Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giáo dục - Đào tạo Cao đẳng - Đại học Khóa luận nghiên cứu phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn methylobacteri...

Tài liệu Khóa luận nghiên cứu phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn methylobacterium sp. từ lá dương xỉ (marattiaceae)

.PDF
63
143
52

Mô tả:

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG ĐẶNG THỊ MỸ TRIỀU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. TỪ LÁ DƯƠNG XỈ (MARATTIACEAE) Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Cán bộ hướng dẫn : TS. PHẠM THỊ MỸ Đà Nẵng – Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Đà Nẵng, tháng 4 năm 2018 Tác giả luận văn ĐẶNG THỊ MỸ TRIỀU LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô TS. Phạm Thị Mỹ người đã trực tiếp truyền đạt kinh nghiệm quý báu và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Xin cảm ơn thầy ThS. Vũ Đức Hoàng đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Sinh - Môi trường - Đại học Sư Phạm - Đại học Đà Nẵng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em trong 4 năm học. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ động viên em trong suốt thời gian làm khóa luận. Xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực hiện Đặng Thị Mỹ Triều MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1. Đặt vấn đề ..................................................................................................1 2. Mục tiêu đề tài............................................................................................2 3. Ý nghĩa của đề tài.......................................................................................2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METHYLOBACTERIUM SP. .....................3 1.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại VK Methylobacterium sp. ..............3 1.1.2. Đặc điểm phân bố ............................................................................4 1.1.3. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lí................................................4 1.1.4. Phương pháp phân lập và định danh................................................6 1.1.5. Các loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium ...............................6 1.1.6. Một số ứng dụng của chi Methylobacterium ...................................7 1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI ...........................................................10 1.2.1. Một số nghiên cứu trên thế giới .....................................................10 1.2.2. Một số nghiên cứu trong nước .......................................................12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................................................................... 15 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU......................................15 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................15 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu .......................................................................15 2.1.3. Nội dung nghiên cứu .....................................................................15 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................16 2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ..................................................................16 2.2.2. Phương pháp thu mẫu ....................................................................17 2.2.3. Phương pháp phân lập ...................................................................17 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào và các test sinh hóa của các chủng VK được tuyển chọn .................................................18 2.2.5. Phương pháp định danh các chủng VK bằng kỹ thuật sinh học phân tử ..............................................................................................................20 2.2.6. Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của các chủng VK tuyển chọn được ............................................22 2.2.7. Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng của các chủng VK tuyển chọn được.......................................................................................23 2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..................................................... 25 3.1. PHÂN LẬP VI KHUẨN TỪ MẪU LÁ DƯƠNG XỈ ..........................25 3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI TẾ BÀO VÀ CÁC TEST SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VK ĐƯỢC TUYỂN CHỌN .......................27 3.3. ĐỊNH DANH 2 CHỦNG VK T6, T12 BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ .........................................................................................................32 3.3.1. Tách chiết và khuếch đại gen ........................................................32 3.3.2. Giải trình tự đoạn gen 16S – rRNA và định danh loài ..................33 3.4. KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG CỦA 2 CHỦNG VK T6 VÀ T12.........................................36 3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ methanol.....................................36 3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ ..............................................37 3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ......................................................38 3.5. NGHIÊN CỨU ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA 2 CHỦNG VK T6 VÀ T12 .......................................................................................................38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 40 1. KẾT LUẬN ..............................................................................................40 2. KIẾN NGHỊ .............................................................................................40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 41 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CTAB Cetyltrimethyl-ammonium bromide CMS: Môi trường MS bổ sung Caseine Hydrolase CFU: Colony Forming Unit IAA: Indole-3-acetic acid MMS: Methanol minerat salts NCBI National Center for Biotechnology Information PCR: Polymerase Chain Reaction PHB: Poly-β-hydroxybutyrate PPFM: Pinkpigmented facultatively methylotrophic PTN Phòng thí nghiệm VK: Vi khuẩn UV: Ultraviolet VSV: Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG BIỂU Kí hiệu bảng 1.1 Tên bảng Trang Danh mục các loài Methylobacterium sp. đã được đặt tên (Lựa chọn dựa trên công bố của các tạp chí 7 trong ngân hàng NCBI) 2.1 Trình tự cặp mồi được sử dụng để khuếch đại vùng gen 16S rRNA 3.1 Hình thái khuẩn lạc 32 chủng VK phân lập được 3.2 Tổng hợp các đặc tính sinh hóa của 2 chủng VK (T6, T12) 22 25,26 31 DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Số hiệu Tên hình ảnh Trang 2.1 Lá dương xỉ 15 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 16 2.3 Phương pháp test Gram (–)/(+) nhanh với KOH 18 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng khuếch đại PCR 22 3.1 Hình thái khuẩn lạc của 34 chủng VK phân lập được từ mẫu lá dương xỉ 25 3.2 Hình thái khuẩn lạc của các chủng VK có sắc tố hồng 27 3.3 Tế bào dưới kính hiển vi của 15 chủng VK (T1, T2, T4, T5, T6, T7, T8, T10, T12, T13, T16, T18, T25, T27, T31) 29 3.4 Thử nghiệm catalase 2 chủng VK T6, T12 30 3.5 Test Urease của 2 chủng VK T6, T12 31 3.6 Sinh khối của 2 chủng VK T6, T12 32 3.7 Sản phẩm PCR 2 chủng VK T6, T12 33 3.8 Tìm kiếm trình tự tương đồng chủng VK T6 34 3.9 Tìm kiếm trình tự tương đồng chủng VK T12 35 Ảnh hưởng của nồng độ methanol lên sự sinh trưởng 3.10 3.11 3.12 3.13 của 2 chủng VK T6 và T12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của 2 chủng VK T6 và T12 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của 2 chủng VK T6 và T12 Đường cong sinh trưởng của 2 chủng VK T6 và T12 sau 120h nuôi cấy 36 37 38 39 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn (VK) có sắc tố hồng dinh dưỡng methyl tuỳ ý (pink-pigmented facultatively methylotrophic, PPFM). Chúng cư ngụ chủ yếu ở vùng lá, nhưng đôi khi vẫn tìm thấy ở trong đất và trong nước. Chúng sử dụng methanol từ thực vật làm nguồn carbon chủ yếu đồng thời sinh tổng hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (auxin, cytokinin, salicylic acid), vitamine (B12) và các enzyme (urease, ACC deaminase) để tác động ngược trở lại đối với thực vật, là nhóm VK có ích nên chúng đã được sử dụng để tăng năng suất lúa [35], kích thích sự sinh trưởng của mía, bông vải hay gia tăng tính kháng bệnh ở đậu phộng [9], [23], [36]. Bên cạnh đó, Methylobacterium sp. có khả năng sử dụng đa dạng các hợp chất hữu cơ khác nhau, từ các chất không độc cho tới các chất độc đối với sinh vật hay các chất gây ô nhiễm môi trường (methyl bromine, methyl chloride, methane, trinitrotoluent, Hg, Ni, Cd...) do vậy chúng có nhiều tiềm năng để ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường [46]. M. radiotolerans, M. extorquens, M. fujisawaense còn có khả năng kháng mạnh với các chất phóng xạ, chúng vẫn tồn tại ở liều chiếu xạ 20kGy. Vì thế, nhóm VK này được sử dụng làm vi sinh vật chỉ thị cho khả năng vô trùng của các vật dụng dùng trong ngành công nghiệp thực phẩm, y tế được xử lý vô trùng bằng công nghệ chiếu xạ [45]. Do sử dụng các hợp chất một carbon làm nguồn năng lượng nên VK Methylobacterium sp. đang là một VK kiểu mẫu đầy tiềm năng trong việc sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị chẳng hạn như: βcarotene, vitamine B12, Q10, các amino acid…[23], [46]. Ngày nay, nhiều công trình tập trung nghiên cứu vào việc thiết kế các hệ thống vector tái tổ hợp nhằm biểu hiện các protein ngoại lai trong tế bào vi khuẩn Methylobacterium sp., trong đó hai công trình nổi bật trong hướng nghiên cứu này là biểu hiện bacteriocin và tinh thể độc tố diệt sâu [23]. Đặc biệt, một hướng tiếp cận mới hiện nay đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm đó là hướng sử dụng protein đơn bào từ vi sinh vật làm nguồn 2 protein thay thế trong thức ăn nuôi trồng thủy sản. Trong một nghiên cứu mới nhất vào đầu năm 2017 tại một công ty công nghệ sinh học có trụ sở tại Massachusetts KnipBio, Tổ chức New England Aquarium, Đại học Massachusetts, Đại học Roger Williams và Cơ quan Nghiên cứu Nông nghiệp của Bộ Nông nghiệp Mỹ USDA đã chỉ ra rằng chế độ ăn có chứa từ 30% đến 100% VK dạng viên Methylobacterium extorquens đóng vai trò như một chất thay thế protein nông nghiệp có chất lượng cao trong thức ăn cho thủy sản (tôm, cá) [22]. Từ những nghiên cứu trên đây nhận thấy rằng VK Methylobacterium sp. đã và sẽ trở thành vi khuẩn đầy tiềm năng trong việc tạo ra các sản phẩm có giá trị cao, phục vụ nông nghiệp và đời sống. Xuất phát từ những lí luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn một số chủng VK Methylobacterium sp. từ lá dương xỉ (Marattiaceae)”. 2. Mục tiêu đề tài Đề tài được thực hiện với mục tiêu là phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. từ lá dương xỉ. Từ đó tạo dữ liệu khoa học về các chủng phập lập được, ứng dụng vào thực tiễn tại địa phương. 3. Ý nghĩa của đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học Phân lập và lưu giữ được một số chủng VK Methylobacterium sp. Đây là nguồn gen cung cấp cho các hướng nghiên cứu chuyên sâu hơn về sinh lý, sinh hóa, di truyền... 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Các chủng VK phân lập được sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu các đặc tính và ứng dụng sản xuất protein đơn bào, nhựa sinh học tự phân hủy PHB, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật… 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METHYLOBACTERIUM SP. 1.1.1 Lịch sử phát hiện và phân loại VK Methylobacterium sp. Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn (VK) có sắc tố hồng dinh dưỡng methyl tuỳ ý (pink-pigmented facultatively methylotrophic, PPFM). Chúng có khả năng sử dụng các hợp chất chỉ chứa một nguyên tử carbon như fomate, formaldehyde, methanol hay các hợp chất chứa nhiều nguyên tử carbon làm nguồn cung cấp năng lượng và nguồn carbon cho quá trình sinh trưởng [23]. Vị trí phân loại chi Methylobacterium trong giới vi sinh vật như sau: Giới: Bacteria, ngành: Proteobacterium, lớp: Alphaproteobacteria, bộ: Rhizobiales, họ: Methylobacteriaceae. Mặc dù, VK Methylobacterium sp. hiện diện rất phổ biến trong đất hay trên các sinh vật nhưng trong một thời gian dài nhóm vi khuẩn này không được nghiên cứu nhiều. Những năm 1960-1970 khi các nghiên cứu tập trung vào con đường đồng hóa các hợp chất một carbon thì nhóm vi khuẩn dinh dưỡng methyl được phân lập, nghiên cứu, trong đó tập trung vào các phương thức biến dưỡng năng lượng và những ứng dụng. Trong đó, loài Methylobacterium sp. được Bassalik phân lập lần đầu tiên vào năm 1913 từ giun đất và được đặt tên lúc đầu là Bacillus extorquens [20], [23]. Trong giai đoạn trước năm 1960, một số loài VK thuộc chi Methylobacterium đã được phân lập nhưng do không có đầy đủ thông tin nên các loài này được phân loại vào các chi VK khác nhau chẳng hạn như: Pseudomonas, Flavobacterium, Protaminobacter, Arthrobacter, Corynebacterium, Vibrio… [20], [23], [36]. Năm 1976, Patt và cộng sự phân lập được loài Methylobacterium sp. đầu tiên có khả năng sử dụng methane. Loài này sắp xếp vào một chi mới là Methylobacterium với tên loài là Methylobacterium organophilum (loài chuẩn cho Chi) [41]. Năm 1982, Green và Bousfield nhận thấy chủng M. organophilum có nhiều đặc điểm rất giống với các loài VK Methylobacterium sp. đã được công bố trước đây (không có khả năng sử dụng methane) và căn cứ trên sự tương đồng trên 70% của 140 đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái của 149 chủng với loài M. organophilum, Green và Bousfield 4 đã đề nghị sắp xếp các loài VK Methylobacterium sp. vào chi Methylobacterium [20], [23]. Từ năm 1992 đến nay, dựa sự phát triển của các phương pháp sinh học phân tử, hơn 50 loài Methylobacterium sp. mới được công bố trên hệ thống NCBI [21], [25], [26], [51]. 1.1.2 Đặc điểm phân bố VK Methylobacterium sp. phân bố rộng trong tự nhiên, hiện diện ở nhiều môi trường khác nhau: môi trường đất, nước, không khí, băng ở hai cực, sần rễ thực vật và tập trung chủ yếu ở vùng lá thực vật [21], [23]. VK Methylobacterium sp. là những vi khuẩn hiếu khí hoàn toàn, do vậy các vi khuẩn này có thể được phân lập môi trường nước sạch nào có chứa oxy hòa tan. Ngoài ra, VK Methylobacterium sp. còn có khả năng kháng với ion Cl- nên chúng vẫn hiện diện trong nước sạch dùng để sinh hoạt [24], [27]. VK Methylobacterium sp. được phân lập trên bề mặt lá, thân, rễ của thực vật nhưng mật độ ở mỗi cơ quan thì khác nhau [29]. Chúng có mặt chủ yếu trên vùng lá của hơn 100 loài thực vật và có mối quan hệ mật thiết với thực vật [18], [38], [40]. Thông qua phương pháp sử dụng carbon phóng xạ (C14) Green đã làm sáng tỏ khả năng sử dụng các hợp chất methanol từ thực vật của VK Methylobacterium sp., điều này giải thích nguyên nhân sự hiện diện của chi VK Methylobacterium sp. trên thực vật [23], [28], [39]. VK Methylobacterium sp. thường lan truyền qua không khí, có khả năng sử dụng các hợp chất có tính độc với sinh vật làm nguồn cung cấp carbon và nitơ: tetrachloromethane, trimethylamine. Chính vì vậy, các VK Methylobacterium sp. còn đóng vai trò quan trọng trong chu trình carbon trong tự nhiên [23], [48], ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường [49]. Tuy nhiên, vai trò của chúng trong hệ sinh thái vẫn chưa được sáng tỏ [38]. 1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lí Hầu hết các loài Methylobacterium sp. thường có hình que kích thước 0,8 - 1 x 1- 8µm và là VK gram âm, thường ở dạng tế bào đơn hay kết đôi lại theo dạng hoa hồng (rosettes) [22], [23]. Hầu hết các chủng Methylobacterium sp. đều có khả năng 5 di động nhờ một tiêm mao ở cực hay gần cực và chúng cho phản ứng dương tính với catalase [23]. Chúng thường tăng sinh chậm, khuẩn lạc có màu hồng hay đỏ cam, một vài chủng không tăng trưởng trên môi trường nutrient agar. Sắc tố hồng của VK Methylobacterium sp. không tan trong nước và là hợp chất carotenoid, không phát ánh sáng huỳnh quang, hấp thu bước sóng cực đại ở 473, 499 và 532nm [21]. Ở môi trường lỏng nuôi cấy tĩnh VK Methylobacterium tạo thành một lớp mỏng trên bề mặt, điều này cho thấy hầu hết các chủng đều là hiếu khí bắt buộc [23]. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của các loài thuộc chi Methylobacterium dao động từ 250C đến 300C. Một vài loài vẫn có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 370C hay 510C. Mặc dù đa số các loài đều tăng trưởng ở khoảng pH trung tính nhưng cũng có một số loài vẫn có khả năng phát triển ở các giá trị pH cực đoan (pH=4; pH=10). Tất cả các loài đều không đòi hỏi các nhân tố tăng trưởng và không có khả năng phân giải các hợp chất như: casein, tinh bột, gelatin, cellulose, lecithin và DNA. Khả năng phân giải các hợp chất lipid chỉ có ở một số loài. Tất cả các loài đều không tạo ra các enzyme: β-galactosidase, L-ornithine decarboxylase, L-lysine decarboxylase, Larginine dihydrolase (ngoại trừ Urease lại hiện diện ở tất cả các loài) [21], [23], [24]. VK Methylobacterium sp. có tính kháng cao với chất khử, nhiệt độ lạnh, Cl-, tia UV phóng xạ ion, nhiệt độ cao. Phần lớn các loài trong Methylobacterium sp. đều nhạy cảm với kháng sinh như: kanamycine, albamycine T, streptomycine, framycine và tetracyline. Trong đó, tetracyline có ức chế mạnh đối với VK Methylobacterium sp [23]. Phương thức chuyển hóa các hợp chất một cacbon ở tất cả các loài VK Methylobacterium sp. đều theo chu trình serine. Trong đó có sự gắn kết giữa chu trình serine và chu trình tricarboxylic (TCA) để tạo ra các sản phẩm hữu cơ cuối cùng cho VK sử dụng. Ngoài ra, các chu trình này còn gắn kết với chu trình PHB để tạo ra các sản phẩm dự trữ cho VK (poly-β-hydroxybutyrate). Một số chủng có khả năng tổng hợp hormone thực vật (phytohormone) trong môi trường nuôi cấy, một số loài có khả năng tổng hợp vitamine B12 và một số khác [39]. Khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ cung cấp cung cấp nguồn cacbon và năng lượng của chủng VK Methylobacterium sp. thuộc chi Methylobacterium sp. rất 6 đặc trưng. Hầu hết các chủng có khả năng sử dụng betaine, trimethylanine, serbactae,... Trong khi một số loài khác có khả năng sử dụng cyanate, thiocianate, formaldehyde, TNT (2,4,6-trinitrotoluene), HMX (octahydro-1,3,5,7-tetranitro1,3,5,7-tetrazicine hay high-melting-point explosive), RDX (hexahydro-trinitro1,3,5-triazine hay royal explosive),... Do vậy, có thể phân biệt các loài VK Methylobacterium sp. nhờ căn cứ vào khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ của các chủng này [21], [23], [24]. 1.1.4 Phương pháp phân lập và định danh Methylobacterium sp. là những vi khuẩn có khả năng sử dụng methanol làm nguồn cung cấp carbon và năng lượng, vì thế môi trường methanol mineral salts (MMS) là môi trường thích hợp để phân lập vi khuẩn Methylobacterium sp. Ngoài ra, VK Methylobacterium sp. có sắc tố hồng đặc trưng nên rất dễ nhận diện trên môi trường phân lập [23]. Khoảng nhiệt độ thường được sử dụng để phân lập Methylobacterium sp. là 25300C. Vi khuẩn có tốc độ tăng trưởng tương đối chậm, trên môi trường MMS sau 2 đến 3 ngày mới hình thành khuẩn lạc, khuẩn lạc đạt đường kính tối đa 1-3 mm sau 7 ngày nuôi cấy. Đôi khi vi khuẩn mọc nhanh, có màu đậm hơn trên môi trường Glycerol-Peptone Agar và môi trường này thường được sử dụng trong giữ giống các chủng VK Methylobacterium sp. [23]. Ngoài việc sử dụng methanol làm tác nhân chọn lọc thì việc sử dụng cycloheximide cũng giúp cho quá trình phân lập được thuận lợi hơn. Khi sử dụng môi trường MMS làm môi trường phân lập thì những khuẩn lạc màu hồng có đường kính khoảng 1 mm thường là vi khuẩn Methylobacterium sp., trong môi trường này nhóm nấm men hay nhóm vi khuẩn có sắc tố hồng không phải là phổ biến [23], [36]. 1.1.5 Các loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium Theo thống kê của ngân hàng dữ liệu NCBI [51] thì đã có tổng cộng 52 loài tính đến tháng 4. 2018 (bảng 1.1). 7 Bảng 1.1 Danh mục các loài Methylobacterium sp. đã được đặt tên. 1 M. adhaesivum 19 M. hispanicum 37 M. pseudosasae 2 M. aerolatum 20 M. indicum 38 M. pseudosasicola 3 M. aminovorans 21 M. iners 39 M. radiotolerans 4 M. aquaticum 22 M. isbiliense 40 M. rhodesianum 5 M. brachiatum 23 M. jeotgali 41 M. rhodinum 6 M. brachythecii 24 M. komagatae 42 M. salsuginis 7 M. bullatum 25 M. longum 43 M. soli 8 M. cerastii 26 M. marchantiae 44 M. specialis 9 M. dankookense 27 M. mesophilicum 45 M. suomiense 10 M. endosymbiont 28 M. nodulans 46 M. tardum 11 M. extorquens 29 M. organophilum 47 M. tarhaniae 12 M. frigidaeris 30 M. oryzae 48 M. thiocyanatum 13 M. fujisawaense 31 M. oxalidis 49 M. thuringiense 14 M. gnaphalii 32 M. persicinum 50 M. trifolii 15 M. goesingense 33 M. phyllosphaerae 51 M. variabile 16 M. gossipiicola 34 M. phyllostachyos 52 M. zatmanii 17 M. gregans 35 M. platani 18 M. haplocladii 36 M. populi TÊN LOÀI STT TÊN LOÀI STT STT (Lựa chọn dựa trên công bố của các tạp chí trong ngân hàng NCBI [51]) TÊN LOÀI 1.1.6 Một số ứng dụng của chi Methylobacterium a.Tác động lên thực vật Khả năng tương tác với thực vật cùng với việc hấp thu các chất tiết ra từ thực vật thì VK Methylobacterium sp. có thể tổng hợp và tiết ra các chất khác nhau có lợi cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chủng Methylobacterium được Basile và cộng sự (1969) phát triển kích thích sinh trưởng ở cây rêu (Scapania nemorosa) trong điều kiện in vitro. Trong những nghiên cứu ban đầu, họ mô tả VK này có thể kích thích sự tăng trưởng và tái sinh của rêu nuôi cấy mô. Sau đó, họ chỉ 8 ra rằng VK Methylobacterium sp. sản xuất vitamine B12 (cyanocobalamine) và sự bổ sung vitamine này khi trồng rêu Jungermannia leiantha và Gymnocolea inflata có thể kích thích sự tăng trưởng và phát triển của cây. VK Methylobacterium sp. có tác động đối với một số lượng lớn các loài cây trồng có giá trị như: thuốc lá, bông, dâu tây, lúa, bông vải, mía, cà chua, hướng dương, đậu phụng [9], [35], [36]. Tuy nhiên, hiệu quả cho từng loại cây trồng không phải do một loài mà là do sự tác động tổng hợp của nhiều loài VK Methylobacterium sp. tạo ra [23]. Ngoài khả năng kích thích sự tăng trưởng và phát triển của một số loài cây trồng, VK Methylobacterium sp. còn có khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh trên thực vật chẳng hạn như: Xanthomonas camprestris, Pseudomonas syringae, Erwinia carotovora, Clavibacter michiganense và Agrobacterium tumefaciens, Fusarium solani (gây bệnh trên cây tiêu), Guignardia citricarpa hay Xylella fastidiosa (gây bệnh nghiêm trọng trên các loài cây có múi). Madhaiyan ghi nhận khả năng kháng bệnh ở cây lúa và cây đậu phộng có liên quan tới sự thay đổi hệ enzyme polyphenol trong cây [35]. Penalvera và Poonguzhali ghi nhận khả năng sinh tổng hợp các phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone, điều này giúp VK Methylobacterium sp. cạnh tranh với các loài VK gây bệnh khác trong quá trình cư trú trên thực vật [42]. Các nghiên cứu này ghi nhận khả năng giúp cây trồng kháng lại với các tác nhân gây bệnh nhưng chưa làm sáng tỏ các cơ chế. Tuy nhiên, những ghi nhận này cũng cho thấy tiềm năng sử dụng VK Methylobacterium sp. để kiểm soát dịch bệnh trên thực vật [18], [40]. b. Sản xuất nhựa sinh học PHB PHB (Poly-β-hydroxybutyrate) là một loại nhựa polymer chịu nhiệt, là nguồn carbon dự trữ ở vi sinh vật. Do vậy, quá trình sinh tổng hợp hay phân giải hợp chất PHB sẽ do các enzyme có trong sinh vật đảm nhiệm. Do đó, PHB được coi như là một loại nhựa sạch, không gây ô nhiễm môi trường, được áp dụng trong lĩnh vực y dược, nông nghiệp hay công nghiệp thực phẩm. PHB được điều chế thành các sản phẩm có giá trị cao như chỉ khâu dùng trong phẫu thuật, vật liệu gắn kết xương bị gãy, nhựa chịu nhiệt…[37] 9 Đa số các loài VK trong chi Methylobacterium đều có khả năng sinh tổng hợp PHB nhưng lượng PHB tạo ra ở mỗi loài Methylobacterium sp. khác nhau và phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy. Ở Methylobacterium extorquens AM1 trên môi trường có nguồn carbon là succinate thì lượng PHB tạo thành chiếm 15-20% trọng lượng sinh khối khô, trong môi trường có methanol lượng PHB tạo ra chiếm tới 80% trọng lượng khô và Methylobacterium fujisawaense trên môi trường glucose chỉ sinh tổng hợp được lượng PHB chiếm khoảng 12,4% [37]. Trong tế bào VK, PHB được dự trữ trong túi bên trong tế bào. PHB bắt màu đặc hiệu với thuốc nhuộm Nile blue, phát ánh sáng đỏ khi được xem dưới kính hiển vi huỳnh quang với bước sóng 235nm. Một số loài VK thuộc chi Methylobacterium đã được sử dụng để tách chiết PHB bao gồm: M. extorquens, M. fujisawaense, M. organophilum, M. mesophilicum, M. rhodium, M. rhodesianum, M. zatmanii, M. radiotolerans [17], [31]. c. Xử lý môi trường VK Methylobacterium sp. có khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ khác nhau gồm các chất gây ô nhiễm môi trường và tổng hợp các hợp chất có lợi cho chính VK cũng như có lợi cho đời sống của con người. Trong nghiên cứu của Van Aken và cộng tác viên (2004), chứng minh rằng VK Methylobacterium sp. cộng sinh được phân lập từ môi trường nuôi cấy mô cây dương Populus deltoides nigra DN34. Chủng VK thuần thuộc Methylobacterium sp. BJ001 có thể chuyển đổi hoàn toàn chất 25mg/l TNT, 20mg/l RDX, 2,5mg/l HMX sau 55 ngày nuôi cấy để tạo ra CO2 [45], [46]. Methylobacterium sp. đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái do chúng có khả năng sử dụng methan một loại khí gây hiệu ứng nhà kính. Ngoài ra, VK Mehtylobacterium sp. cũng có khả năng phân hủy nhiều hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm khác bao gồm methyl chloride, methyl bromide, methyl iodide, dichloromethane, methul tert-butyl ether, methylated amines, những hợp chất có chứa ethylated sulfur, cyanate và thiocyanate [23], [40]. d. Ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm Ngoài khả năng sinh tổng hợp PHB, VK Methylobacterium sp. còn có khả năng sinh tổng hợp một số hợp chất khác có giá trị kinh tế chẳng hạn như: exopolysaccharid 10 được sử dụng để tạo ra các màng sinh học, methylan được sử dụng để tạo ra các polysaccharid ion dương nhằm thay thế cholestyramine dùng trong điều trị bệnh cao huyết áp [47]. Trong lĩnh vực thực phẩm VK Methylobacterium sp. cũng có thể góp phần quan trọng và đầy tiềm năng bởi vì chúng vừa có khả năng sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền vừa có thể tạo các sản phẩm có giá trị như protein đơn bào, β-carotene, vitamine B12 và nhiều sản phẩm có giá trị khác [23], [44]. Từ những cơ sở này có thể kết luận rằng VK Methylobacterium sp. có nhiều tiềm năng ứng dụng không chỉ trong nông nghiệp mà còn trong lĩnh vực môi trường, thực phẩm. 1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 1.2.1 Một số nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới việc nghiên cứu về Methylobacterium sp. khá phong phú và đa dạng. Năm 1976, Patt và cộng sự phân lập được loài VK Methylobacterium sp. đầu tiên có khả năng sử dụng methane. Loài này sắp xếp vào một chi mới là với tên loài là Methylobacterium organophilum (loài chuẩn cho Chi) [41]. Năm 1982, Green và Bousfield nhận thấy chủng M. organophilum có nhiều đặc điểm rất giống với các loài VK Methylobacterium sp. đã được công bố trước đây (không có khả năng sử dụng methane) và căn cứ trên sự tương đồng trên 70% của 140 đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái của 149 chủng VK Methylobacterium sp. với loài M. organophilum, Green và Bousfield đã đề nghị sắp xếp các loài VK Methylobacterium sp. vào chi Methylobacterium [20], [23]. VK Methylobacterium tập trung nhiều trên lá của hơn 100 loài thực vật và chúng có mối quan hệ mật thiết với thực vật. Koenig và cộng sự (2002), nghiên cứu về mối liên hệ giữa Methylobacterium sp. và thực vật ở mức phân tử [30]. Họ chứng minh bốn loài Methylobacterium sp. phân lập từ lá và loài M. extorquens đều tạo ra cytokinin là trans-zeatin ở mức rất thấp và tiết vào môi trường nuôi cấy [41]. Thông qua phương pháp sử dụng carbon phóng xạ (C14) Green đã làm sáng tỏ khả năng sử 11 dụng các hợp chất methanol từ thực vật của VK Methylobacterium sp., điều này giải thích nguyên nhân sự hiện diện của VK Methylobacterium sp. trên thực vật… [21], [22], [23], [24]. Một số công trình nghiên cứu chứng minh tác dụng của VK Methylobacterium sp. trên thực vật có khả năng tăng năng suất cây trồng. Nghiên cứu của Maliti (2000) chỉ ra một số chủng Methylobacterium sp. có khả năng gia tăng callus từ phôi hạt lúa, trong khi một số khác có tác dụng kích thích sinh trưởng và phát triển trên thân, lá, rễ lúa [36]. Trong nghiên cứu của Madhaiyan (2005), đã chỉ ra tất cả chủng VK Methylobacterium sp. có khả năng kích thích nảy mầm hạt lúa, kích thích sinh trưởng và tăng khả năng kháng bệnh, góp phần tăng năng suất trên cây lúa [34], [35]. Một số công trình nghiên cứu khác cũng chứng minh được Methylobacterium sp. góp phần tăng năng suất trên cây mía, bông, đậu phộng [23]. Sự tổng hợp một số hợp chất thứ cấp của Methylobacterium sp. cũng được ghi nhận. Năm 2001, trong nghiên cứu của Ivanova chỉ ra rằng 4 loài Methylobacteria là M. mesophilicum, A. aminovorans, M. mays, P. Kondratievae có thể tạo IAA. Năm 2002, Koenig và cộng sự kiểm tra được lượng cytokynin được tổng hợp bởi PPFM [41]. Năm 2004, nghiên cứu của Omer và cộng sự chứng minh rằng Methylobacteria hiếu khí có thể tổng hợp auxin (chủ yếu là IAA) từ L- tryptophan ngoại bào [39], [40]. Bên cạnh khả năng tổng hợp các chất góp phần gia tăng khả năng sinh trưởng của thực vật, Methylobacterium sp. còn có khả năng tổng hợp nhựa sinh học PHB. Trong nghiên cứu của Ackermann và cộng sự (1994), chứng minh rằng PHB được tích lũy trong tế bào ở điều kiện bị giới hạn dinh dưỡng. Tùy thuộc vào yếu tố giới hạn (nitrogen hoặc phosphate) mà tổng tích lũy PHB biến thiên trong khoảng 2% trọng lượng thô của sinh khối [35], [37]. Ngoài ra, VK Methylobacterium sp. được Van Aken (2004) đánh giá là có tiềm năng ứng dụng trong xử lí ô nhiễm môi trường bởi chúng có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm khác như methyl chloride, methyl bromide, methyl iodide, methyl tert-butyl ether, dichloromethane, những hợp chất chứa ethylated sunfur, cyanate, thiocyanate [45], [46]. 12 Vì sử dụng các hợp chất một carbon làm nguồn năng lượng nên VK Methylobacterium sp. đang là một VK kiểu mẫu đầy tiềm năng trong việc sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị chẳng hạn như: protein đơn bào, β-carotene, vitamine B12, Q10, các amino acid…[23], [46]. Ngày nay, nhiều công trình tập trung nghiên cứu vào việc thiết kế các hệ thống vector tái tổ hợp nhằm biểu hiện các protein ngoại lai trong tế bào VK Methylobacterium sp., trong đó hai công trình nổi bật trong hướng nghiên cứu này là biểu hiện bacteriocin và tinh thể độc tố diệt sâu [23]. Đặc biệt, một hướng tiếp cận mới hiện nay đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm đó là hướng sử dụng protein đơn bào từ vi sinh vật làm nguồn protein thay thế trong thức ăn nuôi trồng thủy sản. Trong một nghiên cứu mới nhất vào đầu năm 2017 tại một công ty công nghệ sinh học có trụ sở tại Massachusetts KnipBio, Tổ chức New England Aquarium, Đại học Massachusetts, Đại học Roger Williams và Cơ quan Nghiên cứu Nông nghiệp của Bộ Nông nghiệp Mỹ USDA đã chỉ ra rằng chế độ ăn có chứa từ 30% đến 100% VK dạng viên Methylobacterium extorquens đóng vai trò như một chất thay thế protein nông nghiệp có chất lượng cao trong thức ăn cho thủy sản (tôm, cá) [22]. Từ những nghiên cứu này, VK Methylobacterium sp. sẽ trở thành VK có lợi trong việc tạo ra các sản phẩm có giá trị cao, phục vụ nông nghiệp và đời sống. 1.2.2 Một số nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam trong những năm gần đây các công trình nghiên cứu chủ yếu tập trung khảo sát hệ VK Methylobacrium sp. trên thực vật và một số ít công trình nghiên cứu về thu nhận PHB. Kiều Phương Nam và cộng sự [8] đã phân lập thành công các chủng M. radiotorelans H2T, M. oryzae 1021b, M. radiotolerans 1019 từ lá lúa. Trong các nghiên cứu của mình họ chỉ ra được chủng VK Methylobacterium radiotolerans 1019 có ảnh hưởng tới sự phát sinh cơ quan ở thực vật: gia tăng sự hình thành chồi, rễ ở cây thuốc lá, cây hoa cúc và cây hồng, ức chế sự tạo mô sẹo ở thuốc lá, sự hình thành chồi ở cây cà chua và tăng cường sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo của cây cúc. Hiệu quả và chiều hướng tác động của VK phụ thuộc vào bản chất loại mô và loại
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan