Tài liệu Luận văn nghiên cứu chuyển gen gmchi vào giống đậu tương đt51

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHẠM HẢI YẾN NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmCHI VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT51 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHẠM HẢI YẾN NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmCHI VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT51 Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trình bày trong luận văn là kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Các số liệu, kết quả sử dụng trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn và nhóm nghiên cứu. Tác giả luận văn Phạm Hải Yến i LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu, người thầy đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ của Đề tài cấp Bộ Giáo dục & Đào tạo “Nghiên cứu nâng cao hàm lượng isoflavone trong cây đậu tương bằng công nghệ gen”, mã số B2016-TNA-18 do TS Hoàng Phú Hiệp làm chủ nhiệm. Tôi xin cảm ơn cô Trần Thị Hồng, nghiên cứu sinh Lê Thị Hồng Trang cùng toàn thể các thầy cô và cán bộ Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện và giúp đã tôi trong quá trình nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành bài luận văn này. Tác giả luận văn Phạm Hải Yến ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan…………………………………………………………. i Lời cảm ơn…………………………………………………………… ii Mục lục………………………………………………………………. iii Danh mục bảng………………………………………………….......... iv Danh mục hình………………………………………………………. v Danh mục chữ viết tắt………………………………………………... vi Mở đầu ………………………………………………………………. 1 1. Đặt vấn đề ……………………………………………………........ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ………………………………………………. 2 3. Nội dung nghiên cứu…………………………………………......... 2 Chương 1. Tổng quan tài liệu……………………………………… 3 1.1. Cây đậu tương…………………………………………………… 3 1.1.1. Đặc điểm hình thái cây đậu tương……………………….......... 3 1.1.2. Vai trò của đậu tương……………………………………......... 4 1.2. Isoflavone và enzyme chìa khóa trong quá trình sinh tổng hợp isoflavone..…………………………………………………................ 6 1.2.1. Isoflavone...……………………………………………………. 6 1.2.2. Con đường sinh tổng hợp isoflavone ở đậu tương…….............. 9 1.2.3. Enzyme chalcone isomerase (CHI) và gen GmCHI……............. 10 1.3. Chuyển gen ở đậu tương nhờ Agrobacterium………….………… 13 iii 1.3.1. Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương........................... 13 1.3.2. Nghiên cứu biểu hiện gen CHI……….......……………………. 17 Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.............................. 19 2.1. Vật liệu nghiên cứu……………………………………………… 19 2.2. Hóa chất và thiết bị……………………………………………… 21 2.3. Phương pháp nghiên cứu………………………………………… 21 2.3.1. Phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen………………….. 21 2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử…………………………............ 24 2.4. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận văn……………............ 27 Chương 3. Kết quả và thảo luận………………………………......... 28 3.1. Chuyển cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc vào giống đậu tương ĐT51 nhờ A.tumefaciens………………………………………..................... 28 3.1.1. Kết quả khử trùng hạt………………………………….............. 28 3.1.2. Kết quả tạo nguyên liệu biến nạp……………………………… 29 3.1.3. Kết quả lây nhiễm và tái sinh cây đậu tương …………………. 30 3.2. Phân tích sự có mặt của gen chuyển GmCHI trong đậu tương chuyển gen thế hệ T0………………………………………………… 35 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số………………………………. 35 3.2.2.Kết quả phân tích khuếch đại gen chuyển GmCHI…………….. 36 3.3. Thảo luận kết quả nghiên cứu…………………………………… 38 Kết luận và đề nghị………………………………………………….. 42 1. Kết luận……………………………………………………………. iv 42 2. Đề nghị…………………………………………………………….. 42 Công trình công bố liên quan đến luận văn…………………………... 43 Tài liệu tham khảo……………………………………………............. 44 Phụ lục 1………………………………………………………........... 50 Phụ lục 2………………………………………………………............ 51 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần đệm tách DNA tổng số................................. 24 Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của các cặp mồi GmCHI-coI- 25 F/GmCHI-cmyc-SacI-R.................................................................... Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR nhân bản đoạn GmCHI- 26 cmyc-KDEL………….……………………………………………. Bảng 2.4. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR……………………….. 26 Bảng 3.1. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI nhờ vi khuẩn A.tumefaciens qua nách lá mầm hạt chín…………………... iv 34 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc phân tử isoflavone...………………………….. 7 Hình 1.1. Chu trình chuyển hóa isoflavone..…………………....... 11 Hình 2.1. Giống đậu tương ĐT51………………………………… 19 Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc 35S-GmCHi-cmyc trong vector chuyển gen pCB301_GmCHI trong vi khuẩn A.tumefaciens…………….. 20 Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm………………………………………………............. 23 Hình 3.1. Khử trùng hạt bằng khí clo trong bình thủy tinh kín 29 Hình 3.2. Hình ảnh hạt đậu tương và hạt nảy mầm trong giai đoạn chuẩn bị nguyên liệu cho biến nạp……………………………….. 30 Hình 3.3. Hình ảnh của đậu tương trong giai đoạn gây tổn thương nách lá mầm và biến nạp………………………………………….. 31 Hình 3.4. Hình ảnh của đậu tương chuyển gen trong giai đoạn tạo chồi và kéo dài chồi………………………………………............. 32 Hình 3.5. Hình ảnh của đậu tương chuyển gen trong giai đoạn ra rễ và trồng cây đậu tương chuyển gen trên giá thể ………............. 33 Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số tách từ lá các cây đậu tương chuyển gen và cây không chuyển gen.................................................................................................... 36 Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen GmCHI-cmyc-KDEL từ các cây đậu tương chuyển gen và cây không chuyển gen với cặp mồi GmCHI-NcoI-F/GmCHIcmyc- SacI-R………………………………………........................ v 37 DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT GmCHI Glycine max chalcone isomerase CHI Chalcone isomerse PCR Polymerase Chain Reaction A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng áp suất cao) ER Estrogens receptor (thụ thể estrogens) CHR Chalcone reductase CHS Chalcone synthease IFS Isoflavones synthease PAL Phenylalanine amoni-lyase DNA Deoxyribonucleotide acid cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid BAP 6-Benzylaminopurine GA3 Gibberillic acid IAA Indole-3-acetic acid DNTPs Deoxynucleotide triphosphate vi MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill] thuộc họ Đậu (Fabaceae) là loại cây trồng quan trọng, đứng thứ sáu về sản lượng hạt có dầu được sản xuất rộng rãi, được trồng ở nhiều vùng khí hậu khác nhau trên thế giới [45]. Đậu tương có hàm lượng dinh dưỡng cao hơn hẳn so với các thực phẩm khác. Hạt đậu tương có hàm lượng protein là 40% khối lượng khô, lipid 12-25%, glucid 0-15% và nhiều hợp chất hữu cơ khác. Theo Cục Quản lý Thực Phẩm và Dược phẩm và Tổ chức Y thế giới đánh giá về chất lượng protein cho trẻ em và người lớn thì protein đậu tương có chất lượng cao nhất, chứa nhiều amino acid cần thiết cho người mà cơ thể không tổng hợp ra được, như metionin, tryptophan, lysine, isoleucine, leucine, phenylalanine, valine Đặc biệt, trong mầm đậu tương có một chất tương tự như kích thích tố nữ estrogen, đó là isoflavone. Chất này có công thức hoá học gần giống như kích thích tố nữ estrogen. Vì thế, nó được mệnh danh là estrogen thực vật (phyto - estrogen) và có vai trò quan trọng đối với sức khoẻ phụ nữ, bảo vệ phụ nữ trước một số căn bệnh như: tim mạch, rối loạn tiền mãn kinh, ung thư và loãng xương [46]. Isoflavone là một nhóm các chất chuyển hóa thứ cấp chủ yếu có ở loại cây họ Đậu và đặc biệt có nhiều trong mầm đậu tương. Tuy nhiên, hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương thấp, trong khoảng từ 50 – 3000 µg/g và tồn tại ở hai dạng chính là glycoside và aglucone. Dạng glycoside có trọng lượng phân tử lớn, chiếm tới trên 90% isoflavone tổng số và được cho là có sự hấp thụ hạn chế trong hệ tiêu hóa người, trong khi đó, dạng aglucone được hấp thụ nhanh hơn, nhưng hàm lượng lại rất thấp, chỉ chiếm từ 1% – 5% isoflavone tổng số [16]. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tăng hàm lượng isoflavone dạng 1 aglucone trong hạt đậu tương. Chính vì vậy hướng tiếp cận nghiên cứu nâng cao hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương bằng công nghệ gen đang được quan tâm ứng dụng. Isoflavone được tổng hợp thông qua con đường phenylpropanoid từ hợp chất flavonoid trong thực vật bậc cao. Quá trình chuyển hóa tổng hợp isoflavone là một chuỗi các phản ứng với sự tham gia của nhiều enzyme, trong đó có hai enzyme chìa khóa là isoflavone synthease (IFS) và chalcone isomerase (CHI). CHI xúc tác chuyển hóa chalcone thành flavanone và từ flavanone tạo thành isoflavone với sự tham gia của enzyme IFS. Như vậy, nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzym chìa khóa trong quá trình sinh tổng hợp isoflavone ở cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen là một biện pháp công nghệ có hiệu quả nâng cao hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen GmCHI vào giống đậu tương ĐT51” 2. Mục tiêu nghiên cứu Chuyển được cấu trúc mang gen GmCHI vào giống đậu tương ĐT51 phục vụ tạo dòng đậu tương chuyển gen có hàm lượng isoflavone cao. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI qua nách lá mầm đậu tương nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và tạo cây đậu tương chuyển gen. 3.2. Phân tích cây đậu tương chuyển gen thông qua xác định sự có mặt của gen chuyển GmCHI bằng kỹ thuật PCR. 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG 1.1.1. Đặc diểm hình thái cây đậu tương Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc chi Glycine, họ Đậu (Fabaceae) có bộ nhiễm sắc thể là 2n = 40. Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm được xác minh. Đậu tương có nguồn gốc được thuần hóa ở Trung Quốc [8]. Cây đậu tương có rễ cọc gồm một rễ chính và nhiều rễ phụ, rễ chính ăn sâu trong lòng đất 30 – 50 cm, các rễ phụ có thế phát triển lan rộng 30 – 40 cm2. Trên rễ của đậu tương có nhiều nốt sần là do các vi khuẩn Rhizobium Japonicum cộng sinh với rễ đậu tương. Trong một nốt sần có khoảng 3 – 4 tỷ vi sinh vật cố định đạm. Đậu tương là một loài cây thân thảo, cây trồng ngắn ngày. Thân thường dài từ 14 – 15 lóng, mỗi lóng có chiều dài khoảng 3 – 10 cm, cây cao khoảng 0,3 - 1,0 m. Toàn thân bao phủ bởi một lớp lông tơ ngắn, mọc dày bao phủ từ gốc lên đến ngọn và cả cuống lá. Những giống có mật độ lông to dày, màu sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn, chịu rét khỏe. Ngược lại, những giống không có lông tơ thường sinh trưởng không bình thường, sức chống chịu kém. Thân cây có lông dài ngắn, dày thưa, nhiều ít là đặc điểm để phân biệt các giống đậu tương với nhau. Thân cây thường có màu xanh hoặc tím khi còn non, về già thì có màu nâu nhạt. Nếu thân non màu xanh thì hoa màu trắng còn thân non màu tím thì hoa có màu tím đỏ. Lá đậu tương có 3 loại lá mọc ra tùy theo giai đoạn sinh trưởng, đó là: 3 lá mầm, lá nguyên và lá kép. Lá thường mọc so le, có màu xanh tươi khi già thì chuyển thành màu vàng nâu. Lá kép thường có 3 lá chét với hình dạng khác nhau tùy loài, thường có nhiều lông tơ. Hoa nhỏ, không mùi, thuộc loại cánh bướm. Màu sắc hoa thay đổi tùy theo giống và thường có màu tím, tím nhạt hoặc trắng. Hoa phát sinh ở nách lá, đầu cành và đầu thân. Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có 1 - 10 hoa và thường có 3 - 5 hoa. Quả đậu tương hơi cong, có chiều dài từ 2 - 7 cm, chứa 2 - 5 hạt, màu sắc biến động từ vàng trắng tới vàng sẫm, nâu hoặc đen. Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: tròn, bầu dục, dẹt,... Hạt to nhỏ khác nhau tùy loài, trung bình có khối lượng 100 - 200 g [9]. 1.1.2. Giá trị dinh dưỡng của hạt đậu tương Hạt đậu tương chứa 8% nước, 5% chất vô cơ, 15 - 25% glucose, 1520% chất béo, 35- 45% chất đạm với đủ các loại amino acid cần thiết và nhiều khoáng chất. So với thịt động vật, đậu tương có nhiều chất dinh dưỡng hơn: 100 gr đậu tương có 411 calo; 34 gr đạm; 18 gr béo; 165mg calcium; 11mg sắt; trong khi đó thịt bò loại ngon chỉ có 165 calo, 21gr đạm; 9gr béo; 10mg calcium và 2,7 mg sắt. Vì có nhiều đạm nên đậu tương đã được coi như “thịt không xương” ở nhiều quốc gia châu Á. Tại Nhật Bản, Trung Quốc 60% hàm lượng đạm tiêu thụ hàng ngày đều do đậu tương cung cấp. Đạm này rất tốt để thay thế cho thịt động vật vì có ít mỡ và cholesterol. Đậu tương có nhiều đạm hơn thịt, nhiều calcium hơn sữa bò, nhiều lecithin hơn trứng. Các amino acid cần thiết mà cơ thể không tạo ra được thì đều có trong đậu tương. Khi đậu tương ăn chung với một số ngũ cốc như ngô thì đạu tương sẽ bổ sung một số amino acid mà ngô không có. Với trẻ em, chất đạm của đậu tương là món ăn 4 quý giá cho các em bị dị ứng với sữa bò hoặc không tiêu thụ được đường lactose. Hàm lượng protein tổng số dao động trong hạt đậu tương từ 29,6 50,5%, trung bình là 36 - 40%. Các nhóm protein đơn giản (% so với tổng số protein): albumin (6 - 8%), globulin (25 - 34%), glutelin(13 - 14%), prolamin chiếm lượng nhỏ không đáng kể. Protein đậu tương dễ tan trong nước và chứa nhiều amino acid không thay thế đáp ứng nhu cầu của người và động vật, như valine, leucine, isoleucine, methionine, tryptophan, threonine, lysine, phenylalanine. Đậu tương được chế biến thành nhiều món ăn như đậu phụ, đậu phù chúc, sữa đậu nành, tào phớ, tương,... Bên cạnh vai trò là một loại cây thực phẩm, đậu tương cũng có tác dụng chữa bệnh tim mạch và ung thư. Theo các nghiên cứu từ trước tới nay, việc sử dụng đậu tương có thể làm giảm lượng cholesterol trong máu 10 - 15%. Lượng cholesterol càng cao thì hiệu quả sử dụng đậu tương càng rõ. Kể cả khi bệnh nhân đã ăn chế độ ít béo, ít cholesterol, nếu ăn thêm đậu tương vẫn có tác dụng hạ thấp hơn nữa lượng cholesterol trong máu. Do vậy, ăn đậu tương được nhiều bác sĩ coi là cách chữa bệnh vừa hiệu quả, lại ít tốn kém và không độc. Cholesterol chỉ gây tác hại cho mạch máu nếu bị oxy hóa. Đậu tương không những làm giảm cholesterol mà còn ức chế khả năng oxy hóa của chất này. Các nhà nghiên cứu Nhật Bản cho biết, đạm đậu tương hoạt động như một chất chống oxy hóa mạnh. Ngoài ra, nó còn có khả năng ức chế sự kết hợp cholesterol thành các tổ chức clot - bước quan trọng dẫn đến rối loạn hoạt động của tim, tạo nên các cơn đau tim. Năm 1990, Viện ung thư Quốc gia Mỹ đã xem xét vai trò của đậu tương trong phòng bệnh ung thư và xác định ở đậu tương có năm nhóm chất chống 5 ung thư. Trong đó, người ta đặc biệt chú ý đến tác dụng chống ung thư của isoflavone, một nhóm hóa chất gần như không tồn tại trong các thực phẩm khác ngoài đỗ tương. Tác dụng chống ung thư của đậu tương được giải thích là do isoflavone của nó đã tác động như một anti-oestrogen, làm vô hiệu hóa tác động của oestrogen, giống như thuốc Tamoxifen đang được dùng rộng rãi và có kết quả trong điều trị ung thư vú [49]. Một trong các isoflavone của đậu tương được nghiên cứu nhiều nhất trong 7 - 8 năm qua là genistein. Các công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng genistein có khả năng ngăn chặn sự phát triển của khối u. Bên cạnh việc ngăn cản sự hình thành các mạch máu mới (một điều kiện tiên quyết để khối u phát triển), genistein còn ức chế các enzyme trong các loại tế bào ung thư, và do đó, nó được coi là chất có khả năng phòng chống nhiều thể ung thư khác nhau [49]. 1.2. ISOLAVONE VÀ ENZYME CHÌA KHÓA TRONG QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP ISOFLAVONE 1.2.1. Isoflavone Đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương đã được quan tâm nhiều hơn trong những năm gần đây, vì đậu tương có vai trò quan trọng đối với sức khỏe con người. Đậu tương chứa daidzein, genistein, glycitein cùng với dạng glycosid của chúng, acetyl tương ứng và dẫn xuất malonyl [21]. Vai trò trên chủ yếu là do một hợp chất trong đậu tương, đó là isoflavone. Isoflavone là các polyphenol không màu thuộc lớp flavonoid. Trong khi phần lớn flavonoid có vòng B gắn vào vị trí 2 của vòng tròn C, isoflavone có vòng B gắn vào vị trí số 3 của vòng C (Hình 1.1). Ngay cả khi chúng không phải là steroid, chúng có cấu trúc tương đồng với estrogen, đặc biệt là estradiol. Điều này mang lại cho chúng tính chất giả hình, chẳng hạn như khả 6 năng gắn kết thụ thể estrogen; do đó, chúng được phân loại như phytoestrogens hoặc estrogen thực vật. Hình 1.1. Cấu trúc phân tử isoflavone (Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Isoflavone) Isoflavone là các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học tích tụ trong đậu tương trong quá trình phát triển. Hàm lượng isoflavone có trong hạt đậu tương là thay đổi, phụ thuộc vào yếu tố di truyền và tác động của môi trường. Các thí nghiệm được tiến hành để xác định liệu isoflavone được tổng hợp trong các mô hạt trong quá trình phát triển hay ở các cơ quan của thực vật và được vận chuyển đến các hạt nơi chúng tích lũy. Phân tích sắc kí khối phổ (HPLC) phát hiện ra các hợp chất này có trong tất cả các cơ quan của đậu tương, nhưng hàm lượng isoflavone khác nhau tùy thuộc loại mô và giai đoạn phát triển. Nồng độ lớn nhất là tìm thấy trong hạt nảy mầm và lá đậu tương [15]. Isoflavone là một lớp chất của isoflavonoid, hoạt động như kích tố nữ ở động vật có vú. Isoflavone chủ yếu được tổng hợp trong các cây họ đậu. Các chất isoflavone hoạt động như phytoestrogens để kích hoạt động giả bằng cách gắn kết các thụ thể estrogens (ER) ở động vật có vú [11], [36]. 7 Các dẫn xuất chính của isoflavone là daidzein, genistein và glycitein [42]. Các chất này chỉ khác nhau về nguyên tử hydro và các nhóm hydroxyl, ví dụ như, genistein và daidzein là hai dạng chính trong họ isoflavone, genistein chỉ khác daidzein ở nhóm hydroxyl liên kết với carbon số 5 [44]. Daidzein và genistein là những chất isoflavone phổ biến nhất, có cấu trúc hóa học đặc trưng [20]. Isoflavone được coi là chất chống oxy hóa, chống ung thư, kháng khuẩn và có cả hoạt động chống viêm giống như các flavonoid khác. Isoflavone gợi lên một hiệu ứng estrogens yếu (agonistic) hoặc chống estrogens (đối kháng), tùy thuộc vào mức độ estrogens nội sinh và ER [23]. Isoflavone ngăn chặn sự liên kết của các estrogens mạnh hơn, có vai trò trong việc phòng ngừa ung thư vú, ung thư cổ tử cung, tuyến tiền liệt hoặc ung thư tinh hoàn [33]. Khi lượng estrogen giảm trong thời kỳ mãn kinh, nhiều phụ nữ sử dụng liệu pháp hormone. Liệu pháp hormone có thể giúp làm giảm triệu chứng mãn kinh nhưng nó cũng gây một số rủi ro. Liệu pháp hormone có thể làm tăng nguy cơ đau tim, đột quỵ, ung thư vú và mất trí nhớ. Isoflavone thì lại không gây những rủi ro này. Nghiên cứu cho thấy isoflavone làm giảm nguy cơ u xơ tử cung và nội mạc tử cung. Tỷ lệ người ung thư vú và tuyến tiền liệt ở người châu Á thấp hơn người ở phương Tây, điều này có thể liên quan đến mức độ tiêu thụ đáng kể isoflavone khác nhau trong chế độ ăn của người châu Á (15 – 4mg/ngày) [27] so với chế độ ăn của người phương Tây (0,15 – 1,7mg/ngày) [29]. Isoflavone có khả năng trung hòa các gốc tự do, trong số các isoflavone, genistein có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất [47]. Trong những thập kỷ gần đây, các nghiên cứu dịch tễ học mở rộng, cùng với các thí nghiệm in vivo, in vitro đã chỉ ra rằng isoflavone có lợi cho bệnh nhân bị các bệnh tim mạch, ung 8 thư, loãng xương và mãn kinh [13], [30]. Isoflavone đã được chứng minh thông qua các thử nghiệm lâm sàng với vai trò làm giảm nguy cơ tăng cholesteron máu, bệnh tim mạch và ung thư [14]. Isoflavone có tầm quan trọng đối với các tương tác giữa thực vật và môi trường như: các chất ức chế nhiễm trùng gây bệnh (phytoalexins) và tín hiệu các phân tử để cộng sinh với vi khuẩn cố định đạm [14]. 1.2.2. Con đường sinh tổng hợp isoflavone ở đậu tương Con đường phenylpropanoid tạo ra một loạt các sản phẩm khác nhau có nguồn gốc tự nhiên của thực vật. Một nhánh của con đường này là nhánh flavonoids phổ biến hầu hết ở các loài thực vật, một nhánh khác của con đường phenylpropanoid mà hầu như chỉ họ Đậu (Fabaceae) mới có, hình thành nên isoflavonoid [14]. Trong đậu tương, isoflavone gồm daidzein, genistein và glycitein được dự trữ trong không bào [38]. Genistein, daidzein và glycitein được tổng hợp bởi một nhánh của con đường phenylpropanoid. Trong con đường trao đổi chất này cũng có sự tổng hợp các hợp chất thực vật quan trọng khác như tannin, linhin, lignans, anthocyanins, flavone, flavonol, phytoalexin, glyceollin và pterocarpan có hoạt động kháng khuẩn [16],[18]. Con đường phenylpropanoid có nhiều nhánh với chất xuất phát ban đầu là phenylalanine, kết quả tạo thành các chất như: glycitein, genistein, flavone, glyceollin, anthocyanin và tanin đặc (còn được gọi là proanthocyanidin) dưới tác dụng của hàng loại các enzyme chuyển hóa [17], [39], [40]. Một enzyme quan trọng khác trong con đường tổng hợp isoflavone là chalcone isomerase (CHI) chuyển đổi chalcone thành flavanone, và chalcone reductase (CHR), hình thành nên daidzein và glycitein. Các chalcone được tổng hợp bởi CHS được chuyển đổi sang các naringenin flavone (5,7,4’9 trihydroxyflavone) bởi enzyme chalcone isomerase (CHI) [40]. Con đường phenylpropanoid bắt đầu với cơ chất đầu tiên là amino acid L – phenylalanine (Hình 2.1). Phản ứng đầu tiên của con đường này là khử nhóm amino (-NH3) của amino acid phenylalanine tạo thành acid cinnamic bởi phenylalanine amoni-lyase (PAL). Con đường này tiếp diễn thêm hai phản ứng khác nữa dẫn đến hình thành coumaroyl – CoA. Hợp chất này được biến đổi thành hai dạng naringenin chalcone hoặc isoliquiritigenin bởi hai enzyme tương ứng là chalcone synthease (CHS) và reductase chalcone (CHR). Sau đó từ hai chất trên, naringenin và liquiritigenin được tạo thành nhờ sự xúc tác của các enzyme chalcone isomerase (CHI). Naringenin được sử dụng để tổng hợp flavonoid như flavones, flavonols, tanin cô đặc và anthcyanins, cũng như isoflavone, genistein. Liquiritigenin trong con đường dẫn chất isoflavonoid của cây họ Đậu (Fabaceae) và được chuyển đổi thành glycitein và daidzein, tiền thân caue glyceollins, một nhóm phytoalexins quan trọng [14]. Sự tổng hợp daidzein và genistein từ liquiritigenin và naringenin là hoàn toàn được xúc tác bởi enzyme isoflavone synthease (IFS) và hydroxylhydroxan dehydratase. Tổng hợp glycitein vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhưng theo giả thuyết có thể có nguồn gốc từ isoliquiritigenin [18]. 1.2.3. Enzyme chalcone isomerase (CHI) và gen GmCHI Con đường phenylpropanoid với sự tham gia của hàng loạt các enzyme chia thành hai nhánh tổng hợp, trong đó enzyme then chốt của một nhánh – chalcone isomerase, xúc tác các phản ứng flavone, là xương sống cho nhiều chất chuyển hóa như flavonoid và isoflavonoid. Trong con đường tổng hợp này, phenylalanine thông qua sự xúc tác của nhiều loại enzyme để biến đổi thành naringenin chalcone. Bắt đầu từ hợp chất này, con đường 10