Tài liệu Bồi dưỡng học sinh giỏi môn sinh học thpt chuyên đề cadn tái tổ hợp (recombinant adn)

  • Số trang: 23 |
  • Loại file: DOC |
  • Lượt xem: 1374 |
  • Lượt tải: 0
dangvantuan

Tham gia: 02/08/2015

Mô tả:

CHUYÊN ĐỀ HỘI THẢO CÁC TRƯỜNG CHUYÊN VÙNG ĐỒNG BẰNG VÀ DUYÊN HẢI BẮC BỘ MỤC LỤC MỞ ĐẦU………………………………………………………………………….………………..1 NỘI DUNG BÁO CÁO……………………………….……………………………………………2 1. Các công cụ chính dùng trong kĩ thuật ADN tái tổ hợp…………………………….….2 1.1. Các enzym chủ yếu …..…………………………….………………………………………2 1.1.1. Enzym giới hạn. ……………………………….…………………………………………2 1.1.2. Enzym polymerase... ……………………………….……………………………………3 1.1.3. Enzym nối (ligase) ……………………………….………………………………………4 1.1.4. Nuclease……………………………….……………………………………………….….5 1.2. Các vector thông dụng……………………………….……………………………………5 2. Tạo dòng gen hay ADN tái tổ hợp……………………………….……………………..…10 2.1. Nguyên tắc chung…………………………………………………………………………10 2.2. Quy trình tạo dòng gen tái tổ hợp……………………………………...………………11 2.3. Tổng hợp và tạo dòng cADN……………………………………………………………14 3. Ứng dụng của công nghệ ADN tái tổ hợp……………………………………………….15 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP…………………………………………………………………….……16 0 MỞ ĐẦU Công nghệ ADN tái tổ hợp được ra đời dựa trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử và hiện nay đang đóng vai trò cách mạng đối với sự phát triển của công nghệ sinh học. Kỹ thuật ADN tái tổ hợp đã cho phép các nhà công nghệ sinh học phân lập và khuếch đại một gen đơn từ genome của một sinh vật để có thể tạo dòng gen, sản xuất gen, đồng thời nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác. Sự ra đời của nó đã đặt nền móng cho việc sửa chữa, trao đổi, cải tạo, tạo mới vật chất di truyền ở cấp độ phân tử từ đó có nhiều ứng dụng trong thực tiễn như: có thể tuyển chọn và dần tạo thêm được nhiều giống cây trồng, vật nuôi mới có năng suất, chất lượng cao, sức chống chịu tốt; đã và đang có thể chuẩn đoán, phòng ngừa hay cứu chữa các bệnh hiểm nghèo, bệnh di truyền như bệnh tiểu đường, khối u, ung thư, lùn bẩm sinh, thiếu máu; các bệnh nhiễm sắc thể thường và nhiễm sắc thể giới tính; viêm gan B, viêm não Nhật Bản, bại liệt, sốt rét, …; đã có thể tạo ra ngày một nhiều các chủng, loài vi sinh vật mới hoặc chỉ định các vi sinh vật này tạo ra các protein, enzim có hoạt tính cao hơn hay các sản phẩm khác mà vốn dĩ trước đây chúng ta không làm được… Vì khả năng ứng dụng cao, tính hiện đại, cập nhật của nó mà trong những năm gần đây, kiến thức ADN tái tổ hợp ngày càng được sử dụng một cách thường xuyên trong đề thi học sinh giỏi Quốc gia và Olimpic Quốc tế ở cả phần thi lí thuyết và thực hành. Trong nội dung báo cáo này, ngoài nội dung lí thuyết tôi còn muốn gửi tới các bạn đồng nghiệp một số câu hỏi, bài tập về ADN tái tổ hợp bao gồm cả những câu hỏi trong đề thi Olimpic Quốc tế những năm gần đây. 1 NỘI DUNG BÁO CÁO ADN tái tổ hợp (recombinant ADN) là phân tử ADN được tạo ra trong ống nghiệm bằng cách kết hợp các ADN từ các nguồn (loài) khác nhau, theo một quy trình kỹ thuật nhất định, gọi là kỹ thuật tái tổ hợp ADN. Thông thường một phân tử ADN tái tổ hợp bao gồm một phân tử ADN có bản chất là plasmid hoặc phage nguyên vẹn gọi là vector (thể tải) và một đoạn ADN từ nguồn khác mang một gen hoặc yếu tố điều hòa mong muốn được cho xen vào hay còn gọi là ADN ngoại lai. 1. Các công cụ chính dùng trong kĩ thuật ADN tái tổ hợp: 1.1. Các enzym chủ yếu: 1.1.1. Enzym giới hạn: Trong công nghệ di truyền muốn tạo ra ADN tái tổ hợp để đưa vào tế bào chủ cần phải có plasmid, công cụ cắt plasmid và đoạn ADN của tế bào rồi nối chúng lại với nhau. Công cụ cắt ADN là các enzym giới hạn. Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhận biết những đoạn trình tự ADN nhất định và cắt ADN ở ngay điểm này hay ở điểm kế cận. Tuỳ theo phương thức cắt và nguồn gốc của enzym giới hạn mà người ta phân loại và đặt tên cho các enzym giới hạn đó. Các enzym giới hạn được phân lập từ các sinh vật prokaryot, có khả năng phân hủy ADN của bacteriophage để hạn chế khả năng sinh trưởng của chúng trong tế bào vi khuẩn. Hiện nay, người ta đã tìm thấy hơn 900 enzym giới hạn khác nhau từ khoảng 250 chủng vi sinh vật. Enzym giới hạn có ba loại (type): I, II và III. Các enzym được dùng phổ biến hiện nay thuộc type II, có cơ chế tác động đơn giản nhất. Đây là các nuclease cắt ở một vị trí đặc hiệu nằm bên trong sợi ADN (chứ không phân hủy ADN từ hai đầu), nên được gọi là endonuclease. Tên gọi đầy đủ của chúng là Restriction Endonuclease type II, hay được gọi đơn giản là enzym giới hạn (RE). Cách đặt tên các enzym giới hạn kiểu II cũng như các enzym giới hạn khác dựa trên quy ước chung. Tên enzym giới hạn được ghép bởi chữ cái đẩu tiên là tên chi và hai chữ tiếp theo là hai chữ cái tên loài của vi sinh vật mà enzym được tách chiết. Còn chữ và số La mã tiếp theo là tên chủng và dòng của loài sinh vật cụ thể đã tách chiết enzym: Ví dụ: E.coRI (thuộc chi Escherichia, loài coli, chủng Ry 13) Một số loại khác như E.coRV, BamHI, HaeIII, Smal, …). 2 Giá trị của enzym giới hạn là ở tính đặc hiệu của chúng. Các enzym này cắt ADN ở các vị trí nhận biết riêng biệt bao gồm từ 4-6 cặp nucleotide có trình tự đối xứng đảo ngược nhau, các đoạn ngắn này gọi là palindrome (đoạn đối xứng, đoạn đích). Ví dụ: enzym EcoRI nhận biết chuỗi hexanucleotide (6 nucleotide). Nhìn chung, các enzym giới hạn khác nhau có hai kiểu cắt sau đây: cắt lệch và cắt thẳng. Với kiểu cắt lệch tức là các vị trí cắt trên hai sợi của ADN sợi kép là so le, tạo ra các đoạn ADN có các đầu sợi đơn gồm một số base bổ sung gọi là các đầu dính. Các enzym giới hạn đó có vai trò to lớn trong việc tạo ADN tái tổ hợp in vitro. Điển hình ở đây là EcoRI và BamHI (bảng 1). Với kiểu cắt thẳng, tức cắt cùng vị trí trên cả hai sợi của ADN sợi kép, do đó tạo ra các đoạn ADN có các đầu bằng; ví dụ, SmaI...(bảng 1). Các enzym giới hạn khác nhau có đoạn đích giống nhau, mặc dù vị trí và kiểu cắt có thể giống hoặc khác nhau, gọi là các enzym giới hạn tương ứng (isoschizomers); ví dụ, SmaI và XmaI (bảng 1). Bảng 1. Các trình tự nhận biết và vị trí cắt của các enzym giới hạn được chọn lọc (mũi tên chỉ vị trí cắt; các trình tự ở đây được chỉ ra trên sợi 5'→3'). Nguồn vi sinh vật Tên enzym Trình tự nhận biết Arthrobacter luteus Bacillus myloliquefaciens H Escherichia coli RY13 Haemophilus influenzae Rd Haemophilus influenzae Rd Nocardia otitidis-caviarum Providencia stuartii Serratia marcescens Sb Xanthomonas malvaccarum AluI BamHI EcoRI HindII HindIII NotI PstI SmaI XmaI AG↓CT G↓GATCC G↓AATTC GTPy↓PuAC A↓AGCTT GC↓GGCCGC CTGCA↓G CCC↓GGG C↓CCGGG Với bốn loại nitrogen base trong phân tử ADN và giả thiết rằng trình tự sắp xếp của chúng là ngẫu nhiên, thì tần số mong đợi (kỳ vọng) của bất kỳ đoạn trình tự xác định nào, theo tính toán sẽ là 4n, n ở đây là chiều dài của đoạn nhận biết (cặp base). Từ đó, có thể thấy rằng với các đoạn có bốn nucleotide thì cứ cách 256 cặp base chúng lặp lại một lần, các đoạn sáu nucleotide thì cách 4096 cặp base mới lặp lại. Tất nhiên, các giá trị này có thể dao động rất lớn, nhưng nói chung chiều dài của các đoạn sinh ra sau khi cắt bằng enzym giới hạn đều gần với các giá trị tính toán. Chẳng hạn, một enzym nhận biết đoạn trình tự bốn nucleotide sẽ sản sinh ra các đoạn ngắn hơn so với enzym nhận biết đoạn với sáu nucleotide. 1.1.2. Enzym polymerase: ADN polymerase được dùng để tổng hợp ADN trong cơ thể hoặc trong điều kiện in vitro. Khi nói về một enzym polymerase nào đó, người ta thường dùng thuật ngữ “ phụ thuộc ADN ” 3 hoặc “ phụ thuộc ARN ” để chỉ axit nucleic mà enzym này xúc tác cho việc sao chép. ADN polymerase phụ thuộc ADN thì sao chép ADN sang ADN; ADN polymerase phụ thuộc ARN thì sao chép ARN sang ADN, còn enzym ARN polymerase phụ thuộc ADN thì phiên mã ADN sang ARN. Các enzym này tổng hợp axit nucleic bằng cách nối các nucleotide với nhau theo nguyên tắc bổ sung dựa theo mạch khuôn. Quá trình tổng hợp mạch mới bổ sung diễn ra theo chiều 5’-3’ và sự khởi đầu cần có đầu 3’-OH tự do. Các ADN polymerase: (ADN polymerase I, đoạn Klenow của ADN polymerase I của E. coli, T4 ADN polymerase, Taq ADN polymerase …) Hiện nay còn có nhiều loại ADN polymerase khác lưu hành trên thị trường như T7 ADN polymerase, Vent ADN polymerase … Các enzym ARN polymerase: Có ba loại enzym ARN polymerase thường được dùng trong thực tế, đó là SP6 ARN polymerase, T3 ARN polymerase và T7 ARN polymerase … Enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase): Có khả năng tổng hợp ADN một mạch gọi là ADN bổ trợ (cADN) từ khuôn mARN, hoặc từ một đoạn polynucleotit được tổng hợp bằng con đường hóa học. Nhờ có con đường phiên mã ngược này mà có thể tổng hợp được hầu hết các gen riêng biệt nào đó nếu như có mặt mARN của gen đó. Các cADN mạch đơn có thể biến thành mạch kép nhờ ADN polymerase và được gọi là cADN mạch kép (c-DNA duplex). Đoạn cADN mạch kép có thể gắn vào plasmid rồi biến nạp vào vi khuẩn, từ đó tạo dòng c-ADN. Nếu cADN có nguồn gốc từ một gen thì ta tạo được dòng gen. Trong trường hợp mARN trưởng thành khi đã ở ngoài nhân thì ta sẽ thu được dòng gen chỉ chứa những đoạn mã hóa (exon). Không có đoạn không mã hóa (intron). 1.1.3. Enzym nối (ligase): Enzym ligase là enzym nối quan trọng trong tế bào. Các enzym này xúc tác hình thành các liên kết phosphodiester để nối các đoạn axit nucleic với nhau. ADN ligase xúc tác nối hai đoạn ADN với nhau, ARN ligase là enzym chủ yếu được sử dụng rộng rãi. Có 3 loại enzym nối thường dùng trong Công nghệ di truyền. Đó là enzym E.coli ADN ligase được tách chiết từ vi khuẩn E.coli, xúc tác phản ứng nối hai đoạn trình tự ADN có đầu sole; enzym T 4 ADN ligase được tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm vào E.coli, có chức năng giống như E.coli ADN ligase nhưng lại có khả năng nối hai đoạn trình tự ADN có đầu bằng; enzym T 4 ARN ligase tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm E.coli, có khả năng nối hai trình tự ARN bằng các liên kết phosphodiester. Trong đó enzym T4 ADN polymerase là enzym được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm. Enzym này là một chuỗi polypeptide (M = 68.000 Da) xúc tác cho sự tạo thành liên kết phosphodiester giữa đầu 3’- OH tự do của một phân tử ADN này với đầu cuối 5’- PO4 của một phân tử ADN khác. ADN ligase có tác dụng cho cả trường hợp đầu so le lẫn 4 đầu bằng, tuy nhiên đối với đầu bằng enzym đòi hỏi nồng độ cao hơn và điều kiện phản ứng cũng khác.. Ngoài các loại enzym nối kể trên, hiện nay người ta còn sử dụng các đoạn nối (đầu dính adapter) cho các enzym cắt đầu bằng. Adapter xúc tác nối các đoạn ADN do có các enzym giới hạn cắt đầu bằng từ đó tạo nên đầu so le. Mỗi đoạn enzym cắt đầu bằng đều có các loại adapter đặc trưng riêng. 1.1.4. Nuclease: Là nhóm các enzym xúc tác thủy phân liên kết phosphodiester trong phân tử ADN hoặc ARN, bao gồm các endonuclease (cắt bên trong phân tử axit nucleic) và exonuclease (cắt bên ngoài phân tử axit nucleic). Các RE cũng là các endonuclease, nhưng chúng có tính đặc hiệu rất cao cho từng trình tự 4 hoặc 6 nucleotide. Dưới đây là các nuclease chính thường được sử dụng: Enzym ADNase I (endonuclease) tách chiết từ tụy của bò, xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết ngay sau một bazo nito ở cả mạch đơn và mạch kép hoàn toàn ngẫu nhiên. Enzym S1 nuclease (endonuclease) là enzym tách chiết từ nấm mốc Aspegillus oryzae. S1 nuclease BAL 3 (endonuclease) phân cắt cả 2 đầu 5’ và 3’ của ADN và không có khả năng cắt nội liên kết. Enzym exonuclease III được tách chiết từ E. coli, là một 3’ exonuclease cắt đầu 3’ của mạch đơn và tạo thành các đoạn ADN có đầu 5’ nhô ra. Enzym ARNase tách chiết từ tụy bò. Enzym này thường được sử dụng để loại bỏ ARN trong hỗn hợp ADN và ARN. Enzym ARNase H dùng để loại bỏ ARN trong các phân tử lai ADN-ARN, nhất là sau phản ứng phiên mã ngược để hình thành mạch thứ hai của cADN, từ đó tạo nên phân tử cADN kép. 1.2. Các vector thông dụng: Muốn chuyển được gen mong muốn từ thể cho sang vật chủ nhận (thể nhận), hoặc tách dòng gen cần phải có các vector chuyển gen. Vector là phân tử ADN có kích thước bé hoặc vừa phải, đóng vai trò là vật trung gian truyền đoạn ADN ngoại lai nghiên cứu vào trong tế bào thể nhận (tế bào khả biến) bằng con đường biến nạp (transformation) hoặc tải nạp (transduction). Vector chuyển gen phải có các đặc điểm quan trọng cần thiết sau: + Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication – ori) để tự sao chép mà tồn tại độc lập trong tế bào. 5 + Có các đoạn trình tự nhận biết cho enzym giới hạn cắt rồi để hở tạo nơi lắp ráp các đoạn gen lạ. + Có trình tự khởi điểm (promoter). + Có dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát hiện nhận biết chúng trong tế bào chủ nhận. Thông thường dấu chuẩn chọn lọc là các gen kháng chất kháng sinh, hoặc gen tổng hợp chất màu. Để đảm bảo cho được tính bền vững của ADN tái tổ hợp, ngoài các đặc điểm trên vector chuyển gen cũng cần có những đặc tính khác để cho việc tạo, tách dòng dễ thực hiên như: + Chứa các gen vô hiệu hóa các đoạn ADN không mong muốn bị gắn nhầm vào. + Có khả năng tạo nhiều bản sao để khi tách khỏi tế bào được số lượng lớn, đảm bảo sự khuếch đại của gen lạ mong muốn được gắn vào. + Giá trị của các vector chuyển gen ở chỗ nó được cấu tạo thuận tiện cho mục đích sử dụng. Hiện tại chưa có loại vector chuyển gen toàn năng, mà cần phải lựa chọn vector chuyển gen cho tưng đối tượng và tùy thuộc và kích thước của đoạn gen cần được chuyển. 1.2.1. Hai loại vector thông dụng: Có hai loại vector thông dụng là plasmid và phage. Plasmid của vi khuẩn (hình 1, 2) được sử dụng rộng rãi hơn cả, bởi vì chúng có các đặc điểm sau: (i) có khả năng xâm nhập vào tế bào vật chủ mà vẫn hoạt động (tái bản, biểu hiện gen) bình thường; (ii) có trọng lượng phân tử thấp nên dễ dàng tinh chiết; (iii) số bản sao trong mỗi tế bào vi khuẩn thường khá cao; và (iv) đặc biệt là, một số plasmid có chứa các gen kháng thuốc tiện lợi cho việc theo dõi và phát hiện sự có mặt của plasmid tái tổ hợp trong vi khuẩn chủ. Plasmid được cải tiến qua 3 thế hệ: Thế hệ thứ nhất là các plasmid tự nhiên và ngày nay hầu như không còn sử dụng như pSC1001, ColE1, …. Plasmid thế hệ thứ hai được cấu tạo phức tạp hơn. Một trong những plasmid thế hệ thứ hai được sử dụng rộng rãi là plasmid pBR322 có nguồn gốc từ một plasmid nhỏ ColE1. Plasmid thế hệ thứ ba là các plasmid đa năng (polycloning plasmid), chuyên dụng có kích thước nhỏ và có một đoạn đa liên kết (polylinker), hoặc điểm đa tách dòng (multiple cloning site). Đoạn đa liên kết là đoạn polynucleotide tổng hợp, mang một chuỗi các vị trí nhận biết của nhiểu loại enzym giới hạn. Nhóm plasmid này là các plasmid pUC, các plasmid pBluescript,... 6 Hình1. Plasmid thế hệ thứ hai pBR 322. 7 Hình 2. Plasmid thế hệ thứ ba pUC 18 và pBluescript II SK. Trong số các phage dùng làm vector thì phage lambda (  ) có nhiều ưu thế nhất, bởi lẽ ở phần giữa của bộ gen có chứa một số gen không quan trọng và không liên quan với sự tái bản của nó, nên thuận lợi cho việc xen đoạn ADN mong muốn vào đây. Các phage không chứa các gen kháng thuốc cho nên việc theo dõi phage tái tổ hợp được xác định dựa vào các vết tan dương tính trên nền vi khuẩn. ADN của nó có dạng mạch thẳng kép có hai đầu bổ trợ sợi đơn dài 12 nucleotide (đầu cos). Có nhiều loại phage  như: EMBL3, EMBL4,  GEM11, phage M13… Phage M13 thường được sử dụng làm vector tách dòng do nó có ADN sợi đơn chứa 10 gen, có kích thước khoảng 6400 bp và chỉ xâm nhiễm vào E.coli. 8 Hình 3. Sơ đồ vector phage M13. 1.2.2. Các vector khác: Vector cosmid: Là các vector đặc biệt được xây dựng bởi plasmid và đầu cos của phage  dùng để tạo dòng các đoạn ADN có kích thước lớn của eukaryot. Cosmid có đặc điểm: mang một marker kháng kháng sinh và một locus khởi đầu của plasmid (ori), mang đoạn ADN với đầu kết dính cos của phage  , kích thước nhỏ sao cho các đoạn ADN eukaryot dài trên 45 kb có thể thích ứng. Hình 4. Vector cosmid: pWEB – TNCTM. 9 Plasmid Ti: Được sử dụng rộng rãi để chuyển gen vào tế bào thực vật. Plasmid Ti bắt nguồn từ vi khuẩn trong đất - Agrobacterium tumifaciens gây bệnh khối u (tumor) ở thực vật. Vector YAC: là vector tạo dòng mạch thẳng dựa trên cấu trúc NST tự nhiên của nấm men. Vector YAC có thể được cắt thành 2 đoạn hoặc 2 nhánh NST để nhận các đoạn rất lớn có kích thước lên đến 2000 kb. Tuy nhiên vector YAC có một số nhược điểm: hiệu suất tạo dòng thấp, xuất hiện các dòng khảm, đoạn chèn hoạt động kém ổn định, thao tác kĩ thuật khó. Vector là virus: Các vector virus thường được sử dụng là các loại virus SV40 (Smian virus) adenovirus, retrovirus, baculovirus, và virus herpes … Các vector nhóm này được sử dụng trong tách dòng gen và chuyển gen ở tế bào động thực vật bậc cao. Nhìn chung có nhiều loại vector khác nhau được dùng trong Công nghệ di truyền. Mỗi loại vector có tế bào chủ đặc trưng và khả năng xen đoạn ADN có kích thước khác nhau. 2. Tạo dòng gen hay ADN tái tổ hợp 2. 1. Nguyên tắc chung: Kỹ thuật ADN tái tổ hợp hay tạo dòng (cloning) gồm các bước chính sau: (1) Tách chiết và tinh sạch ADN thuộc các nguồn khác nhau (gồm vector và ADN mang gen mong muốn); (2) tạo ra phân tử ADN tái tổ hợp in vitro; (3) đưa phân tử ADN tái tổ hợp vào trong tế bào nhận, thường là E. coli hoặc nấm men; (4) phát hiện và phân lập các dòng ADN tái tổ hợp đặc hiệu. Để tạo phân tử ADN tái tổ hợp, tiến hành cắt ADN của vector và ADN mang gen mong muốn bằng một enzym giới hạn sau đó trộn lại rồi nối chúng lại với nhau bằng enzym nối. Tuy nhiên, trên thực tế, bước (4) là bước tiến hành phức tạp nhất và gặp nhiều khó khăn. Bởi vì kết thúc bước (3) sản phẩm thu được có thể là plasmid tái tổ hợp hoặc sản phâm cũng có thể là nhiều plasmid không tái tổ hợp. 10 Hình 5. Qui trình biến nạp ADN tái tổ hợp với vector là plasmid, enzym giới hạn EcoRI, enzym nối ADN ligase và tế bào nhận là E.coli. Trong tế bào chủ, phân tử ADN tái tổ hợp có thể biểu hiện gen mong muốn (cho sản phẩm protein) hoặc tái bản độc lập nhiều lần để tạo ra hàng loạt bản sao của nó, và khi tế bào chủ phân chia sẽ kéo theo sự tạo dòng phân tử (molecular cloning). Mặt khác, do tốc độ phân chia rất nhanh của các vi khuẩn nên có thể tạo hàng triệu bản sao mong muốn trong một thời gian ngắn. Vì thế có thể tách dòng bất kỳ một gen nào để dùng cho nghiên cứu hoặc cho sản xuất trên quy mô công nghiệp một số lượng lớn các chế phẩm y sinh học. 2. 2. Quy trình tạo dòng gen tái tổ hợp: • Bước 1: Tinh chiết ADN Giả sử đã tinh chiết được plasmid có chứa hai gen kháng ampicillin và tetracyclin, ký hiệu là AmpR và TetR; và cũng giả thiết rằng gen Tet R có chứa điểm cắt của EcoRI, và phân tử ADN người có mang gen insulin. • Bước 2: Tạo phân tử ADN tái tổ hợp in vitro Trước tiên, dùng enzym giới hạn đầu dính EcoRI để cắt vòng plasmid tại giữa gen TetR và cắt ADN người, trong số các đoạn bị cắt có một đoạn mang gen insulin. Sau đó đem trộn lẫn hai loại ADN trên trong ống nghiệm với ADN ligase. Kết quả là có thể xảy ra ba tr ường hợp: 11 (1) Plasmid tự nối lại thành mạch vòng như lúc đầu; (2) Đoạn ADN tự nối lại thành mạch vòng; và (3) Plasmid tái tổ hợp có mang gen insulin, và có thể mang một đoạn ADN không phải gen đó. • Bước 3: Biến nạp và phát hiện dòng ADN tái tổ hợp chung Đưa các ADN được xử lý vào các tế bào E. coli. Nếu phân tử có kích thước lớn người ta phải xử lý vi khuẩn “thể nhận” bằng CaCl 2 để làm cho màng trở nên thấm được dễ dàng. Sau đó đem cấy riêng rẽ các vi khuẩn trên môi trường có ampicillin và theo dõi. + Nếu xuất hiện khuẩn lạc (các vi khuẩn trong cùng một khuẩn lạc thì thuộc một dòng vì chúng bắt nguồn từ một vi khuẩn ban đầu) chứng tỏ vi khuẩn có mang gen Amp R, tức là chúng có mang plasmid ban đầu (trường hợp A) hoặc plasmid tái tổ hợp (trường hợp C). Ngược lại, nếu chỗ cấy không xuất hiện khuẩn lạc, chứng tỏ vi khuẩn mang ADN tự nối (trường hợp B). + Tiếp theo đem cấy riêng rẽ các vi khuẩn thu được sang môi trường có tetracyclin. Nếu có xuất hiện khuẩn lạc, chứng tỏ vi khuẩn có mang gen Tet R nguyên vẹn (trường hợp A). Nếu không có khuẩn lạc, chứng tỏ vi khuẩn đem cấy có mang ADN tái tổ hợp (trường hợp C); vì gene TetR bị bất hoạt do đoạn ADN xen vào. Bằng cách theo dõi như vậy cho phép xác định được dòng vi khuẩn mang ADN tái tổ hợp, nhưng vẫn chưa biết được đâu là dòng đặc hiệu, nghĩa là dòng có mang gen insulin. Hình 6. Qui trình tạo dòng vi khuẩn mang gen insulin người. 12 • Bước 4: Chọn dòng ADN tái tổ hợp đặc hiệu: Có 3 hướng chính để chọn lọc dòng ADN là lai axitnucleic dùng mẫu dò ARN đặc hiệu, phát hiện bằng kiểu hình, hoặc phát hiện bằng phản ứng miễn nhiễm tùy theo tính chất của dòng gen. Trong trường hợp này ta có thể sử dụng phương pháp miễn dịch học để chọn dòng ADN tái tổ hợp. Bằng cách dùng kháng thể chống lại protein được sinh ra bởi dòng vi khuẩn tương ứng (tức huyết thanh tìm gen kháng insulin). Ngoài ra để tìm dòng lai đặc hiệu người ta sử dụng các mẫu dò là mARN hoặc rARN đặc hiệu. Chẳng hạn, trong trường hợp nếu cần chọn dòng lai mang đoạn mARN cụ thể, người ta đem cấy đều các dòng vi khuẩn có chứa ADN tái tổ hợp lên trên mặt thạch của hộp petri chứa môi trường nuôi cấy. Sau đó đóng dấu lên màng lọc nitrocellulose và thu được bản sao. Việc xử lý bản sao bằng NaOH sẽ làm cho các tế bào vi khuẩn tan vỡ tại chỗ (in situ), và các ADN thoát ra từ chúng sẽ bị biến tính (các sợi đơn tách rời nhau) và dính vào màng lọc. Sau đó đem nhúng màng lọc này vào mẫu mARN tương ứng đã được đánh dấu phóng xạ (P32) mẫu ARN này được gọi là vật dò phóng xạ. Nếu dòng nào có chứa ADN mã hoá cho mARN thì sẽ xảy ra hiện tượng lai giữa mARN và vùng sợi đơn tương ứng trên ADN đó. Sau khi loại bỏ các mARN không lai được, người ta đặt một miếng phim ảnh lên trên màng lọc; những vết ảnh xuất hiện trên ảnh phóng xạ tự ghi cho thấy vị trí của dòng mang ADN bổ trợ với mẫu ARN. Từ đó có thể tách riêng các dòng lai đặc hiệu để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Hình 7. Các bước xác định các dòng vi khuẩn mang ADN tái tổ hợp đặc hiệu. 13 2. 3. Tổng hợp và tạo dòng cADN: Khi muốn biểu hiện một gen quan tâm (tổng hợp một protein cần thiết) trong vi khuẩn, ta có thể tổng hợp gen của nó dựa trên khuôn mẫu mARN và enzym phiên mã ngược tinh chế từ các virus ARN. Sau đó cho xen gen này vào plasmid, rồi đem cấy vào vi khuẩn và xác định các dòng cADN đặc hiệu. Ở đây ta chỉ xét hai bước: Bước 1: Tổng hợp cADN Vì mARN eukaryot đều có đuôi poly (A) ở đầu 3' nên trình tự này đã được sử dụng để tổng hợp sợi ADN bổ sung, cADN. Khi đem trộn lẫn các đoạn ngắn gồm các nucleotide thymine (oligodT) với mARN sẽ xảy ra sự lai hoá giữa nó với vùng đuôi mARN. Đoạn oligo(dT) làm mồi cho enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase) tổng hợp sợi cADN mà sản phẩm là sợi kép lai ARN - cADN. Ở đầu 3' của sợi cADN được tổng hợp có “mũ” tương tự đầu 5' của mARN. Tiếp theo, bằng cách xử lý với NaOH, sợi mARN bị loại ra; tiếp theo “mũ” ở đầu 3' của cADN lại làm mồi cho ADN polymerase I tổng hợp sợi thứ hai dọc theo sợi khuôn vốn có của nó. Sản phẩm cADN bây giờ có dạng vòng sợi đơn. Sau đó, vòng này sẽ được cắt bỏ bằng cách xử lý với nuclease S1 để tạo ra cADN sợi kép. Hình 8. Sơ đồ tổng hợp cADN từ khuôn mẫu mARN 14 Bước 2: Xen đoạn cADN vào plasmid Tạo linker hoặc adapter nhờ sự xúc tác của ADN ligase T4 gắn thêm vào cả hai “đầu bằng” của sợi kép cADN các oligonucleotide gồm 8-10 cặp base. Sau đó, dùng enzym giới hạn thích hợp để cắt ''đoạn nối'' này tạo ra các đầu dính. Đồng thời cũng sử dụng enzym giới hạn đó để cắt plasmid. Hai ADN nói trên được nối với nhau bằng ADN ligase để tạo ra plasmid lai. Hình 9. Một linker tổng hợp. Hình 10. Một adapter tổng hợp. 3. Ứng dụng của kĩ thuật ADN tái tổ hợp: Đối với con người, kĩ thuật ADN tái tổ hợp được dùng để sản xuất các vaccine tái tổ hợp, sản xuất các chất có hoạt tính sinh học giúp nâng cao chất lượng cuộc sống như kháng sinh, hoocmon, kháng thể đơn dòng. Ngoài ra, nó còn được dùng trong y học để chuẩn đoán bệnh, tư vấn trước sinh, là cơ sở của liệu pháp gen để chữa các bệnh nan y. Trong nông nghiệp, nhờ kĩ thuật ADN tái tổ hợp đã giúp chuyển các gen mong muốn từ đó tạo các giống cây trồng kháng bệnh, năng suất cao, chất lượng tốt và mang những đặc tính quí. CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP 15 1. Bài tập lập bản đồ enzym giới hạn * Phân tử ADN mạch vòng có n điểm giới hạn sẽ tạo ra n đoạn khi xử lý bằng enzym giới hạn. Ví dụ: Khi cắt plasmid pBR322 bằng HaeI, có 11 đoạn ADN được tạo ra. Khi cắt nó bằng BamHI, chỉ có một đoạn được tạo ra. Có bao nhiêu điểm giới hạn cho mỗi loại enzym? Đáp án: ADN của plasmid có mạch vòng. Vậy có 11 điểm giới hạn cho HaeI và 1 cho BamHI. * ADN mạch thẳng có n điểm giới hạn sẽ tạo ra n+1 đoạn. Ví dụ: Một phân tử ADN mạch thẳng được cắt bằng EcoRI và tạo ra các đoạn 3 kb, 4,2 kb và 5 kb. Hãy xác định bản đồ giới hạn của nó. Đáp án: Có ba đoạn, vậy phải có 2 điểm giới hạn. Các điểm đó có thể phân bố như sau: 3   3 5  5  4,2  3  4,2 5 4,2 Đột biến đã làm thay đổi một hoặc một số bazơ tại điểm nhận biết của BgIII, và, như vậy, enzym chỉ cắt phân tử một lần. Đoạn mới là tổng của hai đoạn 1,7 và 2,1 kb, cho thấy hai đoạn này nằm kề nhau trên phân tử ADN bình thường. * Đột biến tạo ra điểm giới hạn mới sẽ làm mất đi một đoạn cũ và xuất hiện hai đoạn mới ngắn hơn. Ví dụ: Khi xử lý AND được tách ra từ một đột biến khác bằng BgIII, người ta thấy xuất hiện các đoạn 1,3 kb, 1,7 kb, 1,9 kb và 2,1 kb. Hãy giải thích kết quả thu được. Đáp án: Chúng ta thấy các đoạn 1,7 và 2,1 kb cùng có cả ở ADN bình thường và ADN đột biến. Điểm giới hạn sinh ra hai đoạn này phải còn nguyên vẹn trên ADN đột biến. Hai đoạn còn lại, 1,3 và 1,9 kb có tổng là 3,2 kb, đúng bằng đoạn bị mất. Vậy, một điểm giới hạn mới đã được tạo ra ở ADN gốc. * Nếu một đoạn do enzym giới hạn tạo ra cùng xuất hiện khi xử lý bằng một enzym và bằng hỗn hợp hai enzym thì đoạn đó không có điểm giới hạn cho enzym thứ hai. Ví dụ: Một phân tử ADN mạch thẳng được xử lý bằng các enzym dưới đây và kết quả như sau: EcoRI: 1,7; 2,1; 3,2 kb. 16 HaeI: 1,0; 1,4; 4,6 kb. Hỗn hợp: 0,7; 1,0; 1,4; 1,8; 2,1 kb. Những đoạn giới hạn nào của EcoRI không chứa các điểm giới hạn của HaeI và ngược lại? Đáp án: Đoạn 2,1 của EcoRI cũng xuất hiện trong “hỗn hợp”, vậy , nó không có điểm giới hạn của HaeI. Các đoạn khác của EcoRI mất đi khi xử lý bằng cả hai enzym, nên chúng phải chứa các điểm giới hạn của HaeI. Tương tự, các đoạn 1,0 và 1,4 của HaeI đều không chứa các điểm giới hạn của HaeI. * Để lập bản đồ giới hạn, phải xem xét các đoạn giới hạn được tạo ra khi xử lý bằng hai enzym với các đoạn tạo ra khi xử lý từng enzym riêng biệt. Ví dụ: Hãy xét lại các đoạn trên và xây dựng bản đồ giới hạn. Đáp án: Vì 1,0 + 0,7 = 1,7 và 1,4 + 1,8 = 3,2 nên đoạn 1,7 của EcoRI phải có điểm giới hạn cho HaeI từ một đầu: E 1,0 H 0,7 E Tương tự, đoạn 3,2 cũng phải có điểm giới hạn cho doạn HaeI dài 1,8 từ một đầu: E 1,8 H 1,4 E Bây giờ, hãy sắp xếp trật tự có thể có cho các đoạn EcoRI: 1,7   2,1  1,7  2,1 3,2  1,7 3,2  3,2 2,1 Hãy thêm các điểm giới hạn đã biết của HaeI vào đúng vị trí. Một trong những trật tự có thể là: 2,1 E H E H     1,0 0,7 1,4 17 1,8 Chúng ta nhận được đoạn 3,1 kb khi xử lý ADN chỉ bằng HaeI. Nếu trật tự là 2,1; 0,7; 1,0; 1,4 và 1,8, thì khi xử lý bằng HaeI phải tạo ra đoạn 2,8 kb. Vậy đoạn 1,7 kb không nằm ở giữa. Nếu đoạn 3,2 kb nằm ở giữa thì chúng ta phải gặp hoặc đoạn 3,5 kb hoặc đoạn 3,9 kb khi xử lý bằng HaeI. Điều đó không xảy ra, vậy trật tự phải là: E  1,7 1,0 E 2,1  0,7 3,2 1,8  H 1,4 H Nếu điểm giới hạn của HaeI là 0,7 kb từ một đầu thì ta phải gặp đoạn 0,7 kb khi xử lý ADN bằng HaeI. Biện luận tương tự cho đoạn 1,8 kb. 2. Dựa vào bảng 1: biết enzym giới hạn EcoRI nhận trình tự và cắt ở vị trí giữa G và A: G↓AATTC. Hãy vẽ trình tự ADN sợi kép trước và sau khi enzym cắt. Trả lời: 5’ GAATTC 3’ ECoRI 5’ G 3’ 5’ AATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ 3’ CTTAA 5’ 3’ G 5’ 3. Giả sử tiến hành tạo một plasmid tái tổ hợp như hình vẽ: 18 AmpR: gen kháng ampicillin, lacZ: gen mã hóa β galactosidase. Nếu môi trường nuôi cấy vi khuẩn ở bước (*) không chứa ampicillin nhưng vẫn có X - gal thì loại khuẩn lạc nào có thể mọc được? Trả lời: Trong môi trường có chứa X - Gal, vi khuẩn sinh trưởng tốt chứng tỏ chúng mang plasmid tái tổ hợp (mang gen lac Z nguyên vẹn) còn nếu không xuất hiện khuẩn lạc có nghĩa là vi khuẩn này mang gen lac Z (vì gen lac Z bị bất hoạt do đoạn ADN cài xen vào). 4. (đề thi quốc tế năm 2009, phần A) Trình tự nhận biết của enzyme giới hạn Aval là CYCGRG, trong đó Y là một pyrimidine bất kỳ còn R là một purin bất kỳ. Khoảng cách mong đợi (tính theo cặp bazơ nitơ) giữa hai điểm cắt của Aval trong một chuỗi ADN dài, có trình tự ngẫu nhiên là bao nhiêu? A. 4096 cặp bazơ nitơ B. 2048 cặp bazơ nitơ C. 1024 cặp bazơ nitơ D. 512 cặp bazơ nitơ E. 256 cặp bazơ nitơ F. 64 cặp bazơ nitơ. 5. (đề thi quốc tế năm 2009, phần A) Sự nhân đôi các trình tự nucleotit trong một gen gây ra những ảnh hưởng nghiêm trọng tới chức năng của gen đó ở một số trường hợp, 19
- Xem thêm -