ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
PHẠM THÙY DUNG
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY HƯƠNG THẢO
(Rosmarinus officinalis L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG
Thái Nguyên, tháng 12 - 2016
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
PHẠM THÙY DUNG
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY HƯƠNG THẢO
(Rosmarinus officinalis L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG
Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu
Thái Nguyên, tháng 12 - 2016
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng
dẫn của GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận
văn là trung thực và chưa được ai công bố.
Tác giả
Phạm Thùy Dung
ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên
cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của chị Trần Thị Hồng - Kỹ thuật
viên Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường
Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
Trong thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ tại Trung tâm Thực nghiệm
thực hành và chuyển giao khoa học công nghệ - Đại học Tân Trào, tôi luôn
nhận được sự giúp đỡ của Ban lãnh đạo Trung tâm, các kỹ thuật viên tại phòng
Nuôi cấy mô đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi thực hiện các thí nghiệm của
luận văn thạc sĩ.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa, các thầy
cô giáo, cán bộ khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học
Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khoa học.
Tác giả
Phạm Thùy Dung
iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................... ii
MỤC LỤC................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT .................................. vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................... viii
MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề .............................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................ 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 4
1.1. Cây Hương thảo .................................................................................. 4
1.1.1. Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Hương thảo ........................ 4
1.1.2. Thành phần hóa học có hoạt tính dược học của cây Hương thảo ...... 4
1.1.3. Đặc điểm sinh thái, trồng trọt cây Hương thảo ................................. 7
1.1.4. Tình hình sử dụng cây Hương thảo tại Việt Nam .............................. 7
1.2. Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in
vitro ........................................................................................................... 8
1.2.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật........... 8
1.2.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................... 9
1.2.3. Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào ........................................... 10
1.3. Nghiên cứu nhân giống in vitro cây dược liệu và cây Hương thảo..... 11
1.3.1. Tình hình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế
bào thực vật ở trong nước ............................................................................... 12
iv
1.3.2. Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Hương thảo bằng phương pháp
nuôi cấy mô thực vật ................................................................................ 14
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 15
2.1. Vật liệu, hoá chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu ..................................... 15
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 15
2.1.2. Hoá chất, thiết bị ................................................................................... 15
2.1.3. Điạ điể m và thời gian nghiên cứu ......................................................... 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 16
2.2.1. Phương pháp khử trùng mẫu ................................................................. 16
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro ................... 16
2.2.3. Đưa cây ra môi trường tự nhiên ............................................................ 19
2.2.4. Điều kiện thí nghiệm ...................................................................... 20
2.2.5. Phương pháp xử lí và tính toán số liệu ................................................. 21
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 22
3.1. Kết quả khử trùng hạt tạo mẫu sạch ................................................... 22
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh
trưởng đến hiệu quả phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi Hương thảo
trong ống nghiệm ............................................................................................ 24
3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sự
sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên cây Hương thảo .... 24
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh và sinh
trưởng chồi từ nách lá mầm của cây Hương thảo...................................... 27
3.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát
sinh và sinh trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên của cây Hương thảo ..... 29
3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ
của chồi Hương thảo in vitro ................................................................... 32
v
3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh
trưởng của cây con in vitro ngoài vườn ươm ............................................ 34
3.5. Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo .................................. 36
3.5.1. Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo từ đoạn thân mang
mắt chồi bên ............................................................................................. 38
3.5.2. Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo từ nách lá mầm ........... 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 40
1. Kết luận ................................................................................................ 40
2. Đề nghị................................................................................................. 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 41
PHỤ LỤC
vi
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT
BA:
6-Benzyladenine
BAP:
6-Benzylaminopurine
Cs:
Cộng sự
CT:
Công thức
DNA:
Deoxyribonucleic acid
ĐC:
Đối chứng
IAA:
Indole-3-acetic acid
IBA:
Indole-3-butyric acid
Kinetin: 6-furfurylaminopurine
MS:
Murashige và Skoog, 1962
NAA:
Naphthalene acetic acid
2,4-D:
2,4-Dichlorophenoxy acetic acid
PLBs:
Protocorm like bodies (thể tiền củ)
SH:
Schenk và Hildebrandt, 1972
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt Hương thảo bằng khí clo sau 20 ngày..............22
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang
mắt chồi bên của cây Hương thảo ..........................................................................25
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ nách lá
mầm của cây Hương thảo .......................................................................................28
Bảng 3.4. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát sinh và sinh trưởng
chồi tái sinh từ mắt chồi bên của cây Hương thảo .................................................30
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi Hương
thảo sau 4 tuần ..........................................................................................................32
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây
con in vitro ngoài vườn ươm sau 60 ngày ..............................................................34
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây Hương thảo ngoài tự nhiên .................................................................... 5
Hình 2.1. Hạt Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) có nguồn gốc từ Nga.......... 15
Hình 3.1. Kết quả khử trùng hạt Hương thảo bằng khí clo trong 5 giờ .................... 23
Hình 3.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng khí clo đến khả năng nảy mầm
hạt Hương thảo.............................................................................................................. 24
Hình 3.3: Ảnh hưởng của BAP đến sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt
chồi bên của cây Hương thảo sau 8 tuần..................................................................... 26
Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP 1,5 mg/l đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ
nách lá mầm của cây Hương thảo ............................................................................... 29
Hình 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp với IBA đến sự phát sinh và sinh
trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên của cây Hương thảo sau 8 tuần. ...................... 31
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi
Hương thảo. ................................................................................................................ 33
Hình 3.7. Cây Hương thảo in vitro trồng trong các giá thể khác nhau sau 60 ngày36
Hình 3.8: Sơ đồ Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo từ đoạn thân và từ
nách lá mầm .................................................................................................................. 37
Hình 3.9. Hình ảnh quy trình nhân giống in vitro cây Hương Thảo ......................... 39
từ đoạn thân mang mắt chồi bên .................................................................................. 39
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây Hương thảo có tên khoa học là Rosmarinus officinalis L., là một
loài thực vật có hoa thuô ̣c họ Hoa môi. Hương thảo là cây bản địa vùng Địa
Trung Hải, được trồng nhiều ở Nam Âu, Tây Á và Bắc Phi. Tại Việt Nam cây
được nhập trồng ở một số tỉnh miền Trung và miền Nam [26]. Hương thảo
được sử dụng để làm gia vị, đuổi muỗi, trị liệu bằng xoa bóp, sản xuất mỹ
phẩm và dược phẩm. Các hợp chất trong cây Hương thảo được bổ sung vào
kem dưỡng da, xà phòng thơm…[25].
Hương thảo tỏa mùi hương nồng ngào ngạt, lá tươi hay lá khô đều
thơm. Lá và ngọn cây Hương thảo được sử dụng là chủ yếu. Lá tươi hay lá
khô đều được dùng làm gia vị trong ẩm thực và chiết xuất tinh dầu, ứng dụng
trong y tế, mỹ phẩm. Hương thảo có vị chát, nóng, mùi thơm nồng, giúp loại
bỏ căng thẳng, tăng cường trí nhớ, giúp tinh thần sảng khoái [26]. Tinh dầu
Hương thảo hỗ trợ việc tuần hoàn máu, giúp máu lưu thông tốt hơn, giúp cải
thiện trí nhớ, giúp tinh thầ n thư giañ , giảm stress... Mặc dù tinh dầu Hương
thảo có nhiều công dụng tốt, nhưng hiện nay nước ta chưa cung cấp đủ
nguyên liệu nên phải nhập hoàn toàn từ nước ngoài [25].
Các thành phần quan trọng nhất của Hương thảo là axit caffeic và các
dẫn xuất như axit rosmarinic và axit carnosic. Những hợp chất này có tác
dụng kháng nấm và kháng khuẩn, làm trẻ hóa làn da bằng cách cải thiện lưu
thông máu, chống viêm và kích ứng da và rất hữu ích trong điều trị mụn trứng
cá, viêm da, eczema và các bệnh ngoài da khác…[23],[25].
Hiện nay, cây Hương thảo đã được nhập trồng ở Việt Nam, cây sinh
trưởng phát triển tốt, thích hợp được với điều kiện khí hậu nhiệt đới, cây
thường được nhân giống bằng cách gieo hạt hoặc giâm cành [25]. Tuy nhiên
2
trồng bằng hạt tỉ lệ nảy mầm thấp, hạt giống phải nhập khẩ u nên giá thành
cao. Nhân giống bằng giâm cành cho hệ số nhân thấp, tỉ lệ thành công cũng
không cao.
Xuất phát từ giá trị to lớn của cây Hương thảo và thực trạng nhu cầu về
giống cây Hương thảo ở nước ta, việc ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào
thực vật nhằm tạo ra được một số lượng lớn giống cây sạch bệnh, đáp ứng nhu
cầu phát triển sản xuấ t ở nước ta là hết sức cần thiết, do vậy chúng tôi xây
dựng đề tài luâ ̣n văn tha ̣c si ̃ là: “Nghiên cứu nhân giống cây Hương thảo
(Rosmarinus officinalis L.) bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng đươ ̣c quy trình tái sinh in vitro cây Hương thảo bằng kĩ thuật
nuôi cấy mô tế bào thực vật.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu điề u kiêṇ khử trùng hạt để ta ̣o mẫu sạch trong ống nghiệm;
3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và sự kết hợp giữa BAP và IBA đến sự
phát sinh chồi và sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên và từ
nách lá mầm;
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro;
3.4. Nghiên cứu giá thể thích hơ ̣p đưa cây ra môi trường tự nhiên.
3.5. Đề xuất được quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu xác định được môi trường thích hợp cho nhân
giống cây Hương thảo bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, đánh
giá được ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng, thành phần môi
trường nuôi cấy và thời gian khử trùng mẫu cấy, đánh giá được tác động
của các giá thể đến sinh trưởng của cây con trong giai đoạn vườn ươm, là
3
cơ sở bổ sung thêm dữ liệu cho việc nghiên cứu các loại cây dược liệu
khác.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tạo ra được các cây con có chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh
không phụ thuộc vào mùa vụ, là cơ sở cung cấp nguồn cây giống theo nhu cầu
thực tiễn.
Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo có thể sử dụng cho các
phòng thí nghiệm công nghệ tế bào để nhân giống phục vụ phát triển Hương
thảo đáp ứng nhu cầu thực tiễn.
4
Chương 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cây Hương thảo
1.1.1. Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Hương thảo
Cây Hương thảo còn có tên gọi khác là cây Mê điệt, tên tiếng Anh là
Rosemary. Cây Hương thảo thuộc chi Rosmarinus, họ Hoa môi (Lamiaceae),
bộ Hoa môi (Lamiales), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida), ngành Hạt kín
(Magnoliophyta), giới thực vật (Plantae) [26].
Hương thảo da ̣ng cây bụi nhỏ, thẳng cứng, cao từ 80 đến 150 cm, lá và
hoa có mùi thơm. Thân cây thẳng đứng có nhiều nhánh dài. Hương thảo có lá
đơn, mọc đối, lá dày, có mép gập xuống, không cuống, mặt trên lá có màu
xanh đậm và bóng, mặt dưới lá có màu trắng và có lông tơ. Những bông hoa
mọc ra từ nách lá. Hoa hình môi, có màu xanh dương dài dưới 1 cm, đài hoa
hình chuông, có lông mịn, tràng hoa 2 môi, môi dưới chẻ sâu như môi của
một số hoa lan. Mùa hoa từ tháng 3 đến tháng 5. Quả Hương thảo giống như
hầu hết quả thuộc họ Lamiaceae, quả là một chùm gồm 4 quả khô hợp lại,
màu nâu. Toàn cây có mùi rất thơm. Bộ phận sử dụng được là ngọn cây có
hoa và lá [26].
1.1.2. Thành phần hóa học có hoạt tính dược học của cây Hương thảo
Cây Hương thảo có chứa một số hoạt chất sinh học bao gồm chất chống
oxy hóa như axit carnosic và axit rosmarinic. Các hợp chất hoạt tính sinh học
khác bao gồm long não (lên đến 20% trong lá Hương thảo khô), axit caffeic,
axit ursolic, axit betulinic, rosmaridiphenol, và rosmanol [25],[26],[23].
Axit
rosmarinic
là
este
của
axit
caffeic
và
axit
3,4-
dihydroxyphenyllactic và được xác định rộng rãi trong các loài thực vật khác
nhau. Axit rosmarinic là một hợp chất có bản chất là polyphenol có khả năng
5
kháng khuẩn, chống viêm, kháng virus, chống oxy hóa, chống dị ứng, viêm
khớp, hen suyễn…và một số nghiên cứu bước đầu cho thấy nó có tác dụng
trong điều trị bệnh Alzheimer. Trong công nghiệp thực phẩm, axit rosmarinic
là thành phần có vai trò ngăn ngừa và hỗ trợ chữa dị ứng, viêm loét dạ dày, là
chất bảo quản tự nhiên, chất chống oxi hóa có thể kéo dài thời gian bảo quản
hải sản tươi sống, một số sản phẩm lên men, là gia vị cần thiết trong nhiều
món ăn [12], [23]. Hoạt động chống oxy hóa của axit rosmarinic mạnh hơn so
với vitamin E.
Hình 1.1. Cây Hương thảo ngoài tự nhiên
Axit carnosic là một chất chống oxy hóa tự nhiên, được sử dụng rộng
rãi thực phẩm, y sinh học ngành công nghiệp, ngành công nghiệp mỹ phẩm...
Là một phụ gia thực phẩm, chất tạo màu tự nhiên tạo ra màu xanh lá cây.
Lipton S. A. và Cs thuộc Viện Nghiên cứu Y học Sanford-Burnham
cho rằng axit carnosic - một thành phần có trong cây Hương thảo - axit
6
carnosic có thể có những ứng dụng lâm sàng cho bệnh ảnh hưởng đến võng
mạc, bao gồm thoái hóa điểm vàng liên quan đến tuổi, các bệnh về mắt. Axit
carnosic bảo vệ võng mạc khỏi thoái hóa và tổn thương ánh sáng gây ra trong
nuôi cấy tế bào và trong các mô hình động vật gặm nhấm. Trong vài năm,
nhóm của Lipton đã phát hiện axit carnosic chống tổn thương các gốc tự do
trong não. Lipton và các đồng nghiệp đã thử nghiệm axit carnosic trong một
mô hình động vật bị tổn thương thụ thể cảm nhận ánh sáng - là phần mắt
chuyển ánh sáng thành tín hiệu điện tử, cho phép nhìn mọi vật. Nghiên cứu
cho thấy rằng loài gặm nhấm được điều trị trước bằng axit carnosic đã lưu giữ
lớp võng mạc của mắt dày hơn, chứng tỏ các thụ thể cảm nhận ánh sáng đã
được bảo vệ [28].
Axit ursolic là triterpenoid pentacyclic, có trong các loại trái cây và rau
quả khác nhau. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy rằng axit ursolic có tác
động chống ung thư, tác dụng chống viêm, và cảm ứng apoptosis trong một số
tế bào ung thư ở người. Đặc biệt, axit ursolic ức chế sự phát triển ung thư vú
bằng cách gây di động G1/G2 bắt giữ và điều chỉnh sự biểu hiện của protein
quan trọng trong con đường truyền tín hiệu [20].
Hương thảo có thể sử dụng theo các bài thuốc dân gian ở nước ta [29].
Bài thuốc số 1: Dùng 200g lá Hương thảo khô ngâm với 1 lít rượu trắng
trên 40 độ, bảo quản trong chai thủy tinh đã được khử trùng, cất nơi khô ráo.
tránh ánh nắng. Ngày uống 2 lần, mỗi lần 2ml rượu thuốc pha với nước sôi để
nguội, giúp tăng cường sức khỏe, chữa căng thẳng thần kinh, tiêu hóa kém.
Bài thuốc số 2: Dùng 2-3 lá Hương thảo khô hãm trong một tách nước
sôi làm một liều. Ngày uống 4-5 liều. Hoặc dùng 20g lá khô (30g lá tươi) hãm
với 500ml nước sôi, chia 4-5 lần để uống trong ngày. Xoa nhẹ nước hãm
thuốc này lên da đầu để tăng cường sự mọc tóc, hoặc dùng để rửa các vết
7
thương nhiễm trùng và lâu khô, rửa mắt 3-4 ngày lần trong ngày khi bị viêm
giác mạc nhẹ.
Bài thuốc số 3: Tinh dầu Hương thảo pha vào nước tắm 3-4 giọt giúp
tinh thần sảng khoái, thư giãn cơ thể, giảm stress.
1.1.3. Đặc điểm sinh thái, trồng trọt cây Hương thảo
Cây Hương thảo phát triển tốt nhất ở Địa Trung Hải hay ở những nơi
có khí hậu tương tự. Hương thảo chịu hạn tốt, thích hợp với đất mùn bở ẩm,
không thích hợp với đất sét. Cây Hương thảo cũng cần thoát nước tốt, nên
trồng ở môi trường không có sương giá có ánh nắng mặt trời chiếu 6-8 giờ để
cây phát triển tốt. Nếu trồng bằng hạt nên trồng vào mùa xuân. Các hạt giống
sẽ bắt đầu nảy mầm khoảng 14-21 ngày sau khi trồng. Đối với nhân giống
bằng giâm hom, chọn những nhánh khỏe mạnh trên cây mẹ, cắt mỗi hom dài
5-10cm, tỉa lá sát gốc. Có một số loài sâu bệnh có thể ảnh hưởng đến cây
Hương thảo. Nó là rất dễ bị bệnh phấn trắng. Cây dễ mắc bệnh khi được trồng
ở trong môi trường có không khí ẩm. Nhện, ruồi trắng và một số loài côn
trùng có thể sử dụng Hương thảo làm thức ăn [27].
1.1.4. Tình hình sử dụng cây Hương thảo tại Việt Nam
Hương thảo mới được du nhập về Việt Nam thời gian ngắn nhưng đã
nhận được sự quan tâm của nhiều người. Đặc biệt là những người yêu thiên
nhiên, thích khám phá. Do cây Hương thảo có mùi thơm nên những người
ngửi qua mùi hương của nó khó có thể quên được, chỉ cần chạm nhẹ tay vào
cây là có thể cảm nhận được mùi hương này. Cây được ưu chuộng và tìm mua
rất nhiều, người ta mua về làm cảnh, trang trí trong nhà, giúp xua đuổi muỗi.
Gần đây, Hương thảo còn trở thành một gia vị mới mẻ đối với người nội trợ.
Nó không hề bị mất đi hương thơm trong khi nấu nướng. Trong nấu ăn, lá
Hương thảo thường được sử dụng tươi, nhưng cũng có thể được sấy khô, nó
có vị đắng nhẹ rất quyến rũ, mùi của Hương thảo có thế át mùi tanh của thịt
8
cá, tạo thêm vị đặc biệt khi làm các món nướng như pizza, gà nướng, tôm
nướng. Hương thảo chứa nhiều canxi, sắt ,vitamin A và C [23].
1.2. Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in vitro
1.2.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các
loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi
trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng [9].
Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là tính
toàn năng (Totipotence) của tế bào. Trong tế bào chứa hệ gen, gồm tất cả
các gen mã hóa cho các protein liên quan đến các đặc tính, tính trạng và
chức năng sinh học của thực vật. Hiện nay, người ta đã hoàn toàn chứng
minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào
riêng rẽ [5].
Theo Nguyễn Quang Thạch và Cs [9] tất cả các loại tế bào đó đều bắt
nguồn từ tế bào hợp tử. Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử sẽ phân chia hình
thành nhiều tế bào phôi sinh sau đó sẽ biến đổi thành các tế bào chuyên hóa.
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau. Mặc dù các tế bào đã phân
hoá thành các tế bào có chức năng riêng nhưng chúng vẫn không mất đi khả
năng biến đổi của mình. Trong điều kiện thích hợp, các tế bào này lại có thể
trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó được gọi là
phản phân hoá tế bào.
phân hóa tế bào
tế bào phôi sinh
tế bào dãn
phản phân hóa tế bào
tế bào chuyên hóa
9
1.2.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho
sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy.
Theo Nguyễn Quang Thạch và Cs [9], nuôi cấy in vitro là nuôi cấy
trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi
cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết. Điều kiện vô trùng
có ý nghĩa quyết đến sự thành bại của của nuôi cấy mô in vitro.
Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các
chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. Vô trùng ban đầu
là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định. Tuy vậy, nếu
tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao, thông
thường hay sử dụng một số hóa chất như HgCl2 0.1%, NaHCl 10%, cồn 70º,
clorox,…để khử trùng. Phương tiện khử trùng: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy,
buồng và bàn cấy vô trùng, phòng nuôi cây [5].
Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính có ảnh hưởng cơ bản đến quá
trình sinh trưởng của mô nuôi cấy. Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy
chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng
và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát
triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây
là 12 – 18 giờ/ngày. Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái
của mô nuôi cấy [5].
Theo Dương Tấn Nhựt (2011) ánh sáng là một trong những yếu tố ảnh
hưởng lên quá trình tạo rễ của mẫu cấy. Quá trình tạo rễ chỉ cần cường độ
ánh sáng thấp, cường độ ánh sáng cao quá ngăn cản quá trình tạo rễ. Chất
lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự ra rễ, ánh sáng đỏ cam thích hợp cho
sự ra rễ hơn ánh sáng xanh da trời [2]. Hiện nay trong các phòng thí nghiệm
nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người
10
ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang [7].
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh
hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc
vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhiệt độ
của buồng nuôi cây cần đảm bảo nhiệt độ ổn định trong khoảng 25ºC [7].
Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật phải có đầy đủ các chất dinh
dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh
trưởng bình thường của cây. Thành phần hóa học của môi trường đóng vai
trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực
vật. Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy
thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử
dụng cho mục đích này, trong đó môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ
biến như MS (Murashige & Skoog, 1962), là môi trường thích hợp cho cả
thực vật một lá mầm, hai lá mầm. Môi trường Gramborg (1965) còn gọi là
B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương, được sử dụng trong tách và nuôi tế bào
trần. Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều
gồm một số thành phần cơ bản sau [3]: Các muối khoáng đa lượng và vi
lượng, nguồn cacbon, các vitamin và aminoaxit, chất bổ sung, chất làm thay
đổi trạng thái môi trường, các chất điều hòa sinh trưởng.
1.2.3. Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào
Theo Ngô Xuân Bình và Cs [7], nuôi cấy mô tế bào thực vật được
thực hiện theo 5 giai đoạn sau: (1) Giai đoạn chuẩn bị nhằm tạo được
nguyên liệu thực vật sạch để đưa vào nuôi cấy. (2) Tái sinh mẫu nuôi cấy
được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ
auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy. (3) Giai đoạn nhân nhanh
chồi thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng
(auxin, cytokinin …), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm
- Xem thêm -