Tài liệu Luận văn nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong một số môi trường​

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA: SINH - KTNN TRẦN MỸ LINH NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật Hà Nội, năm 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA: SINH - KTNN TRẦN MỸ LINH NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật Người hướng dẫn: Th.S Phạm Thị Kim Dung Hà Nội, năm 2019 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời nghiên cứu và hoàn thành khóa luận của mình tôi vô cùng may mắn khi nhận được sự giúp đỡ từ thầy cô,bạn bè và gia đình. Lời đâu tiên cho tôi xin được gửi lời cảm ơn đến Th.S Phạm Thị Kim Dung người đã giúp đỡ tôi rất nhiều, truyền dạy cho tôi những kinh nghiệm cũng như kiến thức để tôi có thể hoàn thành khóa luận của mình Tiếp sau nữa tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô làm việc tại khoa Sinh – KTNN nói chung và các thầy cô ở Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 nói riêng đã nhiệt tình giúp đỡ cũng như tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình. Sau cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình làm khóa luận. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội,ngày 20 tháng 5 năm 2019 Sinh viên Trần Mỹ Linh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của Th.S Phạm Thị Kim Dung. Các thông số, số liệu trong bài đều được lấy từ thực nghiệm và được xử lý thống kê bằng các phần mềm. Mọi thông tin trích dẫn được sử dụng trong bài khóa luận đều được nêu rõ nguồn gốc. Hà Nội,ngày 20 tháng 5 năm 2019 Sinh viên Trần Mỹ Linh MỤC LỤC MỞ ĐẦU...................................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1 2. Mục đích .......................................................................................................... 1 3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ............................................................ 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 1.1. Đặc điểm của Gluconacetobacter Xylinus ..................................................... 3 1.1.1. Phân loại Gluconacetobacter xylinus....................................................... 3 1.1.2. Hình thái của Gluconacetobacter Xylinus................................................. 3 1.1.3. Đặc điểm sinh lí sinh hóa của Gluconacetobacter .................................... 3 1.2. Cellulose vi khuẩn ........................................................................................... 3 1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của cellulose vi khuẩn ................................................. 3 Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của cellulose vi khuẩn ............................................. 4 1.2.2. Các tính chất đặc biệt ................................................................................ 4 1.2.3. Quá trình tạo màng cellulose vi khuẩn từ vi khuẩn Gluconacetobacter... 4 1.2.4. Ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn ..................................................... 4 1.3. Lịch sử nghiên cứu .......................................................................................... 4 1.3.1. Trên thế giới ............................................................................................... 4 1.3.2. Tại Việt Nam .............................................................................................. 5 1.4. Thuốc Diclofenac Natri .................................................................................. 5 1.4.1. Tính chất. ................................................................................................... 6 1.4.2. Tác dụng dược lí và cơ chế tác dụng ......................................................... 6 1.4.3. Chỉ định...................................................................................................... 6 1.4.4. Chống chỉ định ........................................................................................... 6 1.4.5. Tác dụng không mong muốn của thuốc ..................................................... 6 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................... 8 2.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu......................................................... 8 2.1.1. Chủng vi sinh vật ....................................................................................... 8 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu. ................................................................................... 8 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ..................................................................................... 8 2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 9 2.2.1. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................ 9 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 9 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 13 3.1. Kết quả tạo màng cellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter Xylinus. ............ 13 3.1.1. Kết quả tạo chủng vi khuẩn Gluconacetobacter từ dịch trà.................... 13 3.1.2. Kết quả tạo màng cellulose vi khuẩn từ 3 môi trường............................. 13 3.2. Kết quả thu màng thô từ 3 môi trường ........................................................... 14 3.3. Kết quả xử lý màng trước khi hấp thụ ............................................................ 14 3.4. Kết quả quét phổ hấp thụ thuốc diclofenac .................................................... 15 3.5. Kết quả dựng đường chuẩn thuốc diclofenac ................................................ 16 3.6. Kết quả khảo sát khả năng hấp thụ thuốc của màng ....................................... 17 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 23 I. KẾT LUẬN ........................................................................................................ 23 II. KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 24 * Tài liệu nước ngoài ................................................................................................. 25 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của cellulose vi khuẩn...................................................... 4 Hình 1.2. Công thức hóa học ....................................................................................... 5 Hình 3.1. Dịch giống lên men sau 7 -10 ngày ........................................................... 13 Hình 3.2. Màng cellulose vi khuẩn ............................................................................ 14 Hình 3.5. Xử lý màng................................................................................................. 15 Hình 3.6. Phổ hấp thụ của thuốc ................................................................................ 16 Hình 3.7. Phương trình đường chuẩn của diclofenac ................................................ 16 Hình 3.8. Đưa màng vào hấp thụ ............................................................................... 17 Hình 3.9. Thu mẫu đo OD sau thời gian hấp thụ ....................................................... 17 Hình 3.10. Biểu đồ so sánh khả năng hấp thụ thuốc của màng không ép nước trong 3 môi trường.................................................................................................................. 21 Hình 3.11. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ của màng ép nước trong 3 môi trường .................................................................................................................................... 21 Hình 3.12. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ của màng có độ dày 0,5cm ở 3 môi trường khác nhau........................................................................................................ 22 Hình 3.13. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ thuốc của màng 1cm trong 3 môi trường khác nhau........................................................................................................ 22 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách vật liệu sử dụng trong nghiên cứu ............................................. 8 Bảng 2.2. Danh sách các thiết bị dùng trong nghiên cứu ............................................ 8 Bảng 2.3. Thành phần của môi trường lên men tạo màng ........................................... 9 Bảng 3.1. Nồng độ diclofenac và giá trị OD tương ứng (n = 3) ................................ 16 Bảng 3.2. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng ........................................................... 18 Bảng 3.3. Lượng thuốc hấp thụ vào màng sau thời gian 2 giờ .................................. 19 Bảng 3.4. Hiệu suất thuốc hấp thụ vào các loại màng trong 2 giờ ............................ 20 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Thấp khớp là một bệnh lý mà rất nhiều người dân trong các quốc gia trên thế giới mắc phải và Việt Nam của chúng ta cũng không ngoại lệ. Tỉ lệ người Việt Nam mắc bệnh cao chiếm khoảng 20% số người mắc bệnh trên thế giới ở bất cứ độ tuổi và nghề nghiệp nào Diclofenac – dạng thuốc chống viêm không steroid dùng chủ yếu dưới dạng muối Natri, dẫn chất của acid phenylacetic có thể chống viêm, giảm sốt và giảm đau.[2] Diclofenac ức chế mạnh hoạt tính của COX (cyclooxygenase), do đó làm giảm sự tạo thành các chất trung gian của quá trình tiêu viêm như: prostaglandin, prostacyclin và thromboxan[2]. Cũng như một số loại thuốc chống viêm không steroid hiện nay, diclofenac natri có ảnh hưởng không tốt đến đường tiêu hóa vì chúng giảm khả năng tổng hợp prostaglandin dẫn đến tạo mucin có thể gây một vài chứng bệnh về thận như viêm thận kẽ hay viêm cầu thận ngoài ra có thể gây hoại tử nhú và một số bệnh liên quan khác[2] Cellulose vi khuẩn được tạo thành từ các chuỗi không phân nhánh, gồm nhiều sợi siêu nhỏ kết hợp với nhau tạo thành bó có bản chất là hemicellulose được gọi là chuỗi polimer β – 1,4 glucopyranose khác cellulose thực vật về cấu trúc đại thể. Cellulose vi khuẩn có các tính chất như độ bền cao, bị phân hủy sinh học, đàn hồi tốt, không độc,... đặc biệt là có khả năng ngăn cản vi khuẩn tốt. Vì có những đặc tính ưu việt như vậy mà cellulose vi khuẩn được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp đời sống như thực phẩm, công nghiệp, mĩ phẩm và đặc biệt là y học[7,12,21]. Với mục đích nhằm khảo sát các đặc tính của vật liệu cellulose trước khi cho hấp thụ và sau khi cho hấp thụ thuốc Diclofenac natri ở các môi trường khác nhau và so sánh khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac natri của vật liệu cellulose được tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus trong một số môi trường nuôi cấy chúng tôi thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac Natri của vật liệu Cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong một số môi trường”. 2. Mục đích - Tạo ra vật liệu cellulose từ Gluconacetobacter Xylinus trong 3 loại môi trường khác nhau. 1 - So sánh sự hấp thụ thuốc thuốc Diclofenac Natri từ 3 môi trường khác nhau: môi trường chuẩn,môi trường nước dừa, môi trường nước vo gạo từ đó tìm ra môi trường nào có khả năng hấp thụ được nhiều hơn. 3. Nội dung nghiên cứu - Chế tạo màng cellulose vi khuẩn từ Gluconacetobacter Xylinus được nuôi dưỡng và lên men trong 3 môi trường: môi trường chuẩn, môi trường nước dừa và môi trường nước vo gạo. - Tiến hành hấp thụ thuốc Diclofenac Natri vào màng cellulose vi khuẩn trong các khoảng thời gian cố định,xác định được màng đã hấp thụ được bao một lượng thuốc là bao nhiêu và hiệu suất hấp thu của màng ở các môi trường đó là bao nhiêu. - So sánh lượng thuốc được màng hấp thụ và hiệu suất mà màng hấp thụ được ở cả ba môi trường. 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học - Cung cấp thêm nhiều kiến thức về màng cellulose vi khuẩn và ứng dụng của nó trong đời sống. - Tăng nhận thức về vi khuẩn Gluconacetobacter Xylinus trong việc tạo màng cellulose và từ đó tìm ra môi trường có khả năng hấp thu thuốc tốt hơn. - Ứng dụng kiến thức về Gluconacetobacter Xylinus để tạo màng cellulose vi khuẩn ứng dụng vào trong các nghiên cứu để khắc phục điểm hạn chế của một số loại thuốc hiện nay. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn - Biết được các tạo ra màng cellulose vi khuẩn từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Xylynus. - Tạo ra được màng cellulose để nạp thuốc nhằm khắc phục những hạn chế của thuốc. - Khắc phục được những hạn chế của thuốc diclofenac natri từ đó tăng hiệu quả của thuốc trong điều trị. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm của Gluconacetobacter Xylinus 1.1.1. Phân loại Gluconacetobacter xylinus Tên: Gluconacetobacter Xylinus Chi: Gluconacetobacter Họ: Acetobacteraceaea 1.1.2. Hình thái của Gluconacetobacter Xylinus. Gluconacetobacter là chủng vi khuẩn không thể di chuyển có cấu tạo tế bào dạng hình que, thường đứng riêng lẻ hoặc có đôi lúc thành chuỗi, có tế bào dạng thẳng hoặc cong, kích thước khoảng 2 µm, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn gram âm hóa dị dưỡng và hiếu khí.Khi nồng độ acid vượt quá giới hạn thì vi khuẩn sẽ bị ức chế hoạt động [7]. Khi được nuôi cấy trong môi trường lỏng thì vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành một lớp màng phía trên bề mặt môi trường. Còn nếu nuôi ở môi trường lắc thì sẽ tạo thành các hạt nhỏ kích thước không đồng đều và phân tán khắp mọi nơi [7]. Gluconacetobacter xylinus có thể sản xuất cellulose khi được phát triển trong điều kiện hiếu khí. Cellulose do sinh vật này sản xuất rất tinh khiết và có tiềm năng sử dụng trong ngành y sinh 1.1.3. Đặc điểm sinh lí sinh hóa của Gluconacetobacter Xylinus Ngưỡng nhiệt thuận lợi cho sự phát triển của Gluconacetobacter từ 25 -35 độ C. Có khả năng chịu được pH ở nồng độ thấp [9] 1.2. Cellulose vi khuẩn 1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của cellulose vi khuẩn A.J.Brown đã trình bày sự tổng hợp cellulose của vi khuẩn Gluconacetobacter vào năm 1886. Nhưng cellulose vi khuẩn thật sự được quan tâm và được nghiên cứu nhiều là vào những năm đầu của thế kỉ XX [17]. Màng cellulose vi khuẩn có thể được tạo ra bởi một số chi vi khuẩn phổ biến: Achromobacter,Agrobacterium,Azotobacter,Sarcina,Zoogloea, Gluconacetobacter. Hiện nay họ Acetobacteriaceae có 10 chi, trong đó Gluconacetobacter là chi duy nhất có khả thể tổng hợp được cellulose [17]. Cellulose vi khuẩn được cấu tạo bởi chuỗi β – 1,4 glucopyranose, mạch thẳng, có đường kính nhỏ hơn 100Ao[17], có khả năng thấm hút cao, sự kết tinh cao (60%), độ polymer hóa lớn, độ bền cơ học cao,... [17]. 3 Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của cellulose vi khuẩn 1.2.2. Các tính chất đặc biệt - Màng cellulose có độ tinh sạch cao hơn các màng khác có khả năng phục hồi và tái sinh. - Có độ bền cơ học cao, trọng lượng thấp, lực căng tốt và kích thước màng ổn định. - Khả năng giữ nước tốt hơn các màng khác, độ ẩm cao. 1.2.3. Quá trình tạo màng cellulose vi khuẩn từ vi khuẩn Gluconacetobacter Vi khuẩn Gluconacetobacter hấp thụ chất dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào bên trong cơ thể để trao đổi chất. Điều này chỉ xảy ra trong môi trường nhiều chất dinh dưỡng như carbonhydrate, các loại vitamin như B1, B12, B2,... và các chất kích thích sinh trưởng. Một phần tổng hợp cellulose thải ra môi trường bên ngoài tạo thành màng. [7] Gluconacetobacter Xylinus sẽ thực hiện trao đổi chất bằng việc hấp thụ đường và các acid béo trong môi trường lỏng để tạo thành tiền chất tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme. 1.2.4. Ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn Màng cellulose vi khuẩn được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực của cuộc sống và đặc biệt là y học khi màng cellulose vi khuẩn có thể dùng để che phủ vết thương, chế tạo màng trị bỏng vào năm 2012 có tẩm dung dịch Becberin clorid 0,1%, không gây đau, dị ứng hay kích ứng da.[1,7,11 - 13,15 - 17,21- 23] 1.3. Lịch sử nghiên cứu 1.3.1. Trên thế giới Công trình nghiên cứu tạo màng cellulose vi khuẩn được tổng hợp từ Gluconacetobacter Xylinus được quan tâm đến từ khá sớm trên thế giới. Tuy nhiên phải đến thế kỉ thứ XX thì vấn đề này mới được quan tâm một cách rõ nét hơn nhờ vào các công trình nghiên cứu nổi trội ở thời điểm đó. Một trong những công trình 4 nghiên cứu đó không thể không kể đến công trình nghiên cứu khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn Gluconacetobacter Xylinus của Hestrin et al. vào năm 1954. Đây được coi là viên gạch đầu tiên đặt nền móng cho những nghiên cứu sau này về sự lên men tạo màng của vi khuẩn Gluconacetobacter Xylinus [26] Tiếp theo công trình nghiên cứu của Hestrin vào năm 1957, Next và Colvin đã đưa ra được minh chứng cho việc trong môi trường có ATP và đường thì Gluconacetobacter Xylinus có thể tự tổng hợp được. Ngoài ra việc nghiên cứu sử dụng màng để kiểm soát in vitro của thuốc Becberine được Huang et al. nghiên cứu và cho ra kết quả rằng thuốc đã được giải phóng chậm hơn, thí nghiệm này của ông còn được thực hiện ở trên dạ dày và ruôt cũng cho kết quả tương tự [3] 1.3.2. Tại Việt Nam Việc nghiên cứu và ứng dụng màng cellulose trong các nghành công nghiệp, y tế ở Việt Nam hiện nay vẫn còn khá mới lạ và mới thu hút được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu trong vài năm trở lại đây. Các nghiên và đề tài này vẫn còn khá ít chủ yếu là nghiên cứu dừng lại ở việc tạo màng trị bỏng, hay liên quan đến ngành thực phẩm.[7][11] 1.4. Thuốc Diclofenac Natri Diclofanac là một dẫn xuất của acid 2 – amino benzen acetic, có sinh khả dụng thấp do kém tan. Vì vậy, dạng được dùng thường là muối của nó có độ tan lớn hơn, ổn định hơn như muối: Na+, K+, diethylamin, N- ( 2- hydroxy ethyl) pyrrolidin. Trong đó muối Natri Diclofenac được sử dụng nhiều hơn cả [2] Hình 1.2. Công thức hóa học - Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2 - Loại chống viêm không steroid - Tồn tại ở nhiều loại khác nhau như viên nén, thuốc tiêm, thuốc đạn, gel bôi,...[2] 5 1.4.1. Tính chất. Dạng bột có màu trắng hoặc vàng. Dễ tan trong methanol, tan trong ethanol và ít tan trong nước. 1.4.2. Tác dụng dược lí và cơ chế tác dụng Diclofenac Natri là thuốc chống viêm không steroid có tác dụng rất tốt trong việc chống viêm, giảm đau,... ức chế sự tạo thành COX từ đó làm giảm sự tạo thành các chất trung gian của quá trình tiêu viêm [2][4] Diclofenac gây hại cho đường tiêu hóa, ức chế sự tổng hợp prostaglandin do đó có thể gây nên những bệnh liên quan đến thận như viêm thận, thận hư hay một số căn bệnh khác như hoại tử nhú, suy tim thận [2] Diclofenac hấp thụ qua đường tiêu hóa và hấp thụ nhanh vào lúc đói.Sau 2 giờ khi uống nồng độ đạt tối đa ở huyết tương, sau 4-6 giờ nồng độ trong bao hoạt dịch đạt mức cao nhất. Tác dụng của thuốc xuất hiện sau tiêm bắp từ 20- 30 phút, sau khi cho thuốc vào trực tràng từ 30-60 phút, sau khi uống từ 60-120 phút [2][4]. 1.4.3. Chỉ định - Viêm khớp mạn, thoái hóa khớp. - Thống kinh nguyên phát. - Đau cấp và đau mạn - Viêm đa khớp dạng thấp thiếu niên [2] 1.4.4. Chống chỉ định - Viêm loét dạ dày - Bệnh nhân bị hen suyễn, co thắt phế quản, chảy máu, bệnh tim,ứ máu, suy gan suy thận và những bệnh nhân mẫn cảm với các thành phần khác như aspirin hay các thuốc chống viên không steroid khác. - Người đang dùng thuốc chống đông Coumarin [2], [4] 1.4.5. Tác dụng không mong muốn của thuốc - Tác dụng phụ thường gặp: + Đau nhức đầu, trong người cảm giác bồn chồn khó chịu. 6 + Đau bụng trên, mất cảm giác muốn ăn, tiêu chảy, muốn nôn và nôn, khó tiêu, đầy bụng,... + Tăng các transaminase ở gan - Tác dụng phụ ít gặp: + Đau bụng , đi ngoài ra máu, kích ứng tại chỗ, chảy máu đường tiêu hóa,... + Dị ứng, nổi mề đay, choàng, huyết áp giảm đột ngột, viêm mũi,... + Trầm cảm, muốn ngủ, hay ngủ gật, lo lắng vô cứ, dễ kích động, người cảm thấy khó chịu bất an,... + Nổi mề đay + Co thắt phế quản + Thị lực giảm sút. + Ù tai - Tác dụng phụ hiếm gặp: + Dị ứng toàn thân, phù toàn thân,... + Viêm màng não vô khuẩn. + Giảm số lượng bạch cầu, giảm số lượng bạch cầu trung tính, giảm số lượng tiểu cầu, , tăng số lượng bạch cầu ái toan,… + Rối loạn các chức năng của gan. + Suy giảm một số chức năng của thận [4]. 7 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 2.1.1. Chủng vi sinh vật Vi khuẩn được tạo ra từ lên men dịch trà xanh nuôi cấy tại phòng thí nghiệm của viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường ĐHSP Hà Nội 2. 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu Bảng 2.1. Danh sách vật liệu sử dụng trong nghiên cứu STT Tên vật liệu Nguồn gốc 1. Thuốc Diclofenac Trung Quốc 2. Acid Acetic Việt Nam 3. D - Glucose Trung Quốc 4. Amoni sulfat Trung Quốc 5. Disodium photphate Trung Quốc 6. Acid Citric Trung Quốc 7. Cao nấm men Mỹ 8. Peptone European Union 9. Natri hidroxit Việt Nam 10. Nước cất 2 lần Viện NDKH&ƯD 11. Methanol Trung Quốc 12. Nước dừa già Viện NCKH&ƯD 13. Nước vo gạo Viện NCKH&ƯD 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ STT 1. 2. 3. 4. 5. 6. Bảng 2.2. Danh sách các thiết bị dùng trong nghiên cứu Tên thiết bị Nước sản xuất Nồi hấp khử trùng HV- 110/HIRAIAMA Nhật Bản Máy đo quang phổ UV – Vis 2450 Shimardu – Nhật Bản Cân phân tích Sartorius – Thụy Sỹ Buồng cấy vô trùng Haraeus Tủ sấy, tủ ấm Binder – Đức Khuấy từ gia nhiệt IKA – Đức Dụng cụ nghiên cứu: Bình định mức, pipet, micropipet, erlen, thiết bị lên men tạo màng kích thước 1,5cmx0,5cm và 1,5cmx1cm, buồng nuôi cấy, bình tam giác, ống nghiệm, becher,… 8 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Bố trí thí nghiệm - Thí nghiệm 1: Tạo màng cellulose từ ba môi trường: môi trường chuẩn, môi trường nước dừa và môi trường nước gạo. - Thí nghiệm 2: Xử lý màng và kiểm tra độ sạch của màng. - Thí nghiệm 3: Tính toán xác định phổ hấp thụ của thuốc Diclofenac. - Thí nghiệm 4: Dựng đường chuẩn thuốc Diclofenac. - Thí nghiệm 5: Cho màng nạp thuốc trong 2 giờ. - Thí nghiệm 6: So sánh khả năng hấp thụ thuốc ở 3 loại màng. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.2.1. Chế tạo hệ mạng lưới cellulose vi khuẩn Bước 1: Chuẩn bị môi trường [5,6,8,13,20] Bảng 2.3. Thành phần của môi trường lên men tạo màng Các loại môi trường Thành phần MT1 MT2 MT3 ( MTchuẩn) (MT dừa) (MT gạo) Glucose 20 g 20 g 20 g Pepton 5g 10 g 10 g Dinatri phosphat khan (Na2HPO4) 2,7 g Acid Ctric 1,15 g Cao nấm men 5g Nước cất 2 lần 1000 ml Diamoni photphat 0,3 g 0,3 g Amoni sulfat 0,5 g 0,5 g Nước dừa già 1000 ml Nước vo gạo 1000 ml Dịch giống 10% 10% 10% Bước 2: Hấp khử trùng ở nhiệt độ 115⁰C trong 15 phút. Bước 3: Khử trùng môi trường bằng tia UV trong 15 phút. Bước 4: Cho thêm vào môi trường 10% dịch giống, lắc đều tay. 9 Bước 5: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy, bịt kín miệng bằng gạc đã được khử trùng, đặt trong nơi tĩnh khoảng 7 – 14 ngày trong nhiệt độ 28⁰C. Bước 6: Thu hoạch màng, xử lý màng. 2.2.2.2. Xử lý màng trước khi hấp thụ và đánh giá độ sạch của màng Mục đích:Loại bỏ các chất bẩn, độc hại có trong môi trường nuôi cấy.. Phương pháp: Vi khuẩn lên men tạo màng trên bề mặt môi trường nuôi cấy. + Để giải phóng các độc tố và phá vỡ tế bào vi khuẩn đem màng đi hấp trong NaOH 3% trong thời gian 15 phút. + Vớt màng đã ngâm NaOH đặt dưới vòi nước chảy đến khi màng trắng trong. Thử quỳ tìm đến khi đạt trung tính ta thu được màng sạch [13,6] 2.2.2.2.2. Đánh giá độ sạch của màng Mục đích: Đảm bảo có thể loại bỏ vi khuẩn có hại * Tìm sự hiện diện của protein trong màng tinh chế Nguyên tắc: Xác định lượng protein còn lại trong màng bằng cách tạo kết tủa Tiến hành: Cắt nhỏ màng sạch bỏ vào 50ml nước cất và rung trong máy rung siêu âm 10 phút. Acid triclor acetic 1% sẽ phát hiện sự có mặt của protein trong dịch chiết. Mẫu dương ở đây là pepton còn mẫu âm là nước cất 2 lần. Phản ứng dương sẽ cho kết tủa đục. So sánh với mẫu âm không chứa protein [24,11]. Màng cellulose vi khuẩn đã được làm sạch dùng để tạo màng hấp thụ thuốc phải đạt được những tính chất: + Mềm, dẻo, áp sát vào da và có độ che phủ tốt. + Có khả năng hút nước và dịch mô, độ ẩm thích hợp [18] 2.2.2.3. Tìm phổ hấp thụ của thuốc diclofenac Nguyên lí: Để tìm bước sóng mà thuốc diclofenac natri hấp thụ tối đa ta dùng máy đo UV – 2450. Thực hiện: Cân 0,025g thuốc diclofenac rồi pha trong 90ml dung dịch đệm Methanol. Methanol chính là dung dịch mẫu trắng dùng để hòa tan thuốc. Giới hạn bước sóng ở khoảng 200 – 800nm, tiến hành đo 3 lần để có kết quả có độ tin cậy. 10 2.2.2.4. Cách dựng đường chuẩn diclofenac Nguyên lí:Đo quang phổ hấp thụ của thuốc diclofenac ở các nồng độ khác nhau bằng máy đo UV -2450 với bước sóng có phổ hấp thụ cao nhất. Thực hiện: Chuẩn bị mẫu diclofenac ở các nồng độ: 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100% trong dung dịch Methanol. Mẫu trắng là Methanol. Dựng đường chuẩn và lập phương trình đường chuẩn của diclofenac bằng phần mềm Excel 2010 [10]. Để có độ tin cậy cao ta lặp lại 3 lần. 2.2.2.5. Lượng thuốc mà màng hấp thụ được. Tính hiệu suất. Để xác định được lượng thuốc mà màng hấp thụ ta tiến hành trên 4 loại màng cellulose vi khuẩn ở 3 loại môi trường khác nhau. Môi trường chuẩn, nước dừa và gạo. - Mẫu 1: Màng dày 0,5 cm. Mẫu 2: Màng dày 0,5 cm ép nước 50% Mẫu 3: Màng dày 1 cm Mẫu 4: Màng dày 1cm ép nước 50% Chuẩn bị 12 bình tam giác nhỏ trong đó có chứa 12 màng và 25 mg thuốc pha trong 100ml dung dịch Methanol. Lắc các bình chứa màng trong máy lắc với tốc độ 150 vòng/ phút lần lượt trong các mốc thời gian: 0,5h ; 1h; 1,5h; 2h. Để xác định được lượng thuốc còn lại trong dung dịch tại mốc thời gian lấy mẫu ta đem mẫu đi đo quang phổ bằng máy đo UV- 2450. Từ việc xác định được lượng thuốc còn lại ta xác định được lượng thuốc hấp thụ vào màng. Lặp lại thí nghiệm 3 lần để lấy giá trị trung bình và tính toán. Thay giá trị của OD đã đo được vào phương trình đường chuẩn đã được tính toán từ trước ta được nồng độ diclofenac trong dung dịch, từ đó sẽ cho ra kết quả khối lượng diclofenac trong dung : � ��� (��) � ��� (��) C% ( ) = x 100% (1) Trong đó: C%: Nồng độ phần trăm khối lượng – thể tích chỉ số mg chất tan có trong 100ml dung dịch. Mct: khối lượng chất tan (mg) Mdd/vdd : thể tích của dung dịch (ml) 11 Công thức tính khối lượng diclofenac được màng hấp thụ: Mht = mtr – ms (2) Trong đó: mht: khối lượng diclofenac được màng hấp thụ (mg) mtr: khối lượng diclofenac ban đầu có mặt trong dung dịch (mg) ms: khối lượng diclofenac còn lại sau khi đã được hấp thụ vào màng Tỉ lệ phần trăm diclofenac được hấp thụ vào màng cellulose vi khuẩn được tính theo: EE (%) = (��−��) �� x 100% (3) Trong đó: EE: phần trăm thuốc được hấp thụ vào màng (%) Qt: lượng thuốc theo lý thuyết (mg) Qd: lượng thuốc còn lại (mg) 2.2.2.6. Xử lý thống kê Số liệu được xử lý qua phần mềm Excel 2010 và được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn. Giá trị trung bình được kiểm chứng sự chính xác thông qua phần mềm test thống kê. 12 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tạo màng cellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter Xylinus 3.1.1. Kết quả tạo chủng vi khuẩn Gluconacetobacter từ dịch trà Sau 7 -10 ngày ở nhiệt độ 28ºC thu được dịch lên men và màng nổi trên bề mặt [19,23] Hình 3.1. Dịch giống lên men sau 7 -10 ngày 3.1.2. Kết quả tạo màng cellulose vi khuẩn từ 3 môi trường Gluconacetobacter Xylinus sẽ lấy chất dinh dưỡng từ môi trường để tổng hợp màng cellulose vi khuẩn. Màng sẽ được hình thành phía trên bề mặt môi trường sau 7 – 10 ngày và đến khi màng đạt được độ dày như ý muốn thì tiến hành thu màng. 13