Tài liệu Luận văn thạc sĩ nghiên cứu biến nạp gen vào đậu tương (glycine max (l.) merrill) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ---------  -------- NGUYỄN TIẾN DŨNG Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên-2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ---------  -------- NGUYỄN TIẾN DŨNG Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60.42.30 Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: T.S. Nguyễn Văn Đồng PGS.TS. Ngô Xuân Bình Thái Nguyên-2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các quốc gia sản xuất đậu tương nhiều nhất thế giới năm 2008 ............. 5 Bảng 1.2. Số liệu thống kê sản xuất đậu tương qua các vùng khác nhau ............... 6 Bảng 1.3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam ..................................... 7 Bảng 1.4. Các chỉ thị chọn lọc dùng cho biến nạp gen ........................................... 17 Bảng 1.5 Các gen thông báo chỉ thị sinh hóa ......................................................... 20 Bảng 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy ........................................................... 38 Bảng 3.1. Khả năng phát sinh chồi của một số giống đậu tương sau 10 ngày ....... 45 Bảng 3.2. Khả năng kéo dài chồi và ra rễ tạo cây hoàn chỉnh ..................................47 Bảng 3.3. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen .............. 48 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn biến nạp đến hiệu quả biến nạp gen .... 53 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của phương thức tăng cường khả năng lây nhiễm ............... 54 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen ....... 56 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng biến nạp gen ........................ 57 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của L-cystein đến hiệu quả biến nạp gen ............................ 58 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của hygromycin đến khả năng chọn lọc sau chuyển gen ......... 59 Bảng 3.10. Hiệu quả chuyển gen vào một số giống đậu tương .............................. 62 Bảng 3.11. Số cây sau chọn lọc của một số giống đậu tương ................................. 63 Bảng 3.12. Kết quả phân tích PCR các dòng đậu tương chuyển gen với cặp mồi .. 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopin ................................................. 10 Hình 1.2. Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật ........................... 12 Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể ................................................................. 15 Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp ............................................................... 16 Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc vector pX2-H ................................................................. 31 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình tái sinh cây đậu tương ................................................... 35 Hình 2.3. Sơ đồ quy trình biến nạp gen vào đậu tương .......................................... 37 Hình 3.1. Phát sinh tạo đa chồi ở một số giống đậu tương nghiên cứu ................... 46 Hình 3.2. Phát sinh rễ của một số giống đậu tương ................................................ 48 Hình 3.3. Biểu hiện gus ở đậu tương khi được lây nhiễm với các chủng vi khuẩn .......... 49 Hình 3.4. Mẫu biến nạp plasmid pX2-H::gfp trong Agrobacterium chủng AGL1 .. 51 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi gfp ..................... 52 Hình 3.6. Chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường SIM .................................... 60 Hình 3.7. Biểu hiện của gen gfp được chuyển vào các giống đậu tương ................ 63 Hình 3.8. Kết quả điện di DNA tổng số của các dòng đậu tương ........................... 64 Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR . ............................................................ 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AS : Acetosyringone BAP : 6 - Benzylaminopurine bp : base pair (cặp bazơ) GFP : Green Fluorescent Protein DNA EDTA : : Deoxyribo Nucleic Acid Ethylene Diamine Tetraacetace Axit Et-Br gus : : Ethidium Bromide hpt MSC NAA MS : : : : Gen mã hóa hygromycin phosphotransferase Multi - Cloning Site α -Napthalene acetic acid Murashige and Skoog, 1962 LB NOS : : Luria Bertani Nopalin Sythetase OD PCR : : Optical Density (mật độ quang học) Polymerase Chain Reaction SDS TAE : : Sodium Dodecyl Sulfate Tris-Acetate-EDTA TE : Tris-EDTA T- DNA Ti-Plasmid : : Transfer DNA (ADN chuyển) Tumor inducing plasmid (plasmit gây khối u thực vật) VIR X-gluc : : Virulence region (vùng gây độc có khả năng tạo khối u) 2,4-D : Dichlorophenoxy acetic acid & cs : và cộng sự -Glucuronidase gene (gen mã hóa -glucuronidase) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronodase acid Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 2 3. Yêu cầu nghiên cứu ........................................................................................... 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................... 3 1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tƣơng ......................................................... 3 1.2. Đặc tính chống chịu của cây đậu tương ......................................................... 3 1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và tại Việt Nam ....................... 6 1.3.1.Trên thế giới .................................................................................................. 6 1.3.2. Ở Việt Nam ................................................................................................... 7 1.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển gen ................... 9 1.4.1. Agrobacterium tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen thực vật trong tự nhiên ................................................................................................................... 9 1.4.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid ........................................................ 9 1.4.3. Cấu trúc và chức năng của các đoạn T-DNA .............................................. 11 1.4.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen ........................................................... 11 1.4.5. Tương tác giữa T-DNA và genome tế bào thực vật...................................... 13 1.5. Hệ thống vector sử dụng để biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ................................................................................... 14 1.5.1. Vector nhị thể ............................................................................................... 14 1.5.2. Hệ vector liên hợp ........................................................................................ 16 1.6. Gen chỉ thị ..................................................................................................... 17 1.6.1. Chỉ thị chọn lọc ........................................................................................... 17 1.6.2 Chỉ thị sàng lọc ............................................................................................. 18 1.7. Hệ thống tái sinh và biến nạp gen ở giống đậu tƣơng .................................. 20 1.7.1. Hệ thống tái sinh ở đậu tương ..................................................................... 20 1.7.2. Phương pháp biến nạp gen ở đậu tương...................................................... 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 30 2.1. VẬT LIỆU ....................................................................................................... 30 2.1.1. Các thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ............................................................. 30 2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................... 30 2.1.3. Plasmid, primers và vi khuẩn ..................................................................... 30 2.1.4. Vật liệu thực vật................................................................................ ............. 31 2.1.5. Địa điểm nghiên cứu....................................................................................... 32 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU................................................................................ 32 2.3. Ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu..................................................................... ... 32 2.3.1. Biến nạp plasmid vào tế bào E.coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt ............. 32 2.3.2. Biến nạp plasmid vào tế bào Agrobacterium tumefaciens bằng phƣơng pháp xung điện ...................................................................................................... 33 2.3.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn ................................... 33 2.3.4. Phƣơng pháp PCR ...................................................................................... 34 2.3.5. Ph-¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel agarose 2.3.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tái sinh cây hoàn chỉnh ......................................... 35 2.3.7. Phƣơng pháp biến nạp gen vào các giống đậu tƣơng ................................ 39 2.3.8 Sàng lọc, phân tích cây chuyển gen ............................................................. 39 2.3.8.1. Sàng lọc thông qua gen chỉ thị GFP ......................................................... 39 2.3.8.2. Phân tích PCR........................................................................................... 39 2.3.9. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm, theo dõi, đánh giá và sử lý kết quả ........ 41 2.3.9.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm………………………………………….... 41 2.3.9.2. Phương pháp theo dõi, đánh giá ............................................................... .42 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 44 3.1. Kết quả đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của một số giống đậu tƣơng ..................................................................................................................... 44 3.1.1. Khả năng phát sinh chồi của một số giống đậu tương ................................ 44 3.1.2. Khả năng kéo dài chồi, ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của các giống đậu tương nghiên cứu ............................................................................................................. 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen ở đậu tƣơng . 48 3.3. Kết quả biến nạp plasmid vector pX2-H::gfp vào chủng vi khuẩn thích hợp để biến nạp vào đậu tƣơng ............................................................................ 51 3.4. Tối ƣu hóa các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả biến nạp gen ..................... 52 3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lây nhiễm............................................... 52 3.4.2. Ảnh hưởng của phương thức tăng cường khả năng lây nhiễm .................. 54 3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen .......... 55 3.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ Acetosyringon (AS) ............................................. 56 3.4.5. Ảnh hưởng của L-cystein đến khả năng biến nạp ....................................... 57 3.4.6. Ảnh hưởng của hygromycin đến khả năng chọn lọc sau chuyển gen ......... 59 3.5. Đánh giá hiệu quả chuyển gen của một số giống đậu tƣơng ....................... 61 3.5.1. Hiệu quả chuyển gen thông qua gen chỉ thị sàng lọc gfp ........................... 61 3.5.2. Kết quả tách chiết DNA tổng số và phân tích PCR các dòng đậu tƣơng chuyển gen. ............................................................................................................ 63 LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................... 67 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ .......................................... 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill.] là một trong những cây trồng có vị trí quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Ngoài giá trị dinh dưỡng trong hạt, đậu tương còn là cây trồng lý tưởng trong hệ thống luân canh do có khả năng cải tạo đất. Diện tích cây đậu tương ở nước ta 5 năm gần đây chỉ trên 170.000 ha, năng suất bình quân xấp xỉ 1,5 tấn/ha, sản lượng hạt trên 210 nghìn tấn, thấp hơn nhiều so với năng suất bình quân của thế giới [14]. Nguyên nhân chính là do năng suất của giống không cao, tổn thất do sâu bệnh hại trên đồng ruộng và sau thu hoạch lớn (hàng năm, ước tính thiệt hại về số lượng sau thu hoạch đối với đậu tương khoảng 6,2 - 14%). Diện tích đất canh tác nông nghiệp ngày càng bị thu hẹp do sự phát triển của các ngành công nghiệp và dịch vụ. Bên cạnh đó, nhu cầu về sản lượng hạt đậu tương để phục vụ cho phát triển chăn nuôi, công nghiệp chế biến ngày một tăng. Sản lượng đậu tương không đáp ứng đủ nhu cầu trong nước, do đó phải nhập khẩu từ các nước bên ngoài (năm 2009, Việt Nam nhập khẩu 2,3 triệu tấn đậu tương từ nước ngoài). Thêm nữa, những năm gần đây khí hậu toàn cầu đang có dấu hiệu thay đổi phức tạp. Hiện tượng trái đất nóng lên đã làm cho tình hình hạn hán, lũ lụt ngày càng trở nên nghiêm trọng. Việt Nam là một trong những nước sẽ chịu nhiều ảnh hưởng. Dự kiến, nếu mực nước biển dâng cao 1 mét, Việt Nam sẽ mất hơn 12% diện tích đất đai, nơi cư trú của 23% số dân. Nguồn nước và sản xuất nông nghiệp bị ảnh hưởng nghiêm trọng. Cùng với đó là sự gia tăng của dịch hại đã tác động không nhỏ đến cây trồng nói chung và đậu tương nói riêng. Để tăng sản lượng đậu tương, ngoài mở rộng thêm diện tích trong cơ cấu luân canh thì việc tăng năng suất là giải pháp chính. Sử dụng giống đậu tương biến đổi gen là một tiến bộ quan trọng trong ngành sản xuất đậu tương của thế giới hiện nay. Ở nước ta, đậu tương, ngô và bông là 3 cây trồng đang được nghiên cứu để tạo cây chuyển gen. Một số phòng thí nghiệm của các Viện nghiên cứu đã có những báo cáo kết quả nghiên cứu cây chuyển gen của Việt Nam như đậu tương [7], [8], ngô [4]. Tuy nhiên đó mới chỉ là các kết quả nghiên cứu ban đầu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 Việc tạo giống đậu tương biến đổi gen đòi hỏi phải nghiên cứu một cách có hệ thống. Trong phạm vi đề tài, chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu biến nạp gen vào đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu biến nạp gen vào một số giống đậu tương của Việt Nam 3. Yêu cầu nghiên cứu - Lựa chọn giống đậu tương làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển nạp gen - Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen ở đậu tương - Đánh giá hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc vector pX2-H Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tƣơng Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm được xác minh. Những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công nhận rằng đậu tương có nguyên sản ở Châu Á và có nguồn gốc từ Trung Quốc. Cây đậu tương được thuần hóa ở Trung Quốc qua nhiều triều đại và được đưa vào trồng trọt và khảo sát ở triều đại Shang (năm 1700 – 1100 B.C) trước công nguyên. Do xuất phát từ những yêu cầu, căn cứ vào tiêu chí phân loại khác nhau nên cũng có nhiều cách phân loại đậu tương. Nhưng đến nay, hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm về hình thái, phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể được nhiều người sử dụng [63]. Theo hệ thống này ngoài chi Glycine còn có thêm chi phụ Soja. Chi Glycine được chia ra thành 7 loài hoang dại lâu năm, và chi phụ Soja được chia ra làm 2 loài: loài đậu tương trồng Glycine (L.) Merrill và loài hoang dại hàng năm G. Soja Sieb và Zucc. Đậu tương thuộc chi Glycine, họ đậu Leguminosae, họ phụ cánh bướm Papilionoideae và bộ Phaseoleae. Đậu tương có tên khoa học là Glycine Max (L.) Merrill [2], [67]. 1.2. Đặc tính chống chịu của cây đậu tương  Đặc tính chịu hạn Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng là cây có nhu cầu về nước cao hơn các loại cây khác. Đó chính là do đậu tương có hàm lượng protein và lipit cao, để tổng hợp 1 kg chất khô cần 500-530 kg nước. Trong quá trình nảy mầm nhu cầu về nước của đậu tương chiếm 50% khối lượng hạt, trong khi đó ở ngô chỉ là 30%, lúa là 26% [2], [9]. Khi nghiên cứu các đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phương diện sinh lý và di truyền đã cho thấy các đặc tính này liên quan liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất. Khả năng chịu hạn của cây đậu tương mang tính đa gen [9]. Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau như: sự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 phát triển của bộ rễ [16], [69], thời gian sinh trưởng [113], cũng như bản chất di truyền của từng giống. Căn cứ vào đặc điểm này, đậu tương được chia thành hai nhóm : - Nhóm chịu được sự mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây. - Nhóm chịu được sự thiếu nước trong tất cả giai đoạn phát triển của cây. Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có nhiều thành công khi nghiên cứu sâu hơn về tính chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương. Maitra và Cushman (1994) đã phân lập được cDNA của dehydrin từ lá đậu tương khi bị mất nước, ngoài ra các tác giả còn phân lập được cDNA của LEA (late embryogeis abudant protein) nhóm D-95 từ lá và rễ cây đậu tương khi bị hạn. Nguyễn Thu Hiền và cộng sự (2005) đã nghiên cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh và phân lập được gen dehydrin từ một số giống đậu tương của Việt Nam [5]. Các tác giả khác đã nghiên cứu khả năng chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương, tiêu biểu là công trình đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập nội của Nguyễn Huy Hoàng (1992) [9], nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen chaperonin tế bào chất từ giống đậu tương đột biến M103; phân lập gen dehydrin liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương của Trần Thị Phương Liên (1999) [10], Nguyễn Thu Hiền và cộng sự (2005) [5]. Nâng cao tính chịu hạn của cây đậu tương bằng phương pháp đột biến thực nghiệm của Chu Hoàng Mậu (2001) [12].  Đặc tính chống chịu sâu bệnh hại Một nhóm các nhà khoa học tại Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, đại học bang Iowa (ISU) và Brazil đã xác định được nhóm gen có khả năng kháng nấm Phakopsora pachyrhizi gây bệnh rỉ sắt đậu tương châu Á (ASR). Khám phá này giúp bảo vệ đậu nành chống lại bệnh ARS thông qua nhân giống truyền thống hay phương pháp công nghệ sinh học [22]. Ở Châu Á, bệnh rỉ sắt trên lá đậu tương là loại bệnh nghiên trọng, là một trong những nguyên nhân chính làm suy giảm năng suất. Nguyên nhân gây ra bệnh rỉ sắt hiện nay đã được xác định do hai loại nấm khác nhau gây nên (Phakopsora pachyrhizi và Phakopsora meibomiae). Loại nấm Phakopsora pachyrhizi thường gây bệnh trên đậu tương ở khu vực Châu Á hoặc Châu Úc [22]. Năm 1902, lần đầu tiên bệnh rỉ sắt ở đậu tương được phát hiện tại Nhật và cũng là trở ngại cho các nước khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Không lâu sau đó, loại nấm Phakopsora pachyrhizi nhanh chóng lan Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 rộng ra các vùng trồng đậu tương trên toàn thế giới. Một loạt các nước phát hiện ra loại bệnh này như Hawaii (1994), Zimbabwe (1998), Paraquay (2001) và nhiều nước khác thuộc khu vực Châu Phi, Nam Mỹ. Thống kê ở các nước trồng đậu tương trên thế giới đã xác định năng suất đậu tương bị suy giảm do loại bệnh rỉ sắt gây ra khoảng từ 10 đến 80% tùy từng mùa vụ, điều kiện thời tiết, kỹ thuật canh tác và giống đậu tương gieo trồng. Ở Việt Nam, Pham và cộng sự (2009) [111] đã đánh giá khả năng kháng bệnh rỉ sắt của 63 giống đậu tương (trong đó có 3 giống của Việt Nam) qua năm mùa vụ khác nhau từ 2005 đến 2009 đã xác định được giống DT2000 và Vàng Hà Giang là 2 giống có khả năng kháng bệnh rỉ sắt tốt nhất. 1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và tại Việt Nam 1.3.1.Trên thế giới Đậu tương là cây lương thực giàu hàm lượng protein (44%), lipid (12,5 – 25%) và glucid (10 – 15%) được trồng làm thức ăn cho người và gia súc. Trong hạt đậu tương có chứa đầy đủ các axít amin cơ bản như isoleucin, leucin, lycin, methionin, phenylalanin, tryptophan và valin. Cây đậu tương dễ trồng, có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất các cây trồng khác do hoạt động cố định đạm của loài vi khuẩn Rhizobium cộng sinh trên dễ cây đậu. Do khả năng thích ứng khá rộng, cây đậu tương đã được trồng khắp năm châu lục, tập trung nhiều nhất là châu Mỹ 75,68%, tiếp đến là châu Á 21,27% và một số nước khác trên thế giới [42]. Bảng 1.1. Các quốc gia sản xuất đậu tƣơng nhiều nhất thế giới năm 2008 Quốc gia TT Diện tích (Triệu ha) Sản lƣợng (Triệu tấn) 1 Mỹ 30,20 80,50 2 Brazil 21,30 60,00 3 Argentina 16,40 46,20 4 Trung Quốc 9,13 15,50 5 Ấn Độ 9,60 9,04 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 6 Paraguay 2,64 6,80 7 Canada 1,20 3,34 8 Bolivia 0,96 1,60 96,87 230,95 Tổng số trên toàn thế giới (Nguồn: Food & Agriculture Organisation, 2009) 1.3.2. Ở Việt Nam Một số tài liệu cho rằng cây đậu tương được đưa vào trồng ở nước ta từ thời vua Hùng và xác định cây đậu tương được trồng trước cây đậu xanh và cây đậu đen [1]. Ngày nay đậu tương đã trở nên quen thuộc và trồng rộng rãi trên cả nước. Tuy nhiên đậu tương trồng ở nước ta chủ yếu là sử dụng làm thực phẩm mang tính tự cung tự cấp. Trong những năm gần đây, cây đậu tương đã phát triển khá nhanh cả về diện tích và năng suất góp phần tạo ra mặt hàng tiêu dùng quan trọng. Tình hình sản xuất đậu tương trong nước mấy năm gần đây được trình bày trong bảng 1.2 và 1.3. Bảng 1.2. Số liệu thống kê sản xuất đậu tƣơng qua các vùng khác nhau ở Việt Nam, năm 2008 STT Vùng canh tác Diện tích Năng suất Sản lƣợng ( ha) (kg/ha) (tấn/năm) 1 Vùng trung du và miền núi phía Bắc 64100 1152,9 73900 2 Vùng Đồng Bằng Sông Hồng 70100 1440,8 101000 3 Vùng Bắc Trung Bộ và duyên hải miền Trung 4400 1431,8 6300 4 Vùng Tây Nguyên 25000 1768 44200 5 Vùng Đông Nam Bộ 1800 1166,7 2100 6 Vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long 6900 2246,4 15500 191500 1400,0 268600 Tổng số (Nguồn: Niêm giám thống kê 2008, NXB Thống kê Hà Nội, 2009) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6 Về diện tích: Diện tích gieo trồng đậu tương của nước ta chiếm tỉ lệ nhỏ trong tổng diện tích gieo trồng (khoảng 1,5 – 1,6%). Những năm gần đây diện tích trồng đậu tương có xu hướng giảm xuống, nếu lấy năm 2005 làm mốc thì đến năm 2009 diện tích đã giảm 57,7 nghìn ha (bảng 1.3). Về năng suất: năng suất đậu tương bình quân của nước ta rất thấp chỉ đạt khoảng trên 50% so với năng suất bình quân trên thế giới. Tuy nhiên, nhờ những nỗ lực rất lớn của các nhà khoa học trong công tác nghiên cứu chọn tạo giống và các biện pháp canh tác, năng suất đậu tương trong 5 năm gần đây đã tăng từ 1,34 tấn/ha (2004) lên 1,46 tấn/ha (2009). Hiện nay, cả nước đã hình thành 6 vùng sản xuất đậu tương (bảng 1.2). Trong đó vùng Đồng bằng Sông Hồng có diện tích lớn nhất, chiếm 36,6% diện tích đậu tương cả nước; tiếp đến là vùng Trung du miền núi phía bắc (chiếm 33,47%), vùng Tây Nguyên (chiếm 13%), vùng đồng bằng sông Cửu Long 5,7%. Về sản lượng: sản lượng đậu tương của vùng đồng bằng sông Hồng và Trung du miền núi phía Bắc chiếm hơn 65% sản lượng đậu tương cả nước. Vùng đồng bằng sông Cửu Long chỉ chiếm khoảng 3,6% diện tích nhưng năng suất bình quân cao nhất cả nước đạt trên 22 tạ/ha, sản lượng chiếm 5,7% sản lượng của cả nước (bảng 1.2). Bảng 1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam trong những năm gần đây (2004 – 2009) Năm Diện tích (Nghìn ha) Năng suất (Tấn/ha) Sản lƣợng (Nghìn tấn) 2004 183,8 1,34 245,9 2005 204,1 1,43 292,7 2006 185,6 1,39 258,1 2007 187,4 1,47 257,2 2008 191,5 1,40 268,6 2009 146,4 1,46 213,6 (Nguồn: Niêm giám thống kê 2009, NXB Thống kê Hà Nội, 2010) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 Cùng với nhịp độ tăng dân số, vấn đề sức khỏe của người tiêu dùng được chú trọng. Xu hướng sử dụng dầu thực vật để thay thế mỡ động vật trong chế biến thức ăn ngày càng tăng. Hạt đậu tương là một trong những loại nguyên liệu chính được sử dụng để sản xuất dầu thực vật và là nguồn cung cấp protein cho con người. Việt Nam đã đặt ra mục tiêu tăng sản lượng đậu tương lên đến 50 triệu tấn/năm vào năm 2010. Tuy nhiên, sản lượng đậu tương khó tăng nhanh trong những năm tới do năng suất còn thấp, chi phí cho hóa chất trừ sâu hại cao, làm hạn chế khả năng tăng năng suất, tăng mùa vụ và diện tích gieo trồng của đậu tương. 1.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển gen vào cây trồng 1.4.1. Agrobacterium tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen thực vật trong tự nhiên Những năm đầu thế kỷ 20, Smith và Townsend đã phát hiện ở một số cây hai lá mầm xuất hiện những khối u và tác nhân gây bệnh chính là vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens. Đến cuối những năm 1960, mối quan hệ giữa khối u và vật liệu di truyền trong loài vi khuẩn này đã được Braun và Schilperoort khám phá. Agrobacterium tumefaciens có khả năng xâm nhiễm vào thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết thương của cây chủ. Trong tự nhiên, Agrobacterium chủ yếu tấn công vào cây hai lá mầm, đặc biệt là nhóm thực vật có hoa. Một vài loài cây một lá mầm thuộc họ hành tỏi và thủy tiên mẫm cảm yếu với Agrobacterium tumefaciens [27]. Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thường, khối u do vi khuẩn Agrobacterium sinh ra phát triển mạnh ngay trong điều kiện không có hormone sinh trưởng (auxin và cytokinin). Sở dĩ như vậy là do Agrobacterium đã chuyển một đoạn DNA (T-DNA) sang tế bào thực vật và T-DNA đã điều khiển quá trình tổng hợp các chất đó [49], [59]. Ngoài ra, khối u còn tổng hợp opin là các amino axit đặc biệt và các dẫn xuất của đường. Dạng opin được tổng hợp có thể là nopalin, octopin, agrocinopin, mannozapin hay agropin phụ thuộc vào từng chủng Agrobacterium điều khiển quá trình tổng hợp các chất đó. Trong đó nopalin và octopin là hai dạng opin phổ biến nhất. opin được vi khuẩn sử dụng thay cho nguồn cacbon và nitơ nhờ vào gen hoạt động chuyển hóa opin trên plasmid gây khối u thực vật (tumour inducing plasmid – Ti plasmid) [59]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 8 Cơ chế phân tử của sự hình thành khối u đã được quan tâm nghiên cứu nhằm tìm ra phương thức phòng trừ bệnh cho cây. Tuy nhiên, khi phát hiện ra Ti-plasmid và khả năng tự chuyển T-DNA vào genome thực vật người ta đã đặc biệt chú ý và khai thác sử dụng chúng như một vector tự nhiên để chuyển gen quan tâm vào thực vật nhằm tạo ra cây trồng mang những tính trạng mong muốn [49], [59]. 1.4.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid Ti-plasmid được phát hiện ở tất cả các chủng Agrobacterium tumefaciens gây nhiễm và tồn tại bền vững ở nhiệt độ dưới 30 oC. Đây là một phân tử DNA dạng mạch vòng, sợi kép và tồn tại trong tế bào như một đơn vị sao chép độc lập, có kích thước khoảng 200 kb [47]. Phân tích di truyền cho thấy, Ti-plasmid dạng octopin và dạng nopalin là hai dạng phổ biến nhất, có 4 vùng tương đồng, trong đó vùng T- DNA và vùng gây độc (Virulence Region – vùng Vir), liên quan trực tiếp tới sự hình thành khối u ở thực vật. Vùng gây độc có chứa các gen mã hóa các protein/enzyme Vir. Có 9 loại protein Vir là A, B, C, G, B1 – 11, D1 – 2, E1 – 2, F, H, J/AcvB [47], [59]. Các protein Vir này có vai trò quan trọng trong việc chuyển T- DNA sang tế bào thực vật. Hai vùng còn lại chứa gen mã hóa cho việc sao chép plasmid và chuyển nạp. Trên Ti-plasmid, chỉ có vùng T – DNA được chuyển từ vi khuẩn sang genome của các cây bị bệnh và tồn tại bền vững ở trong đó. Tuy nhiên, vùng này lại không mã hóa những sản phẩm trung gian cho quá trình chuyển T – DNA mà cần có sự trợ giúp đặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng Vir và trên nhiễm sắc thể vi khuẩn. Vùng Vir dài khoảng 40 kb đảm nhiệm chức năng gây nhiễm. Ở Ti-plasmid dạng octopin, vùng Vir chứa tới 24 gen gây độc. Sản phẩm protein do các gen này mã hóa đã kích thích sự tách biệt T – DNA, bao bọc che chở và giúp chúng tiếp cận với genome cây chủ [59]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 9 Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopin 1.4.3. Cấu trúc và chức năng của các đoạn T-DNA Kết quả phân tích trình tự gen trên T – DNA ở các Ti-plasmid khác nhau cho thấy, T – DNA được giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần như hoàn toàn từ khoảng 25bp và gọi là đoạn biên. Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển T – DNA và xâm nhập của T – DNA vào tế bào thực vật. Ở đoạn biên bên phải (Right border – RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình chuyển T – DNA. Đoạn bên trái (Left border – LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyển T – DNA và là dấu hiệu để quá trình này kết thúc bình thường [6], [47]. Ti-plasmid dạng nopalin, T – DNA xâm nhập vào genome thực vật ở dạng một đoạn liên tục dài 22 kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopin, T – DNA là một đoạn gen liên tục dài 13 kb. T – DNA mang rất nhiều gen như: (1) các gen mã hóa những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) các gen gây khối u như tms1, tms2, tmr mã hóa cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin [47], [59]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10