Tài liệu đánh giá đa dạng di truyền và xây dựng quy trình nhân giống cây trà hoa vàng (camellia spp.) thu thập tại quảng ninh

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐẶNG QUANG BÍCH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY TRÀ HOA VÀNG (CAMELLIA spp.) THU THẬP TẠI QUẢNG NINH NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP- 2018 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐẶNG QUANG BÍCH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY TRÀ HOA VÀNG (CAMELLIA spp.) THU THẬP TẠI QUẢNG NINH CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC CÂY TRỒNG MÃ SỐ: 9620110 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO TS. NGUYỄN VĂN PHÚ HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả nghiên cứu trong luận án là hoàn toàn trung thực, khách quan, chƣa từng đƣợc tập thể, cá nhân công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận án này đã đƣợc cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Đặng Quang Bích i LỜI CẢM ƠN Sau hơn 03 năm học tập, nghiên cứu tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, trong quá trình thực hiện luận án tại bộ môn Sinh lý Thực vật và bộ môn Công nghệ Sinh học thực vật, nhờ sự hƣớng dẫn và tận tình giúp đỡ của các thầy cô giáo, cùng các cán bộ tại phòng thí nghiệm của bộ môn, với sự nỗ lực, học tập, nghiên cứu của bản thân, tôi đã hoàn thành luận án nghiên cứu của mình. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Quản lý đào tạo Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban chủ nhiệm khoa Nông học, khoa Công nghệ Sinh học và các thầy cô giáo đã hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Phƣơng Thảo; TS. Nguyễn Văn Phú đã tận tình hƣớng dẫn chỉ bảo và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ nghiên cứu thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đinh Trƣờng Sơn, Ths. Ninh Thị Thảo, Ths. Nguyễn Thị Thùy Linh; TS. Hoàng Hải Hà; Ths. Phạm Thị Thu Hằng đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ nghiên cứu thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ sự cảm ơn chân thành tới các em sinh viên cùng toàn thể bạn bè và các anh, chị đang thực tập tại phòng thí nghiệm bộ môn Sinh lý Thực vật, bộ môn Công nghệ Sinh học thực vật và phòng thí nghiệm Hóa sinh khoa Công nghệ Thực phẩm đã hợp tác, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu. Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, những ngƣời thân luôn động viên, hỗ trợ và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2018. Tác giả Đặng Quang Bích ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x Trích yếu luận án xi Thesis abstract xiii PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2 1.3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 3 1.4. Những đóng góp mới của luận án 3 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Giới thiệu về chi trà Camellia và trà hoa vàng (Camellia spp.) 4 2.1.1. Nguồn gốc chi trà Camellia 4 2.1.2. Đặc điểm hình thái thực vật học chi trà Camellia 5 2.1.3. Đặc điểm phân bố chi trà Camellia 8 2.1.4. Sơ lƣợc lịch sử phát hiện và sự phân bố trà hoa vàng (Camellia spp.) 2.2. Những nghiên cứu về chi trà Camellia và trà hoa vàng (Camellia spp.) trên thế giới 2.2.1. 13 Những nghiên cứu về đa dạng di truyền và nhân giống chi trà Camellia và trà hoa vàng (Camellia spp.) 2.2.2. 13 Nghiên cứu về giá trị sử dụng, thực trạng khai thác chi trà Camellia và trà hoa vàng (Camellia spp.) trên thế giới 2.3. 20 Những nghiên cứu về chi trà Camellia và trà hoa vàng (Camellia spp.) trong nƣớc 2.3.1. 10 26 Những nghiên cứu về đa dạng di truyền, nhân giống chi trà Camellia và trà hoa vàng (Camellia spp.) 26 iii 2.3.2. 2.4. Giá trị sử dụng, thực trạng khai thác chi trà Camellia và trà hoa vàng (Camellia spp.) trong nƣớc 33 Một số đặc điểm về trà hoa vàng Camellia spp. tại Quảng Ninh 38 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 3.1. Đối tƣợng nghiên cứu 41 3.2. Vật liệu nghiên cứu 41 3.3. Nội dung nghiên cứu 42 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 42 3.4.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu, mô tả đặc điểm hình thái và xác định thành phần hàm lƣợng một số hợp chất 3.4.2. 42 Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen cây trà hoa vàng thu thập đƣợc bằng kỹ thuật chỉ thị phân tử 3.4.3. 3.4.4. Phƣơng pháp nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống cây trà hoa vàng Ba Chẽ, Quảng Ninh 47 Phƣơng pháp xử lý số liệu 58 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. 59 Thu thập nguồn gen cây trà hoa vàng tại tỉnh Quảng Ninh và đánh giá đặc điểm hình thái thực vật và hóa sinh của chúng 4.1.1. 59 Hàm lƣợng một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong lá và nụ hoa cây trà hoa vàng (Camellia spp.) thu thập tại tỉnh Quảng Ninh 4.2. 59 Thu thập nguồn gen và đánh giá đặc điểm hình thái thực vật cây trà hoa vàng (Camellia spp.) tại Quảng Ninh. 4.1.2. 44 65 Đánh giá đa dạng di truyền mẫu giống trà hoa vàng thu thập đƣợc bằng kỹ thuật chỉ thị phân tử 75 4.2.1. Kết quả phân tích đa dạng kiểu hình mẫu giống trà hoa vàng thu thập 76 4.2.2. Kết quả phân tích đa dạng di truyền mẫu giống trà hoa vàng bằng chỉ thị RAPD và ISSR 78 4.3. Xây dựng qui trình nhân giống cây trà hoa vàng 86 4.3.1. Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây trà hoa vàng 87 4.3.2. Xây dựng quy trình nhân giống vô tính cây trà hoa vàng bằng phƣơng pháp giâm cành 105 iv PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 119 5.1. Kết luận 119 5.2. Kiến nghị 119 Danh mục các công trình khoa học đã công bố liên quan đến luận án 121 Tài liệu tham khảo 122 Phụ lục 143 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt (tiếng Anh) AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism. BLAST Basic Local Alignment Search Tool. BA Benzyl adenine C Catechin CF Caffeic acid CV(%) Coefficient of variation (%) CR Coumarin Ct Công thức Cs Cộng sự CP Cổ phần CK Chất khô C00 Chu vi gốc DPPH 2,2 - Diphenyl -1 - picrylhydrazyl D00 Đƣờng kính gốc D1.3 Đƣờng kính thân ngang ngực Đc Đối chứng EC Epicatechin EGCG Epigallocatechin 3-gallate ECG Epicatechin 3-gallate GA3 Gibberellic acid HSN Hệ số nhân HPLC High performance Liquid Chromatography Hvn Chiều cao vút ngọn IUCN International Union for Conservation of Nature ISSR Inter Simple Sequence Repeat. IBA Indol butyric acid Ki Kinetin LSD0.05 Least significant different 5% MS Murashige and Skoog vi MAS Marker Assisted Selection ND Nƣớc dừa NCBI National Center for Biotechnology information. PCR Polymerase Chain Reaction. PCA P - Coumaric acid QC Quercetin RES Resveratrol RAPD Random Amplified Polymorphism DNA. RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism. RP Resolving power RT Rutin VA Vanilic acid SSR Simple Sequence Repeat. SLA Salicylic acid Tm Nhiệt độ gắn mồi. THT Than hoạt tính TB Trung bình TNHH Trách nhiệm hữu hạn WPM Wooden plant medium α – NAA Axit α - naphtyl axetic vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1. Danh sách 25 mẫu giống trà hoa vàng dùng trong đánh giá đa dạng di truyền 41 3.2. Chế độ gradient với 2 kênh A và kênh B 44 3.3. Danh sách mồi sử dụng trong RADP và ISSR 44 3.4. Thành phần phản ứng RAPD - PCR và ISSR - PCR 46 3.5. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 46 4.1. Kết quả tính chiều cao vút ngọn trung bình cây trà hoa vàng của 12 tuyến thu thập 4.2. 60 Kết quả tính đƣờng kính gốc trung bình cây trà hoa vàng của 12 tuyến thu thập 61 4.3. Các chỉ tiêu về lá cây trà hoa vàng của 12 tuyến thu thập 63 4.4. Danh sách mẫu lá và nụ hoa trà hoa vàng thu thập tại Quảng Ninh đƣợc sử dụng cho phân tích hợp chất có hoạt tính sinh học 4.5. Hàm lƣợng catechin C, EC, EGCG, ECG, rutin và quercetin trong lá trà hoa vàng 4.6. 68 Hàm lƣợng phenolic CF, PCA, SLA, VA, resveratrol và coumarin trong lá trà hoa vàng 4.7. 70 Hàm lƣợng catechin C, EC, EGCG, ECG, rutin và quercetin trong nụ hoa trà hoa vàng 4.8. 66 73 Hàm lƣợng phenolic CF, PCA, SLA, VA, resveratrol và coumarin trong nụ hoa trà hoa vàng 74 4.9. Đa hình của 25 mẫu giống trà hoa vàng dựa trên chỉ thị RAPD và ISSR 80 4.10. Hệ số tƣơng đồng di truyền của 25 mẫu giống trà hoa vàng 83 4.11. Hiệu quả tạo nguồn vật liệu ban đầu từ đoạn cành mang mắt ngủ 88 4.12. Ảnh hƣởng của vật liệu nuôi cấy tới hiệu quả tạo nguồn vật liệu ban đầu 90 4.13. Ảnh hƣởng của tổ hợp BA và GA3 tới sự nảy mầm của hạt trà hoa vàng 92 4.14. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nền tới sự sinh trƣởng của chồi trà hoa vàng 94 4.15. Ảnh hƣởng của tổ hợp các chất điều tiết sinh trƣởng tới khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây trà hoa vàng viii 95 4.16. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa tới khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây trà hoa vàng 4.17. 98 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng môi trƣờng đến khả năng ra rễ của chồi in vitro cây trà hoa vàng 4.18. 99 Ảnh hƣởng của giá thể đến khả năng thích nghi của cây in vitro ngoài vƣờn ƣơm 4.19. 101 Ảnh hƣởng của tuổi cây in vitro tới khả năng thích nghi của cây ngoài vƣờn ƣơm. 103 4.20. Ảnh hƣởng của biện pháp xử lý đến tỷ lệ sống của cành giâm trà hoa vàng 106 4.21. Ảnh hƣởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cành giâm trà hoa vàng 108 4.22. Ảnh hƣởng của α-NAA đến tỷ lệ ra rễ của cành giâm trà hoa vàng 109 4.23. Ảnh hƣởng của chế phẩm giâm chiết cành đến tỷ lệ hom giâm tạo chồi 111 4.24. Ảnh hƣởng của thời vụ giâm đến khả năng ra rễ của cành giâm cây trà hoa vàng 4.25. 113 Ảnh hƣởng của che sáng đến sinh trƣởng của cây con trà hoa vàng trong giai đoạn vƣờn ƣơm 4.26. 114 Ảnh hƣởng của số lần bón phân đến sinh trƣởng của cây trà hoa vàng trong vƣờn ƣơm 4.27. 115 Ảnh hƣởng của thời gian đảo bầu đến sinh trƣởng của cây giống trong giai đoạn vƣờn ƣơm. 117 ix DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1. Hình dạng chóp lá 7 2.2. Hình dạng gốc lá 7 2.3. Quả hình cầu (A: C. hakodae), hình cầu dẹt (B: C. petelotii) và khi mở để lộ trụ quả (C: C. tamdaoensis) 4.1. 8 Hoa, quả, cây trà hoa vàng thu thập tại tuyến số 1 Khe Sút, Hoành Bồ, Quảng Ninh 4.2. 64 Lá, hoa, quả và cây trà hoa vàng thu thập tại Hoành Bồ, Quảng Ninh, mẫu Csp1 77 4.3. Sơ đồ sự tƣơng đồng của 25 mẫu giống trà hoa vàng dựa trên kiểu hình 77 4.4. Ảnh điện di sản phẩm phản ứng mồi RAPD02 với 25 mẫu trà hoa vàng 79 4.5. Sơ đồ quan hệ di truyền của 25 mẫu giống trà hoa vàng dựa trên chỉ thị phân tử RAPD và ISSR 4.6. 84 Đoạn cành mang mắt ngủ đƣợc khử trùng bằng NaOCl 7% bị nhiễm nấm sau 1 tuần nuôi cấy 4.7. 89 Cây nảy mầm từ hạt trà hoa vàng đƣợc khử trùng bằng NaOCl 7% sau 12 tuần nuôi cấy 4.8. 91 Ảnh hƣởng của tổ hợp BA và GA3 tới quá trình nảy mầm của hạt trà hoa vàng sau 2 tuần nuôi cấy 4.9. 93 Ảnh hƣởng của các tổ hợp chất điều tiết sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro trà hoa vàng sau 4 tuần nuôi cấy 4.10. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng môi trƣờng nuôi cấy tới quá trình ra rễ in vitro cây trà hoa vàng sau 12 tuần nuôi cấy 4.11. 100 Ảnh hƣởng của giá thể tới khả năng thích nghi cây in vitro ngoài vƣờn ƣơm sau 12 tuần nuôi cấy 4.12. 97 102 Ảnh hƣởng của tuổi cây in vitro tới khả năng thích nghi của cây ngoài vƣờn ƣơm (10 tuần sau khi ra cây) 104 4.13. Sơ đồ quy trình nhân giống in vitro cây trà hoa vàng Ba Chẽ, Quảng Ninh 105 4.14. Sơ đồ quy trình nhân giống in vivo cây trà hoa vàng 118 x TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Đặng Quang Bích Tên Luận án: “Đánh giá đa dạng di truyền và xây dựng quy trình nhân giống cây trà hoa vàng (Camellia spp.) thu thập tại Quảng Ninh” Chuyên ngành: Khoa học cây trồng Mã số: 9620110 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Hệ thống hóa đƣợc cơ sở dữ liệu về đặc điểm thực vật, hóa sinh và mức độ đa dạng di truyền trà hoa vàng thu thập ở Quảng Ninh, làm cơ sở cho công tác nghiên cứu và phát triển cây trà hoa vàng thành nguồn dƣợc liệu mới; - Xây dựng quy trình nhân giống cây trà hoa vàng (Camellia spp.) với hệ số nhân giống cao, chất lƣợng cây giống tốt, đồng đều phục vụ bảo tồn và phát triển cây thuốc quý này ở qui mô công nghiệp. Phƣơng pháp nghiên cứu Nội dung nghiên cứu 1) Thu thập nguồn gen, đánh giá đặc điểm hình thái thực vật và hóa sinh cây trà hoa vàng phân bố tại Quảng Ninh; 2) Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen cây trà hoa vàng thu thập đƣợc bằng kỹ thuật chỉ thị phân tử; 3) Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống cây trà hoa vàng. Vật liệu nghiên cứu. Là các mẫu lá, hoa, quả, hạt, đoạn thân và cây trà hoa vàng đƣợc thu thập tại tỉnh Quảng Ninh và một số khu vực có cây trà hoa vàng phân bố. Các phƣơng pháp nghiên cứu: (1) Phƣơng pháp thu thập mẫu (Hoàng Chung, 2006; Nguyễn Nghĩa Thìn, 2007; Nguyễn Bá, 2007); (2) Phƣơng pháp mô tả hình thái và so sánh hình thái (Hoàng Thị Sản và Hoàng Thị Bé, 2005; Nguyễn Nghĩa Thìn, 2009); (3) Phƣơng pháp kế thừa; (4) Phƣơng pháp xác định thành phần hàm lƣợng một số hợp chất thứ cấp, áp dụng phƣơng pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đƣợc mô tả theo Ang et al. (2013) để đánh giá thành phần, hàm lƣợng hợp chất sinh học trong trà hoa vàng; (5) Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị ISSR và RAPD. Kỹ thuật PCR đánh giá đa dạng di truyền sử dụng 8 chỉ thị ISSR và 45 chỉ thị RAPD đƣợc thực hiện trên máy PCR (Eppendorf ). Phản ứng PCR bao gồm các thành phần tiêu chuẩn trong đó sử dụng nồng độ dung dịch đệm theo khuyến cáo của nhà sản xuất, 0,2 mM dNTPs, 0,25 mM MgCl2, 0,5 µM mồi, 0,05 đơn vị enzyme/µl. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với chu kỳ nhiệt nhƣ sau: 94°C - 3 phút, (94°C - 30 giây, Tm - 30 giây, 72°C - 2 phút) x 40 chu kỳ, 72°C - (5 - 7) phút (Valdemar et al., 2004; Oliveira et al., 2010). Xử lý số liệu: Xây dựng sơ đồ đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS 2.1; (6) Phƣơng pháp nghiên cứu kỹ thuật xi nhân giống vô tính in vitro cây trà hoa vàng gồm các phƣơng pháp: phƣơng pháp khử trùng mẫu, phƣơng pháp nuôi cấy khởi động, phƣơng pháp nhân nhanh chồi in vitro, Phƣơng pháp tạo cây hoàn chỉnh in vitro, Phƣơng pháp ra cây ngoài vƣờn ƣơm (Murashige and Skoog, 1962); (7) Phƣơng pháp nghiên cứu kỹ thuật nhân giống bằng kỹ thuật giâm hom cây trà hoa vàng gồm các phƣơng pháp: phƣơng pháp lấy hom, phƣơng pháp cắt hom, phƣơng pháp xử lý và cắm hom, phƣơng pháp theo d i và thu thập số liệu; (8) Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm, phƣơng pháp xử lý số liệu theo chƣơng trình Excel và IRRISTART 5.0. Kết quả chính và kết luận 1) Đã xác định đƣợc đặc điểm hình thái của cây trà hoa vàng thu thập tại Quảng Ninh. Đây là cây bụi, thân gỗ nhỏ, có rễ cọc, sống dƣới tán cây khác, phân cành thấp, lá to, bóng, mép có răng cƣa, hoa lƣỡng tính màu vàng tƣơi, quả hình cầu dẹt, màu xanh có từ 1 tới 9 hạt. Dựa trên các đặc điểm hình thái, có thể xác định đƣợc các mẫu trà hoa vàng nghiên cứu thuộc chi Camellia L. 2) Kết hợp các kết quả phân tích: (1) Đánh giá kiểu gen của 25 mẫu trà hoa vàng bằng chỉ thị phân tử RAPD và ISSR; (2) Đánh giá đặc điểm hình thái; (3) Phân tích các hợp chất có hoạt tính dƣợc lý cho thấy: Các mẫu giống trà hoa vàng có sự tƣơng đồng cao về kiểu hình, đa dạng về kiểu gen và khả năng tích lũy hàm lƣợng các hợp chất có hoạt tính dƣợc lý. 3) Đã xây dựng thành công quy trình nhân nhanh in vitro cây trà hoa vàng, xác định đƣợc môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy phù hợp cho từng giai đoạn nuôi cấy cụ thể. Quy trình cho tỷ lệ tái sinh chồi từ hạt cao 100%, hệ số nhân chồi đạt 4,7 chồi/lần, tỷ lệ chồi ra rễ 100%, chất lƣợng cây in vitro tốt, giá thể ra cây phù hợp cho tỉ lệ cây sống đạt tỷ lệ 93,75%. Kết thúc giai đoạn vƣờn ƣơm, cây giống trà hoa vàng sinh trƣởng và phát triển tốt. 4) Đã xây dựng thành công quy trình sản xuất cây giống trà hoa vàng bằng kỹ thuật giâm hom. Quy trình sử dụng hom giống đƣợc lấy từ cành bánh tẻ trên cây mẹ thành thục trồng tại Ba Chẽ, Quảng Ninh và giá thể giâm là cát. Hom giống và giá thể đƣợc xử lý với Viben C, sau đó sử dụng dung dịch α-NAA ở nồng độ 2000 ppm để xử lý hom giâm nhằm kích thích tạo rễ. Vụ thu là thời vụ thuận lợi cho sự tái sinh của cành giâm với tỷ lệ hom ra rễ đạt 60%, tỷ lệ bật chồi là 56,6% sau 90 ngày giâm hom. Việc tƣới phân bón tổng hợp cho cây bầu trong vƣờn ƣơm với liều lƣợng 2 lít/1m2 với tần suất tƣới là 5-10 ngày một lần là phù hợp cho sinh trƣởng của cây con, đảm bảo chất lƣợng cây giống. Sử dụng biện pháp đảo bầu cây với tần suất 20 - 30 ngày một lần không những giảm chi phí sản xuất mà còn đảm bảo chất lƣợng cây giống cho đến khi xuất vƣờn. xii THESIS ABSTRACT PhD candidate: Đang Quang Bich Thesis title: "Assessment of genetic diversity and establishment of the process of propagation of yellow-flower tea (Camellia spp.) collected in Quang Ninh province" Major: Crop Science Code: 9620110 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives - To systematize the databases on plant characteristics, biochemistry and genetic diversity of yellow-flower tea, which shall serve as a basis for the research and development of yellow-tea trees into new sources of medicines; - Establishing the process of propagation of yellow-flower tea (Camellia spp.) with high multiplication coefficient and good quality seedlings for the preservation and development of this precious medicinal plant on an industrial scale. Materials and Methods The research contents include 1) Collecting the gene resource of yellow-flower tea from Quang Ninh province and evaluating their morphology and biochemical characteristics; 2) Evaluating the genetic diversity by using molecular marker techniques; 3) Researching on some technical measures to propagate yellow-flower tea tree. Research materials Leaf, flower, fruit, seed, stem and yellow-flower tea plant were collected in Quang Ninh province and some areas where yellow-flower tea trees grow. Methodology (1) sample collection (Hoang Chung, 2006; Nguyen Nghia Thin, 2007; Nguyen Ba, 2007); (2) Morphology and morphological comparison (Hoang Thi San and Hoang Thi Be, 2005; Nguyen Nghia Thin, 2009); (3) inheritance method; (4) Determination of content of some secondary compounds. Application of high-performance liquid chromatography (HPLC) method described by Ang et al. (2013) to evaluate composition, content of biological compounds in yellow flower tea; (5) Genetic diversity assessment using ISSR and RAPD directives. Genetic diversity evaluation using eight ISSR directives and 45 RAPD directives were performed on PCR (Eppendorf). PCR responses consisted of standard components which used the manufacturer's recommended buffer concentrations, 0,2 mMdNTPs, 0,25 mM MgCl2, 0,5 μM primers, 0,05 units enzyme/μl. The PCR reaction was performed with the following thermal cycles: 94° C - 3 minutes, 94° C - 30 seconds, Tm - 30 seconds, 72° C - 2 minutes) x 40 cycles, 72° C - (5 - 7) minutes (Valdemar et al., 2004; Oliveira et al., 2010). Data processing: Building genetic diversity diagram using xiii NTSYS 2.1 software; (6) The in vitro propagation of clonal propagation in yellow-flower tea tree includes the following methods: sample sterilization method, starter culture method, in vitro shoot multiplication method, complete in vitro, method of nursing outside the nursery (Murashige and Skoog, 1962); (7) In vivo clonal propagation technique, yellowflower tea includes the following methods: cutting method, cutting method, method of cutting and cutting, method of monitoring and collecting numbers whether; (8) Method of experimental lay-out, data processing using Excel and IRRISTART 5.0. Main findings and conclusions 1) The morphological characteristics of yellow tea were identified in Quang Ninh. This is a shrub, small woody, with pile roots, live under other trees, low branches, big leaves, shadows, serrated edges, bright yellow hermaphroditic flowers, flat spherical, blue colour from 1 to 9 seeds. Based on morphological characteristics, the samples of Camellia L. can be identified. 2) Combining the analytical results: (1) Genotyping of 25 yellow and green tea samples by RAPD and ISSR; (2) morphological characterization; (3) Analysis of pharmacologically active compounds showed that yellow-flower tea samples exhibited high phenotypic similarity, genetic diversity and ability to accumulate the compounds that contain pharmacological activity 3) The in vitro rapid growth of yellow-flower tea trees has been successfully established, and the culture conditions have been established for each specific stage of culture. The procedure for seed regeneration rate from 100% seedlings, shoot multiplication ratio of 4,7 shoot/times, 100% root-shoot growth rate, good in vitro seedling quality, suitable seedling ratio. The survival rate was 93,75%. At the end of the nursery stage, the yellow flower tea seedlings grow and develop well. 4) The production process of yellow-flower tea seedlings has been successfully developed using cuttings technique. A sharp knife was used to cut the middle of the branches of the noodles on the mother tree (of yellow-flower tea) in Ba Che, Quang Ninh Province to grow seedlings. Cuttings and media were treated with Viben C, cuttings were then immersed in a solution of α-NAA at 2000 ppm to stimulate root formation. The best setting is the sand bed. Seasonal cuttings are favourable for the regeneration of cuttings is the autumn crop. After 90 days cuttings, the rate of cuttings is 60%, the rate of shoot cuttings is 56,6%. At the nursery stage, NPK fertilizer (20-20-20) Grow more concentration of 0,5% for potted plants in nurseries with the dose of 2 litres /1m2 with the frequency of irrigation is 5-10 days. Once it is suitable for the growth of seedlings, ensure quality seedlings. It is possible to use the method of invasive planting with the frequency of every 20-30 days to reduce production costs, ensure quality seedlings until the garden. xiv PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Trà hoa vàng (Camellia spp.), thuộc họ chè (Theaceae), là loài thực vật quý hiếm có giá trị làm cảnh và có giá trị chữa bệnh. Cho đến nay trà hoa vàng chỉ đƣợc tìm thấy ở một số vùng thuộc Trung Quốc, Việt Nam và đã đƣợc ghi vào sách đỏ (Trần Ninh và Hakoda, 2009; George and Anthony, 2013). Trà hoa vàng có tinh dầu, polyphenol, các alkaloid, các vitamin, các nguyên tố nhƣ Se, Ge, Mo, Mn, Zn (Qin et al., 2008), có tác dụng trong việc phòng và chữa một số bệnh nhƣ: cao huyết áp, kiết lị, lở loét và một số bệnh ngoài da khác. Những năm gần đây, việc kiểm nghiệm dƣợc lý đầu tiên của trà hoa vàng đã đƣợc tiến hành trên động vật và đã cho kết quả khả quan. Thử nghiệm trên chuột cho thấy, dịch chiết từ lá và hoa của cây trà hoa vàng có khả năng ức chế tế bào tiền ung thƣ gan (Li et al., 2007). Nghiên cứu khác của Chen et al. (1993) và Qin et al. (2008) đã chỉ ra rằng trà hoa vàng có tác dụng rõ rệt trong việc giảm lƣợng lipid máu, rất tốt cho bệnh cao huyết áp do khả năng làm giảm và điều hòa huyết áp, tăng cƣờng hệ miễn dịch và kéo dài tuổi thọ. Trà hoa vàng còn chứa các hợp chất polyphenol chống oxy hóa cao hơn so với các loại trà khác (Qin et al., 2008; Lixia et al., 2011). Các flavonids, polyphenol, polysaccharide, trong trà hoa vàng có tác dụng chống viêm, ức chế ung thƣ gan, chống quá trình oxi hóa, điều chỉnh lipid huyết thanh giảm và kích thích sự thèm ăn và đặc biệt là không có tác dụng phụ (Chen et al., 2009; Lin et al., 2013; Wei et al., 2015). Có thể nói, trà hoa vàng là cây dƣợc liệu rất quý, rất cần đƣợc bảo tồn, phát triển và khai thác hiệu quả nguồn gen. Trà hoa vàng là nguồn dƣợc liệu quý nên những năm gần đây, trà hoa vàng phân bố ở Quảng Ninh nói riêng và Việt Nam nói chung đang trong tình trạng khai thác quá mức do chƣa có biện pháp quản lý, sử dụng và bảo tồn phù hợp nên các quần thể trà hoa vàng trong tự nhiên giảm mạnh, sự phân bố cũng bị thu hẹp (Trần Ninh và Hakoda, 2010; Ngô Thị Minh Duyên và cs., 2011; Đỗ Văn Tuân, 2013-2016, Nguyễn Văn Việt và cs., 2017). Do đó, rất cần thiết phải có biện pháp bảo tồn nguồn gen trà hoa vàng. Một trong những thông tin làm cơ sở cho việc quản lý, bảo tồn nguồn gen là sự đa dạng di truyền nguồn gen của cây trà hoa vàng. Tuy nhiên, các thông tin về đa dạng di truyền nguồn gen trà hoa vàng phân bố ở nƣớc ta còn ít, đa số các loài trà hoa vàng đƣợc phân loại dựa 1 theo hình thái (Trần Ninh và Hakoda, 2010; Ngô Thị Thảo và cs., 2016). Chính vì vậy, những phân tích đa dạng di truyền dựa trên sự kết hợp giữa phân tích kiểu hình và chỉ thị phân tử nhƣ RAPD hoặc ISSR sẽ góp phần làm đa dạng nguồn thông tin và do vậy sẽ hỗ trợ rất hiệu quả trong phân tích đa dạng nguồn gen trà hoa vàng. Bên cạnh công tác bảo tồn nguồn gen thì việc khai thác và phát triển nguồn gen cũng là nhiệm vụ quan trọng, đóng góp thiết thực vào việc phát triển kinh tế xã hội đặc biệt tại vùng khó khăn về kinh tế. Đối với cây trà hoa vàng, thì việc xây dựng quy trình nhân nhanh nhằm nhanh chóng cung cấp cây giống cho sản xuất sẽ không những góp phần duy trì đƣợc tập đoàn nguồn gen mà còn góp phần khai thác, sử dụng hiệu quả và bền vững nguồn gen trà hoa vàng quý phục vụ phát triển kinh tế xã hội của các vùng trồng cây trà hoa vàng nhƣ Quảng Ninh. Thời gian gần đây, các biện pháp nhân giống truyền thống nhƣ giâm cành, ghép cành và ghép cây con cũng đƣợc sử dụng để nâng cao năng suất số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng cây giống trà hoa vàng đƣợc trồng tại Quảng Ninh. Đây là những biện pháp nhân giống trà hiệu quả, tuy nhiên nó lại bị hạn chế bởi một số yếu tố nhƣ: tốc độ nhân chậm, không có sẵn vật liệu trồng thích hợp, phụ thuộc vào thời vụ, tỉ lệ sống kém ở vƣờn ƣơm, khó khăn trong quá trình tạo rễ từ cành giâm (Smith and Hood, 1995; Mondal et al., 2004). Việc ứng dụng chỉ thị phân tử để phân loại, đánh giá đa dạng di truyền cây trà hoa vàng phân bố ở Quảng Ninh và sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong nhân giống sẽ không chỉ góp phần cung cấp thêm thông tin khoa học để bảo vệ nguồn gen mà còn là phƣơng thức hiệu quả để phát triển nguồn dƣợc liệu phục vụ công nghiệp dƣợc. Xuất phát từ những lý do trên, việc thực hiện đánh giá đa dạng di truyền cây trà hoa vàng và xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho cây trà hoa vàng Quảng Ninh làm cơ sở cho ứng dụng trong nhân giống ở quy mô lớn là cấp thiết. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI - Hệ thống hóa đƣợc cơ sở dữ liệu về đặc điểm thực vật, hóa sinh và mức độ đa dạng di truyền trà hoa vàng thu thập ở Quảng Ninh, làm cơ sở cho công tác nghiên cứu và phát triển cây trà hoa vàng thành nguồn dƣợc liệu mới; - Xây dựng quy trình nhân giống cây trà hoa vàng (Camellia spp.) Ba Chẽ, Quảng Ninh với hệ số nhân giống cao, chất lƣợng cây giống tốt, đồng đều phục vụ bảo tồn và phát triển cây thuốc quý này ở qui mô công nghiệp. 2 1.3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu Các mẫu giống trà hoa vàng (Camellia spp.) đƣợc thu thập chủ yếu từ tỉnh Quảng Ninh, trong thời gian 3 năm từ 2014 đến 2017. 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu - Thu thập nguồn gen cây trà hoa vàng tại Quảng Ninh, đánh giá một số đặc điểm thực vật, hóa sinh và đa dạng di truyền ở mức độ hình thái và phân tử của chúng, trên cơ sở so sánh với một số nguồn gen thu thập từ địa phƣơng khác trong và ngoài nƣớc; - Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cây trà hoa vàng Ba Chẽ, Quảng Ninh cho vật liệu triển vọng bằng kỹ thuật giâm hom và kỹ thuật nhân giống in vitro. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Luận án đã bổ sung các tƣ liệu khoa học mới về mức độ đa dạng di truyền nguồn gen, đặc điểm thực vật và hóa sinh cây trà hoa vàng (Camellia spp.) thu thập tại Quảng Ninh; - Đã xây dựng đƣợc quy trình nhân giống in vitro và in vivo cho loài trà hoa vàng (Camellia spp.) thu thập tại Ba Chẽ, Quảng Ninh. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp thông tin khoa học mới về đa dạng di truyền, đặc điểm thực vật, hóa sinh của cây trà hoa vàng (Camellia spp.) ở tỉnh Quảng Ninh, Việt Nam; - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá trị về khả năng nhân giống in vitro cây trà hoa vàng (Camellia spp.) thu thập tại Quảng Ninh; - Kết quả nghiên cứu cũng là tài liệu tham khảo cho việc nghiên cứu, giảng dạy về chi Camellia nói chung và loài trà hoa vàng (Camellia spp.) nói riêng. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn - Đề tài cung cấp dữ liệu phân tử nguồn gen, đặc điểm thực vật, hóa sinh cho các chƣơng trình chọn tạo giống trà hoa vàng tại Quảng Ninh, góp phần bảo tồn cũng nhƣ phát triển loài trà hoa vàng (Camellia spp.); - Đề xuất đƣợc quy trình nhân giống vô tính loài trà hoa vàng (Camellia spp.) thu thập tại Ba Chẽ, Quảng Ninh. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI TRÀ CAMELLIA VÀ TRÀ HOA VÀNG (CAMELLIA SPP.) 2.1.1. Nguồn gốc chi trà Camellia Chi Camellia có dạng cây bụi là chi thực vật có hoa trong họ Theaceae và có nguồn gốc ở Đông Á. Chi Camellia đƣợc Linnaeus đặt theo tên của nhà truyền giáo dòng Kamel, ngƣời đầu tiên trồng hoa hồng Nhật Bản ở châu Âu, một nhà thực vật học và là một thầy tu. Trong hệ thống phân loại Naturae năm 1735, Linnaeus đã đặt tên Camellia tsubaki cho loài thực vật đƣợc tìm thấy ở Nhật Bản là tsubaki và sau này đƣợc ông đặt tên là Camellia japonica trong tác phẩm “Giống loài thực vật”, đây đƣợc xem là loài trà đâu tiên trong chi Camellia (Mondal, 2011). Theo Mondal (2011) trung tâm nguồn gốc của chi Camellia nằm ở phía nam và tây nam Trung Quốc, các loài Camellia trên thế giới có nguồn gốc tập trung chính tại các tỉnh Vân Nam, Quảng Tây và Quảng Đông nằm giữa khu vực kinh độ 85° W (kinh Tây) và 150° E (kinh Đông) và vĩ độ 37° N (Đông - Tây) và 10° S, nhƣng sự phân bố trong khu vực này không đồng đều. Một số loài, C. japonica và C. lancelolata có nguồn gốc từ Nhật Bản, Philippines cũng nhƣ Indonesia. Theo Nguyễn Duy Chính (2005) chi trà Camellia có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới (subtropical) tại Ðông và Nam Châu Á - chủ yếu là Trung Hoa, Hải Nam, Ðài Loan và Ðông Nam Á - thuộc họ trà (tea plant) có tên khoa học là Theaceae có 42 chủng loài và mỗi loài có nhiều giống khác nhau. Theo nghiên cứu của các nhà khoa học Việt Nam hiện nay nhƣ Nguyễn Duy Chính (2005), Võ Thái Dân (2006), Lê Quốc Doanh (2006), Trần Ninh và Hakoda (2009), Nguyễn Hữu La (2011) thì chi Camellia có nguồn gốc ở khu vực Assam, Ấn Độ sang Miến Điện, Vân Nam - Trung Quốc, phía Bắc Việt Nam và Thái Lan. Từ đó chia ra làm hai nhánh, một đi xuống phía Nam, và một đi lên phía Bắc, trung tâm là vùng Vân Nam - Trung Quốc. Điều kiện khí hậu ở đây đƣợc cho là phù hợp với chi Camellia sinh trƣởng quanh năm (Lê Quốc Doanh, 2006; Nguyễn Hữu La, 2011). Hiện vẫn còn mâu thuẫn liên quan tới số lƣợng loài đang tồn tại trong chi Camellia, với 82 loài đã đƣợc mô tả vào năm 1958 bởi Sealy (Sealy, 1958), sau đó 200 loài đƣợc mô tả bởi Zhijian et al., (1988) và gần đây vào năm 2002 Mondal đã mô tả và phân loại hơn 325 loài (Mondal, 2002). 4