Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giáo dục - Đào tạo Cao đẳng - Đại học Luận văn bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét plasmodium spp. và hướng ứng dụng​...

Tài liệu Luận văn bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét plasmodium spp. và hướng ứng dụng​

.PDF
111
120
136

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM --------------------------- TRẦN MINH QUÍ BẢO TỒN CHỦNG KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT Plasmodium spp. và HƯỚNG ỨNG DỤNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số ngành: 60420201 TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 11 năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM --------------------------- TRẦN MINH QUÍ BẢO TỒN CHỦNG KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT Plasmodium spp. và HƯỚNG ỨNG DỤNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số ngành: 60420201 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 11 năm 2017 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TP.HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP. HCM ngày 1 tháng … năm … Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ) TT 1 2 3 4 5 Họ và tên Chức danh Hội đồng Chủ tịch Phản biện 1 Phản biện 2 Ủy viên Ủy viên, Thư ký Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được sửa chữa (nếu có). Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc TP. HCM, ngày..… tháng….. năm 20..… NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: TRẦN MINH QUÍ Giới tính: Nam Ngày, tháng, năm sinh: 10/02/1991 Nơi sinh: Tp. Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học MSHV: 1541880009 I- Tên đề tài: Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Sốt Rét Plasmodium spp. và hướng ứng dụng. II- Nhiệm vụ và nội dung:  Thu thập và bảo tồn nguồn chủng KST SR bằng cách nuôi cấy chủng KST SR và bảo quản chủng KST SR trong Nitơ lỏng.  Giải trình tự đoạn gene KST SR của các mẫu thu thập được. III- Ngày giao nhiệm vụ: 15/02/2017 IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: V- Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS, NGUYỄN TIẾN THẮNG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên và chữ ký) KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên và chữ ký) i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nghiên cứu “Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Sốt Rét Plasmodium spp. và hướng ứng dụng” là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng. Đề tài được thực hiện tại khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Tp. Hồ Chí Minh. Các số liệu, kết quả, đánh giá đưa ra trong luận văn chưa được ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây. Những kết quả nghiên cứu, số liệu của tác giả khác trích dẫn trong luận văn này điều được chú thích đầy đủ. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm với nhà trường về cam đoan này. Học viên thực hiện Luận văn (Ký và ghi rõ họ tên) ii LỜI CÁM ƠN Em xin chân thành cảm ơn: Trường Đại học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh; Ban lãnh đạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng thành phố Hồ Chí Minh; Khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng là người Thầy trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành luận văn. Các anh chị đồng nghiệp Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng thành phố Hồ Chí Minh, Khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, cùng bạn bè, và gia đình đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành luận văn này. (Họ và tên của Tác giả Luận văn) iii TÓM TẮT Đặt vấn đề: Bệnh sốt rét là bệnh do ký sinh trùng Plasmodium spp. gây ra, bệnh thường gặp ở các nước thuộc khu vực nhiệt đới. Bệnh truyền từ người bệnh qua người lành nhờ vật chủ trung gian truyền bệnh là muỗi đòn xóc (muỗi Anopheles). Hiện nay, có 5 loài ký sinh trùng sốt rét gây bệnh cho người là: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, và Plasmodium knowlesi. Bệnh SR là vấn đề y tế ảnh hưởng đến sức khỏe, điều kiện kinh tế của người dân sống trong vùng sốt rét lưu hành. Trong những năm gần đây, tình hình KST SR có chiều hướng giảm mạnh, do đó việc bảo tồn chủng KST SR Plasmodium spp. là vấn đề quan trọng để phục vụ cho các nghiên cứu đến KST SR sau này. Đề tài “Bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp. và hướng ứng dụng” đã được tiến hành từ tháng 2/2017 đến tháng 8/2017. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là: Bảo tồn nguồn chủng KST SR, bước đầu xây dựng ngân hàng Gene KST SR và hướng ứng dụng. Đồng thời tiến hành nuôi cấy chủng KST SR tại phòng thí nghiệm. Đề tài tập trung vào các nội dung sau:  Thu thập, lưu trữ và bảo tồn nguồn chủng KST SR trong Nitơ lỏng. + Nuôi cấy chủng KST SR tạo chủng thuần tại phòng thí nghiệm các nguồn máu nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax đơn thuần được thu thập từ thực địa. + Lưu trữ nguồn mẫu KST SR từ các mẫu thu thập được trong nghiên cứu, thử nghiệm,...  Giải trình tự đoạn gene KST SR của các mẫu thu thập được. + Chạy PCR định danh những mẫu máu nhiễm KST SR. + Giải trình tự đoạn gene mã hóa 18S Ribosome đặc trưng cho từng loài KST SR. iv + Giải trình tự đoạn Gene kháng thuốc artemisinin đối với chủng Plasmodium falciparum Phương pháp thực hiện đề tài: Đề tài chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu tại tỉnh Bình Phước, đây là vùng dịch tể SR lưu hành nặng ở khu vực Nam bộ - Lâm Đồng cũng như cả nước. Với kích cỡ mẫu là 30 mẫu được khẳng định dương tính với KST SR bằng kỹ thuật nhuộm Giêm – sa. Chúng tôi sẽ định danh lại các chủng thu thập được bằng kỹ thuật Nested – PCR, giải trình tự. Các chủng được xác định nhiễm P. falciparum, P. vivax đơn thuần bằng kỹ thuật Nested – PCR sẽ được tiến hành nuôi cấy dài ngày chủng KST SR bằng phương pháp nuôi bình nến của Trager và Jensen (1976) với hồng cầu người, môi trường RPMI 1640, 10% huyết thanh AB trong điều kiện nồng độ 5% CO2 và O2 thấp, ở nhiệt độ 37°C. Kết quả nghiên cứu: Trong quá trình tiến hành đề tài, chúng tôi đã thu thập được 30 mẫu máu dương tính với ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật nhuộm Giêm – sa, tiến hành định danh 30 mẫu KST SR bằng kỹ thuật Nested – PCR và giải trình tự các mẫu thu thập được tại phòng thí nghiệm. Bên cạnh đó, với 14 chủng KST SR nhiễm P. falciparum đơn thuần được phân lập, chúng tôi tiến hành giải trình tự phát hiện 9/14 chủng KST SR P. falciparum đơn thuần thu thập được tại Bình Phước có đột biến cánh quạt K13 liên quan đến kháng artemisinin (chiếm 64,3% các chủng P. falciparum đơn thuần). Với tần suất xuất hiện các điểm đột biến K13 cánh quạt liên quan đến kháng artemisinin như sau: C447G có 1 chủng chiếm 7,1%; I543T có 1 chủng chiếm tỉ lệ 7,1%; P553L có 3 chủng chiếm 21,4%; C580Y có 4 chủng chiếm 28,6%. Trong đó đột biến C580Y có tần suất xuất hiện cao ở Bình Phước, cũng như trong các nghiên cứu khác ở khu vực Cam-pu-chia, Myanmar đã được công bố. v ABSTRACT Background: Plasmodium spp. is caused of malaria disease, a common disease in the tropical countries. Disease is spreaded from patient to person healthy by mosquito (Anopheles spp.). Currently, there are five species of malaria parasites infecting human: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale and Plasmodium knowlesi. Malaria disease is the issues affecting health and economic conditions of people living in malaria endemic areas. In recent years, the situation of malaria tends to decline, so conservation species malaria Plasmodium spp. is very important to help malaria researchers in the future. Study "Conservation of species Plasmodium spp. and applications" was conducted from February to August in 2017. The objective of this research is conservation malaria species, building initially the bank Gene malaria and applications. Simultaneously, malaria species are cultured in the Laboratory. The subject focuses on the following:  Collecting, storing and conserving strains of Plasmodium spp. in liquid nitrogen. + Culturing Plasmodium strains to produce pure strains on blood at Labratory, such as: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax isolated from patients. + Plasmodium strains from this research are stored  Analyzing the gene of malaria parasites from the samples collected. + Using PCR method to identify Plasmodium spp. + Anlayzing the gene translation to 18S Ribosomes for each species Plasmodium. + Anlayzing the resistant artemisinin gene of P. Falciparum strains. vi Methods: Our study collected samples in Binh Phuoc province, it is the endemic malaria epidemiology in the South Vietnam - Lam Dong. We found 30 samples positive with malaria by staining Giem - sa. We will identifize strains by Nested – PCR method. And then, the strains of Plasmodium spp. are cultured at Labratory by candle jar method of Trager and Jensen (1976) with human erythrocytes, RPMI 1640 medium, 10% serum concentrations AB, in terms 5% of CO2 and O2 low, at a temperature 37°C. Finally, storing on liquid nitrogen. Results: In this study, we have collected 30 blood samples were positive for Plasmodium spp. by staining Giem – sa method, identification 30 samples of malaria by Nested PCR method and analyzing DNA of samples at Labratory. With 14 cases injected P. falciparum, we conducted to analyzing DNA to detected P. falciparum malaria species on 9/14 samples collected in Binh Phuoc has mutant K13 propeller involving artemisinin resistance (accounting for 64.3% of the isolates of P. falciparum samples). With the point mutatant of K13 propeller involving artemisinin resistance as: C447G 1 strains accounted for 7.1%; 1 strains I543T proportion of 7.1%; P553L strains accounted for 21.4% 3; C580Y 4 strains of 28.6%. C580Y have high frequency appearance in Binh Phuoc, as well as in other studies in Cambodia, Myanmar has been published. vii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... I LỜI CÁM ƠN............................................................................................................II TÓM TẮT ............................................................................................................... III ABSTRACT .............................................................................................................. V MỤC LỤC ..............................................................................................................VII DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... X DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... XI DANH MỤC CÁC HÌNH .....................................................................................XII CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2. Tính cấp thiết của đề tài........................................................................................ 1 1.3. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 2 1.4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 2 1.5. Ý nghĩa đề tài ........................................................................................................ 3 1.5.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................... 3 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................ 4 1.6. Tổng quan về bệnh sốt rét .................................................................................... 4 1.6.1. Lịch sử phát hiện bệnh sốt rét ....................................................................... 4 1.6.2. Định nghĩa bệnh sốt rét ................................................................................. 5 1.6.3. Sơ lược về dịch tể học sốt rét ........................................................................ 8 1.6.3.1. Tình hình dịch tể sốt rét trên thế giới ...................................................... 8 1.6.3.2. Tình hình dịch tể sốt rét tại Việt Nam ................................................... 10 1.6.3.3. Tình hình dịch tể sốt rét tỉnh Bình Phước ............................................. 13 1.7. Chu kỳ và hình thể của ký sinh trùng sốt rét...................................................... 14 1.7.1. Giai đoạn phát triển trong cơ thể người ..................................................... 14 1.7.2. Giai đoạn phát triển trong cơ thể muỗi ....................................................... 16 1.8. Tình hình kháng thuốc hiện nay của ký sinh trùng sốt rét ................................. 17 1.8.1. Định nghĩa kháng thuốc .............................................................................. 17 viii 1.8.2. Trên thế giới ................................................................................................ 18 1.8.3. Tại Việt Nam ................................................................................................ 20 1.9. Tình hình nghiên cứu, bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét trên thế giới và Việt Nam............................................................................................................. 22 1.9.1. Trên thế giới ................................................................................................ 22 1.9.2. Việt Nam ...................................................................................................... 23 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................24 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài ............................................................... 24 2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ................................................................. 24 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 24 2.2.2. Thiết kế nghiên cứu ..................................................................................... 24 2.2.3. Phương pháp phân tích mẫu ....................................................................... 24 2.2.3.1. Phát hiện KST Plasmodium spp. bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa........ 25 2.2.3.2. Xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật Nested – PCR .............. 31 2.2.3.2.1. Giới thiệu khái quát về kỹ thuật PCR và phương pháp phát hiện KST SR bằng kỹ thuật PCR ......................................................................... 31 2.2.3.2.2. Kỹ thuật tách chiết DNA KST SR Plasmodium spp. ....................... 33 2.2.3.2.3. Kỹ thuật Nested – PCR phát hiện KST SR: ..................................... 35 2.2.3.2.4. Kỹ thuật Nested – PCR để phát hiện điểm đột biến K13 liên quan đến kháng artemisinin ................................................................................. 36 2.2.3.2.5. Đọc kết quả điện di:.......................................................................... 37 2.2.3.3. Xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật giải trình tự .................. 38 2.2.3.4. Kỹ thuật tinh sạch sản phẩm DNA để giải trình tự ............................... 39 2.2.3.4.1. Kỹ thuật PCR giải trinh tự ............................................................... 40 2.2.3.4.2. Phân tích kết quả giải trình tự: ........................................................ 41 2.2.4. Kỹ thuật cất đông chủng ký sinh trùng sốt rét............................................. 42 2.2.5. Kỹ thuật nuôi cấy dài ngày để tạo chủng Plasmodium spp. thuần ............. 42 2.2.5.1. Kỹ thuật nuôi cấy chủng P. falciparum thuần: ...................................... 43 2.2.5.2. Kỹ thuật nuôi cấy chủng P. vivax thuần ................................................ 43 ix 2.4.5.3. Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 43 2.4.5.4. Chuẩn bị hồng cầu lành ......................................................................... 44 2.4.5.5. Chuẩn bị huyết thanh nuôi cấy .............................................................. 44 2.4.5.6. Phá đông chủng KST SR Plasmodium spp. .......................................... 45 2.2.6. Điều kiện nuôi cấy ....................................................................................... 45 2.2.6.1. Điều kiện nuôi cấy in vitro Plasmodium spp. ....................................... 45 2.2.6.2. Điều kiện trong lấy mẫu tại thực địa ..................................................... 46 2.3. Thống kê và xử lý số liệu ................................................................................... 47 2.4. Y đức .................................................................................................................. 47 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ, THẢO LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................48 3.1. Kết quả xác thu thập mẫu và xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa ................................................................................................. 48 3.2. Kết quả xác định loài Plasmodium spp. bằng kỹ thuật Nested – PCR ............... 50 3.3. Kết quả giải trình tự Plasmodium spp. ............................................................... 53 3.4. Kết quả giải trình tự kháng K13 ......................................................................... 55 3.5. Kết quả nuôi cấy chủng Plasmodium spp. thuần bằng phương pháp nuôi cấy trong phòng nuôi cấy tại phòng thí nghiệm ........................................................ 57 3.6. Kết quả bảo tồn chủng sốt rét Plasmodium spp. và phát hiện kháng K13 liên quan đến kháng artemisinin. ............................................................................... 59 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................60 4.1. Kết luận............................................................................................................... 60 4.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................62 PHỤ LỤC .................................................................................................................70 x DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AA : Amino acid ACD : Dung dịch chống đông máu ATSH : An toàn sinh học BYT : Bộ Y tế BNSR : Bệnh nhân sốt rét Hồng cầu O : Hồng cầu của người nhóm máu O Huyết thanh AB : Huyết thanh của người nhóm máu AB Huyết thanh O : Huyết thanh của người nhóm máu O KST : Ký sinh trùng KHV : Kính hiển vi NC : Nuôi cấy NCBI : Ngân hàng Gene thế giới Nested – PCR : Phản ứng PCR lồng PCR : Polymerase Chain Reaction PCSR : Phòng chống sốt rét PRG : Plasmodium Genenomics Resource Test : Kiểm tra RPMI 1640 : Môi trường nuôi cấy ký sinh trùng sốt rét (R8758, Glutamine, và NaHCO3) RPM : Vòng trên phút RPS : Môi trường nuôi cấy không huyết thanh RPHS : Môi trường nuôi cấy có huyết thanh SR : Sốt rét SRAT : Sốt rét ác tính TVSR : Tử vong do bệnh sốt rét WHO : Tổ chức Y tế thế giới Ziplock : Túi đựng mẫu có khóa kéo xi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân vùng dịch tễ sốt rét và can thiệp 2009 ............................................11 Bảng 1.2. Thời gian xuất hiện P. falciparum kháng với các loại thuốc SR.............. 19 Bảng 2.1. Trình tự mồi của phản ứng PCR – Nested 1, PCR – Nested 2. ................35 Bảng 2.2. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR – Nested xác định loài Plasmodium spp. ..............................................................................35 Bảng 2.3. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR – Nested 2 xác định loài 04 loài Plasmodium spp. ...................................................................36 Bảng 2.4. Trình tự mồi khuếch đại đọan K13 ...........................................................36 Bảng 2.5. Phản ứng Nested – PCR khếch đại K13 lần 1: .........................................37 Bảng 2.6. Phản ứng Nested – PCR khếch đại K13 lần 2: .........................................37 Bảng 2.7. Thành phần các hóa chất sử dụng trong PCR của giải trình tự ................40 Bảng 2.8. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng control giải trình tự .........40 Bảng 3.1. Kết quả định danh KST SR bằng kỹ thuật giêm – sa ............................... 49 Bảng 3.2. Kết quả xác định chủng bằng kỹ thuật Nested –PCR ............................... 52 xii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây phát sinh loài của Plasmodium spp. gây bệnh cho người và động vật ....................................................................................................7 Hình 1.2. Bản đồ phân bố tỷ lệ tử vong bệnh sốt rét năm 2010 – 2013 ..................10 Hình 1.3. Bản đồ tỷ lệ ký sinh trùng gây bệnh sốt rét tại Việt Nam ........................12 Hình 1.4. Biểu đồ thể hiện số ca nhập viện và tử vong do KST SR tại Việt Nam .................................................................................................13 Hình 1.5. Chu kỳ phát triển của ký sinh trùng sốt rét ở muỗi và người ...................17 Hình 1.6. Phân bố các vị trí đột biến dựa trên mô hình 3D của kháng K13 .............21 Hình 1.7. Sự phân bố đa kháng thuốc sốt rét 2016 ..................................................21 Hình 2.1. Các bước tiến hành trong kỹ thuật nhuộm giêm – sa................................ 26 Hình 2.2. Hình thể KST SR P. falciparum soi bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa .................................................................................................27 Hình 2.3. Hình thể KST SR P. vivax soi bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa ..............28 Hình 2.4. Hình thể KST SR P. malariae soi bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa ........29 Hình 2.5. Hình thể KST SR P. ovale soi bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa .............30 Hình 2.6. Hình minh họa các bước trong phản ứng PCR .........................................33 Hình 2.9. Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tư dùng gel polyacrylamide. .......39 Hình 3.1. Hình thể KST SR P. falciparum bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa. ...........48 Hình 3.2. Hình thể KST SR P. vivax bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa. ....................49 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm DNA Plasmodium spp.....................................51 Hình 3.4. Biểu đồ sánh kết quả định danh KST SR bằng kỹ thuật giêm – sa và kỹ thuật Nested – PCR..................................................................................52 Hình 3.5. Kết quả trình tự DNA P. falciparum với NCBI ........................................53 Hình 3.6. Sơ đồ cây P. falciparum với NCBI ...........................................................53 Hình 3.7. Kết quả trình tự DNA P. vivax với NCBI .................................................54 Hình 3.8. Sơ đồ cây P. vivax với NCBI ....................................................................54 Hình 3.9. Sơ đồ cây P. falciparum và P. vivax với NCBI ........................................55 Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm DNA kháng K13 của P. falciparum ..............56 xiii Hình 3.11. Kết quả trình tự aa K13 của P. falciparum với PGR ............................. 57 Hình 3.12. KST SR Plasmodium spp. được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm.............58 Hình 3.13. Hình thể P. falciparum được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm ..................58 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặt vấn đề Bệnh sốt rét là bệnh do ký sinh trùng Plasmodium spp. gây ra, bệnh thường gặp ở các nước thuộc khu vực nhiệt đới [12] [17] . Bệnh truyền từ người bệnh qua người lành nhờ vật chủ trung gian truyền bệnh là muỗi đòn xóc (muỗi Anopheles) [3] [5] [17] [45] [58] [74] . Hiện nay, có 5 loài ký sinh trùng sốt rét gây bệnh cho người là: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, và Plasmodium knowlesi [4] [5] [12] , trong đó Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax là 2 loài thường gặp [3] [6] [7] [45] [74]. Ngày nay, tuy tình hình bệnh SR có chiều hướng giảm so với những thập niên gần đây, nhưng nó vẫn một vấn đề liên quan đến sức khỏe con người và nhận được sự quan tâm của toàn cầu, là bệnh truyền nhiễm làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe, kinh tế [4] [71] và gây nhiều thiệt hại, tổn thất cho nhân loại [35], đặc biệt là đối với phụ nữ mang thai và trẻ em [68] . Hàng năm, trên toàn cầu có khoảng 350 - 500 triệu người mắc SR và hơn 1 triệu người chết do SR. Đến năm 2010, trên thế giới có 216 triệu người mắc SR và 655.000 người chết do SR và có khoàng 3,3 tỷ người sống trong vùng dịch tể sốt rét và có nguy cơ mắc bệnh sốt rét [65]. Theo ước tính của WHO khoảng 40% dân số thế giới hiện nay đang sống trong vùng có nguy cơ mắc SR. Dân số Việt Nam năm 2013 là 89,9 triệu người, với khoảng 14,4 triệu người sống ở những vùng có SR lưu hành (khoảng 16% dân số), có 35.406 ca SR được ghi nhận, trong đó có 17.128 ca xác định có KST SR (60% số ca xác nhận SR là do KST Plasmodium falciparum gây ra. 6 ca tử vong do SR [1]. 1.2. Tính cấp thiết của đề tài Tỷ lệ mắc sốt rét ở Việt Nam đã liên tục giảm, từ 2,8 ca/1.000 dân năm 1991 xuống 0,87 ca/1.000 dân năm 2001 và năm 2013 chỉ còn 0,2 ca/1.000 dân [28] [66]. Tỷ lệ mắc sốt rét giảm là do áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật để hạn chế số lượng mắc và tử vong do KST SR, nhưng vẫn còn hơn 11 triệu người sống trong vùng dịch tể sốt rét [2]. Theo một báo cáo khác về tình hình tử vong do sốt rét ở Việt Nam, được đăng trên tạp chí The Guardian năm 2012, số ca tử vong do sốt rét/1.000 2 dân ở các năm 1980, 1990, 2000 và 2010 lần lượt là: 57,5 ca; 36,2 ca; 15,0 ca; 1,4 ca [59]. Trước tình hình bệnh SR có chiều hướng giảm mạnh [7] , áp lực điều trị thuốc SR tăng, di biến động dân từ vùng dịch tể SR diễn biến phức tạp,... làm cho tình trạng kháng thuốc sốt rét ngày càng tăng cao [62] [63] [69], gia tăng nguy cơ thành dịch SR. Do đó việc tìm kiếm KST SR để phục vụ nghiên cứu gặp nhiều khó khăn; trong khi đó các nghiên cứu, thử nghiệm đánh giá đáp ứng thuốc điều trị bệnh sốt rét của KST SR có vai trò rất quan trọng việc loại trừ SR. Từ các vấn đề trên, đòi hỏi phải có sẵn nguồn chủng KST SR. Với mong muốn tạo tiền đề cho việc thành lập thư viện Genenome, thư viện chủng KST SR để phục vụ cho công tác nghiên cứu về các kỹ thuật chuyên sâu trong chuẩn đoán và điều trị bệnh SR và phát triển vaccine kháng sốt rét sau này, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Bảo tồn chủng Ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp. và hướng ứng dụng”. 1.3. Mục tiêu nghiên cứu  Bảo tồn chủng KST SR các mẫu được thu thập ở thực địa, trong quá trình làm đề tài tại Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Thành phố Hồ Chí Minh.  Bước đầu xây dựng trình tự đoạn gene mã hóa 18S Ribosome từ các mẫu KST SR thu thập được trong quá trình thực đề tài. 1.4. Nội dung nghiên cứu  Thu thập, lưu trữ và bảo tồn nguồn chủng KST SR trong Nitơ lỏng – 196oC. + Nuôi cấy chủng KST SR tạo chủng thuần tại phòng thí nghiệm các nguồn máu nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax đơn thuần được thu thập từ thực địa. + Lưu trữ nguồn mẫu KST SR từ các mẫu thu thập được trong nghiên cứu, thử nghiệm,...  Giải trình tự đoạn gene KST SR của các mẫu thu thập được. 3 + Chạy PCR định danh những mẫu máu nhiễm KST SR [40] [46]. + Giải trình tự đoạn gene mã hóa 18S Ribosome đặc trưng cho từng loài KST SR [33] [41] [44] [46]. + Giải trình tự đoạn gene kháng thuốc Artemisinin đối với chủng Plasmodium falciparum 1.5. Ý nghĩa đề tài Nghiên cứu này là nghiên cứu đầu tiên kết hợp giữa giám sát ca bệnh chủ động, thu thập và bảo tồn chủng KST SR, đồng thời thời bước đầu xây dựng được trình tự đoạn Gene bảo tồn các chủng KST SR, làm tiền đề cho việc so cho các nghiên cứu sau này. Bên cạnh đó, việc bảo tồn chủng KST SR tại phòng thí nghiệm, cũng góp phần duy trì nguồn chủng KST, Gene trong điều kiện KST SR đang giảm mạnh như hiện nay. Việc bảo tồn chủng KST SR cũng có vai trò quan trọng trong việc cung cấp chứng dương cho các kỹ thuật sinh học phân tử, cung cấp mẫu cho công tác nghiên cứu tạo vaccine, kháng thuốc sốt rét, tiêu bản mẫu hình thể KST SR trong công tác đào tạo nguồn nhân lực y tế. 1.5.1. Ý nghĩa khoa học Đề tài được thực hiện với nhiều phương pháp khác nhau từ các kỹ thuật truyền thống (Giêm – sa) cho đến áp dụng các kỹ thuật hiện đại (sinh học phân tử) trong chuẩn đoán ký sinh trùng sốt rét, đồng thời áp dụng kỹ thuật giải trình tự để xác định trình tự đoạn Gene đặc trưng của từng loài KST SR để phát hiện KST SR, đã góp phần vào việc chuẩn đoán chính xác các chủng KST SR gây bệnh SR để có phát đồ điều trị thích hợp. Góp phần bảo tồn và duy trì nguồn chủng KST SR, nguồn dữ liệu về Gene trong giai đoạn KST SR đang giảm dần, và tình hình kháng thuốc ngày càng gia tăng [40] [62] [69] [75], cũng như phục vụ cho công tác nghiên cứu chuyên sâu về sốt rét và phát triển thuốc, vaccine sau này.
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan