Tài liệu Khả năng sinh trưởng của cordycep sp1. và isaria javanica trên môi trường rắn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH -------------- TRẦN ĐÌNH ĐƯỜNG KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA Cordycep sp1. VÀ Isaria javanica TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NGÀNH: NÔNG HỌC Vinh – 2011 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH -------------- KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA Cordycep sp1. VÀ Isaria javanica TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NGÀNH: NÔNG HỌC Người thực hiện : Trần Đình Đường Lớp : 48K2 – Nông học Người hướng dẫn : PGS.TS. Trần Ngọc Lân Vinh – 2011 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, các số liệu được thu thập qua các thí nghiệm do bản thân tiến hành và chưa từng sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan các thí nghiệm để thu thập số liệu trong luận văn đã được chính bản thân tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh học Nông nghiệp, khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại Học Vinh với sự đồng ý và hướng dẫn của PGS. TS Trần Ngọc Lân, giáo viên hướng dẫn và các kĩ thuật viên phụ trách phòng thí nghiệm. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Vinh, ngày 20 .tháng 07 năm 2011 Tác giả Trần Đình Đường 3 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp ngành kĩ sư Nông học, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phía thầy cô, bạn bè, người thân. Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt tới PGS. TS. Trần Ngọc Lân, Th.S Nguyễn Thị Thúy, KS Trần Văn Cảnh, những người hướng dẫn tôi từ những bước đầu làm nghiên cứu khoa học, đã rất tận tâm và nhiệt tình hướng dẫn tôi suốt thời gian làm đề tài luận văn tốt nghiệp. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong tổ bộ môn Bảo vệ thực vật, các giáo viên phụ trách, các kĩ thuật viên phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình làm đề tài. Và tôi xin được chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè đã động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Vinh, ngày 20 tháng 07 năm 2011 Tác giả Trần Đình Đường 4 MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục các bảng số liệu Danh mục các hình vẽ Danh mục chữ cái viết tắt 1. 2. 3. 3.1. 3.2. 3.3. 4. 1.1 MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tượng, phạm vi và phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU Cơ sở khoa học i ii Vi Vii ix 1 1 4 4 4 4 4 5 6 6 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3. 1.1.3.1. 1.1.3.2. 1.2. Nấm ký sinh côn trùng Cơ chế tác động của nấm lên cơ thể côn trùng Giả thuyết khoa học Câu hỏi nghiên cứu Giả thuyết khoa học Tình hình nghiên cứu ứng dụng nấm Cordyceps và Isaria 6 7 10 10 10 1.2.1. 1.2.2. trên thế giới Nghiên cứu về đa dạng nấm ký sinh côn trùng loài Cordyceps Các hoạt chất sinh học có trong nấm Cordyceps và nấm Isaria 10 10 11 1.2.2.1. 1.2.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.3. Các hoạt chất sinh học có trong nấm Cordyceps Các hoạt chất sinh học có trong nấm thuộc nhóm Isaria Tình hình nghiên cứu về công nghệ lên men Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm từ nấm Cordyceps Tình hình nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng ở 11 13 14 17 19 Việt Nam CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Quy trình nghiên cứu 2.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu 2.3. Vật liệu nghiên cứu 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp thu thập nấm ký sinh côn trùng 2.4.1.1. Đặc điểm của nơi thu thập 2.4.1.2. Phương pháp thu thập 5 21 21 22 22 22 22 22 23 2.4.1.3. Thời gian thu thập 2.4.2. Phương pháp phân lập và bảo quản giống 2.4.2.1. Môi trường nuôi cấy 2.4.2.2. Phương pháp phân lập 2.4.2.3. Phương pháp cấy truyền 2.4.2.4. Phương pháp bảo quản giống 2.4.3. Phương pháp xác định số lượng bào tử 2.4.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.4.4.1. Thí nghiệm nhân nuôi nấm Isaria javanica trên môi trường rắn 2.4.4.2. Thí nghiệm nhân nuôi nấm Cordyceps sp1. trên môi trường rắn 2.5. Phương pháp xử lý số liệu CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm hình thái của nấm ký sinh côn trùng Cordyceps 23 24 24 25 25 27 28 30 3.1.1. 3.1.2. 3.2. sp1. và Isaria javanica Đặc điểm hình thái nấm ký sinh côn trùng Cordyceps sp1. Đặc điểm hình thái của Isaria javanica Ảnh hưởng của hàm lượng gạo lứt đến sự sinh trưởng và 31 31 33 36 3.2.1. phát triển của Cordyceps sp1. và Isaria javanica Ảnh hưởng của hàm lượng gạo tới khả năng sinh trưởng và phát 36 3.2.2. triển của sợi nấm Cordyceps sp1. trên môi trường rắn Ảnh hưởng của hàm lượng gạo lứt tới khả năng sinh trưởng, 3.2.3. phát triển của sợi nấm Isaria javanica trên môi trường rắn Khả năng phát sinh bào tử trên môi trường rắn của Cordyceps 40 41 3.2.4. 3.3. sp1. Khả năng phát sinh bào tử của nấm Isaria javanica Ảnh hưởng của hàm lượng bột nhộng tằm đến khả năng sinh 42 42 3.3.1. 3.3.2. 3.3.3. trưởng và phát triển của nấm C. sp1. và Isaria javanica Sinh trưởng của Cordyceps sp1. trên môi trường rắn Sinh trưởng của Isaria javanica trên môi trường rắn Khả năng phát sinh bào tử của nấm Cordyceps sp1. khi thay đổi 42 45 47 3.3.4. lượng bột nhộng tằm Khả năng phát sinh bào tử của nấm Isaria javanica trên môi 50 3.4. trường rắn Xây dựng quy trình nhân sinh khối nấm Cordyceps sp1. và 51 nấm Isaria javanica KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 54 55 56 6 30 30 32 PHỤ LỤC DANH MỤC CẤC BẢNG SỐ LIỆU Bảng Bảng 3.1. Tên bảng Trang Khả năng bao phủ bề mặt môi trường rắn của nấm 35 Bảng 3.2. Cordyceps sp1. Khả năng bao phủ toàn bộ khối môi trường rắn của nấm Cordyceps sp1. ở các công thức. Ảnh hưởng của hàm lượng gạo lứt tới khả năng bao 36 Bảng 3.3. 37 Bảng 3.4. phủ bề mặt môi trường của nấm Isaria javanica. Khả năng bao phủ toàn bộ khối môi trường rắn của 38 Bảng 3.5. nấm Isaria javanica. Khả năng phát sinh bào tử của Cordyceps sp1. trên cơ chất gạo lứt ở môi trường rắn. Khả năng sinh bào tử của nấm Isaria javanica trên 40 Bảng 3.6. 41 Bảng 3.7. môi trường rắn. Khả năng sinh trưởng của nấm Cordyceps sp1. trên 43 Bảng 3.8. bề mặt môi trường rắn. Khả năng bao phủ toàn bộ khối môi trường của nấm Cordyceps sp1. trên môi trường rắn theo lượng bột 43 Bảng 3.9. nhộng tằm Khả năng sinh trưởng của nấm trên môi trường rắn cơ chất thay đổi. 45 Bảng 3.10. Khả năng bao phủ toàn bộ khối cơ chất của nấm 46 Bảng 3.11. Isaria javanica. Ảnh hưởng của hàm lượng bột nhộng tằm đến khả năng sinh bào tử của nấm C. sp1. 48 7 Bảng 3.12. Khả năng sinh bào tử của trên môi trường rắn của 49 Isaria javanica. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Hình 1.1. Hình 1.2. Hình 2.1. Hình 3.1. Hình 3.2. Nội dung Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng Mô tả phương pháp chuẩn bi môi trường rắn Mẫu nấm Cordyceps sp1. Mẫu Isaria javanica. trên môi trường PDA và bào tử Trang 07 09 26 32 Hình 3.3. quan sát dưới kính hiển vi. Sự phát triển của sợi nấm Cordyceps sp1. trên bề 34 35 Hình 3.4. mặt môi trường Sự phát triển ăn sâu vào môi trường của nấm 36 Hình 3.5. Cordyceps sp1 Khả năng bao phủ bề mặt môi trường của Isaria 37 Hình 3.6. javanica Sự phát triển ăn sâu vào môi trường của Isaria 38 Hình 3.7. Hình 3.8. javanica Nhân nuôi Isaria javanica Sự phát sinh bào tử trên cơ chất gạo lứt của nấm 39 40 Hình 3.9. Cordyceps sp1. Nấm Cordyceps sp1 trên môi trường rắn với cơ chất 41 Hình 3.10. gạo lứt Khả năng sinh bào tử của nấm Isaria javanica trên 41 Hình 3.11. Hình 3.12. môi trường rắn với cơ chất gạo lứt Khả năng sinh trưởng bề mặt Sự tăng trưởng về khối lượng và độ dày của 43 44 Hình 3.13. Hình 3.14 Hình 3.15 . Cordyceps sp1 Cordyceps sp1. trên bề mặt môi trường. . Cordyceps sp1 sau 8 ngày nhân nuôi Ảnh hưởng hàm lượng bột nhộng tằm đến khả năng 44 44 45 Hình 3.16. bao phủ bề mặt môi trường của nấm Isaria javanica Isaria javanica trên môi trường rắn thay đổi hàm 45 lượng nhộng tằm 8 Hình 3.17. Khả năng ăn sâu và phủ kín khối môi trường của 46 Hình 3.18. nấm I. javanica Ảnh hưởng hàm lượng bột nhộng tằm đến khả năng 49 phát sinh bào tử của nấm Cordyceps sp1. trên môi Hình 3.19. Hình 3.20. Hình 3.21. trường rắn Sự phát sinh bào tử nấm I. javanica sau 9 ngày. Sơ đồ quy trình nhân sinh khối nấm Cordyceps sp1. và I. javanica DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Chữ viết tắt BN Bt C Nội dung Bột gạo nếp Bào tử Các bon 9 49 49 52 C. CT ĐTHT CV% EPF Lsd0.05 MT N PDA SD TB VQG Cordyceps Công thức Dông trùng - Hạ thảo Độ biến thiên của mẫu Entomology Pathogenic Fungi – Nấm ký sinh côn trùng phương sai mẫu Môi trường Ni tơ Potato Dextrose Agar Độ lệch chuẩn Trung bình Vườn Quốc Gia 10 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn dề tài Nấm ký sinh côn trùng - Entomology pathogenic fungi (EPF) hay nấm côn trùng (Insect fungi) không chỉ là một nhóm có tính đa dạng sinh học cao, nguồn lợi tài nguyên quý giá mà còn có vai trò rất quan trọng trong phòng trừ sinh học sâu hại cây trồng và trong y - dược. Theo đánh giá của David Hawkswrth, trong tự nhiên có khoảng 1,5 triệu loài EPF đang chờ các nhà khoa học khám phá. Cho đến nay, trên thế giới có khoảng 700 loài EPF đã được xác định. Trong đó ở Thái Lan đã phát hiện được hơn 400 loài nấm ký sinh côn trùng (Morakot, 2003) (Dẫn theo Trần Ngọc Lân, 2007) [11]. Nấm ký sinh côn trùng được sử dụng nhiều để sản xuất các hoạt chất sinh học, enzim, sản xuất thuốc chữa bệnh cũng như các chất tăng cường sinh lực cho con người như Cordyceps sinensis “Đông trùng - Hạ thảo” (Nguyễn Lân Dũng và nnk, 2005) [3]. Nấm ký sinh côn trùng được xem như là nguyên liệu sản xuất thủ công nghiệp và công nghiệp các chất y - dược chữa nhiều bệnh cho con người, như ở Trung Quốc hiện có ít nhất 25 sản phẩm của Cordyceps sinensis từ công nghệ sinh học nấm ký sinh côn trùng (www.made-in-china.com). Các quốc gia phát triển Hoa Kỳ, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Hàn Quốc đã nghiên cứu thành công và triển khai nhân nuôi sản xuất nấm ký sinh côn trùng ở quy mô nông hộ, quy mô thủ công nghiệp và quy mô công nghiệp. Cordyceps là một giống nấm côn trùng thuộc giống nấm túi (Ascomycetes), bộ Clavicipitales, họ Clavicipitaceae. Tất cả các loài Cordyceps ký sinh chủ yếu trên côn trùng và động vật chân khớp, một số ít ký sinh trên các loài nấm khác. Loài được biết đến nhiều nhất của giống là Cordyceps sinenesis - nấm phát triển trên sâu bướm thực vật, một thành phần quý giá trong các vị thuốc cổ truyền của Trung Hoa [12]. Trên thế giới hiện có hơn 400 loài của giống Cordyceps đã được mô tả, trong khi đó ở Trung Quốc đã tìm thấy hơn 60 loài, nhưng cho đến nay mới chỉ tập trung 11 nghiên cứu trên 2 loài chủ yếu (Cordyceps sinensis (Beck.) Sacc. - Đông trùng Hạ thảo và Cordyceps militaris (L. Ex Fr.) Link - Nhộng trùng thảo) (http://www.sgtt.com.vn) [13]. Cùng nằm trong họ Cordycipitaceae với loài Cordyceps nhưng sinh sản ở dạng vô tính, loài Isaria javanica và một số loài khác (Sung et al, 2007) qua phân tích hóa sinh cho thấy những hoạt chất sinh học độc đáo tiềm ẩn. Giống nấm Cordyceps và loài Isaria là giống nấm đặc biệt, có nhiều ứng dụng để sản xuất ra các hoạt chất sinh học, sản xuất thuốc chữa bệnh và các sản phẩm chức năng nhằm tăng cường sinh lực của con người. Chính vì những tính chất độc đáo về dược liệu đã tạo nên giá trị hàng hóa khá cao và được sử dụng ngày càng rộng rãi, tăng liều lượng dẫn đến thu hoạch quá mức làm giảm nguồn tài nguyên hoang dã, mặt khác đề phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn về nấm ký sinh côn trùng và nấm dược liệu nên người ta cần một số lượng lớn. Để bù đắp cho sự thiếu hụt đó các nhà khoa học đã tiến hành mở rộng nghiên cứu nhân nuôi nhân tạo trên các chất nền như các loại hạt ngũ cốc, sâu non, tằm, nhộng tằm và một số nguyên liệu khác bằng việc mô tả các đặc điểm tự nhiên của chúng. Đặc biệt là sự thành công về nhân nuôi Cordyceps trên môi trường rắn nhân tạo, tạo ra các hoạt chất sinh học, các thực phẩm chức năng có giá trị dinh dưỡng cao. Các nước Tây Âu gọi thực phẩm chức năng (functional) là dược phẩm dinh dưỡng (nutraceutics) hay thực phẩm bổ sung dinh dưỡng (food suplement), còn ở Trung Quốc gọi là thực phẩm bổ dưỡng bảo vệ sức khỏe. Loại thực phẩm này nằm giữa ranh giới giữa thức ăn và thuốc chữa bệnh. Các loại hoạt chất mà thực phẩm chức năng mang lại cho con người chính là những vị thuốc quý giúp con người phòng và chữa bệnh, kể cả những bệnh hiểm nghèo. Theo dự báo của các chuyên gia, thì “thức ăn của con người trong thế kỷ XXI là thực phẩm chức năng” (Nguyễn Tài Lương, 2008) [7] Các nghiên cứu trong y học và dược hoc đã chứng minh nấm thuộc loài Cordyceps sinensis (Đông trùng - Hạ thảo) có tới 25 tác dụng về các chức năng và 12 bệnh thuộc thận, huyết áp, tim mạch, nội tiết tố, miễn dịch, ung thư, an thần, ... (Nguyễn Lân Dũng, 2005) [2]. Các nghiên cứu phân tích hóa sinh cho thấy trong sinh khối (biomas) của nấm ký sinh côn trùng, như Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có tới 17 axit amin khác nhau, có chứa nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, K, Na, ...), các loại vitamin (như A, B12, B2, C, ...) và quan trọng nhất là có nhiều hoạt chất sinh học có giá trị dược liệu thần kỳ (như HEAA - Hydroxy ethyl adenosine analogs, cordyceptic acid, cordycepin, adenosine, ...) [6]. Loài nấm ký sinh côn trùng Cordyceps unilateralis có các dẫn xuất của napthoquinone có hoạt chất sinh học cao như eythrostominone, deoxyrythostominone, 4- O - methyl erythrostominone, epierythrostominol, deoxyerythrosstominol và đặc biệt là 3,5 - β - trihydrooxy - 6 methoxy - 2 - (5 - oxyohexa - 1,3 - dienyl) - 1,4 - naphthoquinone được xem như là chất có khả năng chống lại bệnh sốt rét (Dẫn theo Trần Ngọc Lân, 2008) [11, tr. 1 2 ], và qua nghiên cứu, hóa phân tích sơ bộ cho thấy loài một số loài như Isaria javanica, Cordyceps sp1. (VN1331), có một số thành phần hóa học đặc biệt mới, đã mang đến nhiều hy vọng về tính chất dược lý quan cũng như dạng thực phẩm chức năng quan trọng từ các loài này. Đối với Việt Nam, công nghệ nấm ký sinh côn trùng là một lĩnh vực mới, đặc biệt là đối với các loài nấm ký sinh côn trùng có các hoạt chất sinh học cao và dùng làm dược liệu. Cho đến nay nước ta chỉ mới có một số công trình nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng như Beauveria và Metarhizium, trong tự nhiên còn rất nhiều loài nấm ký sinh côn trùng mà ta chưa biết đến. Trung tâm nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học Nông nghiệp, Trường Đại học Vinh (CRABTA - VU) đã thu thập được trên lớp dất mặt của rừng nguyên sinh thuộc vườn quốc gia Pù Mát - Nghệ An mẫu nấm ký sinh côn trùng Cordyceps sp1. (ở độ cao 800 - 1000 m so với mực nước biển), Isaria javanica và nhiều mẫu nấm ký sinh côn trùng khác. Qua nghiên cứu cho thấy rằng, loài Cordyceps sp1. có những điểm giống và có những điểm không giống với loài Cordyceps sinensis của Trung Quốc (Trần Ngọc Lân và cs., 2008). 13 Việc tiến hành thu thập và tìm ra được mâu nấm Cordyceps sp1. và Isaria javanica đã mang đến triển vọng lớn, hứa hẹn các nghiên cứu về Đông trùng - Hạ thảo ở Việt Nam. Tuy nhiên việc chứng minh được tác dụng của nấm ký sinh côn trùng thông qua các chất có hoạt tính sinh học cao và nghiên cứu các thực phẩm chức năng đòi hỏi phải tiến hành nhiều nghiên cứu, nhiều phân tích tỉ mỉ. Trong khi đó, qua nhiều đợt thu thập thì mẫu vật Cordyceps sp1. có được chỉ dừng lại ở một vài mẫu. Chính vì vậy, cần tiến hành các nghiên cứu để tìm ra phương pháp nhân nhanh sinh khối nấm Cordyceps sp1. và Isaria javanica. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Quy trình nhân sinh khối nấm Cordyceps sp1., Isaria javanica trên môi trường rắn”. 2. Mục đích nghiên cứu Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của nấm Cordyceps sp1. và Isaria javanica trên môi trường rắn với các hàm lượng cơ chất khác nhau và phương pháp nhân nhanh sinh khối thích hợp. Từ đó xây dựng quy trình nhân nhanh sinh khối nấm, phục vụ cho các nghiên cứu ứng dụng trong phòng trừ sinh học và y - dược. 3. Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu Loài nấm Cordyceps sp1. và Isaria javanica được nhóm nghiên cứu của Trung tâm Nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ sinh học Nông nghiệp, trường Đại học Vinh (CRABTA - VU) thu thập trên đất mặt của rừng nguyên sinh thuộc Vườn Quốc gia Pù Mát - Nghệ An vào tháng 1 năm 2008. 3.2. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bảo vệ thực vật và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Nông nghiệp, khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Vinh trong thời gian từ tháng 01 năm 2010 đến tháng 07 năm 2010. 3.3. Nội dung nghiên cứu Đề tài được tiến hành nghiên cứu với các nội dung sau: 14 - Đánh giá sự sinh trưởng, phát triển của nấm Cordyceps sp1. trên môi trường rắn. - Đánh giá sự sinh trưởng, phát triển của nấm Isaria javnica trên môi trường rắn. - Hoàn thiện và xây dựng quy trình nhân sinh khối nấm Cordyceps sp1 và Isaria javnica trên môi trường rắn. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Đề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cho những nghiên cứu sâu hơn trong nghiên cứu nhân nuôi nấm ký sinh côn trùng. Kết quả của đề tài sẽ bổ sung cho những nghiên cứu trước đó về nấm Cordyceps sp1 và Isaria javanica, đồng thời làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về nấm ký sinh côn trùng. 15 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cơ sở khoa học 1.1.1. Nấm ký sinh côn trùng “Nấm ký sinh côn trùng – Entomology pathogenic fungi (EPF)” hay “nấm côn trùng – Insect fungi” là khái niệm được các nhà khoa học sử dụng như là một thuật ngữ đồng nghĩa, đề cập về nhóm sinh vật (nấm) ký sinh gây bệnh cho côn trùng. Nấm ký sinh côn trùng vừa là nhóm có tính đa dạng sinh học cao: trên thế giới có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó ở Thái Lan có khoảng 70000 – 150000 loài nấm và hơn 2000 loài nấm ký sinh côn trùng. Vừa có vai trò quan tronhj trong phòng trừ sinh học sâu hại cây trồng và trong y dược [11,tr.1]. Nấm ký sinh côn trùng được chia thành 4 nhóm (Evan, 1988) (Dẫn theo Trần Ngọc Lân, 2008) [11] - Ký sinh trong tức là nấm ký sinh trong các nội quan, xoang cơ thể của côn trùng ký chủ. - Ký sinh ngoài tức là nấm phát triển trên lớp vỏ cuticun của cơ thể côn trùng và gây nên bẹnh hại cho ký chủ côn trùng. - Nấm mọc trên côn trùng tức là những nấm đã trực tiếp hoặc gián tiếp chứng minh chúng ký sinh trên côn trùng (Samson et al., 1988). - Cộng sinh, tức là nấm và côn trùng cùng nhau mang lại những lợi ích cho nhau trong mối quan hệ cùng nhau chung sống. Nấm còn được chia ra thành ký sinh sơ cấp (primery pathogen) và ký sinh thứ cấp (secondary pathogen) (Pu và Li, 1996). Nấm ký sinh sơ cấp thường nhiễm vào ký chủ côn trùng khỏe mạnh, gây bệnh và sau đó giết chết côn trùng. Trong khi đó, nấm ký sinh thứ cấp chỉ có thể ký sinh trên những côn trùng bị yếu hoặc côn trùng bị thương. Các mầm bệnh ký sinh trên côn trùng trưởng thành hoặc côn trùng bị bệnh được gọi là ký sinh cơ hội hoặc ký sinh không chuyên tính, loại ký sinh này có thể nhiễm vào ký chủ thông qua sự xâm nhập qua lớp cuticun vỏ cơ thể của côn trùng. 16 Các nấm ký sinh trên côn trùng bị thương gọi là bệnh lây qua vết thương. Sự khác nhau của ký sinh cơ hội và ký sinh qua vết thương đó là ký sinh qua vết thương chỉ có thể xâm nhập vào côn trùng qua vết thương. Như vậy, nấm ký sinh côn trùng (EPF) được dùng để mô tả hiện tượng nấm ký sinh trên hoặc trong ký chủ côn trùng. Theo Tzean và cs (1997), khái niệm này cũng được dùng cho nấm ký sinh trên nhện bởi vì nhện và côn trùng là 2 nhóm (lớp) trong một ngành (phyllum) Động vật chân khớp (Arthropoda) và chúng có cùng kiểu sinh thái ăn thực vật hoặc ăn thịt và sinh sống chủ yếu trên cây (Dẫn theo Trần Ngọc Lân, 2008) [11, tr. 5]. 1.1.2. Cơ chế tác động của nấm lên cơ thể côn trùng Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua con đường hô hấp, tiêu hóa hoặc qua cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn là qua lớp vỏ cuticun của chúng. Tức là phải có sự tiếp xúc của bào tử nấm và bề mặt cơ thể vật chủ. Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, khi đủ điều kiện ẩm độ bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp cuticu n. Hình 1.1. Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng (Nguồn: Cheah, C., M. E. Montgomery, S, Salom, B. L. Parker, S. Costa, and M. Skinner, 2004). Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính: (i) Giai đoạn xâm nhập Tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng. Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh mầm bệnh, nó giải 17 phóng các enzym ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như Protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, N - axetylglucosaminidase, cenlulase. Các enzym này được tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và thậm chí ngay trong một loài. Enzym protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein). Lipase, cenlulase và các enzym khác cũng là những enzym có vai trò không kém phần quan trọng. Nhưng quan trọng hơn nhất là enzym phân hủy protein (protease) và enzym phân huỷ kitin (chitinase) của côn trùng. Hai enzym này có liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng (Lerger R. J. et al., 1986; Charley A. K. et al., 1991; Eguchi M., 1992; Tạ Kim Chỉnh và cs., 2005; Hà Thị Quyến và cs., 2005; Janet Jennifer et al., 2006) [1, 10, 14, 15, 21]. (ii) Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết Đây là giai đoạn sống ký sinh của nấm. Trong xoang cơ thể côn trùng nấm tiếp tục phát triển, hình thành rất nhiều sợi nấm ngắn. Khi hệ sợi nấm được hình thành trong cơ thể, nó phân tán khắp cơ thể theo dịch máu, phá hủy các tế bào máu và làm giảm tốc độ lưu thông máu. Toàn bộ các bộ phận nội quan bị xâm nhập. Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp. Hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài. Kết quả là vật chủ mất khả năng kiểm soát hoạt động sống và dẫn đến chết (David Pramer, 1965; Phạm Văn Lầm, 2000) [9 ]. (iii) Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết Ở bên trong cơ thể côn trùng, sợi nấm sinh trưởng và nhân lên nhanh chóng. Một số loài nấm tiếp tục sinh trưởng ở dạng sợi nấm. Tuy nhiên, hầu hết các loài nấm ký sinh côn trùng nhân lên giống như pha lên men tạo blastospore và phát triển mạnh trong toàn bộ cơ thể côn trùng. Hệ thống miễn dịch của ký chủ côn trùng sử dụng cơ chế thực bào và tiết ra các hợp chất đối kháng (như quinine và melanine). 18 Đầu tiên, cơ thể côn trùng phải xác định cơ thể ngoại lai và tạo ra phản ứng miễn dịch (Latge et al., 1984). Tuy nhiên, nấm ký sinh côn trùng phát triển rất nhanh thông qua việc tái sản xuất nhanh chóng sợi nấm làm áp đảo hệ thống miễn dịch của côn trùng. Hơn thế nữa nấm còn tạo ra các dạng độc tố và một số công cụ tấn công khác để giết chết côn trùng (Gillespie & Claydon, 1989; Butt & Goettel, 2000), chính những độc tố và công cụ tấn công này đã phá hủy cơ chế kháng của ký chủ. Hầu hết các nấm bất toàn (inperfect fungi) thường tạo ra độc tố và giết chết côn trùng trong một thời gian ngắn hơn là nấm có giai đoạn sinh sản hữu tính. Trong giai đoạn đầu độc ký chủ, một số loài nấm bất toàn giết chết ký chủ trước khi gây hại ra toàn bộ cơ thể côn trùng và trên cơ thể côn trùng quan sát thấy rất ít sợi nấm. Điều đó chứng tỏ côn trùng bị chết vì chất độc được tiết ra từ nấm ký sinh (Li & Fan, 1998). Một số loài nấm ký sinh đáh lừa hệ thống miễn dịch của ký chủ, làm cho chúng không nhận biết được cơ thể ngoại lai và làm cho hệ thống miễn dịch của côn trùng mất tác dụng (Evan, 1988) (Dẫn theo Trần Ngọc Lân, 2007) [11]. Hình 1.2. Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng (Nguồn: Thomas M.B. & Read A.F., 2007) Sau khi giết chết côn trùng, nấm ký sinh tạo ra các hợp chất có hoạt tính sinh học cao để nấm có thể tiếp tục sinh trưởng hoại sinh. Cuối cùng , bên trong cơ thể côn trùng được thay thế bởi sợi nấm. Trong điều kiện môi trường thích hợp sợi nấm 19 sinh trưởng ra ngoài tạo ra các cấu trúc sinh sản và phát tán bào tử sang các ký chủ khác. Trong điều kiện không thích hợp, hầu hết các loài nấm ký sinh côn trùng có thể tạo ra dạng bào tử nghỉ (như chlamydospore, zygospore và oospore) hoặc tạo ra dang bào tư hữu tính (ascospore). Những dạng bào tử này cho phép nấm qua đông hoặc chống chịu với các điều kiện bất thuận (Latge et al., 1978; McCoy, 1981 và Pendland, 1982). 1.1.3. Giả thuyết khoa học 1.1.3.1. Câu hỏi nghiên cứu - Nấm Cordyceps và Isaria javanica sinh trưởng, phát triển trên cơ thể côn trùng vậy nó có thể sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường nhân tạo được không ? - Nguồn dinh dưỡng nào phù hợp cho nấm sinh trưởng và phát triển ? 1.1.3.2. Giả thuyết khoa học - Nấm ký sinh côn trùng có khả năng mọc trên nhiều loại môi trường khác nhau. - Hầu hết các nguồn dinh dưỡng mà con người sử dụng được thì nấm ký sinh côn trùng cũng sử dụng được và các loại môi trường khác nhau thì khả năng sinh trưởng, phát triển của nó cũng khác nhau. 1.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng nấm Cordyceps và Isaria trên thế giới 1.2.1 Nghiên cứu về đa dạng nấm ký sinh côn trùng loài Cordyceps Theo Steinhaus (1956, 1975), bức tranh minh họa về nấm ký sinh côn trùng được xuất bản năm 1726 và có thể bức tranh đó mô tả loài Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. ký sinh trên ấu trùng bộ Lepidoptera. Theo Pu & Li trong cuốn “Shennong ben cao jing” ứng dụng nấm ký sinh côn trùng (Beuaveria sp.) như một loại thuốc được mô tả gần khoảng 200 năm trước công nguyên ở Trung Quốc. Đến Triều đại Nhà Minh (1578), loài Cordyceps sinensis (Đông trùng - Hạ thảo) được xác định bởi Li Shin Zhen là có giá trị trong y dược và được mô tả trong cuốn “Compendium of Chinese Materia Medica” (Dẫn theo Trần Ngọc Lân, 2008) [11]. Các nhà khoa học BIOTEC đã phân loại về hình thái, sinh học các loài Cordyceps bằng sinh học phân tử DNA (Gi - Ho Sung, Nigel L. Hywel - Jones et 20