Tài liệu Nghiên cứu bệnh do streptococcus iniae gây ra trên cá chẽm (lates calcarifer) và biện pháp phòng bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRƯƠNG THỊ HOA NGHIÊN CỨU BỆNH DO Streptococcus iniae GÂY RA TRÊN CÁ CHẼM (Lates calcarifer) VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Mã ngành 9620301 Cán bộ hướng dẫn PGS. TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Cần Thơ, 2019 LỜI CẢM TẠ Kính gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Huế, Ban Chủ nhiệm Khoa Thủy sản và Bộ môn Bệnh thủy sản đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành chương trình đào tạo tiến sĩ tại Trường Đại học Cần Thơ. Trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban lãnh đạo Khoa Sau đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Thủy sản, quý Thầy, Cô Khoa Thủy sản và Bộ môn Bệnh học Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập, nghiên cứu, nâng cao trình độ chuyên môn và hoàn thành chương trình học trong thời gian qua. Trân trọng cảm ơn Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Huế và dự án VLIR - Network – Việt Nam đã hỗ trợ nguồn kinh phí giúp tôi hoàn thành chương trình đào tạo tiến sĩ. Đặc biệt, xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Đặng Thị Hoàng Oanh đã dành thời gian quý báu, luôn sẵn sàng hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và hoàn thành luận án này. Xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô và các anh, chị, em trong Khoa Thủy sản và Bộ môn Bệnh Thủy sản Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Huế đã giúp đỡ, chia sẽ những khó khăn, khuyến khích và động viên tôi hoàn thành chương trình học; đặc biệt, xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Ngọc Phước đã luôn sẵn sàng hướng dẫn và hỗ trợ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Và xin cảm ơn tất cả các bạn nghiên cứu sinh và các em sinh viên đã luôn hỗ trợ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu. Cuối cùng, xin trân trọng biết ơn gia đình và người thân đã dành cho tôi tất cả tình yêu và sự ủng hộ để tôi có đủ nghị lực hoàn thành chương trình học. Xin trân trọng cảm ơn tất cả! TRƯƠNG THỊ HOA i TÓM TẮT Streptococcus iniae là một trong những tác nhân vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên động vật thuỷ sản đặc biệt trên các loài cá nuôi ở nước mặn, lợ, ngọt. Nghiên cứu được thực hiện nhằm: (i) xác định đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn S. iniae trên cá chẽm; (ii) tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá dìa, chẽm, rô phi có tính đối kháng với vi khuẩn S. iniae và (iii) xác định một số chỉ tiêu huyết học và khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh cá chẽm khi có sử dụng vi khuẩn lactic. Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 42 chủng vi khuẩn từ 87 mẫu cá chẽm bị bệnh xuất huyết và định danh là S. iniae bằng phương pháp sinh hóa, khuếch đại đoạn gen đặc hiệu và giải trình tự đoạn gen được khuếch đại. Kết quả gây bệnh thực nghiệm 2 chủng S. iniae HTA1 và HTA3 trên cá chẽm giống xác định giá trị LD50 của 2 chủng HTA1 và HTA3 lần lượt là 1,9x105 CFU/mL và 1,5x105CFU/mL. Sau 48 giờ cảm nhiễm với 2 chủng HTA1 và HTA3, cá chẽm có dấu hiệu bơi lờ đờ trên mặt nước, xuất huyết trên da và gốc vây, mắt lồi và xuất huyết. Sau 72 giờ, cá bắt đầu chết và tỉ lệ chết tích lũy cao nhất sau 8 ngày là 76,7% (chủng HTA1) và 80% (chủng HTA3). Trong khi đó ở lô đối chứng, cá không thể hiện dấu hiệu bệnh lý, không chết và không tái phân lập được vi khuẩn S. iniae. Kết quả nghiên cứu mô học cá chẽm cảm nhiễm S. iniae trong điều kiện thực nghiệm cho thấy vi khuẩn S. iniae gây xuất huyết và hoại tử trên các mô gan, thận, lách và não cá. Tổng cộng có 61 chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ ruột cá rô phi, chẽm và dìa thu tại Thừa Thiên Huế. Các chủng vi khuẩn này đều là vi khuẩn Gram dương, hình que hoặc hình cầu, không hình thành bào tử, không di động, phản ứng catalase và oxidase âm tính, có khả năng phân giải CaCO3 và không làm tan chảy gelatin. Trong 61 chủng vi khuẩn lactic có 28 chủng có khả năng kháng S. iniae, trong đó 3 chủng C21, D1 và D7 có khả năng kháng mạnh. Kết quả định danh 3 chủng C21, D1 và D7 bằng phương pháp khuếch đại đoạn gen đặc hiệu và giải trình tự đoạn gen được khuếch đại, xác định 3 chủng trên là Lactobacillus fermentum. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của việc bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào thức ăn đến các chỉ tiêu huyết học và khả năng kháng S. iniae của huyết thanh cá chẽm được bố trí với 4 nghiệm thức và 3 lần lặp. Nghiệm thức đối chứng âm (NT 1): Không bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào thức ăn và không cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae vào xoang bụng cá; Nghiệm thức đối chứng dương (NT 2): Không bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào thức ăn và ii cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae vào xoang bụng cá sau 14 ngày thí nghiệm với liều tiêm là 1,9x105 CFU/mL/cá; Nghiệm thức thí nghiệm 1 (NT 3): Bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào thức ăn, mật độ 109 CFU/g thức ăn và không cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae; Nghiệm thức thí nghiệm 2 (NT 4): Bổ sung vi khuẩn L. fermentum vào thức ăn, mật độ 109 CFU/g thức ăn và cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae vào xoang bụng cá sau 14 ngày cho ăn với liều tiêm là 1,9x105 CFU/mL/cá. Tỷ lệ sống của cá được theo dõi ngay sau khi cảm nhiễm S. iniae đến 14 ngày sau cảm nhiễm. Các chỉ tiêu huyết học và khả năng kháng S. iniae của huyết thanh cá chẽm được đánh giá vào 1, 14, 21 và 28 ngày thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, đến ngày thứ 14 (trước khi gây cảm nhiễm S. iniae) số lượng tế bào hồng cầu và tổng bạch cầu của cá ở NT 3 và NT 4 cao hơn so với NT 1 và NT 2 (p<0,05). Đến ngày thứ 28 (sau khi gây cảm nhiễm S. iniae), số lượng hồng cầu của cá ở NT 2 thấp hơn so với NT 4 (p<0,05); số lượng tổng bạch cầu của cá ở NT 2, NT 3 và NT 4 cao hơn NT 1 (p<0,05). Khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh cá chẽm ở NT 4 cao hơn có ý nghĩa thống kê so với NT 1 và NT 2 (p<0,05). Kết quả xác định hoạt tính lysozyme của huyết thanh cá chẽm cho thấy ở NT 3 và NT 4, sau 14 ngày bổ sung L. fermentum vào thức ăn, hoạt tính lysozyme cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với NT 1 và NT 2. Sau khi cảm nhiễm S. iniae ở NT 2 và NT 4, hoạt tính lysozyme ở NT 4 cao hơn nhưng không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với NT 2 (p>0,05). Tỷ lệ sống của cá sau 14 ngày cảm nhiễm S. iniae, ở NT 2 và NT 4 lần lượt là 23,7% và 52,3%. Tỷ lệ bảo hộ khi bổ sung L. fermentum vào thức ăn là 37,5%. Từ khóa: Cá chẽm (Lates calcarifer), huyết học, Lactobacillus fermentum, Streptococcus iniae iii ABSTRACT Streptococcus iniae is one of the most popular bacterial pathogens in aquatic animals, especially in marine, brackish and freshwater farmed fish. This study aimed to: (i) determine the pathogenic characteristics of Streptococcus iniae on barramundi; (ii) isolate and select the lactic acid bacteria recovered from the intestinal tracts of rabbit fish, barramundi, tilapia which antagonistic to S. iniae; and (iii) determine the haematological charateristics and the antagonistic activities of barramundi serum to S. iniae when lactic acid bacteria added. The results showed that 42 bacterial isolates from 87 infected barramundi samples were recovered and identifed as S. iniae via biochemical tests, specific 16S rRNA amplification and sequencing. The results of challenged tests of 2 isolates S. iniae HTA1 and HTA3 on barramundi indicated the LD50 of 2 isolates HTA1 and HTA3 were 1.9x105 CFU/mL and 1.5x105 CFU/mL, respectively. After 48h challenged with the HTA1 or HTA3 strains by i.p injection, fish showed the typical clinical signs of diseases such as anorexia, haemorrhagic on body and fins as well as exophthalmia and haemorrhagic on eyes. After 48h i.p injection challenged, the mortality was observed. The cumulative mortality was the highest at 8 days post challenged, accounted for 76.7% (HTA1 isolate) and 80% (HTA3 isolate). Fish was healthy and no mortality was observed in the control group, as well as no S. iniae were recovered. Necrosis and haemorhagic were observed in liver, kidney, spleen and brain in S. iniae infected barramundi under experimental condition. A collection of 61 lactic acid bacterial isolates were recovered from the intestinal tracts of rabbit fish, barramundi, tilapia in Thua Thien Hue province. All isolates were Gram positive, rod or cocci-shaped bacterium, no spore formation, non-mobile, negative for catalase and oxidase, CaCO3 degration and no gelatin liquidation. Within the collection of these 61 lactic acid bacterial isolates, 28 isolates antagonistic to S. iniae, especially, the 3 isolated of C21, D1 and D7 showed strong antagonistic activity to S. iniae. The 3 isolated of C21, D1 and D7 were identified via specific 16S rRNA amplification and sequencing. The results showed that they are Lactobacillus fermentum. The experiment to determine the effect of L. fermentum supplement to the barramundi diet to the haematology profile and the antagonistic ability of iv barramundi serum to S. iniae were designed in 4 treatments with triplicates. The negative control (NT 1): no L. fermentum supplement to the barramundi diet and no S. iniae i.p injection. The positive control (NT 2): no L. fermentum supplement to the barramundi diet and S. iniae i.p injection to the barramundi cavity after 14 days with the dose of 1.9x105 CFU/mL/fish. The treatment 1 (NT 3): L. fermentum supplement to the barramundi diet at 109 CFU/g in feed and no S. iniae i.p injection. The treatment 2 (NT 4): L. fermentum supplement to the barramundi diet at 109 CFU/g in feed for 14 days before i.p injection to the barramundi with the dose of 1.9x105 CFU S. iniae /mL/fish. Blood samples were colleted on day 1, 14, 21 and 28 for hamatological analysis and the ability of fish serum collected to identify the against of S. iniae. The results showed that the number of reb blood cells and total white blood cells of fish in NT 3 and NT 4 on day 14 (before challenged to S. iniae) were significantly higher than those from NT 1 and NT 2 (p<0.05). After challenged to S. iniae, the number of reb blood cells of fish in NT 4 was significantly higher than that from NT 2 on day 28; the number of total white blood cells of fish in NT 2, NT 3 and NT 4 were significantly higher than those from NT 1 on day 28 (p<0.05). The antagonistic ability of barramundi serum to S. iniae from NT 4 was significantly higher than those from NT 1 and NT 2 (p<0.05). The lysozyme activity of fish in NT3 and NT 4 treatments were significantly higher than those in NT 1 and NT 2 treatments (p<0.05). The lysozyme activity of fish in NT 4 treatment was not significantly higher than those in NT 2 treatment (p>0.05). The survival rate of fish in NT 2 and NT 4 treatments were 23.7% and 52.3%, respectively. The relative percentage of survival with L. fermentum supplement to the barramundi diet was 37.5%. Keywords: Barramundi, haematology, Lactobacillus fermentum, Streptococcus iniae v CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc ---------------------------- LỜI CAM KẾT Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác. Cần Thơ, ngày 03 tháng 10 năm 2019 Người hướng dẫn Nghiên cứu sinh PGS.TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH vi TRƯƠNG THỊ HOA MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ..................................................................................................... i TÓM TẮT .......................................................................................................... ii ABSTRACT...................................................................................................... iv LỜI CAM KẾT ................................................................................................. vi MỤC LỤC ....................................................................................................... vii DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................... xi DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................... xiii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT…………………………………………….…..xv Chương 1 GIỚI THIỆU .................................................................................. 1 1.1 Giới thiệu .................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................. 3 1.3 Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 3 1.4 Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 3 1.5 Ý nghĩa của nghiên cứu ............................................................................ 3 1.6 Điểm mới của luận án............................................................................... 4 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 5 2.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và Việt Nam .................................. 5 2.1.1 Trên thế giới ....................................................................................... 5 2.1.2 Ở Việt Nam ........................................................................................ 6 2.2 Một số bệnh thường gặp trên cá chẽm ..................................................... 8 2.2.1 Bệnh do virus ..................................................................................... 8 2.2.2 Bệnh do vi khuẩn ............................................................................... 9 2.2.3 Bệnh do ký sinh trùng ...................................................................... 10 2.3. Tổng quan về bệnh do vi khuẩn S. iniae trên cá ................................... 11 2.3.1. Tình hình dịch bệnh do vi khuẩn S. iniae trên cá ........................... 11 2.3.1.1 Trên thế giới .................................................................................. 11 2.3.1.2 Ở Việt Nam ................................................................................... 12 2.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của S. iniae ....................... 13 2.3.2.1 Hệ thống phân loại ..................................................................... 13 2.3.2.2 Đặc điểm hình thái ..................................................................... 13 2.3.2.3 Đặc điểm sinh lý và sinh hóa ..................................................... 15 2.3.3 Đặc điểm bệnh lý ............................................................................. 17 vii 2.3.4 Con đường lan truyền và xâm nhập của vi khuẩn S. iniae trên cá ... 20 2.3.5 Độc lực và cơ chế gây bệnh ............................................................. 21 2.3.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh của vi khuẩn S. iniae ................................................................................................................... 22 2.3.7 Phương pháp chẩn đoán ................................................................... 23 2.3.8 Biện pháp phòng và trị bệnh ............................................................ 24 2.4 Hệ miễn dịch không đặc hiệu ở cá ......................................................... 26 2.4.1 Hàng rào vật lý ................................................................................. 26 2.4.2 Hàng rào hóa học ............................................................................. 27 2.4.3 Hàng rào tế bào ................................................................................ 27 2.5 Đặc điểm huyết học ở cá ........................................................................ 28 2.5.1 Hồng cầu .......................................................................................... 29 2.5.2 Bạch cầu ........................................................................................... 29 2.5.3 Tiểu cầu ............................................................................................ 30 2.6 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để phòng bệnh trên cá ... 31 2.6.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn lactic ............ 31 2.6.2 Vai trò và cơ chế tác động của vi khuẩn lactic ................................ 34 2.6.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để phòng bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá .................................................................................. 36 2.6.3.1 Một số vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh trên cá .......................................................................... 36 2.6.3.2 Sử dụng vi khuẩn lactic để phòng bệnh trên cá…...…………..38 Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………..……40 3.1 Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 40 3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................... 40 3.3 Phương tiện nghiên cứu.......................................................................... 40 3.3.1 Dụng cụ và thiết bị ........................................................................... 40 3.3.2 Hóa chất và môi trường.................................................................... 41 3.4 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 42 3.4.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn S. iniae trên cá chẽm .............................................................................................. 42 3.4.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn S. iniae gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm ....................................................................................................... 42 viii 3.4.1.2 Xác định khả năng gây bệnh thực nghiệm của vi khuẩn S. iniae ............................................................................................................... 48 3.4.1.3 Xác định đặc điểm mô bệnh học của cá chẽm cảm nhiễm S. iniae ............................................................................................................... 51 3.4.2 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic từ ruột một số loài cá nước lợ có khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae ........................................................ 51 3.4.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ ruột cá chẽm, cá dìa và cá rô phi .......................................................................................................... 52 3.4.2.2 Xác định khả năng đối kháng với vi khuẩn S. iniae của vi khuẩn lactic ....................................................................................................... 54 3.4.2.3 Định danh các chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn S. iniae .................................................................... 54 3.4.3 Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của việc bổ sung chủng vi khuẩn lactic vào thức ăn đến một số chỉ tiêu huyết học và khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh cá chẽm ................................................... 55 3.4.3.1 Cá chẽm thí nghiệm ................................................................... 55 3.4.3.2. Chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm……………………………...…55 3.4.3.3 Bố trí thí nghiệm ........................................................................ 56 3.4.3.4 Phương pháp xác định các chỉ tiêu huyết học ........................... 57 3.4.3.5 Xác định khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh ... 59 3.4.3.6 Xác định hoạt tính lysozyme trong huyết thanh ........................ 59 3.4.3.7 Phương pháp xác định tỷ lệ sống của cá ................................... 60 3.5 Xử lý số liệu ........................................................................................... 60 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 61 4.1 Đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn S. iniae trên cá chẽm...................... 61 4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn S. iniae trên cá chẽm ............................. 61 4.1.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn ......................................................... 61 4.1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm ......................................................... 63 4.1.2 Khả năng gây bệnh thực nghiệm của S. iniae trên cá chẽm ............ 67 4.1.2.1 Kết quả xác định độc lực vi khuẩn ............................................ 67 4.1.2.2 Kết quả xác định LD50 của S. iniae trên cá chẽm.......................68 4.1.2.3 Kết quả gây bệnh thực nghiệm .................................................. 68 ix 4.1.2.4 Đặc điểm mô bệnh học của cá chẽm cảm nhiễm S. iniae ......... 71 4.2 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng vi khuẩn S. iniae từ ruột một số loài cá nước lợ.......................................................... 77 4.2.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn lactic..................................... 77 4.2.2 Kết quả xác định khả năng đối kháng với vi khuẩn S. iniae của vi khuẩn lactic ............................................................................................... 80 4.2.3 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn S. iniae........................................................................ 82 4.3 Ảnh hưởng của việc bổ sung chủng vi khuẩn lactic vào thức ăn đến một số chỉ tiêu huyết học và khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh cá chẽm ......................................................................................................... 83 4.3.1 Kết quả xác định các chỉ tiêu huyết học của cá chẽm...................... 83 4.3.1.1 Số lượng hồng cầu trong máu cá chẽm ..................................... 83 4.3.1.2 Số lượng tổng bạch cầu trong máu cá chẽm…………………..86 4.3.1.3 Số lượng các loại bạch cầu trong máu cá chẽm ........................ 88 4.3.1.4 Số lượng tiểu cầu trong máu cá chẽm ....................................... 92 4.3.2 Khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh cá chẽm .......... 94 4.3.3 Hoạt tính lysozyme trong huyết thanh ............................................. 96 4.3.4 Tỷ lệ sống của cá .............................................................................. 97 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................... 100 5.1 Kết luận ................................................................................................ 100 5.2 Đề xuất.................................................................................................. 100 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 101 PHỤ LỤC ..................................................................................................... 115 x DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Lịch sử xuất hiện và đặc điểm phân bố của bệnh do S. iniae trên cá ở trên thế giới ................................................................................................... 12 Bảng 2.2: Lịch sử xuất hiện và đặc điểm phân bố của bệnh do S. iniae trên cá ở Việt Nam ....................................................................................................... 13 Bảng 2.3: Một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn S. iniae ............................. 16 Bảng 2.4. Một số giống vi khuẩn lactic và đặc điểm cơ bản để phân biệt các giống .......................................................................................................................... 32 Bảng 2.5. Đặc điểm sinh hóa của một số loài thuộc giống Lactobacillus được phân lập từ động vật thủy sản .......................................................................... 34 Bảng 2.6: Một số vi khuẩn lactic được phân lập từ ruột cá có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản ....................................................... 37 Bảng 2.7: Một số vi khuẩn lactic được sử dụng trong nuôi cá nước lợ ........... 38 Bảng 3.1: Số mẫu cá chẽm bị bệnh xuất huyết thu tại tỉnh Thừa Thiên Huế .. 43 Bảng 3.2. Thuốc thử và cách đọc kết quả của bộ kít API 20 Strep…………..46 Bảng 3.3: Thiết kế thí nghiệm xác định LD50 của vi khuẩn S. iniae trên cá chẽm .......................................................................................................................... 50 Bảng 3.4: Thiết kế thí nghiệm xác định khả năng gây bệnh của chủng HTA1 và HTA3 trên cá chẽm ..................................................................................... 51 Bảng 3.5: Kết quả thu mẫu để phân lập vi khuẩn lactic .................................. 52 Bảng 3.6: Thiết kế thí nghiệm xác định ảnh hưởng của L. fermentum đến các chỉ tiêu huyết học và khả năng kháng S. iniae ................................................. 57 Bảng 4.1: Tỷ lệ % số chủng vi khuẩn phân lập từ các mô của cá chẽm bị bệnh xuất huyết nuôi tại tỉnh Thừa Thiên Huế ......................................................... 63 Bảng 4.2: Một số đặc điểm hình thái và sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập được từ cá chẽm và so sánh với chủng S. iniae theo Bromage et al. (1999)............ 65 Bảng 4.3: Kết quả xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập được từ cá chẽm bằng bộ kít API 20 Strep, so với chủng S. iniae của Bromage et al. (1999) và chủng S. iniae của Rahmatullah et al. (2017)......... 66 Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm xác định độc lực của vi khuẩn ......................... 67 Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm xác định LD50 của hai chủng S. iniae HTA1 và HTA3 trên cá chẽm .......................................................................................... 68 xi Bảng 4.6: Kết quả so sánh mức độ tương đồng trình tự vi khuẩn phân lập trên cá chẽm bị bệnh xuất huyết với vi khuẩn trong ngân hàng dữ liệu gen của NCBI ......... 77 Bảng 4.7: Kết quả phân lập vi khuẩn lactic từ cá chẽm, cá rô phi và cá dìa ... 78 Bảng 4.8. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá dìa, cá chẽm và cá rô phi .............................. 79 Bảng 4.9: Kết quả xác định khả năng đối kháng với vi khuẩn S. iniae HTA1 của các chủng vi khuẩn lactic .......................................................................... 81 Bảng 4.10: Khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh cá chẽm ....... 95 xii DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1. Hình dạng Streptococcus sp. dưới kính hiển vi điện tử ................... 14 Hình 2.2. Hình dạng vi khuẩn S. iniae sau khi nhuộm Gram (100X) ............. 15 Hình 2.3. Dấu hiệu bệnh lý của cá hồng mỹ bị bệnh xuất huyết do S. iniae ... 18 Hình 2.4. Dấu hiệu bệnh lý của cá chẽm bị bệnh xuất huyết do S. iniae ........ 18 Hình 2.5. Mô bệnh cá rô phi bị bệnh xuất huyết do S. iniae ........................... 19 Hình 2.6. Hình dạng vi khuẩn lactic ................................................................ 33 Hình 2.7. Hình dạng vi khuẩn Lactobacillus plantarum ................................. 33 Hình 3.1. Sơ đồ khối các nội dung nghiên cứu................................................ 42 Hình 3.2. Bộ test sinh hóa định danh vi khuẩn ................................................ 46 Hình 3.3. Sơ đồ phương pháp tuyển chọn vi khuẩn lactic………………..….52 Hình 4.1. Cá chẽm bị bệnh xuất huyết do vi khuẩn......................................... 62 Hình 4.2. Hình dạng khuẩn lạc và nhuộm Gram vi khuẩn S. iniae ................. 64 Hình 4.3. Khuẩn lạc S. iniae trên môi trường BA+ sau 48 giờ nuôi cấy......... 64 Hình 4.4. Kết quả xác định một số đặc điểm sinh hóa của 02 chủng vi khuẩn HTA1 và HTA3 bằng bộ kít API 20Strep ....................................................... 66 Hình 4.5. Cá chẽm trước và sau thí nghiệm cảm nhiễm S. iniae. .................... 69 Hình 4.6. Tỷ lệ chết tích lũy của cá chẽm trong 14 ngày cảm nhiễm hai chủng S. iniae HTA1 và HTA3 .................................................................................. 70 Hình 4.7. Mô gan cá chẽm cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae…………………….72 Hình 4.8. Mô thận cá chẽm cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae…………………....74 Hình 4.9. Mô lách cá chẽm cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae…………………....75 Hình 4.10. Mô não cá chẽm cảm nhiễm vi khuẩn S. iniae…………………...76 Hình 4.11. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA tách chiết từ hai chủng vi khuẩn HTA1 và HTA3 trên gel 2% agarose ..................................... 77 Hình 4.12. Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn lactic trên môi trường MRS agar sau 24 giờ nuôi cấy .......................................................................................... 79 Hình 4.13. Hình dạng vi khuẩn lactic sau khi nhuộm Gram (100X) ............... 80 Hình 4.14. Kết quả thử nghiệm khả năng đối kháng của chủng D7 với vi khuẩn S. iniae sau 48 giờ nuôi cấy (A và B thể hiện đường kính vòng kháng khuẩn) .. 81 Hình 4.15. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel 2% agarose ............. 82 xiii Hình 4.16. Cây thể hiện mối quan hệ di truyền của các chủng C21, D1 và D7 so với các chủng trên ngân hàng gen ............................................................... 83 Hình 4.17. Hình dạng tế bào hồng cầu trong máu cá chẽm ............................. 85 Hình 4.18. Biến động số lượng hồng cầu trong máu cá chẽm......................... 85 Hình 4.19. Biến động số lượng tổng bạch cầu trong máu cá chẽm ................. 86 Hình 4.20. Hình dạng tế bào lympho trong máu cá chẽm ............................... 88 Hình 4.21. Biến động số lượng tế bào lympho trong máu cá chẽm ................ 89 Hình 4.22. Hình dạng bạch cầu đơn nhân trong máu cá chẽm ........................ 90 Hình 4.23. Biến động số lượng bạch cầu đơn nhân trong máu cá chẽm ......... 90 Hình 4.24. Hình dạng bạch cầu trung tính trong máu cá chẽm ....................... 91 Hình 4.25. Biến động số lượng bạch cầu trung tính trong máu cá chẽm ........ 92 Hình 4.26. Hình dạng tiểu cầu trong máu cá chẽm ......................................... 93 Hình 4.27. Biến động số tiểu cầu trong máu cá chẽm ..................................... 93 Hình 4.28. Hoạt tính lysozyme trong huyết thanh cá chẽm ............................ 97 Hình 4.29. Tỷ lệ sống của cá sau khi cảm nhiễm S. iniae ............................... 98 Hình 4.30. Kết quả cảm nhiễm S. iniae trên cá chẽm...................................... 99 xiv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ADH Arginine dihydrolase ARA Arabinose AMD Amygdalin BA Blood Agar BA+ Môi trường BA có bổ sung 1,5% NaCl BLAST Basic Local Alignment Search Tool CFU Colony forming unit DNA Deoxyribonucleic acid ĐC Đối chứng ESC Hydrolysis of Esculin GLYG Glycogen INU Inulin H&E Hematoxylin và Eosin HIP Hydrolysis of Hippurate LAP Leucine arylamidase LAC Lactose LCD lysine decarboxylase LD50 Lethal dose 50 MRS De Man, Rogosa and Sharpe MRSA De Man, Rogosa and Sharpe Agar MAN Mannitol NCBI National Center for Biotechnology Information NMSL Nước muối sinh lý NT Nghiệm thức OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PYRA Pyrrolidonyl arylamidase PAL Alkaline phosphatase RAF Raffinose xv RIB Ribose RNA Ribonucleic acid RPS Relative Percentage Survival SOR Sorbitol TBTB Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide TRE Trehalose TSA Tryptic Soy Agar TSB Tryptic Soy Broth TSA+ Môi trường Tryptic Soy Agar có bổ sung thêm 1,5% NaCl TSB+ Môi trường Tryptic Soy Broth bổ sung thêm 1,5% NaCl VP Voges-Proskauer αGAL α-Galactosidase βGUR β-Glucuronidase βGAL β-Galactosidase xvi Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu Cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch 1790) là loài cá có giá trị kinh tế quan trọng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc châu Á - Thái Bình Dương. Với đặc tính dễ nuôi và thời gian sinh trưởng nhanh, sau một năm thả nuôi từ cá giống cỡ 4 - 5 cm, cá có thể đạt khối lượng 1,5 - 3 kg. Hơn nữa, thịt cá chẽm thơm ngon, giá thành cao nên loài này đã được nuôi phổ biến ở nhiều nước trên thế giới như Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Indonesia, Australia… (Buendia, 1997). Trong những năm gần đây, thành công của những mô hình nuôi cá chẽm đã khẳng định đây là đối tượng nuôi có hiệu quả kinh tế cao. Nghề nuôi cá chẽm thương phẩm phát triển mạnh ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (Lý Văn Khánh và ctv., 2016). Riêng tại tỉnh Thừa Thiên Huế, cá chẽm được nuôi khá phổ biến và mang lại hiệu quả kinh tế cao (Tôn Thất Chất và ctv., 2010; Trần Thị Cẩm Tú và ctv., 2017). Bệnh do Streptococcus iniae được báo cáo ở nhiều loài cá nước ngọt và cá biển ở 15 quốc gia khác nhau thuộc 4 châu lục, gồm châu Phi, châu Á, châu Úc và châu Âu. Bệnh đã và đang là mối đe dọa cho nhiều loài cá nuôi ở cả môi trường nước mặn, lợ và ngọt (Hossain et al., 2014). Trên cá chẽm, bệnh do S. iniae được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1999 tại Úc (Bromage et al., 1999), sau đó bệnh tiếp tục xuất hiện trên cá chẽm nuôi tại Úc năm 2006 (Creeper và Buller, 2006), tại Thái Lan năm 2010 (Suanyuk et al., 2010). Bệnh do S. iniae trên cá chẽm gây xuất huyết trên da, vây và mắt lồi đục (Bromage et al., 1999). Một số dấu hiệu khác như lở loét ngoài da hay xuất huyết ở các gốc vây, nắp mang, hậu môn đã được quan sát trên cá chẽm và cá rô phi nhiễm S. iniae (Suanyuk et al., 2010). Bệnh do S. iniae có thể gây ra tỷ lệ chết lên đến 70% ở giai đoạn cá chẽm giống (Creeper và Buller, 2006). Ở Việt Nam, bệnh do S. iniae được báo cáo xuất hiện đầu tiên trên cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa vào năm 2013 (Tran Vi Hich et al., 2013). Tại Thừa 1 Thiên Huế, từ năm 2007, để hạn chế dịch bệnh và ô nhiễm môi trường do nuôi thâm canh tôm thẻ chân trắng gây ra, tỉnh đã phát triển nuôi các đối tượng cá nước mặn, lợ như cá mú, cá hồng, cá dìa, cá chẽm…, để thay thế các vùng nuôi tôm bị dịch bệnh. Trong đó, cá chẽm được người dân địa phương nuôi khá phổ biến và mang lại hiệu quả kinh tế cao (Tôn Thất Chất và ctv., 2010). Tuy nhiên, việc mở rộng diện tích mặt nước nuôi cá chẽm thiếu quy hoạch chặt chẽ đã làm nghề nuôi cá gặp rất nhiều khó khăn về môi trường và dịch bệnh, trong đó bệnh xuất huyết trên cá chẽm rất phổ biến. Thuốc kháng sinh thường được sử dụng để trị bệnh do vi khuẩn gây ra trên động vật thủy sản nuôi. Việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh do vi khuẩn đã mang lại những thành công nhất định, nhưng cũng làm gia tăng những dòng vi khuẩn kháng thuốc (Weston, 1996; Tu Thanh Dung et al., 2008). Do đó nghiên cứu sử dụng vi khuẩn có khả năng kháng với vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản ngày càng được quan tâm. Trong đó có vi khuẩn lactic, có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh và có lợi với sức khỏe vật chủ khi được bổ sung đủ số lượng trong đường ruột (Nirunya et al., 2008). Vi khuẩn lactic sản xuất một số chất kháng khuẩn như axit hữu cơ, các hợp chất kháng nấm và bacteriocin để ức chế sự phát triển của mầm bệnh (Ringo et al., 2005; Gatesoupe, 2007). Vi khuẩn lactic có thể được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như từ các sản phẩm lên men, từ ruột gia súc và các loài động vật thủy sản. Một số nghiên cứu về vi sinh vật đường ruột của cá trong các môi trường sống khác nhau cho thấy vi khuẩn lactic tồn tại trong ruột cá nhưng không chiếm ưu thế trong hệ vi sinh đường ruột (Ringo et al., 2010). Do đó, có thể bổ sung vi khuẩn lactic vào khẩu phần ăn của cá để ức chế vi khuẩn gây bệnh và nâng cao sức đề kháng bệnh cho cá (Lauzon và Ringo, 2011). Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có các nghiên cứu về ảnh hưởng của việc bổ sung vi khuẩn lactic vào thức ăn đến các chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm. Xuất phát từ thực tiễn đó, thực hiện đề tài “Nghiên cứu bệnh do Streptococcus iniae gây ra trên cá chẽm (Lates calcarifer) và biện pháp phòng bệnh” nhằm cung cấp thông tin về bệnh do vi khuẩn S. iniae trên cá và góp phần phát triển nghề nuôi cá chẽm bền vững. 2 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Cung cấp thông tin về bệnh do vi khuẩn S. iniae gây ra trên cá chẽm làm cơ sở khoa học cho việc quản lý dịch bệnh và góp phần phát triển nghề nuôi cá chẽm bền vững. Mục tiêu cụ thể: Xác định đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn S. iniae trên cá chẽm và đề xuất giải pháp phòng bệnh làm cơ sở cho việc chẩn đoán và phòng bệnh xuất huyết trên cá chẽm. 1.3 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tập trung tìm hiểu bệnh xuất huyết do vi khuẩn S. iniae gây ra trên cá chẽm nuôi tại tỉnh Thừa Thiên Huế, tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng vi khuẩn S. iniae từ ruột cá dìa, cá chẽm và cá rô phi, đồng thời xác định một số chỉ tiêu huyết học và khả năng kháng vi khuẩn S. iniae của cá chẽm giai đoạn giống. 1.4 Nội dung nghiên cứu Đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn S. iniae gây ra trên cá chẽm Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng vi khuẩn S. iniae từ ruột một số loài cá nước lợ Xác định ảnh hưởng của việc bổ sung chủng vi khuẩn lactic vào thức ăn đến một số chỉ tiêu huyết học và khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh cá chẽm. 1.5 Ý nghĩa của nghiên cứu Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp thông tin về bệnh vi khuẩn trên cá, đặc biệt là bệnh xuất huyết do vi khuẩn S. iniae gây ra trên cá chẽm. Đồng thời đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn lactic phân lập từ ruột một số loài cá nước lợ đến một số chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu ở cá chẽm. Kết quả của luận án còn có ý nghĩa trong việc sử dụng vi khuẩn lactic có tính đối kháng với mầm bệnh vi khuẩn S. iniae tạo chế phẩm sinh học phòng bệnh xuất huyết trên cá. Bên cạnh ý nghĩa khoa học và ứng dụng trong thực tiễn, luận án còn giúp nâng cao kiến thức, năng lực nghiên cứu cho người tham gia và là nguồn tài liệu tham khảo bổ sung cho nghiên cứu và giảng dạy sinh viên trong các trường đại học. 3