Tài liệu đặc điểm hình thái và sự hình thành synnema của isaria tenuipes (peck) samson trên nhộng tằm dâu bombyx miri linnaeus

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH -------------- VƯƠNG THỊ HIỀN §Æc ®iÓm h×nh th¸i vµ sù h×nh thµnh synnema cña nÊm Isaria tenuipes (Peck.) Samson trªn nhéng t»m d©u Bombyx mori Linnaeus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NGÀNH: NÔNG HỌC Vinh – 2011 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH -------------- §Æc ®iÓm h×nh th¸i vµ sù h×nh thµnh synnema cña nÊm Isaria tenuipes (Peck.) Samson trªn nhéng t»m d©u Bombyx mori Linnaeus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NGÀNH: NÔNG HỌC Người thực hiện : Vương Thị Hiền Lớp : 48K2 – Nông học Người hướng dẫn : PGS.TS. Trần Ngọc Lân Vinh – 2011 3 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, các số liệu được thu thập qua các thí nghiệm do bản thân tiến hành và chưa từng sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan các thí nghiệm để thu thập số liệu trong luận văn đã được chính bản thân tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh học Nông nghiệp, khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại Học Vinh với sự đồng ý và hướng dẫn của PGS. TS Trần Ngọc Lân, giáo viên hướng dẫn và các kĩ thuật viên phụ trách phòng thí nghiệm. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Vinh, ngày 20 tháng 7 năm 2011 Tác giả Vương Thị Hiền 4 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp ngành kĩ sư Nông học, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phía thầy cô, bạn bè, người thân. Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt tới PGS. TS. Trần Ngọc Lân, Th.S Nguyễn Thị Thúy, KS Trần Văn Cảnh, những người hướng dẫn tôi từ những bước đầu làm nghiên cứu khoa học, đã rất tận tâm và nhiệt tình hướng dẫn tôi suốt thời gian làm đề tài luận văn tốt nghiệp. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong tổ bộ môn Bảo vệ thực vật, các giáo viên phụ trách, các kĩ thuật viên phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình làm đề tài. Và tôi xin được chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè đã động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Vinh, ngày20 tháng 7 năm 2011 Tác giả Vương Thị Hiền MỤC LỤC 5 Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Bảng chữ cái viết tắt Danh mục các bảng số liệu Danh mục các hình vẽ MỞ ĐẦU 1. 2. 3. 4. 1.1 Lý do chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tượng, phạm vi và phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU Nấm ký sinh côn trùng i ii iii vi vii viii 1 1 3 3 4 5 5 1.1.1. 1.1.2. 1.2. 1.2.1. 1.2.2. Khái niệm và phân loại Cơ chế lây nhiễm của nấm ký sinh côn trùng Lược sử nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng Lược sử nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trên thế giới Lược sử nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam (Báo 5 5 9 9 17 1.2.3. cáo NKSCT) Lược sử nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng ở Nghệ An Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 23 2.1. Quy trình nghiên cứu 2.2. Thời gian và địa điểm 2.3. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 2.3.1. Vật chủ 2.3.2. Chủng nấm 2.3.3. Trang thiết bị, vật tư, hóa chất 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu đa dạng loài nấm ký sinh côn trùng 2.4.2. Phương pháp lây nhiễm nấm lên vật chủ 2.4.3. Thu thập và xử lý số liệu CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Sự đa hình của Isaria tenuipes. 3.2. Ảnh hưởng của môi trường lỏng đến khả năng sinh trưởng 23 24 24 24 24 24 25 25 26 29 30 30 32 3.3. của sợi nấm. Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm nấm Isaria tenuipes 3.3.1 trên nhộng tằm dâu. Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm đến tỷ lệ nhiếm nấm của 33 33 nhộng 6 3.3.2 Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm đến thời gian hình 34 3.3.3 thành synnema Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm đến sản lượng 35 3.4. 3.4.1. synnema Lựa chọn nồng độ bào tử cho việc lây nhiễm nấm trên nhộng Ảnh hưởng của nồng độ bào tử đến khả năng lây nhiễm của 37 37 3.4.2. nấm trong nhộng. Ảnh hưởng của nồng độ bào tử đến thời gian hình thành 39 3.4.3. 3.5. synnema. Ảnh hưởng của nồng độ bào tử đến sản lượng synnema. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến khả năng hình thành 40 3.5.1. synnema. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến thời gian hình thành 42 42 3.5.2. 3.6. synnema. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sản lượng synnema Chu trình lây nhiễm của nấm ký sinh côn trùng Isaria 44 48 3.7. tenuipes trên nhộng tằm. Quy trình sản xuất synnema của Isaria tenuipes trên nhộng 48 tằm bằng phương pháp tiêm nhiễm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 49 49 50 51 7 DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung cfu Bào tử CT Công thức CV% EPF I. KBTTN KH Độ biến thiên của mẫu Entomology Pathogenic Fungi - Nấm ký sinh côn trùng isaria. Khu bảo tồn thiên nhiên Kiểu hình PDA Phương sai mẫu Giá trị trung bình Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth RH Ẩm độ SD Độ lệch chuẩn LSD0.05 M SDY Sapouraud Dextrose Peptone Yeast extract Agar VQG Vườn Quốc Gia YM Yeast extract, Malat extrac 8 DANH MỤC CẤC BẢNG SỐ LIỆU Bảng Bảng 1.1. Tên bảng Tổng quan phân loại nấm ký sinh côn trùng theo Trang Bảng 3.1. Sung et al. 2007 Tần suất bắt gặp các kiểu hình I. tenuipes trong tự 14 30 Bảng 3.2. Bảng 3.3. nhiên (N=123). Các kiểu hình của Isaria tenuipes. Ảnh hưởng của các loại môi trường lỏng đến khả năng 31 32 Bảng 3.4. phát triển của sợi nấm. Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm đến tỷ lệ nhiễm nấm trên nhộng. Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm đến thời 34 Bảng 3.5. 35 Bảng 3.6. gian hình thành synnema Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiếm đến sản 36 Bảng 3.7. lượng synnema của I. tenuipes. Tỷ lệ hình thành synnema trên nhộng bởi phương pháp tiêm nhiễm. Ảnh hưởng của nồng độ bào tử đến thời gian và tỷ lệ 38 Bảng 3.8. 39 Bảng 3.9. hình thành synnema . Ảnh hưởng của nồng độ bào tử đến sản lượng 41 Bảng 3.10. synnema. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến thời gian hình thành synnema. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến tỷ lệ hình 43 Bảng 3.11. 44 Bảng 3.12. thành synnema. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sản lượng synnema. 45 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Hình 1.1. Nội dung Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng. Trang 06 9 Hình 1.2. Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 08 Hình 2.1. Sơ đồ mô tả quy trình nghiên cứu hình thành synnema 21 của Isaria tenuipes trên nhộng tằm Hình 3.1. Sự phát triển của sợi nấm trên môi trường lỏng khác nhau. Tỷ lệ lây nhiễm của nấm trên nhộng từ hai phương pháp 33 Hình 3.2. 34 Hình 3.3. lây nhiễm. Thời gian hình thành synnema trên nhộng bởi hai 35 Hình 3.4. phương pháp lây nhiễm. Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm đến sản lượng Hình 3.4a. synnema. Kích thước synnema. 36 36 Hình 3.4b. Kích thước synnema 36 Hình 3.5. Sự hình thành synnema từ hai phương pháp lây nhiễm. 37 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ bào tử đến tỷ lệ nhiễm nấm trên 38 Hình 3.7. nhộng. Ảnh hưởng của nồng độ bào tử đến thời gian và tỷ lệ 40 Hình 3.8. hình thành synnema Ảnh hưởng của nồng độ bào tử đến sản lượng synnema. 41 Hình 3.9. Tỷ lệ nhiễm nấm và hình thành synnema của nhộng tằm ở 42 Hình 3.10. các nồng độ bào tử. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến thời gian hình 43 Hình 3.11a. thành synnema. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến kích thước 46 Hình 3.11b. synnema. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sản lượng 46 synnema. 10 Hình 3.12. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sự hình thành 47 Hình 3.13. synnema. Chu trình hình thành synnema của Isaria tenuipes trên 48 nhộng tằm dâu Bombyx mori 11 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Hiện nay có hơn 700 loài nấm gây bệnh côn trùng trên thế giới [28], [30]. Có trên 131 loài đã được thu thập và định loại tại Vườn Quốc gia Pù Mát – Nghệ An (Trần Ngọc Lân và cs., 2010). Isaria tenuipes (Peck.) Samson (trước đây là Paecilomyces tenuipes hay Paecilomyes japonica) là một loại nấm ký sinh trên nhộng sâu cánh vẩy Lepidoptera thường được tìm thấy ở các Vườn Quốc Gia và Khu bảo tồn thiên nhiên của Việt Nam. Các synnema của loại nấm này có các hình dạng khác nhau và dạng đặc trưng của nó được gọi là dạng bông tuyết vì thế loài nấm này còn được gọi là Đông Trùng Tuyết. Đông trùng tuyết được báo cáo là có các hợp chất sinh học và dược phẩm như Adenosine và N 6-(2-hydroxyethyl) adenosine [16], [33]. Kỹ thuật nhân nuôi nhân tạo của loại nấm này đã được phát triển mạnh ở các nước như Nhật Bản, Trung Quốc và đặc biệt là Hàn Quốc có quy mô sản xuất I. tenuipes lớn nhất thế giới. Sản phẩm của I. tenuipes đa dạng từ dạng thực phẩm chức năng đến các dạng thuốc viên nang. J. Jennifer Luangsa - Ard, Nigel L. Hywel - Jone, Leka Manoch và Robert A. Samson (2005) đã nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài của nhóm Paecilomyces và các loài Isarioidea, bằng cách sử dụng gen ß-tubulin và ITS rDNA. Kết quả phân tích cho thấy chúng không tạo thành một nhóm phân loại tự nhiên mà đang phát sinh trong Hypocreales. Tuy nhiên, một nhóm đã được công nhận, gọi là nhóm đơn phát sinh - Isaria bao gồm các loài Paecilomyces sau đây: P. amoeneroseus, P. cateniannulatus, P. cateniobliquus, P. cicadae, P. coleopterorus, P. farinosus, P. fumosoroseus, P. ghanensis, P. javanicus và P. tenuipes. Một số loài có dạng hữu tính là Cordyceps . Các hoạt chất sinh học có trong Isaria đã được nghiên cứu ứng dụng ở nhiều nước trên thế giới. Theo kết quả nghiên cứu của Haruhisa Kikuchi và cs, 2004 cho thấy, trong sinh khối nấm I. tenuipes chứa Paecilomycine A, B và C là các hoạt chất có hoạt tính sinh học cao. Năm 2009, Akira Sakakura, Kazufumi Shioya và cs., [2] 12 đã phát hiện hợp chất mới chống oxy hóa pseudo-di-peptide và tiền chất của nó được chiết xuất từ I. japonica. Chất này đã được sử dụng như một loại thuốc dân gian có nguồn gốc từ thiên nhiên tại Nhật Bản và có tên là ‘Hanasanagitake’. Cấu trúc pseudo-di-peptide được xác định là (R)-3,4-diguanidinobutanoyl-(S)-DOPA và (R)-3,4-diguanidinobutanoyl-(S)-tyrosine bằng phân tích quang phổ, tổng hợp hóa học và chuyển đổi enzym. Theo Ban và cs. (1998) báo cáo rằng Polysacchoride phân lập từ P. tenuipes có hoạt chất chống ung thư trong cơ thể, nguyên nhân được nhận định có thể là do sự kích thích hệ thống miễn dịch. Park và cs. (2000) nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào ung thư của P. tenuipes trên môt số tế bào khối u ở con người. Các chiết xuất của methanol từ P. tenuipes cho thấy khả năng gây độc đáng kể so với dòng tế bào ung thư HeLa, HeLa S3 và A-431 (Shin và cs., 2000). Ở Việt Nam có rất ít quan tâm tới các hoạt chất sinh học và dược phẩm từ nấm ký sinh côn trùng Isaria tenuipes. Tuy nhiên, nghiên cứu đầu tiên về nhân nuôi nhân tạo của Nguyễn Mậu Tuấn (công bố Hội Nghị Côn trùng toàn quốc lần thứ 7 năm 2011) trên giá thể nhộng tằm qua kết quả phân tích hợp chất hóa học trong nấm không cho thấy 2 hợp chất sinh học quan trọng kể trên. Vì vậy, nghiên cứu này đóng góp một phần quan trọng cho phân tích các hợp chất sinh học từ loài Isaria tenuipes ở vùng á nhiệt đới, đồng thời là nguồn dẫn liệu khoa học và cơ sở thực tiễn cho nhân nuôi hàng loạt nguồn dược liệu và thực phẩm chức năng. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu đề tài “Đặc điểm hình thái và sự hình thành synnema của nấm Isaria tenuipes (Peck.) Samson trên nhộng tằm dâu Bombyx mori Linnaeus”. Kết quả nghiên cứu góp phần quan trọng làm cơ sở khoa học cũng như thực tiễn cho những nghiên cứu sâu hơn về sản xuất thử nghiệm và phân tích các hợp chất sinh học của các loài này. 13 2. Mục đích nghiên cứu 2.1. Mục đích tổng quát Đề tài nghiên cứu nhằm mục đích xác định thành phần dinh dưỡng và thời gian thích hợp cho sự hình thành synnema của I. tenuipes trên nhộng tằm để cung cấp dẫn liệu khoa học cho việc xây dựng quy trình kỹ thuật sản xuất synnema của I. tenuipes trên nhộng tằm dâu. 2.2. Mục tiêu cụ thể - Xác định công thức giống lỏng có hàm lượng dinh dưỡng phù hợp nhất để phục vụ cho việc lây nhiễm trên cơ thể nhộng tằm. - Đánh giá sự hình thành và sinh trưởng phát triển synnema của I. tenuipes trên cơ thể nhộng tằm - Xây dựng quy trình sản xuất synnema của I. tenuipes trên nhộng tằm dâu. 3. Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu Nấm ký sinh côn trùng Isaria tenuipes (Peck.) Samson được thu thập tại Vườn Quốc gia Pù Mát và Khu Bảo tồn thiên nhiên Pù Huống. 3.2. Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu đa dạng tại Vườn Quốc gia Pù Mát và Khu Bảo tồn thiên nhiên Pù Huống - Nghiên cứu nhân nuôi thực hiện tại phòng thí nghiệm Bảo vệ thực vật thuộc khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Vinh. 3.3. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá sự đa hình của Isaria tenuipes trong tự nhiên - Lựa chọn ra môi trường giống lỏng tốt nhất để phục vụ cho việc lây nhiễm trên nhộng tằm. - Lựa chọn phương pháp và nồng độ thích hợp nhất để lây nhiễm (tiêm, phun) trên nhộng tằm. - Đánh giá sự hình thành và sự sinh trưởng, phát triển Synnema của I. tenuipes trên nhộng tằm - Xây dựng quy trình sản xuất synnema của I. tenuipes trên nhộng tằm. 14 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Đề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học quan trọng cho những nghiên cứu nhân nuôi nấm ký sinh côn trùng nói chung, loài nấm I. tenuipes nói riêng. Ngoài ra, kết quả còn góp phần bổ sung cho những nghiên cứu trước đó về nấm I. tenuipes đồng thời làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về nấm Iaria. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Phân tích các hoạt chất có hoạt tính sinh học cao để làm thực phẩm chức năng và chữa các chứng bệnh nan y đáp ứng nhu cầu đời sống ngày càng cao của con người. 15 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về nấm ký sinh côn trùng 1.1.1. Khái niệm và phân loại “Nấm ký sinh công trùng - Entomology phathogenic fungi (EPF) hay nấm côn trùng – Insect fungi” là thuật ngữ đề cập về nhóm sinh vật ký sinh gây bệnh cho côn trùng. Theo Evans (1982) [15], nấm ký sinh côn trùng được chia thành 4 nhóm: (1) Ký sinh trong tức là nấm ký sinh trong các nội quan, khoang cơ thể của côn trùng ký chủ; (2) Ký sinh ngoài tức là nấm phát triển trên lớp cuticun vỏ cơ thể của côn trùng và gây nên bệnh hại cho ký chủ; (3) Nấm mọc trên côn trùng tức là những nấm đã được trực tiếp hoặc gián tiếp chứng minh chúng ký sinh trên côn trùng; (4) Cộng sinh có nghĩa là cả nấm và côn trùng cùng mang lại lợi ích cho nhau trong mối quan hệ cùng chung sống. Nấm còn được chia ra thành ký sinh sơ cấp (primery pathogen) và ký sinh thứ cấp (secondery pathogen). Nấm ký sinh sơ cấp thường nhiễm vào ký chủ côn trùng khoẻ mạnh, gây bệnh và sau đó giết chết côn trùng. Trong khi đó, nấm ký sinh thứ cấp chỉ có thể ký sinh trên những côn trùng yếu hoặc bị thương. Các mầm bệnh ký sinh trên côn trùng trưởng thành hoặc côn trùng bị bệnh được gọi là ký sinh cơ hội hoặc ký sinh không chuyên tính, loại ký sinh này có thể nhiễm vào ký chủ thông qua sự xâm nhập qua lớp cuticun vỏ cơ thể côn trùng (dẫn theo Trần Ngọc Lân và cs, 2007) [7]. 1.1.2. Cơ chế lây nhiễm của nấm ký sinh côn trùng Nấm lây nhiễm côn trùng được tìm thấy trong các môi trường như là các bào tử. Côn trùng có thể bị nhiễm khi tiếp xúc với các bào tử trên bề mặt của thực vật, trong đất, trong không khí hoặc trên các cơ quan của côn trùng đã chết. Bào tử bám dính lên bề mặt của các côn trùng và lây nhiễm do sự thâm nhập qua lớp da ngoài (lớp cuticun) của côn trùng. Thường ở các khớp hoặc các nếp da nhăn nơi côn trùng che đậy, bảo vệ là mỏng hơn. Khí nấm xâm nhiễm vào bên trong, nấm mọc khắp cơ thể của côn trùng, nhiều loại 16 nấm cũng sản xuất các độc tốc trong đó để tăng tốc độ giết chế côn trùng hoặc ngăn chặn sự cạnh tranh của các loài vi sinh vật khác. Hình 1.1. Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng Thông thường sau khi côn trùng đã chết, nấm mọc ra bao phủ xung quanh cơ thể côn trùng, chúng bắt đầu xâm nhiễm ở các khu vực mỏng hơn như khớp hoặc nếp da nhăn và bắt đầu sản xuất bào tử. Các bào tử của loài nấm tạo ra các ổ dịch tự nhiên trong nhóm entomophthorales thường chủ động phóng ra ngoài từ côn trùng đã chết, nhóm này lây lan nhanh và mạnh. Côn trùng bị giết bởi nấm thường có vẻ xù ra bên ngoài do sự tăng trưởng của sợi nấm từ bên trong cơ thể để sản xuất các bào tử . Nếu bào từ không gặp một vật chủ nào thì hoặc là chết hoặc vẫn tồn tại trên các bộ phận của cây hay trong đất. Mặc dù có một số loài nấm có thể sản xuất bào tử có thể sống nhiều năm trong đất, nhưng hầu hết các bào tử nấm chỉ có hiệu quả cho một mùa hoặc nhiều nhất là một năm (www.extension.org/artcle/18928). Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính: * Giai đoạn xâm nhập Tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng. Hầu hết các nấm ký sinh côn trùng cần đâm xuyên qua lớp biểu bì để vào trong cơ thể côn trùng hấp thu dinh dưỡng để sinh trưởng và phát triển. Sự đâm xuyên của nấm ký sinh côn trùng qua lớp da của ký chủ bao gồm cả quá trình cơ học và enzyme phân hủy. Trong đó quan trọng nhất là enzym phân 17 hủy protein (protease) và kitin (chitinase) của côn trùng. Hai enzym này có liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng (dẫn theo Tạ Kim Chỉnh và cs.,2005. * Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng đến khi côn trùng chết. Ở bên trong cơ thể côn trùng, sợi nấm sinh trưởng và nhân lên nhanh chóng. Khi hệ sợi nấm được hình thành trong cơ thể sẽ phát tán khắp cơ thể theo dịch máu, phá hủy các tế bào máu và làm giảm tốc độ lưu thông máu. Làm cho toàn bộ các bộ phận của nội quan bị xâm nhập. Hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với tác nhân kích thích bên ngoài do nấm xâm nhập vào khí quản làm suy yếu đường hô hấp. Kết quả làm cho vật chủ mất khả năng kiểm soát hoạt động và dẫn đến chết (Dẫn theo Phạm Văn Lầm, 2000) [13]. * Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết. Xác chết côn trùng là nguồn dinh dưỡng có giá trị cho các vi sinh vật. Trên bề mặt ngoài của cơ thể côn trùng, các nấm hoại sinh như Aspergillus spp., Penicillium spp. và Fusarium spp. định cư ở lớp biểu bì và cạnh tranh với vi khuẩn ở bên trong cơ thể côn trùng. Do nấm côn trùng có khả năng sản xuất ra các chất có hoạt tính như thuốc kháng sinh ức chế hoạt động của vi khuẩn và nấm hoại sinh khác nên chúng có thể cạnh tranh với các sinh vật này để tồn tại và phát triển, làm cho xác vật chủ không bị phân hủy. Sau khi nấm côn trùng đã sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bên trong cơ thể côn trùng, nó chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử. Ở giai đoạn xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng, nấm sử dụng các enzym ngoại bào để phân hủy lớp vỏ cuticun. Khác với giai đoạn này, ở giai đoạn nấm đâm xuyên, mọc thành sợi ra bên ngoài nó sử dụng toàn bộ tác động cơ học. Sau đó các bào tử được hình thành trên lớp sợi nấm ở bề mặt cơ thể vật chủ. Nhiều côn trùng bị bao bọc toàn bộ bên ngoài bởi hệ sợi nấm và các bào tử, vì vậy mà rất khó hoặc không thể xác định các vật chủ (Dẫn theo Janet Jennifer et al., 2006) [26]., 18 Những cá thể sâu hại bị nhiễm bệnh nấm côn trùng thường có màu hồng nhạt. Một số loài nấm có thể làm cho sâu bệnh trở nên có màu vàng nhạt, xanh lá cây hoặc nâu. Cơ thể sâu bị bệnh ngày càng trở nên hóa cứng. Hình 1.2. Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng (Nguồn: Thomas M.B. & Read A.F., 2007) Cơ thể côn trùng bị chết do nấm côn trùng không bao giờ bị tan nát, mà thường vẫn giữ nguyên hình dạng như khi còn sống. Toàn bộ bên trong cơ thể sâu chết bệnh chứa đầy sợi nấm. Sau đó, các sợi nấm này mọc ra ngoài qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể sâu chết bệnh. Đây là đặc điểm rất đặc trưng để phân biệt sâu chết bệnh do nấm côn trùng với các bệnh khác (Phạm Văn Lầm, 2000) [13]. Các loài côn trùng có thể phản ứng lại sự xâm nhiễm này của nấm bằng cả hai phương thức là tế bào và thể dịch. Sự hình thành hoạt động miễn dịch càng sớm ở điểm phân giải bào tử đính trong suốt quá trình xâm nhập. Còn sự phát triển của các dạng sinh trưởng giai đoạn tiềm ẩn là sự ngụy trang hữu hiệu từ các phản ứng tự vệ của côn trùng và sự sản xuất ra các chất miễn dịch phân hóa thuận nghịch của bộ phận ức chế hệ thống bảo vệ. 19 1.2. Lược sử nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng 1.2.1. Lược sử nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trên thế giới  Nghiên cứu về đa dạng sinh học và nguồn lợi nấm ký sinh côn trùng Trên thế giới có khoảng 1,5 triệu loài nấm tính đến năm 2005 theo đánh giá của Hywel-Jones (BIOTEC, Thái Lan). Trong 1,5 triệu loài nấm có khoảng 2.000 loài nấm ký sinh côn trùng (Hywel-Jones, 2005). Mặt khác, theo kết quả công bố mới nhất về nấm ký sinh côn trùng của trang web Index Fungorum (www.indexfungorum.org), trên thế giới có khoảng 2.500 loài nấm ký sinh côn trùng, trong đó thứ tự về sự đa dạng của nấm được xếp như sau: Cordyceps với 525 loài, Verticillium với 261 loài, Entomophthora với 152 loài,tiếp đến là Hypocrella với 112 loài, Aschersonia với 79 loài và Turrubiella với 83 loài,… Hiện nay, trên thế giới nghiên cứu mới chỉ tập trung vào một số ít loài như Metarhizium anisopliae, Hisutela lecaniicola, Beauveria basiana , B. amorpha , Akathomyces aranearum , Cordycep sinclairii ,… Nấm ký sinh côn trùng không chỉ là nhóm có tính đa dạng sinh học cao và là nguồn lợi có vai trò rất quan trọng trong phòng trừ sinh học sâu hại cây trồng mà còn là một nguồn tài nguyên rất quí cung cấp thực phẩm chức năng, dược liệu. Có một số loài EPF được ứng dụng để sản xuất các hoạt chất sinh học dược liệu, các chất tăng cường sinh lực cho con người. Nấm ký sinh côn trùng được đánh giá là một trong những nguồn cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học cao sử dụng trong y - dược trong tương lai để chữa trị các chứng bệnh nan y hiện nay. Trong đó, Bộ Clavicipitales được đánh giá có nhiều đặc tính ưu việt nhất với các giống như Cordyceps, Mertacordyceps, Elaphocordyceps, Ophiocordyceps, vì phần lớn các loài cho các chất có hoạt tính sinh học cao. Cordyceps là nhóm nấm ký sinh côn trùng thuộc lớp nấm túi Ascomycetes, hầu hết các loài này ký sinh chủ yếu trên côn trùng và động vật chân khớp, một số ít ký sinh trên các loài nấm khác. Cordyceps là nhóm nấm ký sinh côn trùng thuộc lớp nấm túi Ascomycetes, hầu hết các loài này ký sinh chủ yếu trên côn trùng và động vật chân khớp, một số ít ký sinh trên 20 các loài nấm khác. Cho đến nay, mới chỉ nghiên cứu nhiều về 2 loài là Cordyceps sinensis S. (Đông trùng hạ thảo) và C. militaris L. (Nhộng trùng thảo). Ỏ các nước Châu Âu sử dụng nấm này làm thực phẩm chức năng bổ sung dinh dưỡng., còn ở nước ta hiện đang sử dụng nấm Cordyceps sinensis làm dược liệu trong Đông y. Trên thế giới một số nước đã thành công trong nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng trong thực phẩm chức năng, dược liệu, enzyme, như Hoa Kỳ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan, Trung Quốc (“Đông trùng Hạ thảo“ Cordyceps sinensis). Cordyceps sinensis, khi ký sinh trên các ấu trùng của các loài sâu thuộc chi Thiarodes được gọi là đông trùng hạ thảo, một loại dược liệu quý hiếm sử dụng trong y học cổ truyền một số quốc gia Đông Á, chẳng hạn như trong y học cổ truyền Trung Hoa hay trong y học cổ truyền Tây Tạng. Phần lớn các loài của giống Cordyceps cho các chất có hoạt tính sinh học cao. Trong loài thuộc giống Cordyceps có chất Cordycepin có thể chữa các bệnh ưng thư thông qua việc tăng khả năng miễn dịch của con người, có thể ngăn chặn được di căn và sự phát triển của tế bào ung thư (Thomadaki H. và cs., 2008). Nghiên cứu của Nan J. X. (2001) đã chứng minh nấm Đông trùng - Hạ thảo chữa bệnh rối loạn chức năng gan hiệu quả. Các nghiên cứu của Pegler D. N. và cs. (1994); Mizuno T. (1999) và Tang W., Eisenbrand G., 1992 cho thấy các loài Cordyceps sp. thường được sử dụng như là một loài thuốc kéo dài tuổi thọ và nó được xem như là thuốc cầm máu, thuốc chữa bệnh hen và chứng giảm glucoza trong máu. Sở dĩ nó có được những chức năng như thế là vì chúng có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao, như cordycepin, ophiocordin và một số hợp chất polisaccharides. Loài C. unilateralis có 6 chất dẫn xuất của napthoquinone có hoạt tính sinh học cao như eythrostominone, deoxyerythrostominone, 4 - O - methyl erythrostominone, epierythrostominol, deoxyerythrostominol và đặc biệt là 3,5 - β trihydrooxy - 6 - methoxy - 2 - (5 - oxyohexa - 1,3 - dienyl) - 1,4 - naphthoquinone được xem như là chất có khả năng chống lại bệnh sốt rét - malaria (Patcharaporn Wongsa và cs., 2005 và Kittakoop P. và cs., 1999).