tác động của ánh nắng mặt trời, tăng cường chức năng hệ miễn dịch, ngăn ngừa hay làm chậm quá trình phát bệnh của các bệnh mãn tính có tác dụng trong điều trị và phòng ngừa một số bệnh ung thư (Giovannucci, 1999; Lee and Schmidt-Dannert, 2002; Lenore Arab and Steck, 2000; Lu et al., 2001). 2.1.1.2. ß-carotene a. Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa Công thức cấu tạo : ß-carotene có công thức cấu tạo là C40H56 (hình 2.4). Hình 2. 4 : Công thức cấu tạo của ß-carotene Tính chất lý hóa : ß-carotene có màu vàng cam, thường thấy trong các phần xanh của thực vật và các loại rau quả có màu da cam như cà rốt, bí ngô, đào, khoai lang đỏ, … (Thủy, 2005). ß-carotene rất nhạy cảm với oxy trong không khí và ánh sáng. ßcarotene tan trong lipid và các chất hoà tan lipid, không tan trong nước (Thủy, 2005). 9 b. Vai trò của ß-carotene ß-carotene, với vai trò là tiền chất vitamin A, tăng cường hệ miễn dịch và chống một số bệnh ung thư như : ung thư tiền liệt tuyến, ung thư dạ dày, ung thư đại tràng, ung thư da, ... (Bendich, 2004) đã trở thành một trong những chất được quan tâm nhất trong nhóm carotenoid. Cơ thể con người không tự tổng hợp được ß-carotene mà phải hấp thụ từ thức ăn (Fujisawa et al., 2008). Cơ thể con người có thể chuyển ß-carotene thành vitamin A. Quá trình chuyển hoá các ß-carotene thành vitamin A trong cơ thể (hình 2.5) xảy ra chủ yếu ở thành ruột non và là một quá trình phức tạp. Carotene không chuyển thành vitamin A hoàn toàn mà chỉ khoảng 70 – 80% (Thủy, 2005). Hình 2. 5 : Quá trình chuyển hoá β-carotene thành vitamin A c. Sinh tổng hợp Trong con đường sinh tổng hợp carotenoid, ß-carotene được tổng hợp từ lycopene nhờ enzyme lycopene cyclase được mã hóa bởi gene crtY (hình 2.6). 10 Hình 2. 6 Con đường sinh tổng hợp carotenoid 2.1.2. Vi khuẩn Pantoea ananatis và gene crtY Hiện nay, đã có hơn 20 gene crt chịu trách nhiệm tổng hợp nên carotenoids được tách dòng từ các loại sinh vật như vi khuẩn, vi khuẩn lam, nấm, tảo cho đến thực vật bậc cao (Joseph Hirschberg, 1997 ). Một trong những vi khuẩn có thể cung cấp các gene carotenoid để tổng hợp carotenoid là vi khuẩn Pantoea ananatis (trước đây gọi là Erwinia uredevora) (Misawa et al., 1990). Pantoea ananatis là vi khuẩn gam âm thuộc chi Pantoea, họ Laspeyresiini, bộ Enterobacteriaceae, phân lớp Eubacteriales, lớp Schizomycetes, ngành Proteobacteria. Đây là loài vi khuẩn gây bệnh trên một số loại cây lương thực và lâm nghiệp như dứa, ngô, gạo, hành tây, dưa hấu, và bạch đàn, …. (De Maayer et al., 2010). Tuy nhiên hệ gene của Pantoea 11 ananatis có các gene crt mã hóa các enzyme tham gia quá trình sinh tổng hợp các carotenoid. Một số nghiên cứu đã chỉ ra có thể tách dòng thành công các gene crtE, crtX, crtY, crtI, crtB, crtZ từ Pantoea ananatis và biểu hiện chúng trong E.coli sản xuất các hợp chất khác nhau trong nhóm carotenoid (De Maayer et al., 2010; Misawa et al., 1990). Gene crtY mã hóa cho enzyme lycopene cyclase tham gia chuyển hóa lycopene thành ß-carotene (hình 1.1) có chiều dài 1161bp với một bộ ba mã mở đầu ATG và bộ ba mã kết thúc ATT đã được xác định trình tự nucleoid và công bố trên ngân hàng gene NCBI với mã số D90087.2. 2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới 2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên được tổng hợp chủ yếu trong thực vật, tảo, vi khuẩn và nấm (Schmidt-Dannert et al., 2000). Hiện nay đã phát hiện hơn 600 loại carotenoid, chúng đang được nghiên cứu. Nghiên cứu của Yu và CS về sự tích lũy của carotenoid trong thực vật bậc cao cho thấy sự tích lũy carotenoid được quy định bởi môi trường, loại mô và giai đoạn phát triển của cây (Yu et al., 2008). Carotenoid được tích lũy ở hoa, quả, hạt hoặc rễ và tạo ra các màu sắc khác nhau, từ màu vàng, màu cam và đỏ (Devitt et al., 2010). Các sắc tố carotenoid trong trái cây là dấu hiệu của quá trình chín (Blas et al., 2010). Carotenoid có ảnh hưởng đến thành phần dinh dưỡng, chất lượng trái cây, thời gian sử dụng, và sở thích của người tiêu dùng (Blas et al., 2010). Carotenoid có vai trò trong hình thành màu sắc, che chắn ánh sáng và hình thành các hormone (Vershinin, 1999), carotenoid cũng có vai trò cấu trúc trong các khu phức hợp quang hợp ở thực vật (La Rocca et al., 2007). Các con đường sinh tổng hợp carotenoid đã được nghiên cứu trong nhiều sinh vật bao gồm cả sinh vật có gene carotenoid và sinh vật không có gene caorotenoid (Devitt et al., 2010). Kỹ thật di truyền, phân tử đã được ứng dụng để làm thay đổi khả năng tích lũy carotenoids trong sinh vật. Bằng cách sử dụng can thiệp RNA, nghiên cứu của Yu, B. và CS đã làm thay đổi khả năng tích lũy carotenoid trong hạt 12 giống của cây Brassica napus. (Yu et al., 2008), nghiên cứu làm tăng lượng carotenoid trong hạt ngô (Harjes et al., 2008), đu đủ Carica (Blas et al., 2010). Sử dụng hệ thống vector biểu hiện có chứa các gene crtI, crtY, crtW và crtZ để sản xuất astaxanthin trong vi khuẩn quang hợp sulfidophilum Rhodovulum (Mukoyama et al., 2006) …. Các con đường sinh tổng hợp chính của carotenoids đã được làm sáng tỏ ở cấp độ phân tử (Armstrong et al., 1990; Linden et al., 1994). Hơn 27 gene mã hóa cho enzyme tổng hợp lên 150 carotenoid khác nhau đã được nhân bản từ vi khuẩn, thực vật, tảo và nấm (Sandmann, 1994) Carotenoid như lycopene, β-carotene và zeaxanthin đã được tổng hợp trong vật chủ không có gene carotenoid bằng cách đưa các gene sinh tổng hợp carotenoids vào Escherichia coli (Albrecht et al., 1997). β-carotene một trong những chất được quan tâm nhất trong nhóm carotenoid. Các nghiên cứu về β-carotene cho thấy vai trò của β-carotene trong chế độ dinh dưỡng. β-carotene là tiền chất vitamin A, đây là chất chống oxi hóa, có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch và chống một số bệnh ung thư (Bendich, 1989). Một nghiên cứu khác cho thấy Chế độ ăn uống thiếu vitamin A gây ra các bệnh về mắt ở 40 triệu trẻ em mỗi năm và có khoảng 140-250 triệu trẻ có nguy cơ bị rối loạn sức khỏe, tình trạng này đáng báo động ở các quốc gia châu Phi cận Sahara (Harjes et al., 2008). Sự thiếu hụt vitamin A làm chậm quá trình phát triển, gây thiếu máu, giảm khả năng đề kháng với nhiễm trùng, suy giảm sự biệt hóa tế bào xerophthalmia, có thể gây mù lòa và tử vong (Ribaya-Mercado et al., 2007). ß-carotene được tổng hợp từ lycopene nhờ enzyme lycopene cyclase được mã hóa bởi gene crtY. Trên thế giới, gene crtY đã được tách dòng thành công từ vi khuẩn Pantoea ananatis (trước đây là Erwinia uredovora) (Misawa et al., 1990). Các nghiên cứu về gene crtY cho thấy quá trình dịch mã tạo sản phẩm protein tương ứng trong Escherichia coli bắt đầu tại codon mã mở đầu ATG. Tuy nhiên nghiên cứu của Kim, S. W. và CS chứng minh enzyme này cũng có thể được sản xuất trong E.coli mà không có sự hiện diện codon mã mở đầu ATG. Kết quả nghiên cứu cho thấy đột biến điểm trình tự GTG(Val) 13 nằm phía sau trình tự ATG 24 bp có thể hoạt động như một codon mã mở đầu tiềm năng (Kim et al., 2008). Một nghiên cứu khác chỉ ra enzyme lycopene cyclase xúc tác cho phản ứng khử oxy hóa không phụ thuộc vào FADred (Yu et al., 2010). 2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Ở nước ta, carotenoids cũng đã được nghiên cứu, chủ yếu là các nghiên cứu tách chiết các hợp chất carotenoid từ tự nhiên như : nghiên cứu tách chiết các hợp chất carotenoid từ gấc Momordica cochinchinensis (Tran Thi Huyen Nga, 2006), mướp đắng Momordica charantia (Lưu Vân Quỳnh, 2006), từ lá của một số cây họ bầu bí Cucurbitaceae (Nguyễn Thu Huyền, 2007), cúc vạn thọ Tagetes erecta L.(Hà Thị Tâm Tiến, 2006 ),… Nghiên cứu điều tra các hợp chất carotenoid trong thực vật (Hà Thị Bích Ngọc, 2007), trong một số loài rau (Nguyễn Thị Phương Thảo, 2007) Nghiên cứu thử hoạt tính một số carotenoid (Nguyễn Văn Phòng, 2008), nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học của carotenoid như lutein (Hà Thị Tâm Tiến, 2006 ), lycopen (Nguyễn Thị Hải Thanh, 2006), … Nghiên cứu ảnh hưởng của lutein lên sự sinh trưởng của vi sinh vật bị chiếu UV tia tử ngoại (Phùng Xuân Lê, 2008). Nghiên cứu tác động sinh học của carotenoids và chất flavonoid từ lá của một số loài Camellia vàng (Do Xuan Hoan, 2007), … Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về tách dòng và xác định trình tự các gene mã hóa cho enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp các carotenoid cũng như các nghiên cứu về tổng hợp carotenoid từ vi sinh vật. 14 Phần III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và phạm vi nghiên cứu 3.1.1. Vật liệu nghiên cứu - Vi khuẩn Pantoea ananatis được cung cấp từ hãng DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Zellkulturen GmbH) và được sử dụng làm nguyên liệu DNA khuếch đại gene crtY - Chủng vi khuẩn E.coli DH5α được cung cấp từ phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, viện Công nghệ sinh học. Vi khuẩn E.coli DH5α được sử dụng để làm vật chủ cho quá trình tách dòng gene crtY. 3.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu Thiết bị - Bộ điện di DNA Scie-plas - Tủ cấy vô trùng RuifierTMClean Bench - Cân phân tích GM 612 - Máy lắc IKA®KS130 - Máy khuấy từ HI 310 Autospeed - Máy vortex Genius 3 - Pipetman, đầu côn, ống eppendorf - Lò vi sóng Wave Dom - Tủ lạnh thường, tủ lạnh sâu, tủ ấm Hóa chất • Hóa chất dùng cho PCR : - Dung dịch đệm 10xPCR có chứa 20mM MgCl2, - dNTP (1mM) • Hóa chất điện di - Agarose - Dung dịch TE 1X • Hóa chất tách plasmid - Bể ổn nhiệt Multi temp III - Máy ly tâm thường Mikro22Hettich.2entrifugen - Máy PCR AB - Tủ nuôi 370C OF-22 - Máy xác định trình tự DNA tự động 3130 Genetic Analyzer - Máy chụp ảnh gel CLS-Microdoc - Máy soi gel Carestrealth IN - Mồi (10 pm/µl) - Taq-polymerase (5U/µl) - H2O - Đệm tra mẫu DNA - Ethidium bromide 15 Sol I : Glucose : 50 mM Tris-HCl (pH=8) : 25 mM EDTA (pH=8) : 10 mM Sol II : NaOH : 0,2 N SDS : 1% Sol III : CH3COOK (potassium acetal) 5M : 60 ml/100ml CH3COOH : 11,5 ml/100ml H2O : 28,5 ml/100ml TE Tris-HCl (pH=8) : 10 mM EDTA (pH=8) : 1mM • Một số hóa chất sử dụng trong tách dòng gene - Cặp mồi khuếch đại gene crtY. Chúng tôi sử dụng một cặp mồi để nhân đoạn gene crtY. Trình tự mồi được thiết kế dựa trên trình tự gene công bố trên ngân hàng gene NCBI với mã số D90087.2 . Cặp mồi được đặt làm từ hãng Invitrogen. Trình tự và thông tin về cặp mồi được thể hiện qua bảng 3.1 Bảng 3. 1 : Trình tự và thông tin về cặp mồi CrtY Tên mồi Trình tự mồi crtY-F 5’TGAATTCAGGAGGTGTCTTAAATGGGAGCGGCTAT3’ crtY-R 5’GCAAGCTT TTAACGATGAGTCGTCATAATGG3’ - Vector tách dòng pLUG® TA-cloning (Intronbiotechnology) Vector tách dòng pLUG® TA-cloning là một trong những vector được sử dụng phổ biến trong tách dòng gene hiện nay. Vector pLUG® TA-cloning có kích thước 2982bp, cấu trúc của vector được thiết kế gồm một gene kháng kháng sinh Amp và một gene LacZα có chứa vị trí đa tách dòng giúp cho quá trình chọn lọc. 16 Trên vùng gene LacZα có chứa vị trí đa tách dòng, chứa vị trí cắt của 11enzyme giới hạn: SacI, NotI, XbalI, BamHI, SamI, PstI, EcoRI, HindIII, HindIII, SacI, KpnI. Những vị trí cắt của enzyme giới hạn này cho phép sử dụng loại enzyme thích hợp trong các nghiên cứu tách dòng gene sử dụng vector pLUG® TA-cloning. Gene LacZα bị bất hoạt bởi sự gắn xen thành công đoạn DNA ngoại lai, không sinh ra enzyme phân hủy X-Gal, IPTG, khuẩn lạc có màu trắng. Những vector pLUG® TA-cloning tự đóng vòng sẽ biểu hiện gene LacZα, sinh ra enzyme phân hủy X-Gal, IPTG, khuẩn lạc có màu xanh. Hình 3. 1: Cấu trúc vector tách dòng pLUG® TA-cloning 17 - Enzym cắt sử dụng trong thí nghiệm được cung cấp từ hãng Fermentas. - Enzym nối T4 DNA ligase được cung cấp từ hãng Intronbio 3.1.3. Phạm vi nghiên cứu - Phân lập gene crtY từ vi khuẩn Pantoea ananatis trong điều kiện nhân tạo. - Xác định trình tự gene crtY đã phân lập và so sánh trình tự gene này với các trình tự gene đã công bố trên ngân hành gene quốc tế. 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm : Phòng Sinh học phân tử và Kỹ thuật di truyền - viện Khoa hoc sự sống - Đại học Thái Nguyên - Tổ 10 - Xã Quyết Thắng - TP Thái Nguyên. Thời gian : Đề tài được thực hiện từ tháng 10 năm 2009 đến tháng 10 năm 2010 3.3. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1 : Tách dòng gene crtY. + Nhân dòng gene crtY sử dụng cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng PCR từ vi khuẩn Pantoea ananatis. + Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp thôi gel. + Gắn gene vào vector tách dòng pLUG® TA-cloning bằng enzyme T4 DNA ligase + Biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng E. coli DH5α khả biến. + Chọn lọc dòng mang gene crtY +Tách chiết DNA plasmid bằng kit “DNA-spinTM” của hãng Intron Biotechnology + Cắt kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn. Nội dung 2 : Xác định trình tự gene crtY và so sánh với trình tự đã công bố trên ngân hàng gene quốc tế. + Xác định trình tự gene bằng phương pháp giải trình tự tự động. + So sánh trình tự gene crtY với trình tự đã công bố trên ngân hàng gene quốc tế thông qua chương trình BLAST. 18 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Quy trình tách dòng gene crtY từ Pantoea ananatis Trình tự gene đã công bố PCR Mồi đặc hiệu nhân gene Pantoea ananatis (crtY ) Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp thôi gel Gắn gene vào vector tách dòng pLUG Biến nạp vào vi khuẩn Ecoli chủng DH5α Cấy trải trên môi trường chọn lọc Chọn lọc dòng mang gene cần chuyển Tách DNA plasmid Cắt kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạnHindIII Xác định trình tự gene bằng phương pháp giải trình tự tự động So sánh trình tự bằng phần mềm Blast Hình 3. 2: Quy trình tách dòng và xác định tự gene crtY 19 3.4.2. Phương pháp thiết kế mồi cho gene crtY Sử dụng phần mềm vector NTI của hãng Invitrogen để thiết kế mồi dựa trên trình tự gene crtY đã công bố trên ngân hàng gene NCBI với mã số D90087.2. Đoạn mồi được thiết kế có đặc điểm: có khả năng bắt cặp được với 2 đầu của gen crtY cần nhân, mồi xuôi và mồi ngược không có khả năng tự bắt cặp. Trong thiết kế mồi chúng tôi đưa vào 1 đầu của mỗi mồi một vị trí của enzyme cắt giới hạn là EcoRI hay HindIII. Mồi xuôi crtY-F : 5’TGAATTCAGGAGGTGTCTTAAATGGGAGCGGCTAT3’ được thiết kế gồm hai phần. Phần liên kết với DNA khuân được thiết kế dựa trên trình tự 14 nucleotide đầu tiên của gene crtY (phần tô nền vàng). Trong đó nucleotide G đầu tiên của gene crtY được thay thế bằng nucleotide A (màu đỏ) nhằm tạo ra một bộ ba mã khởi đầu ATG, kế tiếp là trình tự 8 nucleotide phía trước gene crtY (phần tô nền xanh), 8 trình tự này đảm bảo ribosome hoạt động tối ưu. Phần đầu treo được thiết kế trình tự 6 nucleotide AGGAGG là điểm bám của ribosome. Tiếp đến là Vị trí cắt của enzyme giới hạn EcoRI (trình tự nucleotide màu đỏ, gạch chân), nucleotide T được thiết kế ngoài cùng có tác dụng bảo vệ vị trí cắt enzyme giới hạn. Mồi ngược crtY-R : 5’GCAAGCTT TTAACGATGAGTCGTCATAATGG3’ cũng được thiết kế gồm 2 phần. Phần liên kết với DNA khuân được thiết kế dựa trên trình tự 23 nucleotide cuối cùng của gene crtY (tô nền xanh). Phần đầu treo thiết kế vị trí cắt giới hạn của HindIII (màu đỏ, gạch chân), ngoài cùng là vị trí 2 nucleotide được thiết kế ngẫu nhiên có tác dụng bảo vệ vị trí cắt của enzyme giới hạn. Độ dài, trình tự mồi xuôi và mồi ngược đã được tính toán sao cho nhiệt độ gắn mồi trong phản ứng PCR của 2 mồi gần tương đương nhau. Trình tự hai mồi sau thiết kế được đặt làm tại hãng Invitrogen. 3.4.3. Phương pháp nuôi phục hồi khuẩn Pantoea ananatis Khuẩn khi đặt mua từ hãng Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Zellkulturen GmbH (DSMZ) ở dạng đông khô cần nuôi phục hồi để đảm bảo