Tài liệu Khảo sát các yếu tố ảnh h ưởng đến chất lượng của rượu vang trong quá trình lên men rượu vang từ quả xoài

i LỜI CẢM ƠN Qua 3 tháng nghiên cứu và thực hành tại phòng thí nghiệm trường Đại Học Nha Trang, được sự chỉ bảo, giúp đỡ của quý thầy cô, gia đ ình và bạn bè đến nay em đã hoàn thành đồ án tốt nghiệp “ Khảo sát các yếu tố ảnh h ưởng đến chất lượng của rượu vang trong quá trình lên men rượu vang từ quả Xoài”. Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Ban các Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Các thầy cô giáo trong khoa Chế biến đã truyền đạt cho em những kiến thức c ơ bản về chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm để em có thể thực hiện đề t ài này. Em xin cảm ơn quý thầy cô giáo, các cán bộ ph òng thí nghiệm khoa Chế biến đã tạo điều kiện cho em thực hiện tốt đề t ài. Đặc biệt em xin cảm ơn ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ và sự chỉ bảo tận tình của thầy Nguyễn Đại Hùng đã trực tiếp hướng dẫn em trong suốt thời gian l àm đồ án. Em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ, cho em nhiều ý kiến hay trong quá tr ình thực hiện đồ án. Em xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng 7 năm 2011 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Sương ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ .i MỤC LỤC ............................................................................................................... .ii DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... .v DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... .vi LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................ ..1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.................................................................................. ..3 1.1 Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men ........................................................... …. 3 1.1.1 Các quá trình lên men .................................................................................. ..3 1.1.2. Điều kiện lên men ....................................................................................... ..5 1.2 Tổng quan về nấm men: ..................................................................................... 8 1.2.1 Đặc điểm của nấm men .............................................................................. ..8 1.2.2 Cấu tạo tế bào nấm men .............................................................................. .9 1.2.3 Thành phần hóa học của tế bào nấm men.................................................... 11 1.2.4 Dinh dưỡng nấm men .................................................................................. 13 1.2.5 Sinh trưởng của nấm men............................................................................ 13 1.3 Giới thiệu về quá trình lên men rượu ............................................................... 15 1.3.1 Đại cương về lên men rượu......................................................................... 15 1.3.2 Cơ chế của quá trình lên men rượu ............................................................. 16 1.4 Tổng quan về rượu vang..................................................................................... 20 1.4.1. Giới thiệu sơ lược về rượu vang, lịch sử của rượu vang ............................ 20 1.4.2. Phân loại rượu vang ................................................................................... 20 1.4.3. Tình hình sản xuất rượu vang: .............................................................. 20 1.4.4 Thành phần hóa học của rượu vang: ........................................................... 21 1.4.5. Nguyên liệu chế rượu vang quả .................................................................. 25 1.4.6 Một số biện phấp nâng cao chất l ượng ....................................................... 26 1.4.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men.............................................. 29 iii 1.4.8 Vi sinh vật dùng trong chế biến rượu vang ................................................. 32 1.4.9 Các giai đoạn trong quá trình lên men rượu vang:...................................... 35 1.4.10 Quy trình sản xuất rượu vang từ nước trái cây ........................................... 36 1.4.11 Chỉ tiêu chất lượng rượu vang .................................................................... 38 1.5 Tổng Quan Về Nguyên Liệu Xoài .................................................................... 39 1.5.1 Tình hình phát triển cây xoài ở Việt Nam................................................... 40 1.5.2 Tình hình trồng xoài ở Khánh Hòa: ............................................................ 40 1.5.3 Thành phần hóa học của trái xoài. ............................................................... 43 1.5.4 Đặc tính y dược của quả xoài....................................................................... 44 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU.................. 45 2.1 Đối tượng nghiên cứu: ...................................................................................... 45 2.1.1 Nguyên liệu xoài: ......................................................................................... 45 2.1.2 Nấm men: ..................................................................................................... 45 2.1.3: Đường.......................................................................................................... 46 2.1.4 Axit citric ..................................................................................................... 46 2.1.5 Enzyme pectinaza: ...................................................................................... 46 2.1.6 Dụng cụ và thiết bị dùng trong quá trình nghiên cứu. .................................. 47 2.2 Sơ đồ quy trình sản xuất rượu vang xoài khảo sát: ..............................................48 2.3 Các thông số chính cần nghiên cứu: .................................................................. 49 2.4 Phương pháp nghiên cứu: .......................................................................................50 2.4.1 Xác định độ rượu của dịch lên men: ............................................................ 50 2.4.2 Xác định độ axit toàn phần: ......................................................................... 51 2.4.3 Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand. ................... 52 2.4.4 Phương pháp xác định độ pH ....................................................................... 54 2.4.5 Phương pháp xác định độ khô hòa tan bằng khúc xạ kế .............................. 54 2.4.6 Đánh giá chất lượng sản phẩm: .................................................................... 55 2.4.7 Phương pháp xác định số lượng nấm men trong quá trình tăng sinh ……57 iv 2.5 Phương pháp thí nghi ệm : ................................................................................. 58 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 72 3.1 Kết quả xác định tỷ lệ enzyme pectinase cần bổ sung. ...................................... 72 3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ nước pha loãng dịch cốt xoài: ....................................... 74 3.3 kết quả xác định thời gian nhân giống nấm men ............................................... 76 3.4 Kết quả khảo sát tỉ lệ nước cái men bổ sung vào dịch lên men ......................... 78 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu …………………82 3.6 Kết quả khảo sát sự ảnh h ưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men ............ 86 3.7 Khảo sát thời gian lên men chính ....................................................................... .90 3.8 Khảo sát hàm lượng NaHSO 3 sử dụng .............................................................. .93 3.9 Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm ................................................................ .96 3.10 Hình sản phẩm ........................................................................................... 97 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .................................................................... .98 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... .100 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Giá trị trung bình các axitamin nằm trong thành phần protein ở nấm men Saccharomyces .................................................................................................................. 9 Bảng 1.2. Thành phần chính của rượu vang ..................................................................... 22. Bảng 1.3:Thành phần những quả có thể chế rượu vang.................................................... 25 Bảng 1.4: Chỉ tiêu hóa học của rượu vang ........................................................................ 37 Bảng 1.5: Giới hạn hàm lượng kim loại nặng của r ượu vang ........................................... 37 Bảng 1.6 Chỉ tiêu vi sinh vật của rượu vang .................................................................... 39 Bảng 1.7: Hiện trạng diện tích trồng xo ài của tỉnh Khánh Hòa qua các năm................... 41 Bảng 1.7: Sản lượng xoài của tỉnh Khánh Hòa qua các năm........................................... 41 Bảng 1.8: Một số đặc điểm chính của các giống xo ài Cam Ranh. ................................... 42 Bảng 1.9: Thành phần chất dinh dưỡng có trong 100g quả .............................................. 43 Bảng 2.1: Bảng điểm cảm quan chỉ ti êu vị của rượu vang. .............................................. 55 Bảng 2.2: Bảng điểm cảm quan chỉ ti êu mùi của rượu vang ............................................ 55 Bảng 2.3: Bảng điểm cảm q uan chỉ tiêu màu sắc và độ trong của rượu vang .................. 55 Bảng 2.4: Phân cấp chất lượng rượu vang theo TCVN 3215 -79. ..................................... 56 Bảng 3.1: Đặc điểm cảm quan của các mẫu T N xác định tỷ lệ enzyme bổ sung ............. 72 Bảng 3.2: Bảng tổng hợp các thông số của TN xác định tỷ lệ enzyme bổ sung............... 72 Bảng 3.3 Chất lượng cảm quan các mẫu sau l ên men. .................................................... 75 Bảng 3.4: Bảng số lượng nấm men trong quá tr ình nhân giống ....................................... 77 Bảng 3.5 Bảng tổng hợp các thông số của TN khảo sát tỷ lệ nước cái men ..................... 79 Bảng 3.6 Bảng tổng hợp các thông số của TN khảo sát hàm lượng đường ..................... 82 Bảng 3.7 Bảng tổng hợp các thông số của TN khảo sát pH lên men................................ 86 Bảng 3.8: Bảng tổng hợp các thông số của TN xác định thời điểm kết thúc lên men ...... 90 Bảng 3.9: Bảng tổng hợp các thông số của TN xác định hàm lượng NaHSO 3 sử dụng 94 Bảng 3.10: Bảng điểm cảm quan sản phẩm ...................................................................... 96 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men .............................................. 15 Hình 1.2. Sơ đồ lên men ethanol ....................................................................................... 18 Hình 1.3 Cơ chế phân hủy đường trong tế bào nấm men .................................................. 19 Hình 1.4 Sơ đồ quy trình sản xuất rượu vang từ nước ép trái cây …………………… .…37 Hình 2.1: Hình ảnh quả xoài ............................................................................................ 45 Hình 2.2: Hình ảnh nấm men ............................................................................................ 45 Hình 2.3: Sơ đồ quy trình sản xuất rượu vang xoài .......................................................... 48 Hình 2.4: Hình ảnh buồng đếm ......................................................................................... 57 Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định enzyme pectinase bổ sung ............................ 59 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ nước bổ sung khi ép dịch xo ài ............... 61 Hình 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát l ượng đường thích hợp cho lên men………..63 Hình 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát pH thích hợp cho lên men…………………..65 Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ l ệ nước cái men bổ sung………………….67 Hình 2.10: Sơ đồ bố thí nghiệm khảo sát thời gian lên men............................................. 69 Hình 2.11: Sơ đồ bố trí thí nghệm khảo sát l ượng NaHSO 3 ............................................ 71 Hình 3.1: Hiệu suất thu hồi dịch ép phụ thuộc v ào tỷ lệ enzyme .................................... 73 Hình 3.2: Sự thay đổi hàm lượng đường khử ttrong các mẫu thí nghiệm có tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau .................................................................................................... 74 Hình 3.3: Sự thay đổi điểm cảm quan của các mẫu l ên men dịch xoài có tỷ lệ nước pha loãng khác nhau ................................................................................................................ 75 Hình 3.4: Sự thay đổi số lượng tế bào nấm men theo thời gian ....................................... 77 Hình 3.5: Sự thay đổi điểm cảm quan của các mẫu l ên men dịch xoài có tỷ lệ cái men khác nhau........................................................................................................................... 80 Hình 3.6: Sự thay đổi độ cồn của các mẫu l ên men dịch xoài có tỷ lệ cái men khác nhau80 vii Hình 3.7: Sự thay đổi lượng đường còn lại của các mẫu lên men dịch xoài có tỷ lệ cái men khác nhau........................................................................................................................... 81 Hình 3.8: Sự thay đổi điểm cảm quan của các mẫu l ên men dịch xoài có hàm lượng đường bổ sung khác nhau .................................................................................................... 83 Hình 3.9: Sự thay đổi độ cồn của các mẫu l ên men dịch xoài có hàm lượngđườngbổ sung khác nhau........................................................................................................................... 83 Hình 3.10: Sự thay đổi lượng đường còn lại của các mẫu lên men dịch xoài có hàm lượng đường khác nhau .................................................................................................... 84 Hình 3.11: Sự thay đổi điểm cảm quan của các mẫu l ên men dịch xoài có pH khác nhau…………………... .................................................................................................... 87 Hình 3.12: Sự thay đổi độ cồn của các mẫ u lên men dịch xoài có pH khác nhau……….87 Hình 3.13: Sự thay đổi lượng đường còn lại của các mẫu lên men dịch xoài có pH khác nhau .................................................................................................................................. .88 Hình 3.14: Sự thay đổi lượng độ axit còn lại của các mẫu lên men dịch xoài có pH khác nhau ................................................................................................................................... 88 Hình 3.15: Sự thay đổi điểm cảm quan của các mẫu lên men dịch xoài có thời gian khác nhau .................................................................................................................................. 91 Hình 3.16: Sự thay đổi độ cồn của các mẫu l ên men dịch xoài có thờigian khác nhau... .91 Hình 3.17: Sự thay đổi lượng đường còn lại của các mẫu lên men dịch xoài có pH khác nhau ................................................................................................................................... 92 Hình 3.18: Sự thay đổi điểm cảm quan của các mẫu l ên men dịch xoài có NaHSO 3 khác nhau ................................................................................................................................... 94 Hình 3.19: Sự thay đổi độ cồn của các mẫu l ên men dịch xoài có NaHSO 3 khác nhau…95 Hình 3.20: Hình sản phẩm rượi vang Xoài ........................................................................ 97 1 LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay cùng với sự phát triển của kinh tế v à những tiến bộ của khoa học kỹ thuật, ngành công nghệ thực phẩm ở nước ta không ngừng thay đổi nhằm đa dạng hóa sản phẩm, nâng cao chất l ượng để có thể đáp ứng nhu cầu ng ày càng cao của người tiêu dùng. Cùng với sự phát triển của thế giới, sự giao lưu kinh tế các quốc gia , nền kinh tế các nước nói chung, Việt Nam nói riêng, đang dần dần phát triển. Cuộc sống ngày càng được cải thiện, thị trường ngày càng được mở rộng, hàng hoá đa dạng hơn về chủng loại, chất lượng, hình thức… Cuộc sống ngày càng được thay đổi. Con người không chỉ dừng lại ở nhu cầu ăn no, mặc ấm mà ngày càng tiến lên nhu cầu ăn ngon, mặc đẹp. Đặc biệt là các sản phẩm có nguồn gốc tự nhi ên rất được chú ý và ưa chuộng vì chúng ít độc hại,an toàn và bổ dưỡng. Nắm bắt được nhu cầu này các nhà sản xuất đã không ngừng tìm kiếm nguyên liệu, nghiên cứu quy trình, đổi mới công nghệ để có thể tạo ra các sản phẩm đảm bảo ding dưỡng, vệ sinh và an toàn thực phẩm. Trong dòng sản phẩm từ tự nhiên thì rượu trái cây là dòng sản phẩm có nhiều tiềm năng. Ngày nay rượu trái cây được biết đến nhiều nhất l à rượu nho với nhiều loại sản phẩm và công dụng bổ dưỡng. Tuy nhiên nho không phải là loại trái cây có thể lên men tạo rượu duy nhất. Nước ta là nước nhiệt đới với nhiều loại trái cây có h ương vị thơm ngon và chất lượng tốt có thể lên men tạo rượu cho chất lượng tốt . Hiện nay trên thị trường Việt Nam đã có một số rượu vang từ trái cây như mơ ,dứa, nho, chuối… Trong khi đó, Xoài cũng là loại quả thơm ngon, thành phần hóa học chứa nhiều đ ường, protein, vitamin, khoáng ,acid h ữu cơ …không chứa nhiều tanin. Hơn nữa xoài được trồng phổ biến, bên cạnh các giống xoài cho giá trị kinh tế cao như xoài Cát Hòa Lộc, xoài Thái, xoài Tượng…thì số lượng xoài có giá trị kinh tế thấp như xoài Mủ, xoài Min… vẫn còn trồng nhiều ở nước ta. 2 Vì vậy với mong muốn đưa ra một quy trình hoàn thiện về quá trình lên men để tạo ra một sản phẩm rượu vang xoài có hượng vị, chất lượng, giá trị cao, đồng thời với mong muốn nâng cao giá trị sử dụng của các giống xo ài có gía trị kinh tế thấp , cải thiện đời sống cho bà con nông dân vùng trồng xoài. Được sự đồng ý của Nhà trường, khoa chế biến và được sự hướng dẫn trực tiếp của thấy giáo Nguyễn Đại H ùng em đã tiến hành thực hiện đề tài “ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu vang Xoài” tại phòng thí nghiệm của trường”. Để thực hiện đề tài này cần nghiên cứu các nội dung sau: - Khảo sát lượng enzym pectinase bổ sung thích hợp để ép dịch xo ài - Khảo sát lượng nước pha loãng. - Khảo sát lượng đường bổ sung thích hợp. - Khảo sát pH thích hợp. - Khảo sát lượng cái men thích hợp - Khảo sát thời gian lên men thích hợp. - Khảo sát hàm lượng NaHSO 3 Qua ba tháng thực hiện đề tài đến nay đã hoàn thành. Vì thời gian ngắn, điều kiện nghiên cứu cũng như kiến thức còn hạn chế nên nội dung của đề tài chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong sự góp ý của quý thầy cô và các bạn để nội dung của đề tài được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! 3 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men: [1], [2] 1.1.1 Các qúa trình lên men: Lên men theo nghĩa hẹp là thuật ngữ để chỉ các quá tr ình phân giải các chất để thu năng lượng, trong đó hydro được tách ra từ một cơ chất ( thường là glucoseside), được chuyển đến chất nhận cuối c ùng là hợp chất hữu cơ. Oxy phân tử không tham gia vào quá trình lên men (sự phân giải yếm khí). Theo định nghĩa của Pasteur th ì “ sự lên men là sự sống không có oxy phân tử”. ví dụ trong lên men rượu hydro được tách ra trong quá trình phân hủy glucose kị khí được chuyển đến acetaldehyd (CH3CHO) hình thành trong quá trình đường phân để tạo ethanol. Đối với tế bào thì ý nghĩa của sự lên men ở chỗ chúng thu được năng lượng ở dạng ATP, dự trữ cho cơ thể sinh vật. Một chất hữu cơ có thể lên men kị khí có khả năng được oxy hóa từng phần nhờ quá trình phân giải nội phân tử kèm theo quá trình phân giải năng lượng. Các chất có thể lên men được chủ yếu là glucid dạng đơn giản như monosaccharide, disaccharide… các loại acid amin (trừ acid amin có nhân thơm), các base purin, pirimidin. Trong đó quan tr ọng và dễ lên men được như steroid, tecpen… các acid béo từ 5 C trở lên chỉ trong điều kiện hiếu khí mới bị phân giải v à oxy hóa. Ở vi sinh vật trong quá tr ình tiến hóa đã hình thành nhiều kiều lên men khác nhau. Dựa vào bản chất của sản phẩm chính cuối c ùng của quá trình lên men cũng như các con đường trao đổi chất đặc tr ưng cho từng loại vi sinh vật mà người ta phân loại các quá trình lên men như: lên men rượu, lên men lactic, lên men do n ấm men, nấm mốc. Ngày nay trong lĩnh vực công nghiệp cũng nh ư trong thực tiễn đời sống người ta có quan điểm quá trình lên men theo nghĩa rộng hơn. Quá trình lên men là quá trình trao đổi chất, qua đó các chất hữu cơ mà chủ yếu là đường bị biến đổi dưới tác dụng của enzyme vi sinh vật. Sự h ình thành các chất khác nhau xảy ra trong điều kiện kị khí hoặc hiếu khí (không có oxy hoặc có oxy tham gia). 4 Từ khái niệm mở rộng trên đây, dựa vào cơ chế phản ứng người ta đã chia lên men thành hai loại: - Lên men kị khí( yếm khí) - Lên men hiếu khí Dù các quá trình lên men có khác nhau v ề hình thức, cơ chế, tiến trình phản ứng, sản phẩm cuối cùng và hệ vi sinh vật tham gia, hệ enzyme xúc tác… nh ưng các quá trình lên men có bản chất cơ bản giống nhau. Các phản ứng sinh hóa xảy ra trong quá tr ình lên men là những phản ứng chuyển hydro và điện tử (H+ và e-). Các enzyme xúc tác cho quá trình này là các enzyme oxy hóa - khử (dehydrogenase, oxydase…) chủ yếu từ vi sinh vật. Như vậy, thực chất các quá trình lên men là các quá trình oxy hóa – khử sinh học để thu năng lượng và các hợp chất trung gian. Năng l ượng này rất cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật như sinh trưởng, phát triển, sinh sản… T ùy theo chủng vi sinh vật, môi trường, và điều kiện lên men chúng ta thu được các sản phẩm chính, phụ khác nhau. Trong quá trình oxy hóa - khử sinh học, hydro được tách khỏi cơ chất ban đầu nhờ enzyme dehydrogenase, v à chuyển đến những chất tiếp nhận khác n hau. Tùy theo chất tiếp nhận hydro từ cơ chất mà người ta phân biệt các dạng l ên men và hô hấp như sau: Trong lên men yếm khí (lên men theo định nghĩa của Pasteur) không có sự tham gia của oxy phân tử, hydro được tách ra khỏi cơ chất và chuyển đến chất nhận là chất hữu cơ chưa no. Sau khi nhận hydro các chất này tạo thành các chất hữu cơ nhất định, đây chính là sản phẩm của quá trình của quá trình lên men tích tụ ttrong môi trường (ví dụ như ethanol, acid lactic…). Trong lên men rư ợu hydro được tách ra trong quá trình phân hủy glucose, được chuyển hóa đến acetaldehy de (CH3CHO) hình thành trong quá trình đường phân và tạo thành ethanol trong điều kiện thiếu oxy, chất n ày hoạt động như chất nhận oxy, chất này hoạt động như chất nhận hydro và khử thành ethanol, đồng thời tái sinh NAD từ NAD.H 2. 5 Trong hô hấp hiếu khí (lên men hiếu khí) hydro được tách ra từ cơ chất hữu cơ trải qua hàng loạt các giai đoạn trung gian, cuối c ùng kết hợp với oxy để tạo H 2O. Ví dụ acid pyruvic bị oxy hóa ho àn toàn trong chu trình Krep, qua hàng lo ạt sản phẩm trung gian, cuối cùng tạo CO2 và H2O, giải phóng năng lượng. Qúa trình hô hấp hiếu khí giải phóng ra năng lượng lớn cung cấp cho quá tr ình hoạt động sống của cơ thể sinh vật. Nguyên liệu của quá trình oxy hóa (hô hấp hiếu khí ) chủ yếu là glucid, sáp, chất béo…Sản phẩm cuối c ùng này là CO 2 , H2O và một số sản phẩm trung gian do oxy hóa không hoàn toàn như acid acetic, acid citric… Các vi sinh vật sống trong điều kiện kị khí th ường có thể sống trong đi ều kiện kị khí hoặc kị khí bắt buộc không hoàn toàn. Chất nhận điện tử và hydro cuối cùng không phải oxy mà là nitrat hay sulfat. Kiểu chuyển điện tử và H+ này giúp cho vi khuẩn oxy hóa hoàn toàn cơ chất mà không cần sự tham gia của oxy phân tử. So với quá tr ình lên men trong hô hấp kị khí vi sinh thu được nhiều năng lượng hơn. Tóm lại trong thực tiễn sản xuất hiện nay, ng ười ta chỉ phân biệt hai dạng l ên men là lên men hiếu khí và lên men yếm khí. 1.1.2 Điều kiện của quá trình lên men: - Nguyên liệu để lên men: Một trong những thành phần chủ chốt của môi trường lên men là glucid. Glucid không những là nguồn cung cấp năng lượng mà còn là nguồn cung cấp vật liệu xây dựng cần thiết để sinh tổng hợp các cấu tử cần thiết của tế bào. Dạng glucid dễ lên men là monosaccharide , đặc biệt là glucose, fructose…là dạng đường dễ lên men, ngoài ra nấm men cùng lên men được disaccharide như saccharose, maltose b ởi vì nấm men có enzyme saccharase và maltase thủy phân cá đường disaccharide trên thành đường đơn là glucose và fructose. Với polysaccharide như tinh bột nấm men không lên men được mà phải qua khâu trung gian l à thủy phân tinh bột ra đường đơn giản, nhờ xúc tác là enzyme amylase của malt hay nấm mốc hoặc tác nhân hóa học khác. [6] Trong điều kiện sản xuất công nghiệp ng ười ta thường chú ý sử dụng nguyên liệu tự nhiên, ngoài thành phần chính là glucid cần cho lên men,còn có các thành ph ần 6 khác cần cho sự sinh trưởng và phát triển của tế bào vi sinh vật như: muối khoáng, vitamin, yếu tố vi lượng, acid amin, chất th ơm, chất màu. Ví dụ trong công nghiệp lên men để đạt được mục đích người ta thường dùng nguyên liệu tự nhiên như nước chiết trái cây, nước chiết bắp, rỉ đường, malt, nước chiết thịt…Một số vi sinh vật khác có thể lên men từ nguyên liệu là pectin… a) Photphat. Photphat có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của hệ thống sinh học. Vì vậy photphat rất cần thiết trong th ành phần dung dịch lên men, nó đưa vào môi trường dưới dạng photphat vô cơ như photphat kali hay photphat amon. Nồng độ photphat thường khoảng từ 0,1-0,5%. Ngoài ra người ta cũng đưa vào môi trường một lượng nhỏ photphat ở dạng hợp chất hữu c ơ. b) Nitơ. Nitơ là cấu tử quan trọng trong th ành phần protein và acid nucleic. Là thành phần rất cần cho sự sống của vi sinh vật. Nit ơ được đưa vào môi trường lên men dưới dang nitrat, muối amon, ure, hợp chất nit ơ có gốc sinh học. c) Nguyên tố vi lượng. Nguyên tố vi lượng rất cần thiết cho phát triển, sinh tr ưởng của vi sinh vật. Nguyên tố vi lượng thường gặp là : Mn, Zn, Ni, Na, Si. Ngoài các nguyên tố vi lượng vô cơ, các vi lượng hữu cơ cũng rất cần thiết và quan trọng trong quá trình lên men, tuy sử dụng với nồng độ cực nhỏ nh ưng có hiệu quả rõ rệt. Ví dụ: acid pantotenic với nồng độ 1: 5000, alanin vói nồng độ 1:10 8 cũng đã có tác dụng rất rõ rệt đến sự lên men. Thông thường các nguyên tố vi lượng đã có mặt trong nguyên liệu tự nhiên tự nhiên ban đầu khi đưa vào lên men như dịch trái cây, nước chiết malt, nấm men, dịch thủy phân đạm… Vitamin cũng cần cho sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật v à ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả của quá trình lên men. Đặc biệt là vitamin nhón B như B1, B2, PP, biotin(H). Riêng biotin là vitamin quan tr ọng cho sinh trưởng của vi sinh vật. Biotin 7 được gọi là “ yếu tố sinh trưởng” và thường được sử dụng trong môi trường nuôi vi sinh vật. d) Nhiệt độ của môi trường lên men: Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh h ưởng đến sự phát triển của vi sinh vật và hiệu quả lên. Vì vậy trong thực tế sản xuất ng ười ta sử dụng yếu tố này để điều chỉnh vận tốc phản ứng và chiều hướng phản ứng tạo sản phẩ m theo mong muốn. Trong ngành công nghiệp lên men sử dụng vi sinh vật để chuyển hóa các chất do enzyme vi sinh vật làm chất xúc tác, vì vậy nhiệt độ sử dụng trong quá tr ình lên men phải phù hợp với nhiệt độ sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật v à khoảng nhiệt độ tối ưu của phản ứng xúc tác bằng enzyme. Tùy theo từng chủng giống vi sinh vật v à từng loại lên men mà ta chọn chính xác khoảng nhiệt độ ph ù hợp, tối ưu nhất. e) pH môi trường lên men. Ngoài nhiệt độ, pH cũng là một yếu tố quan trọng ảnh h ưởng lớn đến sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật v à hiệu quả lên men của chúng. Đối với vi sinh vật bao giờ cũng có một khoảng pH thích hợp với sinh lý của chúng cũng nh ư pH tối ưu để vân tốc lên men đạt cực đại, hoặc đúng hướng tạo sản phẩm yêu cầu. Ở các giá trị pH khác nhau của môi tr ường lên men, ta có thể thu nhận các sản phẩm khác nhau. Ví dụ: ở pH = 3–4 nấm men sẽ lên men đường tạo ethanol là sản phẩm chính. Nếu pH kiềm thì chiều hướng lên men của nấm men sẽ tạo sản phẩm chính l à glycerin. f) Oxy Tùy theo kiểu lên men chúng ta phải khống chế lượng oxy sao cho phù hợp. Ví dụ lên men yếm khí như lên men lactic, lên men rư ợu, bia cần tạo điều kiện yềm khí nghiêm ngặt. Lên men hiếu khí như: lên men acid citric, acid gluconic…. Cần cung cấp oxy vào quá trình lên men, hoặc tạo môi trường thoáng khí tối đa cho môi tr ường. Trong cùng một quá trình lên men các giai đoạn khác nhau cũng cần thay đổi điều kiện yếm 8 khí hay hiếu khí như trong lên men rượu giai đoạn đầu cần oxy cho nấm men sinh trưởng phát triển đủ lượng yêu cầu, giai đoạn sau cần tạo điều kiện yếm khí, để nấm men chuyển hóa đường thành ethanol. 1.2 Tổng quan về nấm men: [4], [5] 1.2.1 Đặc điểm của nấm men: Nấm men ( yeast, levure ) l à tên chung dùng để chỉ nhóm nấm cấu tạo đ ơn bào. Nấm men với số giống hiện biết là 39 và 349 loài (theo Lodder, 1970), ho ặc 66 giống, 483 loài (theo J.A.Barnett ,R.W, Payne v D. Yarrow, 1983). Nấm men có cấu tạo và sinh sản bằng cách nảy chồi v à phân cắt. Chúng phân bố rộng r ãi khắp nơi. Đặc biệt chúng có mặt nhiều ở đất trồng nho và các nơi trồng hoa quả. Nấm men thường được dùng cho sản xuất rượu vang thuộc là chủng thuộc giống Saccharomyces. Nó nằm trong giới nấm (Fungi), thuộc nấm thật (Eumyophyta ) theo (W. Carrol Frazier ). Lớp : Ascomycetes Bộ : Endomycetales Họ : Endomycestaceae Họ phụ : Saccharomyceteae Giống : Saccharomyces Theo Lodder (1971 ) nấm men thuộc giống saccharomyces có đặc điểm như sau: sinh sản sinh dưỡng bằng nảy chồi ở nhiều phía, khôn g tạo bào tử bắn, tế bào sinh dưỡng hình tròn, elip, ovan, hình tr ứng, không có hình tam giác, có tạo nang bào tử, nang bào tử hình thoi, mỗi nang chứa hai bào tử, bào tử hình cầu hoặc hình trứng, nang chìm khó vỡ, không đồng hóa nitrat, lên men glucose mạnh mẽ , không tạo thành váng sớn trên nước chiết mạch nha. Nấm men thuộc giống saccharomyces có khả năng lên men rượu. Con người sử dụng chúng để nấu rượu bia, cồn, glycerin. Nấm men sinh sản nhanh chóng, sinh khối của nó giàu protein, vì vậy chúng được sử dụng rộng rãi trong ngành sản xuất thức ăn gia súc.. 9 Nấm men Saccharomyces th ường có cấu tạo đơn bào, có nhân thật, hình tròn, hình trứng hay hình bầu dục, hình dài hoặc hình elip. Nói chung kích th ước tế bào nấm men khá lớn, to hơn hẳn so với tế bào vi khuẩn. Các loại nấm men đ ơn bào sử dụng trong công nghiệp thường có kích thước (3-5)x5x10µm, nặng 10-12 pg (1pg = 10 –12g). trong tự nhiên chúng có mặt ở khắp mọi nơi: trong hoa quả, trong đất, nước… 1.2.2 Cấu tạo tế bào nấm men: Trong tế bào nấm men saccharomyces có: 34,1% polysacharit 5,0% trehaloza 10,8% acid nucleic và nucleotit 4,5% photpholipit 2,5% triglycerit 1,0% sterol 3.1% các thành phần tro 39.0% protein Thành phần acid amin trong tế bào nấm men được cho trong bảng sau: Bảng 1.1. giá trị trung bình các acid amin nằm trong thành phần protein ở nấm men Saccharomyces: acid amin mmol/100g protein nấm men Alanin 114,70 Arginin 40,18 Asparagi 25,43 Acid aspatic 74,38 Cystein 1,65 Acid glutamic 74,45 Glutamin 25,33 Glixin 72,56 10 Histidin 16,55 Isoleusin 48,17 Leusin 74,08 Lizin 1,54 Metionin 12,66 Phenylalanin 33,44 Prolin 41,13 Xerin 46,33 Treonin 45,85 Một phần acid amin này sẽ trả lại cho rượu vang khi kết thúc lên men, tế bào nấm men bị phân hủy. V ì vậy vang là loại đồ uống cao cấp. Nấm men chứa nhiều vitamin (mg/kg chất khô). Vitamin B1 : 15 -18 Vitamin B2 : 54- 68 Vitamin B3 : 130-160 Vitamin B4 : 2600 Vitamin B5 : 500 -600 Vitamin B6 : 19 – 30 Vitamin B7 : 1,6 - 3 Vitamin B8 : 500 Nấm men là loại cơ thể đơn bào có nhân thật khá hoàn chỉnh. - Vỏ tế bào: Bao vây tế bào nấm men là một lớp màng mỏng dày đặc, mềm mại có thể đàn hồi để định hình cũng như bảo vệ tế bào chống lại các tác động b ên ngoài và chất độc, nó còn có tác dụng giữ áp suất thẩm thấu nội bào, điều chỉnh các chất dinh dưỡng là các hợp chất có phân tử lượng thấp và các muối khoáng đi qua các lỗ nhỏ vào trong tế bào. Thành phần hóa học của vỏ tế b ào gồm có các phức chất protein -polysacarit, 11 phosphat, lipid, kitin. Vỏ tế bào dày khoảng 25nm chiếm khoảng 25% khối l ượng tế bào. - Tế bào chất: còn gọi là nguyên sinh chất. Nó có cấu trúc không đồng nhất v à ở thể keo, chứa tất cả các cấu trúc c ơ bản của tế bào: ti thể, riboxom, mạng lưới nội chất, các chất dự trữ dạng tinh bột, d ạng chất béo, hợp chất lipoit v à hydratcacbon tự nhiên trong nội bào. Tế bào chất là hệ keo được cấu tạo từ protein, hydratcacbon, lipid, chất khoáng, nước và các hợp chất khác nữa. Nước trong tế bào chất chiếm khoảng 90% ở dạng tự do để hòa tan các chất trước khi tham gia vào các phản ứng trao đổi chất và dạng liên kết. - Nhân tế bào: có màng vỏ, hạch nhân và chất nhân. Vỏ nhân tham gia v ào điều hòa các qui trình trong nhân b ằng cách thay đổi tính thấm v à thông báo trực tiếp giữa nhân với môi trường bên ngoài tế bào, cũng như giữa nhân và tế bào chất. Thành phần hóa học cơ bản của nhân là acid deoxynucleic, nó đảm nhận vai trò truyền thông tin từ thế hệ này tới thế hệ sau. Ngoài ra còn có protein và một số thành phần khác. Hàm lượng AND trong nhân tế bào là ổn định và không phụ thuộc vào các điều kiện bên ngoài, vào dinh dưỡng cũng như vào tác động từ các yếu tố khác. Các thể vùi và các chất dự trữ trong tế bào nấm men: nằm trong tế b ào chất và dịch không bào, chúng có thể thay đổi trong suốt quá trình sống của tế bào. 1.2.3 Thành phần hóa học của tế bào nấm men Thành phần hóa học của tế bào nấm men thay đổi phụ thuộc v ào thành phần môi trường dinh dưỡng, mức độ tăng trưởng của giống nấm men v à điều kiện nuôi cấy. Nhưng nhìn chung bao gồm: Nước: 75 – 85%, chất khô: 15 – 25%. Trong đó chất khoáng chiếm 2 – 14% hàm lượng chất khô. Nấm men gồm một số thành phần như: protein, glycogen, tregaloza, ch ất béo, tro, photpho, lưu hu ỳnh, sắt, magie, kali, canxi, các nguy ên tố vi lượng, vitamin và nhân tố sinh trưởng... Magie có tác dụng hoạt hóa nhiều photphastaza v à enolaza. Mg 2+ có ảnh hưởng 12 giữ gìn hoạt tính enzyme khi đun nóng. Mg v à Mn làm tăng nhanh nhu c ầu về glucose của nấm men. Ảnh hưởng của Mg mạnh hơn khi nồng độ glucose thấp trong môi trường. Các môi trường dinh dưỡng thường có 0,02 ÷ 0,05% Mg ở dạng sunfat. Kali vừa là chất dinh dưỡng vừa là chất kích thích sinh trưởng của nấm men. Tác dụng kích thích được giải thích bằng vai tr ò của ion này trong quá trình phosphoryl – oxy hóa và quá trình đường phân. Nó còn kích thích quá trình v ận chuyển phospho vô cơ vào trong tế bào. Kali hoạt hóa hàng loạt enzyme của nấm men như aldolaza, enzyme pyruvat cacboxylaza và c òn ảnh hưởng đến trao đổi chất Nitơ, lưu huỳnh và chất béo của tế bào nấm men. Canxi đóng vai trò hoạt hóa trong tế bào vi sinh vật nói chung cũng như tế bào nấm men. Ca2+ liên kết với protein-enzyme làm trung tâm ho ạt động của amylaza. Ion này có thể liên kết với ATP cùng với cả Mg 2+, Mn2+. Nâng cao hàm lượng muối canxi trong môi trường sẽ làm ức chế sinh sản và làm giảm tích lũy glycogen, làm tăng hàm lượng sterin của nấm men. Đối với nấm men h àm lượng Ca 2+ đạt tới 40 mg/l có tác dụng kích thích sinh trưởng tốt hơn là kiềm hãm. Các nguyên tố vi lượng có vai trò quan trọng đối với sinh sản và hoạt động sống của nấm men. Chúng tham gia v ào nhiều thành phần của enzyme, vitamin v à nhiều hợp chất khác nữa trong quá tr ình sinh tổng hợp các sản phẩm của tế b ào. Nó còn kích thích tổng hợp vitamin như riboflavin(vitamin B2) và acid ascorbic (vitamin C). Các ion kim loại vi lượng trong thành phần enzyme tạo thành phức hữu cơ – kim loại và các hợp chất phức khác trong tế b ào. Kết quả là các phức này sẽ tạo điều kiện phản ứng cho enzyme kết hợp với c ơ chất tốt hơn làm tăng hoạt tính của enzyme và cơ chất sẽ được chuyển hóa nhiều hơn. Vitamin và nhân tố sinh trưởng: để nấm men có thể phát triển b ình thường thì cần vitamin làm cofacto trong nhiều enzyme của tế bào nấm men. Nấm men có thể tổng hợp được nhiều vitamin trong chừng mự c nào đó nhưng không tổng hợp được vitamin H. Vì vậy trong môi trường dinh dưỡng nhất định phải có vitamin n ày. 13 1.2.4 Dinh dưỡng nấm men: Có 2 nguồn dinh dưỡng khác nhau là dinh dưỡng nội bào và dinh dưỡng ngoại bào. Dinh dưỡng ngoại bào là các chất dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài thấm qua màng tế bào. Khi môi trường bên ngoài nghèo hoặc cạn chất dinh dưỡng thì các thành phần dự trữ nội bào như glycogen, tregaloza, lipid, các h ợp chất chứa nitơ sẽ được dùng để cung cấp chất dinh dưỡng gọi là dinh dưỡng nội bào. 1.2.5. Sinh trưởng của nấm men 1.2.5.1. Sinh sản của nấm men Nấm men có 2 hình thức sinh sản: sinh sản hữu tính (sinh sản bằng b ào tử) và sinh sản vô tính (sinh sản bằng cách nảy chồi hoặc phân cắt tế b ào ). Trong quá trình sinh sản vô tính, nhân và tế bào chất từ tế bào mẹ chuyển sang tế bào con. Trước khi phân cắt, nhiễm sắc thể trong nhân cũng chia th ành 2 phần bằng nhau cho tế bào mẹ và tế bào con. Trong các thế hệ tế bào nấm men thì số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào nấm men được bảo tồn một cách nghiêm ngặt. Sinh sản hữu tính: trong quá tr ình nuôi cấy, nấm men chuyển đột ngột từ môi trường giàu dinh dưỡng sang môi trường nghèo dinh dưỡng trong khi vẫn giữ nguyên độ ẩm, tích tụ các hợp chất trung gian, đủ oxy của không khí th ì tế bào sẽ sinh bào tử nằm trong các túi được gọi là bào tử nang. Bào tử nang bền với các tác nhân b ên ngoài như nhiệt độ cao, khô hạn nhưng kém bền nhiệt hơn so với bào tử của vi khuẩn. Chúng chết ở nhiệt độ 60 0C còn bào tử của vi khuẩn chết ở nhiệt độ 12 0 0 C. Bào tử nang hình thành do kết quả giao hợp 2 tế bào có tính đực cái và quá trình phân chia nhân thụ thành hợp tử. Trong một nang có từ 1 -4 bào tử đôi khi có đến 8 bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi cho quá tr ình sinh sản vô tính ở môi trường mới, các bào tử nảy mầm thành tế bào mới và tiếp tục sinh sản bằng cách nảy chồi. Trong vòng đời sinh sản của nấm men có sự luân phi ên sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính với các giai đoạn khác nhau. 1.2.5.2. Sinh trưởng của nấm men Khi cấy nấm men vào môi trường dinh dưỡng chúng sẽ sinh sản cho đến c ơ