Tài liệu Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theobroma cacao l.) chuyển gen

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ----------------------------- HÀ HỒNG HẠNH NGHIÊN CỨU TÁI SINH IN VITRO VÀ TẠO CÂY CA CAO (Theobroma cacao L.) CHUYỂN GEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2015 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------------------------- HÀ HỒNG HẠNH NGHIÊN CỨU TÁI SINH IN VITRO VÀ TẠO CÂY CA CAO (Theobroma cacao L.) CHUYỂN GEN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS LÊ THỊ THU HIỀN 2. PGS.TS NÔNG VĂN HẢI HÀ NỘI - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Lê Thị Thu Hiền và PGS. TS. Nông Văn Hải. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả khác. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận án Hà Hồng Hạnh i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Thu Hiền - Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trưởng phòng Đa dạng sinh học hệ gen là người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu cũng như thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nông Văn Hải - Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo và các cán bộ thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, đặc biệt là tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Đa dạng sinh học hệ gen đã luôn quan tâm và giúp đỡ, góp ý cho tôi thực hiện và hoàn thành bản luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Chu Hoàng Hà và các cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được thực hiện một số thí nghiệm tại Phòng. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo, Phòng Quản lý tổng hợp, Th.S. Bùi Hải Hà, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về mọi mặt, hỗ trợ tôi thực hiện các thủ tục cần thiết để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập và nghiên cứu của Nghiên cứu sinh. Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và người thân đã ở bên tôi, chăm sóc, động viên giúp tôi yên tâm học tập và nghiên cứu. Tôi cũng gửi lời cảm ơn tới các bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ tôi thực hiện luận án. Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài: “Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển gen” thuộc Chương trình Trọng điểm phát triển và ứng dụng Công nghệ sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đến năm 2020 do Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn quản lý. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự trợ giúp quý báu của các chuyên viên Vụ Khoa học Công nghệ và Môi trường, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Tác giả luận án ii MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................... III DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... VI DANH MỤC BẢNG .................................................................................................VIII DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... IX MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 4 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CA CAO ............................................................ 4 1.1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại ca cao .............................................................. 4 1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây ca cao ..................................................................... 5 1.1.3 Ý nghĩa kinh tế của cây ca cao ........................................................................ 8 1.1.4 Bệnh do nấm ở cây ca cao.................................................................................. 9 1.1.5 Phát triển cây ca cao ở Việt Nam ................................................................... 11 1.2 NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG Ở CÂY CA CAO ...... 12 1.2.1 Nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống ca cao theo phương pháp truyền thống .......................................................................................................................... 12 1.2.2 Chọn tạo giống ca cao sử dụng công nghệ sinh học .................................... 15 1.3 GEN MÃ HÓA CHITINASE ............................................................................... 26 1.3.1 Nguồn gốc và cấu trúc của chitinase tự nhiên ............................................. 26 1.3.2 Chitinase ở một số đối tượng sinh vật .......................................................... 27 1.3.3 Vai trò của gen mã hóa chitinase .................................................................. 29 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................................... 32 2.1 VẬT LIỆU ......................................................................................................... 32 2.1.1 Mẫu thực vật .................................................................................................... 32 2.1.2 Các vector và chủng vi khuẩn .......................................................................... 32 2.13. Hóa chất, thiết bị .............................................................................................. 33 2.2 PHƯƠNG PHÁP .................................................................................................. 34 2.2.1 Các phương pháp liên quan đến tái sinh in vitro cây ca cao ............................ 34 iii 2.2.2 Các phương pháp liên quan đến phân lập gen mã hóa chitinase và thiết kế các vector chuyển gen thực vật ........................................................................................ 38 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ ............................................................................................. 48 3.1 TÁI SINH IN VITRO MỘT SỐ DÒNG CA CAO NGHIÊN CỨU .................... 48 3.1.1 Thu thập mẫu ................................................................................................... 48 3.1.2 Xác định khả năng tạo mô sẹo từ nhị lép và cánh hoa ở các dòng ca cao ....... 49 3.1.3 Xác định khả năng nhân sinh khối mô sẹo từ nhị lép và cánh hoa ở các dòng ca cao…………………………………………………………………………………..51 3.1.4 Cảm ứng tạo phôi soma sơ cấp ........................................................................ 53 3.1.5 Cảm ứng tạo phôi soma thứ cấp....................................................................... 55 3.1.6 Tạo cây ca cao in vitro hoàn chỉnh .................................................................. 57 3.1.7 Khả năng thích ứng cây ca cao in vitro ra vườn ươm ...................................... 60 3.1.8 Quy trình tái sinh in vitro cây ca cao ............................................................... 62 3.2. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA CHITINASE VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT ....................................................................................................... 63 3.2.1 Nhân và tạo dòng vùng gen TcChi1_W ........................................................... 63 3.2.2 Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen mã hóa chitinase sử dụng hệ vector pCB301 ........................................................................................................... 70 3.2.3 Tạo các chủng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp chứa vector biểu hiện thực vật đã thiết kế............................................................................................................. 73 3.2.4 Kiểm tra hoạt động của cấu trúc gen chuyển trên cây thuốc lá ....................... 75 3.3 CHUYỂN GEN CHỈ THỊ GUS/GUSPLUS VÀO CÂY CA CAO ....................... 77 3.3.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn, vector thích hợp và thời gian lây nhiễm vi khuẩn cho chuyển gen vào ca cao ........................................................................................ 78 3.3.2 Chuyển gen chỉ thị gus/gusplus vào dòng ca cao TD8 .................................... 80 3.3.3 Phân tích và đánh giá mô, cây chuyển gen ...................................................... 81 3.4 CHUYỂN GEN MÃ HÓA CHITINASE VÀO CÂY CA CAO ............................ 84 3.4.1 Biến nạp gen mã hóa chitinase vào dòng ca cao TD8 ..................................... 84 3.4.2 Kiểm tra cây ca cao chuyển gen bằng các phương pháp sinh học phân tử ...... 87 iv 3.4.3 Quy trình chuyển gen thông qua A. tumefaciens vào dòng ca cao TD8 .......... 89 CHƢƠNG 4: THẢO LUẬN ....................................................................................... 91 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 102 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................. 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 105 SUMMARY ..................................................................................................................... PHỤ LỤC ......................................................................................................................... v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Bệnh nấm ở cây ca cao………………………………………………. 10 Hình 2.1. Một số vector sử dụng trong nghiên cứu…………………………….. 32 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm………………………………………………. 34 Hình 2.3. Hoa ca cao…………………………………………………………… 35 Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và TDZ đến tỷ lệ tạo phôi từ nhị lép ở một số dòng ca cao nghiên cứu…………………………………….. 50 Hình 3.2. Ảnh hưởng của kiểu gen đến tỷ lệ tạo mô sẹo từ nhị lép……………. 51 Hình 3.3. Mô sẹo từ nhị lép và cánh hoa trên môi trường PCG và SCG………. 52 Hình 3.4. Tỷ lệ tạo phôi sơ cấp từ nhị lép và cánh hoa ca cao…………………. 54 Hình 3.5. Tái sinh phôi sơ cấp từ nhị lép và cánh hoa ca cao………………….. 54 Hình 3.6. Tỷ lệ tạo phôi soma thứ cấp từ trục mầm và lá mầm………………... 56 Hình 3.7. Tái sinh phôi soma thứ cấp từ trục mầm và lá mầm của phôi soma sơ cấp dòng ca cao TD8…………………………………………………. 57 Hình 3.8. Tỷ lệ phôi soma sơ cấp tạo chồi và ra rễ…………………………….. 59 Hình 3.9. Tạo chồi và ra rễ từ phôi soma sơ cấp và thứ cấp…………………… 59 Hình 3.10. Tỷ lệ cây con sống trên các loại giá thể khác nhau sau 20 ngày…… 60 Hình 3.11. Các cây ca cao in vitro trên môi trường ra cây…………………….. 61 Hình 3.12. Quy trình tái sinh in vitro cây ca cao……………………………….. 62 Hình 3.13. Tách chiết DNA tổng số từ lá ca cao dòng TD3…………………… 63 Hình 3.14. Sản phẩm nhân vùng gen TcChi1-W và xử lý pJET+TcChi1-W/1, pJET+TcChi1-W/7 và pJET+TcChi1-W/13 bằng BglII trên gel agarose 0,8%………………………………………………………….. 65 Hình 3.15. Trình tự nucleotide vùng gen TcChi1-U phân lập từ dòng ca cao TD3…………………………………………………………………… 67 Hình 3.16. So sánh trình tự protein TcChi1 ở ca cao dòng TD3 với một số trình tự chitinase lớp I của một số loài thực vật khác……………. 69 Hình 3.17. Sản phẩm PCR nhân gen TcChi1 và sản phẩm xử lý BglII và NotI các plasmid tái tổ hợp pJET+TcChi1 trên gel agarose 0,8%............ 70 vi Hình 3.18. Sơ đồ thiết kế vector pRTRA+TcChi1………………………………. 71 Hình 3.19. Kết quả thiết kế pRTRA+TcChi1 trên gel agarose 0,8%…………... 72 Hình 3.20. Sơ đồ thiết kế vector pCB301+TcChi1…………………………….. 72 Hình 3.21. Sản phẩm xử lý pCB301+TcChi1 bằng HindIII trên gel agarose 0,8%…………………………………………………………………… 73 Hình 3.22. Sản phẩm PCR gen TcChi1 từ pCB301+TcChi1………………… 74 Hình 3.23. Điện di sản phẩm PCR nhân gen TcChi1 từ thuốc lá……………… 75 Hình 3.24. Sản phẩm RT-PCR từ mRNA của các dòng thuốc lá chuyển gen TcChi1…………………………………………………………….. 76 Hình 3.25. Cây thuốc lá chuyển gen…………………………………………….... 77 Hình 3.26. Các mảnh mô ca cao dòng TD8……………………………………. 78 Hình 3.27. Biến nạp gen chỉ thị gus/gusplus vào dòng ca cao TD8……………. 81 Hình 3.28. Biểu hiện gen gus/gusplus trên các mô ca cao chuyển gen………… 82 Hình 3.29. Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ các dòng ca cao chuyển gen…………………………………………………………………. 84 Hình 3.30. Tái sinh cây từ phôi soma của dòng ca cao TD8 chuyển gen TcChi1 86 Hình 3.31. Các cây ca cao chuyển gen…………………………………………. 86 Hình 3.32. Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ các cây ca cao chuyển gen………………………………………………………………….. 87 Hình 3.33. Sản phẩm PCR nhân một phần đoạn CaMV35S+TcChi1+cmyc+ KDEL+tNOS………………………………………………………. 87 Hình 3.34. Vùng T-DNA của vector pCB301+TcChi1………………………… 89 Hình 3.35. Lai Southern các mẫu ca cao chuyển gen…………………………... 89 Hình 3.36. Quy trình chuyển gen vào cây ca cao………………………………. 90 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Nhân mô sẹo sơ cấp trên môi trường SCG…………………………... 52 Bảng 3.2. Nhân mô sẹo thứ cấp trên môi trường SCG………………………..... 56 Bảng 3.3. Tỷ lệ phôi soma thứ cấp tạo chồi và ra rễ……………………………. 58 Bảng 3.4. Lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumefaciens và vector biểu hiện thích hợp cho chuyển gen ca cao………………………………………….. 79 Bảng 3.5. Lựa chọn thời gian lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp cho chuyển gen ca cao…………………………………………………… 80 Bảng 3.6. Khả năng tạo mô sẹo, tạo phôi soma, tạo chồi và ra rễ của các mẫu 82 ca cao biến nạp gen chỉ thị………………………………………….. Bảng 3.7. Khả năng tạo mô sẹo, tạo phôi soma, tạo chồi và ra rễ của các mẫu ca cao TD8 biến nạp gen mã hóa chitinase…………………………. viii 85 DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid AS Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy acetophenone) BAP 6-benzylaminopurin Bar Bialaphos resistance gene - Gen chịu thuốc trừ cỏ Bp Base pair - Cặp base CaMV Cauliflower mosaic virus - Virus khảm súp lơ DEPC Diethyl pyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DKW Driver and Kuniyuki medium - Môi trường DKW EDTA Ethylene diaminne tetra acetic acid EGFP Enhanced green fluorescent protein - Protein tăng cường phát huỳnh quang ED Embryo development medium - Môi trường cảm ứng tạo phôi EDL Embryo development in light medium - Môi trường chuyển dạng phôi và tạo cây gus β-1,4-glucuronidase LB Luria bertani - Môi trường LB nuôi vi khuẩn IM Induction medium - Môi trường cảm ứng MS Murashige and Skoog medium - Môi trường MS nptII Neomycin phosphotransferase II kb Kilobase OD Optical density - Mật độ quang PCG Primary callus growth medium - Môi trường cảm ứng tạo mô sẹo PCR Polymerase chain reaction - Phản ứng dây chuyền polymerase PVPP Poly vinyl poly pyrolidone RNA Ribonucleotic acid ix SCG Secondary callus growth medium - Môi trường nhân mô sẹo SD Standard deviation - Độ lệch chuẩn RD Root development and maintenance medium - Môi trường hình thành và phát triển rễ TDZ Thidiazuron YEP Yeast extract peptone - Môi trường YEP chứa cao nấm men và thịt bò X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid x 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Ca cao (Theobroma cacao L.) là một trong những cây kinh tế quan trọng, đem lại lợi nhuận đáng kể cho một số quốc gia trên thế giới. Bột ca cao được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm tại nhiều nước. Có nguồn gốc từ vùng Amazon (Nam Mỹ), cây ca cao phát triển mạnh ở các vùng có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, trong đó có Việt Nam. Hiện nay, cây ca cao đang được quan tâm để phát triển rộng rãi ở nước ta vì cây có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau như triền dốc, đất cát, phù sa, đất nghèo dinh dưỡng. Ngoài ra, ca cao còn là cây chịu bóng mát tốt, nên có thể trồng xen canh với cây ăn trái, cây lâm nghiệp, phủ xanh đất tốt, thích hợp với kinh tế hộ gia đình và đặc biệt, thị trường tiêu thụ sản phẩm ca cao là rất lớn. Tuy nhiên, tương tự các loài cây trồng khác, phát triển sản xuất ca cao gặp nhiều khó khăn do giống bị thoái hóa, sự cạnh tranh của các loại cây trồng khác, kỹ thuật canh tác chưa hiệu quả, sâu và bệnh hại... Riêng bệnh nấm đã gây sụt giảm khoảng 30% sản lượng ca cao hàng năm trên toàn thế giới. Theo truyền thống, có rất nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học đang được sử dụng để phòng trừ bệnh hại với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người sản xuất và tiêu dùng, cũng như môi trường. Để cải thiện tình hình, giúp cho cây ca cao phát triển bền vững, nhiều chương trình nghiên cứu nhằm nâng cao khả năng chống chịu sâu bệnh và các tác nhân gây hại khác đã và đang được thực hiện với sự tham gia của nhiều tổ chức nghiên cứu và thương mại trên thế giới. Bên cạnh công tác chọn tạo giống theo phương pháp truyền thống, phương pháp chọn tạo giống ứng dụng công nghệ sinh học như tạo cây chuyển gen là một trong hướng nghiên cứu triển vọng trong việc tạo các giống ca cao có năng suất cao và chất lượng tốt, có khả năng kháng sâu bệnh, chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường. Tại Việt Nam, nhiều dòng ca cao được cấp phép sử dụng rộng rãi được nhập nội và tuyển chọn từ Malaysia trong Chương trình do Hiệp hội Ca cao 2 Thế giới (The World Cocoa Foundation) hỗ trợ. Chính phủ và nhiều tổ chức quốc tế rất quan tâm phát triển cây ca cao nhằm đưa Việt Nam vào bản đồ ca cao thế giới, trở thành quốc gia giàu tiềm năng về cung cấp ca cao. Hiện nay chưa có nghiên cứu về tái sinh và chuyển gen vào cây ca cao ở Việt Nam. Bên cạnh những thuận lợi và thành công đã đạt được trong lĩnh vực công nghệ sinh học, những khó khăn có thể gặp phải trong quá trình nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng, trong đó có cây ca cao bằng công nghệ sinh học ở nước ta là không nhỏ. Trên cơ cở lý luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển gen”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Đề tài đặt mục tiêu chung là xây dựng được quy trình tái sinh in vitro và tạo cây ca cao chuyển gen. Mục tiêu cụ thể: - Xây dựng được quy trình tái sinh in vitro ở 1 - 2 dòng ca cao đang được canh tác ở Việt Nam; - Xây dựng được quy trình chuyển gen và tạo được cây ca cao chuyển gen chỉ thị gus/gusplus và gen kháng nấm. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thăm dò khả năng tái sinh in vitro của 9 dòng ca cao đang được canh tác ở Việt Nam; - Nghiên cứu đặc điểm của gen mã hóa chitinase (TcChi1) từ cây ca cao ở Việt Nam và thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen mã hóa chitinase; - Nghiên cứu chuyển gen chỉ thị gus/gusplus vào 1 - 2 dòng ca cao ở Việt Nam; - Nghiên cứu chuyển gen TcChi1 vào 1 - 2 dòng ca cao ở Việt Nam và phân tích các dòng ca cao được chuyển gen. 4. - Đóng góp mới của luận án Lần đầu tiên ở Việt Nam, các dòng ca cao thương mại TD1, TD3, TD5, TD7, TD8, TD9 đã được tái sinh in vitro thành công; 3 - Gen mã hóa chitinase có hoạt tính kháng nấm đã được phân lập từ dòng ca cao hiện đang được canh tác tại Việt Nam và được chuyển vào vector biểu hiện thực vật thích hợp phục vụ công tác chuyển gen; - Gen chỉ thị gusplus và gen mã hóa chitinase đã được chuyển thành công vào dòng ca cao TD8 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về ứng dụng công nghệ tế bào thực vật và công nghệ gen trong việc nhân giống và chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây ca cao nói riêng, cải tiến giống và tăng khả năng chống chịu với các tác nhân gây bệnh. - Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam công bố quy trình tái sinh in vitro thông qua phôi soma của một số dòng ca cao hiện đang được canh tác ở Việt Nam. Các kết quả đạt được trong nghiên cứu này là cơ sở cho các ứng dụng nhân nhanh các dòng ca cao mới chất lượng, bảo tồn nguồn gen có giá trị cũng như phục vụ công tác chuyển gen. - Quy trình chuyển gen chỉ thị và gen đích vào cây ca cao thông qua A. tumefaciens là cơ sở khoa học để cải tiến giống ca cao thông qua công nghệ chuyển gen; đồng thời đây là mô hình để nghiên cứu chức năng gen ở cây trồng. - Kết quả phân lập gen mã hóa chitinase kháng nấm, thiết kế vector biểu hiện thực vật và chuyển gen này vào cây thuốc lá và cây ca cao là cơ sở khoa học cho việc tạo ra các dòng ca cao có khả năng kháng nấm. 6. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 141 trang (bao gồm cả tài liệu tham khảo và phụ lục), được chia thành các phần: Mở đầu gồm 3 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 28 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp, 16 trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu, 43 trang; Chương 4: Thảo luận, 11 trang; Kết luận và đề nghị, 2 trang. Các công trình đã công bố liên quan đến luận án: 1 trang; Summary: 4 trang; Tài liệu tham khảo: 16 trang với 123 tài liệu tham khảo, trong đó 18 tài liệu tiếng Việt và 105 tài liệu tiếng Anh. Phần kết quả luận án có 7 bảng số liệu, 36 hình. Phụ lục: 8 trang. 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CA CAO 1.1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại ca cao Cây ca cao có nguồn gốc ở lưu vực sông Amazon, Nam Mỹ. Từ đây, ca cao phát triển rộng sang nhiều quốc gia khác trên thế giới, tập trung ở khu vực Nam Mỹ và Tây Phi. Ca cao đặc biệt thích hợp ở những quốc gia có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm. Theo xếp loại của Hiệp hội Ca cao Thế giới thì hai quốc gia dẫn đầu về sản lượng ca cao hiện nay là Bờ Biển Ngà (Côte d’Ivoire) và Ghana (thuộc Tây Phi). Ở khu vực châu Á, từ năm 1985 trở lại đây, ca cao được phát triển khá mạnh, tiến tới trở thành vùng trồng ca cao lớn không kém Nam Mỹ và châu Phi. Các quốc gia sản xuất ca cao hàng đầu ở khu vực này là Indonesia và Malaysia. Việt Nam cũng nằm trong cùng vĩ độ “ca cao” với Ghana, Bờ Biển Ngà, Indonesia, Malaysia với khí hậu nhiệt đới mưa nhiều, đất đai màu mỡ, rất thích hợp với cây ca cao. Nhìn chung việc trồng, chế biến, tiêu thụ các sản phẩm của cây ca cao trên toàn cầu đang có xu hướng tăng rất cao và nhanh nhờ sự phát triển kinh tế năng động với mức sống của hàng tỷ người được nâng cao và các sản phẩm ca cao được tiêu thụ phổ biến hơn. Trong khi, sản lượng ca cao sản xuất hàng năm rất bấp bênh, không đủ đáp ứng nhu cầu…Vì vậy, việc phát triển ca cao bền vững, chuyển dịch cơ cấu cây trồng, nâng cao chất lượng giống, hạt ca cao là những vấn đề được đặc biệt lưu tâm ở các quốc gia ưu tiên phát triển cây ca cao. Ca cao thuộc chi Theobroma, họ Stercu-liaceae. Chi Theobroma bao gồm 22 loài, trong đó chỉ có loài Theobroma cacao được trồng rộng rãi, còn các loài khác hoặc hoang dại, hoặc rất ít được trồng. Các tác giả chia Theobroma cacao ra hai loài phụ là: Theobroma cacao spp. ca cao, gồm các quần thể dạng Criollo và Theobroma cacao sphaerocarpum, gồm các quần thể còn lại, trong đó có Forastero. Các loài phụ này đều là các dòng nhị bội, với số nhiễm sắc thể 2n = 20. Criollo có hạt dạng tròn, nội nhũ trắng, có hương vị nhẹ và tương đối dễ nhiễm bệnh. Forastero có dạng cây cao, khỏe, hạt nhỏ hơn Criollo nhưng hương vị đậm hơn. Hạt Forastero dạng dẹp, lá mầm bên trong 5 màu tím, chứa nhiều chất béo hơn Criollo. Do vậy, hầu hết các vùng trồng ca cao lớn trên thế giới hiện nay đều trồng dạng Forastero. Giống thứ ba được công nhận là Trinitario, một dòng lai giữa Criollo và Forastero, là giống có khảng năng kháng bệnh và mang một số hương vị đặc trưng. Tập đoàn gen ca cao phong phú nhất được lưu giữ ở Trinidad với khoảng 2.500 kiểu gen, ở Brazil với khoảng 2.000 kiểu gen và ở Costa Rica với 700 kiểu gen. Nghiên cứu gần đây về phân bố ca cao trên toàn thế giới cho thấy một số thay đổi về các nhóm ca cao có thể phân biệt về mặt di truyền và địa lý. Theo các nghiên cứu, ca cao phân bố ở Trung và Nam Mỹ đã được chia thành 10 cụm di truyền: Amelonado, Contamana, Curaray, Guiana, Iquitos, Maranon, Nacional, Nanay và Purus, xuất hiện ở lưu vực sông Amazon và Bahia. Nhóm số 10 được mô tả là nhóm Criollo xuất hiện ở khu vực lưu vực sông Amazon (Motamayor et al., 2008; Utro et al., 2012). 1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây ca cao Ca cao là loài cây thân gỗ nhỏ, có thể cao đến 10 - 20 m nếu mọc tự nhiên. Trong sản xuất do trồng mật độ cao và khống chế sự phát triển thông qua tỉa cành nên cây thường có chiều cao trung bình khoảng 5 - 7 m, đường kính thân 10 - 18 cm. Ca cao sinh trưởng tốt dưới bóng che, do đó có thể trồng xen với một số loại cây kinh tế khác. Thời kỳ kinh doanh hiệu quả có thể kéo dài từ 25 - 40 năm (Phạm Hồng Đức Phước, 2009). Thân: Đối với thân phát triển từ hạt, sự phát triển của thân có thể chia thành ba giai đoạn. Giai đoạn 1: Hạt nẩy mầm thượng địa (lá mầm nhô lên khỏi mặt đất). Đoạn thân dưới lá mầm không có mầm bất định là nơi để ghép khi nhân giống vô tính mà không sợ bị lẫn giống. Giai đoạn 2: lá mầm mở, 4 lá đầu tiên phát triển, đốt rất ngắn. Mỗi đợt sinh trưởng kéo dài khoảng 6 tuần, đốt dài ra trong thời gian này. Tùy theo điều kiện môi trường, trong giai đoạn này thân có thể cao lên từ 0,5 - 2 m. Giai đoạn 3: Cây tạm ngừng tăng trưởng về chiều cao. Cành ngang trên đỉnh ngọn phát triển tạo tầng cành đầu tiên. Đối với thân phát triển từ cành ghép (mầm ghép lấy từ cành ngang): Cành không tăng trưởng thẳng đứng mà thường mọc nghiêng. Các chồi nách phát triển sớm, nhiều nên 6 cây có dạng bụi gồm nhiều cành chính và không có tầng cành. Nếu mầm ghép lấy từ thân chính hoặc cành vượt, sự sinh trưởng giống như thân mọc từ hạt. Lá: Lá non phát triển theo từng đợt, sau mỗi đợt ra lá, đỉnh cành vào trạng thái ngủ. Thời gian ngủ tùy theo điều kiện môi trường nhưng thường khoảng 4 - 6 tuần lễ. Sự phát triển lá liên quan đến tình trạng nước của cây. Ca cao trồng không che bóng, các đợt ra lá nhanh hơn là trồng trong điều kiện có bóng che. Điều này là do khi không có bóng che, sự biến động hàm lượng nước trong cây xảy ra thường xuyên và nhiệt độ môi trường bên ngoài cao kích thích chồi lá phát triển. Cây cần dinh dưỡng khi đợt lá mới phát triển. Nếu cây thiếu dinh dưỡng sẽ có sự vận chuyển dinh dưỡng từ lá già sang lá non mới ra và dẫn đến việc lá già bị rụng sớm. Do đó, số lá già hiện diện trên thân giúp người trồng có thể hiểu được phần nào hiện trạng dinh dưỡng của cây ca cao. Màu sắc lá non thay đổi tùy theo giống từ màu xanh nhạt đến vàng, từ màu hồng đến đỏ đậm. Khi trưởng thành, lá có màu xanh thẫm, cứng cáp hơn và nằm ngang. Lá dưới bóng che có phiến rộng và xanh hơn ngoài nắng. Rễ: Hạt sau khi nẩy mầm, rễ mọc rất nhanh và có nhiều rễ ngang mọc thẳng góc quanh rễ trụ. Ba tháng đầu rễ phát triển rất nhanh có thể cao hơn 25 cm. Để tránh rễ cong khi ươm cây, cần chọn túi đủ dài để rễ phát triển trong 3 4 tháng đầu. Rễ trụ tiếp tục phát triển khi bị cắt ngang nên khi trồng ta cắt bỏ phần rễ cong trong bầu đất mà không ảnh hưởng đến sinh trưởng tiếp theo của rễ. Khi cây được 3 năm tuổi, rễ trụ dài khoảng 1,5 - 2 m. Trên suốt chiều dài của rễ trụ, có rất nhiều rễ ngang mọc ra và phân nhánh với rất nhiều rễ con, tập trung chủ yếu ở vùng rễ phía dưới cổ rễ khoảng 20 cm. Hoa: Hoa xuất hiện trên sẹo lá ở thân, cành. Đợt hoa đầu tiên trên cây từ hạt có thể nở vào khoảng 14 - 20 tháng sau khi trồng. Cây ghép hay giâm cành có thể ra hoa sớm hơn từ 9 - 18 tháng sau khi trồng. Hoa ra tập trung vào mùa mưa. Những nơi có đủ nước, cây ra hoa quanh năm và vẫn có cao điểm ra hoa rộ. Do hàng năm, hoa xuất hiện cùng một chỗ nên lâu ngày phình to gọi là đệm hoa. Thường mỗi đệm mang rất nhiều hoa, nếu đệm hoa bị tổn thương thì 7 lượng hoa giảm hoặc không ra nữa. Hoa có cuống dài từ 1 - 3 cm, có 5 cánh đều đặn. Hoa bắt đầu nở từ khoảng 3 giờ chiều hôm trước cho đến 9 giờ sáng hôm sau. Thụ phấn: Hoa ca cao thụ phấn nhờ côn trùng thuộc họ Ceratopogonidae. Loài Forcipomyia là loài phổ biến nhất tham gia thụ phấn. Côn trùng này rất nhỏ thường cư trú trong điều kiện tối, ẩm nơi có các tàn dư thực vật đậu quanh cây ca cao, do đó nếu vườn quá sạch hoặc quá khô sẽ không thuận lợi cho sự thụ phấn. Hoa ca cao ra nhiều nhưng chỉ thụ phấn và đậu 1 - 5%. Phần lớn hoa nở mà không được thụ phấn sẽ rụng sau 48 giờ. Quả: Sự phát triển của quả: Sau khi thụ phấn, quả tăng trưởng chậm trong khoảng 40 ngày đầu và đạt tốc độ tối đa sau 75 ngày. Sau 85 ngày, sự tăng trưởng của quả chậm lại, trong khi hạt bên trong quả bắt đầu tăng trưởng nhanh, đây cũng là thời kỳ hạt tích lũy chất béo. Lớp cơm nhầy hình thành khoảng 140 ngày sau khi thụ phấn. Khi hạt tăng trưởng tối đa, quả vào giai đoạn chín. Quả chín không nở bung ra và ít khi rụng khỏi cây. Quả có cuống hóa gỗ nên rất dai. Quả non có 5 ngăn trong đó hạt được phân chia đều, khi quả chín vách ngăn này biến mất chỉ còn lại một hốc chứa đầy hạt. Từ khi thụ phấn đến khi quả chín kéo dài từ 5 - 6 tháng, tùy theo giống. Màu sắc của quả khá đa dạng. Quả chưa chín có màu xanh, đỏ tím hoặc xanh điểm đỏ tím. Khi quả chín, màu xanh chuyển sang màu vàng; màu đỏ tím chuyển sang màu da cam. Hình dạng quả thay đổi nhiều từ hình cầu đến dài nhọn hay hình trứng. Số lượng rãnh và độ sâu của khía trên quả cũng thay đổi từ 5 - 10 rãnh, rãnh có thể sâu nhiều, nông hoặc trơn nhẵn. Vỏ quả có thể dày từ 1 - 3 cm. Trọng lượng quả dao động từ 0,2 - 1 kg. Hạt: Mỗi quả chứa từ 30 - 40 hạt. Mỗi hạt có lớp cơm nhầy bao quanh có vị chua, ngọt, thơm và xếp thành 5 dãy. Hạt có vỏ mỏng màu hồng, nhiều đường gân. Hạt rất dễ mất sức nẩy mầm sau khi tách khỏi quả nên thường phải gieo ngay. Hạt sau khi tách lớp cơm nhầy và hong ráo, nếu giữ trong mùn cưa hoặc than có thể giữ được sức nẩy mầm trong 3 - 4 tuần (Phạm Hồng Đức Phước, 2009). 8 1.1.3 Ý nghĩa kinh tế của cây ca cao Cây ca cao là cây kinh tế quan trọng đem lại lợi nhuận rất cao nhờ xuất khẩu cho một số quốc gia trên thế giới. Hạt ca cao là nguồn cung cấp thực phẩm giàu dinh dưỡng cho con người. Ca cao cho hạt làm nguyên liệu sử dụng cho ngành công nghiệp thực phẩm cụ thể là các sản phẩm cao cấp như chocolate, ca cao... Sản lượng ca cao hàng năm trên toàn thế giới (ca cao là sản phẩm khô thu được bằng cách lên men hạt ca cao) 2/3 được chế biến thành bột ca cao và bơ ca cao, 1/3 được sử dụng để chế biến các thành phần tạo hương vị và màu của chocolate. Khoảng 5 - 6 triệu hộ nông dân sản xuất nhỏ chiếm 95% sản lượng ca cao toàn thế giới. Theo thống kê mới nhất được công bố bởi ICCO 11/6/2015, trong năm 2013/2014, thế giới sản xuất được tổng cộng 4.232.000 tấn hạt ca cao, châu Phi chiếm ưu thế (71,6%). Trong số các nước sản xuất ca cao, Bờ Biển Ngà và Ghana xếp hạng đầu tiên và thứ hai với khoảng 1.000.000 tấn mỗi năm. Ở châu Á và châu Đại Dương, Indonesia là quốc gia sản xuất ca cao nhiều nhất. Ca cao còn được chứng minh về tác dụng phòng các bệnh tim mạch. Các flavanol và procyanidin có trong hạt ca cao đã thể hiện khả năng chống oxi hóa mạnh trong các thử nghiệm in vitro (Keen et al., 2005). Các ứng dụng của hạt ca cao đã một lần nữa khẳng định giá trị quan trọng của loài cây công nghiệp này. Ngoài ra, trồng ca cao còn mang lại những lợi ích về môi trường. Do ca cao là loại cây ưa bóng với thời gian thu hoạch trên 20 năm, có thể trồng dưới tán những cây lâu năm khác, chúng mang lại các lợi ích như tăng cường đa dạng sinh học trong những vùng đất có chim di cư, bảo vệ hành lang đầu nguồn, đất, nguồn nước và các vùng đệm của những khu rừng nhiệt đới (Rice, Greenberg, 2003). Các tổ chức quốc tế như Tổ chức Bảo tồn Quốc tế (Conservation International), Liên đoàn Động vật hoang dã Thế giới (The World Wildlife Federation) và Hiệp hội Ca cao Thế giới đã nhận thức được vai trò của ca cao trong việc ổn định nền kinh tế địa phương và môi trường và đã khuyến khích nông dân trồng ca cao trong những khu vực này (Guyton et al., 2003).